CN110904114B - 一种Gnb2基因的编码序列和Gnb2基因的编码序列在构建小鼠模型中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种Gnb2基因的编码序列和Gnb2基因的编码序列在构建小鼠模型中的应用，属于基因工程技术领域。本发明的Gnb2基因的编码序列敲除后，会影响神经元树突棘的发育，导致树突棘密度降低。高尔基染色方法分析了锥体神经元树突棘的密度，结果发现在敲除Gnb2基因后无论是底树突还是顶树突上的树突棘的数目都明显减少，单位长度内树突棘的密度明显降低，表明Gnb2基因的编码序列敲除后，会影响锥体神经元树突棘的密度，使锥体神经元树突棘明显减少，导致树突棘密度显著降低。本发明对树突棘发育和功能调节的研究分析具有重要意义。

Description

一种Gnb2基因的编码序列和Gnb2基因的编码序列在构建小鼠 模型中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种Gnb2基因的编码序列和 Gnb2基因的编码序列在构建小鼠模型中的应用。

背景技术

G蛋白(guanine nucleotide-bindingproteins)是含鸟苷酸的一类蛋白质，又可以称其为GTP结合蛋白，存在于细胞质膜的内侧，是一类具有GTP水解酶活性的信号转导蛋白，任何一种G蛋白(Heterotrimeric Gprotein)都是由α、β、γ三种亚基组合而形成的。

现有技术公开了，编码异源三聚体G蛋白复合体β2亚基的Gnb2是家族性窦房结功能障碍和房室传导缺陷的新型疾病基因。另外，Gnb2基因在各种血液病和肿瘤中都有多发性突变。但是，目前还没有关于Gnb2基因对神经发育存在何种影响的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Gnb2基因的编码序列和Gnb2基因的编码序列在构建小鼠模型中的应用，对Gnb2基因的编码序列进行敲除后，会使锥体神经元树突棘明显减少，导致树突棘密度显著降低，以及神经元细胞的膜通透性有明显提高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明还提供了一种Gnb2基因的编码序列，所述Gnb2基因的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述方案所述Gnb2基因的编码序列编码的蛋白Gβ2，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述方案所述Gnb2基因的编码序列或者所述蛋白Gβ2 在降低动物神经元的树突棘密度中的应用。

优选的，所述神经元包括皮层锥体神经元。

本发明还提供了上述方案所述Gnb2基因的编码序列或者所述蛋白Gβ2 在提高动物神经细胞膜通透性中的应用。

优选的，所述动物包括小鼠。

本发明还提供了上述方案所述Gnb2基因的编码序列在构建研究树突棘发育和功能调节的小鼠模型中的应用，包括以下步骤：

1)体外转录获得gRNA1和gRNA2；所述gRNA1针对Gnb2基因的2 号外显子区域设计，所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述 gRNA2针对Gnb2基因的5号外显子区域设计，所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

2)将所述gRNA1、gRNA2和Cas9蛋白混合，得到混合物，将混合物注射到小鼠受精卵的原核区域，培养受精卵获得子代鼠；

3)对获得的子代鼠通过PCR筛选和DNA序列分析，鉴定得到纯合Gnb2 基因的编码序列敲除的小鼠模型。

本发明的有益效果：神经元发育包括轴突和树突的形态发育以及树突棘的发育；其中树突棘的发育直接决定了神经元传递神经信号的能力，对于神经元功能至关重要。本发明提供了一种Gnb2基因的编码序列，该Gnb2基因的编码序列敲除后，会影响神经元树突棘的发育，导致树突棘密度降低。高尔基染色分析了皮层神经元树突棘的密度，结果发现在敲除Gnb2基因后无论是底树突还是顶树突上的树突棘的数目都明显减少，单位长度内树突棘的密度明显降低，表明该Gnb2基因的编码序列敲除后，会影响锥体神经元树突棘的密度，使锥体神经元树突棘明显减少，导致树突棘密度显著降低。本发明对树突棘发育和功能调节的研究分析具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中Gnb2外显子及gRNA模式图；

图2为实施例1中gRNA获得方式示意图；

图3为实施例1中gRNA显微注射入受精卵中，移植入代孕母鼠体内示意图；

图4为实施例1中gRNA的鉴定引物模式图；

图5为实施例1中F0代小鼠382F/1231R引物扩增结果，其中1～14分别代表每只F0小鼠编号；

图6为实施例1中F0代小鼠903F/1860R引物扩增结果，其中1～14分别代表每只F0小鼠编号；

图7为实施例1中gRNA1和gRNA2之间638bp的片段缺失；

图8为实施例1中gRNA2和gRNA3之间636bp的片段缺失；

图9为实施例1中F1代新生小鼠及其基因型鉴定结果，其中1～8分别表示每只F1小鼠的编号；

图10为实施例2中Gnb2基因敲除鼠中G蛋白的Western-Blot检测结果；

图11为实施例2中Real time PCR检测Gnb2mRNA在杂合敲除鼠和纯合敲除鼠中的表达量变化情况；

图12为实施例3中Gnb2^-/-和Gnb2^+/+小鼠和鼠脑图片；

图13为实施例3中小鼠生长曲线分析结果(小鼠数目：n＝15(WT)； n＝44(hets)n＝15(KO)，统计分析方法：t-test，展示数据为Mean±SEM)；

图14为实施例3中小鼠体长分析结果(小鼠数目：n＝4(WT)；n＝4 (KO)，p＝0.6326，统计分析方法：t-test，展示数据为Mean±SEM)；

图15为实施例3中小鼠脑重分析结果(小鼠数目：n＝4(WT)；n＝4 (KO)，p＝0.6624，统计分析方法：t-test，展示数据为Mean±SEM)；

图16为实施例3中小鼠脑长度分析结果(小鼠数目：n＝4(WT)；n＝4 (KO)，p＝0.8351，统计分析方法：t-test，展示数据为Mean±SEM)；

图17为实施例3中小鼠脑宽度析结果(小鼠数目：n＝4(WT)；n＝4 (KO)，p＝0.6554，统计分析方法：t-test，展示数据为Mean±SEM)；

图18为实施例4中激光扫描共聚焦显微镜拍摄的Gnb2^-/-；Thy1-YFP和 Gnb2^+/+；Thy1-YFP鼠脑锥体神经元底树突和顶树突的树突棘，Scale bar＝5μm；

图19为实施例4中底树突树突棘密度统计结果(小鼠数目：n＝3(WT)； n＝3(KO)，神经元树突棘统计数：n＝12(WT)；n＝8(KO)，*P<0.001，统计分析方法：t-test，展示数据为Mean±SEM)；

图20为顶树突上树突棘密度统计结果(小鼠数目：n＝3(WT)；n＝3 (KO)，神经元树突棘统计数：n＝9(WT)；n＝10(KO)，*P<0.001，统计分析方法：t-test，展示数据为Mean±SEM)。

具体实施方式

本发明还提供了一种Gnb2基因的编码序列，所述Gnb2基因的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

本发明还提供了上述方案所述Gnb2基因的编码序列编码的蛋白Gβ2，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

本发明还提供了上述方案所述Gnb2基因的编码序列或者所述蛋白Gβ2 在降低动物神经元的树突棘密度中的应用；所述神经元优选的包括皮层锥体神经元。

本发明还提供了上述方案所述Gnb2基因的编码序列或者所述蛋白Gβ2 在提高动物神经细胞膜通透性中的应用。

本发明中，所述动物包括小鼠。

本发明还提供了上述方案所述Gnb2基因的编码序列在构建研究树突棘发育和功能调节的小鼠模型中的应用，包括以下步骤：

1)体外转录获得gRNA1和gRNA2；所述gRNA1针对Gnb2基因的2 号外显子区域设计，所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：ccagtggggcgaattcagatgag；所述gRNA2针对Gnb2基因的5号外显子区域设计，所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为： tatagtctcaagacccgagaggg；

2)将所述gRNA1、gRNA2和Cas9蛋白混合，得到混合物，将混合物注射到小鼠受精卵的原核区域，培养受精卵获得子代鼠；

3)对获得的子代鼠通过PCR筛选和DNA序列分析，鉴定得到纯合Gnb2 基因的编码序列敲除的小鼠模型；本发明对所述PCR筛选和DNA序列分析的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1 Gnb2基因敲除鼠构建

1、利用CRIPSR/Cas9技术，针对Gnb2的外显子区域，利用在线软件 (http://crispr.mit.edu/)设计guide RNA(gRNA)，选取位于2号外显子的 gRNA1、5号外显子的gRNA2以及位于7号外显子的gRNA3设计了3个gRNA位点，其中gRNA1的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，具体为： ccagtggggcgaattcagatgag；gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：tatagtctcaagacccgagaggg；gRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示为：cgagtcggacatcaatgccgtgg。外显子区域的基因编辑可以有效的导致编码序列的变化，从而引起蛋白功能的改变或缺失(Gnb2外显子及gRNA模式图参见图1)。

2、gRNA通过末端互补(overlappingPCR)以及体外反转录的方式获得。首先合成用于overlapping PCR的DNA片段(参见图2)，在gRNA的5’段引入T7启动子序列，在gRNA的3’引入tracrRNA序列和poly T序列。其中T7启动子序列和poly T序列用于实现体外转录反应，tracrRNA序列用于帮助gRNA结合到Cas9蛋白。

3、将纯化后的三个gRNA以及Cas9蛋白显微注射到小鼠受精卵的原核区域，待受精卵发育到二细胞时期后将受精卵转入代孕小鼠体内(参见图 3)。

4、由于采取了三种gRNA的混合注射的方式，根据各个gRNA在细胞中效率的不同，因此可能获得多种不同基因编辑的小鼠。经统计共获得14 只F0代小鼠，为了鉴定F0小鼠的基因编辑情况，针对每一个gRNA所在区域，分别设计了一对鉴定引物(参见图4，针对gRNA设计扩增引物，检测各个gRNA的编辑情况)。引物序列如下：

针对gRNA1设计的鉴定引物为GNB2382F和GNB2646R；所述GNB2 382F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：cactgaagaatgggaggtgtt；所述GNB2646R的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，具体为： accctgtactatcattctgccc；

针对gRNA2设计的鉴定引物为GNB2903F和GNB21231R；所述GNB2 903F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：caaggtaaagcgggtaccc；所述GNB21231R的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，具体为： aggttgcagtcaggcatttt；

针对gRNA3设计的鉴定引物为GNB21530F和GNB21860R；所述GNB2 1530F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：tcctgttgcctctccagtg；所述GNB21860R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为： agccattggggaagaactg。

5、将不同gRNA位点的上下游引物交叉使用，来检测是否存在片段缺失情况。共获得14只F0小鼠。结果如图5和图6所示，其中图5为使用 382F/1231R进行PCR扩增的结果，其中1～14分别代表每只F0小鼠编号；图6为使用903F/860R进行PCR扩增的结果，其中1～14分别代表每只F0 小鼠编号；382F/1231R引物扩增的片段为849bp，在检测的14只F0小鼠中 9号鼠和11号鼠除显示849bp外，还存在一条小的条带。903F/1860R引物扩增的DNA片段为957bp，9号鼠显示小于500bp的两条带，提示gRNA1 和gRNA2之间以及gRNA2和gRNA3之间存在基因编辑。

通过各个gRNA位点的引物扩增鉴定在各个gRNA位点处是否存在基因片段删除，其中9号F0小鼠在多个gRNA位点处存在片段删除情况。

6、对9号小鼠的PCR产物进行了测序，结果显示9号小鼠染色体上出现不同片段的缺失，其中一种为gRNA1和gRNA2之间638bp的片段缺失(参见图7)，导致Gβ2从第36位氨基酸以后移码改变(shift reading frame)； gRNA1和gRNA2之间的位于外显子上的638bp缺失片段序列如SEQ ID NO. 12所示，具体为：

gggctggacccagtggggcgaattcagatgagaacacggaggaccctccgtggacacctggcaaaaatct atgccatgcactgggggacagactcaaggtgcgtgggtggcccctgctttagtatgtctaggttctggggtgattttat ataatgggcagaatgatagtacagggtgtggggaggactctcaggtctggggggagaatctgtcagtaatttggga agactgattcccagtatccttggaagaccagggatccaggatcatcctgagaggatttgggggaatgcctctaaaaa gcttctctagccagggagggttagggggcctctcttccacaccctgagctgtctgccactggcccgccaggctgctg gtcagcgcctcccaggacggaaagctcatcatttgggacagctacaccactaacaaggtaaagcgggtacccaag gtgggtggggcagggctgtcaggccctggctgactctgactcagggtgctgctctcctctaggtccacgccatccct ctgcgttcctcctgggtcatgacctgtgcctacgccccctcagggaactttgtggcctgtgggggtttggacaacatct gctccatctatagtctcaagacccgaga；

另一种为gRNA2和gRNA3之间636bp的片段缺失(参见图8)，导致 Gβ2从第132位以后氨基酸移码；gRNA2和gRNA2之间的位于外显子上的 636bp缺失片段序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：

gagagggcaatgtcagggtcagcagagagctgcctggccacactggtgagtggagccagaagaggcaagaacacggtcaggggaagggaagagatgcactgtcctctaaaatgcctgactgcaacctcctttctccagggtacctgtcatgctgccgcttcctggacgacaaccaaatcatcaccagctctggggacaccacctggtgaggctctgccgtgctggctccctgccttcgggggatccagggcccagcaggtggcaggcacacttctgagcacctagtcttcccctctgcatggtggccaagtggctcccccactatttcgggttcttggccctctttctagagggccccgtcagggttgggctcatac agtagttaagccagggtttctgtcctctagtcctttcctaatccttcctcctgttgcctctccagtgccctgtgggacattg agacaggccagcagacggtggggtttgctggacacagtggggatgtgatgtccctgtcactggcccccgatggcc gcacctttgtgtcaggtgcctgtgacgcctccatcaagctgtgggatgttcgggattccatgtgccgacagacattcat aggtcacgagtcggacatcaatg。

结果显示：在9号F0小鼠两条染色体分别存在不同的DNA片段敲除情况。

7、为了进一步确认9号F0小鼠的基因型，我们将9号F0小鼠与野生型C57鼠交配，共获得8只F1小鼠(参见图9，其中1～8分别表示每只F1 小鼠的编号)，其中5只F1小鼠携带638bp缺失，另外3只F1小鼠携带636bp 缺失。这两种基因型的小鼠均可以稳定遗传，同时在身体外观上没有明显区别。本发明将基因标记形式为gRNA1和gRNA2之间638bp片段缺失的小鼠命名为Gnb2^-/-小鼠。

实施例2 Gnb2基因敲除鼠敲除效率的检测

为了证实基因敲除效率，本发明提取了出生后7天(postnatal day 7,P7) 小鼠的脑蛋白，进行Western-Blot检测。结果显示，在Gnb2^+/-小鼠鼠脑中 Gβ2蛋白的表达量大约降低了50％，在Gnb2^-/-小鼠鼠脑中检测不到Gβ2蛋白的表达(图10)。同时，Gβ1蛋白的表达没有受到明显的影响(图11)。以上结果说明，在我们所构建的Gnb2基因敲除鼠中，纯合小鼠不表达Gβ2 蛋白。由图10可以看出，Western-Blot结果显示Gβ2在Gnb2敲除鼠的鼠脑皮层蛋白中没有表达，而Gβ1表达没有受到影响。由图11可以看出，Real time PCR检测Gnb2mRNA在杂合敲除鼠和纯合敲除鼠中的表达量变化(**p <0.01，***p<0.001)。

实施例3 Gnb2敲除鼠大体外观

比较出生后56天(P56)Gnb2^-/-与Gnb2^+/+小鼠体型和脑结构外形，二者相比没有明显差异(图12)。在出生后8周时间内，Gnb2^-/-与Gnb2^+/+小鼠的生长曲线相似(图13)。P56小鼠的体长(图14)，脑重(图15)，脑长(图16)和脑宽(图17)等基础表型，没有发现Gnb2^-/-以及Gnb2^+/+小鼠有肉眼可见的差异。

实施例4 Gnb2敲除鼠树突棘密度分析

神经元发育包括轴突和树突的形态发育以及树突棘的发育。其中树突棘的发育直接决定了神经元传递神经信号的能力，对于神经元功能至关重要。我们利用上述实验中P56，基因型为Gnb2^-/-；Thy1-YFP和Gnb2^+/+；Thy1-YFP 鼠，计数锥体神经元中底树突和顶树突上树突棘的密度，选取二级树突上一段树突棘清晰的区域进行双盲统计，计算每10μm中树突棘的数目。图18 为Gnb2^-/-；Thy1-YFP和Gnb2^+/+；Thy1-YFP鼠脑皮层第5层锥体神经元底树突和顶树突上的树突棘。实验结果显示，Gnb2^-/-；Thy1-YFP的鼠脑皮层第5层的锥体神经元的底树突的树突棘与Gnb2^+/+；Thy1-YFP鼠相比明显减少(图19)。顶树突的树突棘数目也减少，密度降低(图20)。以上结果表明，Gnb2敲除影响了神经元树突棘的发育，导致树突棘密度降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 东北师范大学

<120> 一种Gnb2基因的编码序列和Gnb2基因的编码序列在构建小鼠模型中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1023

<212> DNA

<213> 小鼠(mouse)

<400> 1

atgagtgagc tggagcaact gagacaggag gccgagcagc tccggaacca gatccgggac 60

gccagaaaag catgcgggga ttccacactg acccagatca cagctgggct ggacccagtg 120

gggcgaattc agatgagaac acggaggacc ctccgtggac acctggcaaa aatctatgcc 180

atgcactggg ggacagactc aaggctgctg gtcagcgcct cccaggacgg aaagctcatc 240

atttgggaca gctacaccac taacaaggtc cacgccatcc ctctgcgttc ctcctgggtc 300

atgacctgtg cctacgcccc ctcagggaac tttgtggcct gtgggggttt ggacaacatc 360

tgctccatct atagtctcaa gacccgagag ggcaatgtca gggtcagcag agagctgcct 420

ggccacactg ggtacctgtc atgctgccgc ttcctggacg acaaccaaat catcaccagc 480

tctggggaca ccacctgtgc cctgtgggac attgagacag gccagcagac ggtggggttt 540

gctggacaca gtggggatgt gatgtccctg tcactggccc ccgatggccg cacctttgtg 600

tcaggtgcct gtgacgcctc catcaagctg tgggatgttc gggattccat gtgccgacag 660

acattcatag gtcacgagtc ggacatcaat gccgtggctt tcttccccaa tggctatgcc 720

ttcaccacgg gatcagatga cgccacttgt cgcctctttg acctgcgggc tgatcaggag 780

ctgctcatgt attcccacga caacatcatc tgcggcatca cctcggttgc cttctcgcgc 840

agcggccggc tgctgctcgc tggctacgac gacttcaact gcaacatctg ggatgccatg 900

aagggtgacc gtgcaggtgt cctcgctggc catgataacc gtgtgagctg ccttggggtc 960

acagatgatg gaatggccgt ggctacaggc tcctgggact ccttcctcaa gatctggaac 1020

taa 1023

<210> 2

<211> 340

<212> PRT

<213> 小鼠(mouse)

<400> 2

Met Ser Glu Leu Glu Gln Leu Arg Gln Glu Ala Glu Gln Leu Arg Asn

1 5 10 15

Gln Ile Arg Asp Ala Arg Lys Ala Cys Gly Asp Ser Thr Leu Thr Gln

20 25 30

Ile Thr Ala Gly Leu Asp Pro Val Gly Arg Ile Gln Met Arg Thr Arg

35 40 45

Arg Thr Leu Arg Gly His Leu Ala Lys Ile Tyr Ala Met His Trp Gly

50 55 60

Thr Asp Ser Arg Leu Leu Val Ser Ala Ser Gln Asp Gly Lys Leu Ile

65 70 75 80

Ile Trp Asp Ser Tyr Thr Thr Asn Lys Val His Ala Ile Pro Leu Arg

85 90 95

Ser Ser Trp Val Met Thr Cys Ala Tyr Ala Pro Ser Gly Asn Phe Val

100 105 110

Ala Cys Gly Gly Leu Asp Asn Ile Cys Ser Ile Tyr Ser Leu Lys Thr

115 120 125

Arg Glu Gly Asn Val Arg Val Ser Arg Glu Leu Pro Gly His Thr Gly

130 135 140

Tyr Leu Ser Cys Cys Arg Phe Leu Asp Asp Asn Gln Ile Ile Thr Ser

145 150 155 160

Ser Gly Asp Thr Thr Cys Ala Leu Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Gln

165 170 175

Thr Val Gly Phe Ala Gly His Ser Gly Asp Val Met Ser Leu Ser Leu

180 185 190

Ala Pro Asp Gly Arg Thr Phe Val Ser Gly Ala Cys Asp Ala Ser Ile

195 200 205

Lys Leu Trp Asp Val Arg Asp Ser Met Cys Arg Gln Thr Phe Ile Gly

210 215 220

His Glu Ser Asp Ile Asn Ala Val Ala Phe Phe Pro Asn Gly Tyr Ala

225 230 235 240

Phe Thr Thr Gly Ser Asp Asp Ala Thr Cys Arg Leu Phe Asp Leu Arg

245 250 255

Ala Asp Gln Glu Leu Leu Met Tyr Ser His Asp Asn Ile Ile Cys Gly

260 265 270

Ile Thr Ser Val Ala Phe Ser Arg Ser Gly Arg Leu Leu Leu Ala Gly

275 280 285

Tyr Asp Asp Phe Asn Cys Asn Ile Trp Asp Ala Met Lys Gly Asp Arg

290 295 300

Ala Gly Val Leu Ala Gly His Asp Asn Arg Val Ser Cys Leu Gly Val

305 310 315 320

Thr Asp Asp Gly Met Ala Val Ala Thr Gly Ser Trp Asp Ser Phe Leu

325 330 335

Lys Ile Trp Asn

340

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 3

ccagtggggc gaattcagat gag 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 4

tatagtctca agacccgaga ggg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 5

cgagtcggac atcaatgccg tgg 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 6

cactgaagaa tgggaggtgt t 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 7

accctgtact atcattctgc cc 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 8

caaggtaaag cgggtaccc 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 9

aggttgcagt caggcatttt 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 10

tcctgttgcc tctccagtg 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 11

agccattggg gaagaactg 19

<210> 12

<211> 638

<212> DNA

<213> 小鼠(mouse)

<400> 12

gggctggacc cagtggggcg aattcagatg agaacacgga ggaccctccg tggacacctg 60

gcaaaaatct atgccatgca ctgggggaca gactcaaggt gcgtgggtgg cccctgcttt 120

agtatgtcta ggttctgggg tgattttata taatgggcag aatgatagta cagggtgtgg 180

ggaggactct caggtctggg gggagaatct gtcagtaatt tgggaagact gattcccagt 240

atccttggaa gaccagggat ccaggatcat cctgagagga tttgggggaa tgcctctaaa 300

aagcttctct agccagggag ggttaggggg cctctcttcc acaccctgag ctgtctgcca 360

ctggcccgcc aggctgctgg tcagcgcctc ccaggacgga aagctcatca tttgggacag 420

ctacaccact aacaaggtaa agcgggtacc caaggtgggt ggggcagggc tgtcaggccc 480

tggctgactc tgactcaggg tgctgctctc ctctaggtcc acgccatccc tctgcgttcc 540

tcctgggtca tgacctgtgc ctacgccccc tcagggaact ttgtggcctg tgggggtttg 600

gacaacatct gctccatcta tagtctcaag acccgaga 638

<210> 13

<211> 636

<212> DNA

<213> 小鼠(mouse)

<400> 13

gagagggcaa tgtcagggtc agcagagagc tgcctggcca cactggtgag tggagccaga 60

agaggcaaga acacggtcag gggaagggaa gagatgcact gtcctctaaa atgcctgact 120

gcaacctcct ttctccaggg tacctgtcat gctgccgctt cctggacgac aaccaaatca 180

tcaccagctc tggggacacc acctggtgag gctctgccgt gctggctccc tgccttcggg 240

ggatccaggg cccagcaggt ggcaggcaca cttctgagca cctagtcttc ccctctgcat 300

ggtggccaag tggctccccc actatttcgg gttcttggcc ctctttctag agggccccgt 360

cagggttggg ctcatacagt agttaagcca gggtttctgt cctctagtcc tttcctaatc 420

cttcctcctg ttgcctctcc agtgccctgt gggacattga gacaggccag cagacggtgg 480

ggtttgctgg acacagtggg gatgtgatgt ccctgtcact ggcccccgat ggccgcacct 540

ttgtgtcagg tgcctgtgac gcctccatca agctgtggga tgttcgggat tccatgtgcc 600

gacagacatt cataggtcac gagtcggaca tcaatg 636

Claims (1)

1.一种Gnb2基因的编码序列在构建研究树突棘发育和功能调节的小鼠模型中的应用，包括以下步骤：

1)体外转录获得gRNA1和gRNA2；所述gRNA1针对Gnb2基因的2号外显子区域设计，所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述gRNA2针对Gnb2基因的5号外显子区域设计，所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

2)将所述gRNA1、gRNA2和Cas9蛋白混合，得到混合物，将混合物注射到小鼠受精卵的原核区域，培养受精卵获得子代鼠；

3)对获得的子代鼠通过PCR筛选和DNA序列分析，鉴定得到纯合Gnb2基因的编码序列敲除的小鼠模型；

所述Gnb2基因的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

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