CN110898062B - Tak1抑制剂ng25及其衍生物在制备肌营养不良症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了TAK1抑制剂NG 25及其衍生物在制备肌营养不良症药物中的应用,NG 25能够减轻骨骼肌炎症、纤维化,促进肌再生以增加骨骼肌的抓力,最终改善肌营养不良症引起的肌无力和/或肌萎缩。NG 25是一种人工合成的小分子2型TAK1抑制剂,其能够结合到目标激酶的ATP位点上,从而达到抑制TAK1活性的作用。抑制TAK1的活性可能抑制炎症反应及纤维化的过程。NG 25最大的优势在于容易合成获得,并且价格较低廉。

Description

TAK1抑制剂NG25及其衍生物在制备肌营养不良症药物中的 应用
技术领域
本发明涉及抑制剂在制备药物中的应用,具体涉及一种TAK1抑制剂NG 25 及其衍生物在制备肌营养不良症药物中的应用。
背景技术
肌营养不良症是一种常见的遗传性骨骼肌疾病,表现为进行性的肌肉萎缩和肌无力。根据临床表现又主要分为杜氏肌营养不良症,即Duchenne muscular dystrophy,DMD和贝氏肌营养不良症,即Becker muscular dystrophy,BMD。研究显示,杜氏肌营养不良症和贝氏肌营养不良症主要是由于人体Xp21染色体上蛋白基因突变,编码抗肌萎缩蛋白dystrophin的DMD基因突变所致的遗传性肌营养不良,两者均是横纹肌的变性疾病。DMD患者是由于DMD基因的突变导致 dystrophin蛋白的完全缺失;而BMD患者是由于部分类型的DMD基因突变,导致dystrophin蛋白截短但仍具有部分功能。
杜氏肌营养不良症是一种严重的神经肌肉遗传性疾病,是抗肌萎缩蛋白dystrophin基因发生突变所致,属于进行性肌营养不良症常见类型。抗肌萎缩蛋白是用于在肌收缩时保护肌纤维膜的一种结构蛋白,其缺失引起肌纤维细胞渗透性改变,NADPH氧化酶激活,ROS增多,炎症激活,使骨骼肌功能紊乱和多种信号通路的变化,导致严重的进行性肌萎缩。显微镜下可以看到DMD患者骨骼肌纤维数量明显变少,能观察到大的纤维坏死和小群变性肌纤维;苏木精-伊红,即HE染色能看到明显的炎性细胞浸润,ATP酶染色能观察到DMD组织中肌纤维大小不一,肌纤维圆形化。DMD临床患者表现为独立行走较迟,易跌倒,上楼、下蹲站起困难,逐渐出现步态异常,举臂无力,约l/3患儿智力低下。通常 6岁左右出现行走困难,骨盆带近端肌尤其无力,由于盆带肌肉无力而呈典型的鸭步,肩带肌肉萎缩无力造成翼状肩胛或游离肩,而腹肌和髂腰肌萎缩无力。贝氏肌营养不良症患者由于仍有部分dystrophin蛋白表达,因此其发病较杜氏肌营养不良症患者轻。
该病发病率约为:男婴1/3500,女性为致病基因的携带者。中国内地患者及携带者总数近10万人,包含贝氏肌营养不良症。患儿普遍在2-3岁阶段发病,骨骼肌进行性萎缩,在12岁前丧失行走能力,最终因心肺功能衰竭在20至30 岁期间死亡。DMD作为一种基因突变导致的遗传性疾病,基因治疗也许是最终治疗DMD的有效方法。但是,截止到目前基因治疗手段仍处于研究阶段,激素联合护理仍是治疗DMD的一线手段。激素治疗虽然有一定效果但是给患者带来一系列不良反应,包括:胃肠道反应、肥胖等。所以急需要找到激素以外的药物来治疗DMD患者肌肉组织中的炎症,氧化应激和纤维化。这方面的药物全世界的研究者也在研究当中,但是至今仍没有一种药物能用于临床治疗DMD。
发明内容
发明目的:本发明的第一目的在于提供一种TAK1抑制剂NG 25在制备肌营养不良症药物中的应用;
本发明的第二目的在于一种TAK1抑制剂NG 25衍生物在制备肌营养不良症药物中的应用。
技术方案:本发明公开一种TAK1抑制剂NG 25在制备肌营养不良症药物中的应用。
优选地,所述肌营养不良症为引起的肌无力或/和肌萎缩的肌营养不良症。
进一步地,引发所述肌营养不良症的诱因及特征包括:
1)TAK1过表达;
2)骨骼肌纤维化;
3)骨骼肌炎症。
本发明还提供一种TAK1抑制剂NG 25衍生物在制备肌营养不良症药物中的应用,其中,所述肌营养不良症为引起的肌无力或/和肌萎缩的肌营养不良症。
优选地,所述TAK1抑制剂NG 25衍生物为NG 25的可药用盐。
优选地,引发所述肌营养不良症的诱因及特征包括:
1)TAK1过表达;
2)骨骼肌纤维化;
3)骨骼肌炎症。
优选地,所述肌营养不良症为杜氏肌营养不良症或贝氏肌营养不良症中的一种或两种。
有益效果:NG 25能够减轻骨骼肌炎症、纤维化,促进肌再生以增加骨骼肌的抓力,最终改善肌营养不良症引起的肌无力和/或肌萎缩。NG 25是一种人工合成的小分子2型TAK1抑制剂,其能够结合到目标激酶的ATP位点上,从而达到抑制TAK1活性的作用。抑制TAK1的活性可能抑制炎症反应及纤维化的过程。NG 25最大的优势在于容易合成获得,并且价格较低廉。
附图说明
图1为TAK1抑制剂NG 25的化学结构式;
图2为5-6周龄不同处理组mdx小鼠步态实验结果图;其中A为正常组; B为DND模型组;C为NG 25治疗组;
图3为5-6周龄不同处理组mdx小鼠骨骼肌苏木精-伊红,即HE染色结果图;其中A为正常组;B为DND模型组;C为NG 25治疗组;
图4为5-6周龄不同处理组mdx小鼠骨骼肌免疫荧光黏连蛋白,即 Fibronectin染色,其中,A为正常组;B为DND模型组;C为NG 25治疗组;
图5为5-6周龄不同处理组mdx小鼠骨骼肌免疫荧光肌纤维重链,即MHC 染色,其中A为正常组;B为DND模型组;C为NG 25治疗组。
具体实施方式
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
mdx小鼠是DMD基因缺陷,导致dystrophin蛋白缺失的一种公认用于研究杜氏/贝氏肌营养不良的模型鼠。mdx小鼠与野生对照组相比,肌肉的组织形态异常,肌肉退化的标志物-血清中的肌酸激酶和乳酸脱氢酶水平升高,肌肉组织中大量巨噬细胞聚集,并且伴随纤维化和坏死的发生。
本发明所用实验动物为mdx转基因小鼠命名为(C57BL/10ScSnJNju-DmdDMD/Nju)和C57BL/10ScSnJNju小鼠,均购自南京大学南京生物医药研究院。
本发明中的药物为NG 25,是TAK1抑制剂,其结构式如图1所示,购买于 Sigma生命科技有限公司。
实施例1
NG 25治疗3-4周龄的mdx小鼠肌无力和肌萎缩的药效学评价,具体方法如下:购买mdx小鼠18只,3-4周龄,雄性;以及同周龄的C57BL/10ScSnJNju 正常雄性小鼠9只,为正常组,即n=9,mdx小鼠按体重随机分为2组,分别命名为DMD模型组,即n=9,和NG 25治疗组,NG 25治疗组给药剂量为30μ mol/天/只,n=9。具体分组及给药方式如表1所示:
表1实验小鼠具体分组及给药剂量和给药方式
Figure BDA0002296122430000041
每天上午9时至10时给药,并观察与记录所有动物状态。
肌抓力测定:给药第14天进行小鼠前肢抓力测定,采用济南益延科技发展有限公司生产的型号为YLS-13A的肌抓力测定仪测定各组小鼠前肢最大肌抓力,每只测3次取平均值,结果如表2所示。
表2 mdx小鼠肌抓力统计结果
分组 正常组 DMD模型组 NG 25治疗组
肌抓力(g) 73.9±11.0 42.8±5.4<sup>*</sup> 64.2±7.4<sup>#</sup>
*P<0.05与正常组相比;#P<0.05与DMD模型组相比。
结果表明,给药14天后NG 25治疗组小鼠较DMD模型组小鼠在前肢肌抓力方面明显优于DMD模型组,表明NG 25能够增加mdx小鼠骨骼肌的力量,改善mdx小鼠肌无力的症状。
实施例2
步态分析:采用墨汁法于实施例1中给药第14天后的mdx小鼠进行步态分析与统计。分别记录各组小鼠前、后肢的步距和步宽。每只测3次取平均值,结果如表3所示。
表3 mdx小鼠步态实验统计结果
分组 正常组 DMD模型组 NG 25治疗组
步长(cm) 5.9±0.4 5.0±0.3<sup>*</sup> 5.8±0.2<sup>#</sup>
前肢步宽(cm) 1.7±0.1 1.5±0.1<sup>*</sup> 1.7±0.1<sup>#</sup>
后肢步宽(cm) 2.4±0.2 2.8±0.1<sup>*</sup> 2.5±0.2<sup>#</sup>
*P<0.05与正常组相比;#P<0.05与DMD模型组相比。
结果表明,DMD模型组小鼠前肢步宽变窄,后肢步距变短且步宽变宽;NG 25给药14天后前肢步宽变宽,后肢步距较DMD模型组变长且步宽变窄,代表性图片如图2所示。
实施例3
给药14天后,隔夜禁食12小时后于第15天安乐死实施例1中mdx小鼠,腹股沟静脉取血,3500转/分钟离心10分钟,取上层血清测定血清肌酸激酶,即CK和乳酸脱氢酶,即LDH含量。随后解剖胫骨前肌、膈肌并快速液氮冷冻,第二天转移至负80冰箱备用。血清CK、LDH含量和胫骨前肌肌肉重量如表4 所示。
表4 mdx小鼠胫骨前肌重量
Figure BDA0002296122430000051
*P<0.05与正常组相比;#P<0.05与DMD模型组相比。
结果表明,NG 25给药后能显著降低血清CK和LDH含量。此外,DMD模型鼠胫骨前肌假性肥大,重量较正常组增加;NG 25给药能改善模型鼠肌肉的假性肥大。
实施例4
苏木精-伊红(HE)染色观察实施例3中各组实验鼠骨骼肌病理及形态变化:新鲜胫骨前肌和膈 肌迅速OCT包埋,然后于冷冻切片机进行切片,切片厚度为 8μm,各组切片用HE染料进行染色,封片后与日本Olympus制造的型号为BX53的显微镜下观察、拍照。结果如图3所示。
结果表明,DMD模型组小鼠胫骨前肌和膈肌都存在大量炎性细胞浸润,肌纤维变圆,大小不一,细胞核中心化,膈肌肌纤维明显丢失。NG 25给药后能明显改善胫骨前肌和膈肌的炎症,部分恢复膈肌肌纤维的形态和数量。
实施例5
免疫荧光染色考察实施例3中各组小鼠骨骼肌纤维化情况:新鲜胫骨前肌和膈 肌迅速OCT包埋,然后于冷冻切片机进行切片,切片厚度为8μm,用 Fibronectin抗体进行染色,4℃冰箱孵育过夜。再用荧光二抗染色,室温孵育1 小时,封片后于日本Olympus制造的型号为BX53的激光共聚焦显微镜下观察、拍照。结果如图4所示。
结果表明,DMD模型组小鼠胫骨前肌和膈 肌都存在明显纤维化,NG 25治疗后能够改善mdx小鼠胫骨前肌和膈 肌的纤维化。
免疫荧光染色骨骼肌肌纤维:用肌纤维重链,即MHC和新生肌纤维重链即 eMyHC的特异性标记抗体染色,4℃冰箱孵育过夜。再用荧光二抗染色,室温孵育1小时,封片后于日本Olympus制造的型号为BX53的激光共聚焦显微镜下观察、拍照。结果如图5所示。
结果表明,DMD模型组小鼠胫骨前肌有大量新生肌纤维和存在肌纤维重链缺失的现象,NG 25治疗后能够显著逆转mdx小鼠肌纤维的缺失;此外DMD模型组小鼠肌纤维重链有明显缺失,NG 25治疗后能够显著减少mdx小鼠肌纤维的缺失。
综合实施例1-5所述,本发明通过以国际公认的DMD基因敲除小鼠,即 mdx小鼠为肌营养不良的模型,在mdx小鼠上考察NG 25对肌营养不良引起的肌无力和肌萎缩的治疗效果。从药效学、行为学和分子生物学等方面对NG 25 对肌营养不良症引起的肌无力和肌萎缩的影响做了系统研究,结果显示:NG 25 能够逆转肌纤维的缺失,增强骨骼肌的力量和功能。NG 25能够减轻骨骼肌炎症、纤维化,增加骨骼肌的抓力。因此,本研究为TAK1抑制剂NG25开发治疗肌营养不良症引起的肌无力和/或肌萎缩提供了理论研究基础。

Claims (3)

1.一种TAK1抑制剂NG 25在制备肌营养不良症药物中的应用;所述肌营养不良症为杜氏肌营养不良症或/和贝氏肌营养不良症。
2.根据权利要求1所述的TAK1抑制剂NG 25在制备肌营养不良症药物中的应用,其特征在于:NG 25用于改善所述肌营养不良症引起的肌无力或/和肌萎缩。
3.一种TAK1抑制剂NG 25可药用盐在制备肌营养不良症药物中的应用,其特征在于:所述肌营养不良症为杜氏肌营养不良症或/和贝氏肌营养不良症。
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