CN110895260B - 基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的制备方法及应用 - Google Patents
基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的制备方法及应用，具体步骤如下：(1)捕获单元(P‑Au‑Fe3O4)的制备；(2)信号单元(Ru(phen)3 2+‑NetDNA@Ab)的制备；(3)传感器的制备Ru(phen)3 2+‑NetDNA@Ab/P‑Au‑Fe3O4/MGCE。在乙酰化反应中，改变HAT p300浓度及其小分子抑制剂浓度，探究所制备的一系列传感器对电化学发光信号的影响。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学发光传感器及其检测方法，尤其是涉及一种基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的制备方法及应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
组蛋白乙酰转移酶是一种典型的生物酶，通过在组蛋白的赖氨酸位点添加乙酰基减少组蛋白表面的负电荷，进而降低了组蛋白与DNA之间的结合能力，使染色质处于开放状态，从而为转录因子提供适宜的条件。实际上，除了组蛋白外，非组蛋白的乙酰化在调控基因转录、维持蛋白稳定性、趋化反应、应激反应及代谢调控方面均有重要作用。细胞可以通过对专利因子或是DNA/RNA结合蛋白的乙酰化状态进行控制进而调控基因的表达，从而导致乙酰转移酶的异常作用，引发一系列有关疾病，如癌症、代谢综合征和神经失调等。对乙酰转移酶活性及其抑制剂进行分析检测将大大有助于基因转录相关生化研究以及抗癌药物发现。目前，最为典型的工作是通过抗体识别和酶联免疫的方法实现乙酰转移酶的分析检测。这些方法特异性强，但灵敏度较低，且不同批次之间抗体差异性大等。因此，探索HAT活性和筛选其抑制剂的定制分析方法将有助于临床诊断和药物研究。
核酸(DNA)是一种由核苷酸构成的生物分子，通过氢键结合形成碱基配对，利用Watson-Crick配对方式(A-T，G-C)产生双螺旋结构。近年来，因其可程序化序列设计，精确的碱基互补配对结合作用，以及灵活的化学合成与修饰，不仅使其拥有巨大的信息编码能力，同时也为我们提供了一种精确设计可控的自组装方法，DNA作为构建复杂纳米结构的机缘，有着其独特的优势，如尺寸小、编码性强、结构稳定、易于操作等。1982年，科学家就首次利用碱基互补配对形成的DNA周期性结构作为蛋白等其他分子结晶的框架，并提出交叉结构的概念。导致DNA纳米技术飞速发展，并在生物传感、逻辑运算以及疾病诊断领域具有潜在的应用价值。这些奇特的特征使其能够较好地应用于生物传感领域，而DNA纳米网应用于美杜莎式p300电化学发光传感体系十分罕见。
在这里，我们设计了捕获单元和信号单元，用于探测HAT活性。使用HAT p300作为模型，该项目的实施主要依赖于以下内容：捕获单元(Au-Fe3O4)的完美合成，通过Au-S键固定底物肽，通过乙酰化反应从Ac-CoA将乙酰基转移到底物多肽的赖氨酸残基上，通过抗原(乙酰基)-抗体(乙酰基抗体)相互作用，进而与信号单元Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab，成功制备美杜莎式p300电化学发光传感器。当乙酰化反应发生时，显示出明显的电化学发光信号，这与目标(HAT p300)浓度成正比。目前，国内外尚未发现基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的制备方法及应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的一种基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的制备方法及应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的制备方法及应用，具体步骤如下：
(1)捕获单元(P-Au-Fe3O4)的制备
a.Fe3O4NPs：将2～10g FeCl3·6H2O和5～50g乙酸钠在搅拌下溶解在20～200mL乙二醇中。然后将所得溶液转移到聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中并密封以在180～250℃下加热。反应4～12h后，将高压釜冷却至室温。将得到的黑色磁铁矿用乙醇彻底洗涤，并在45～80℃下真空干燥。
b.L-半胱氨酸官能化Fe3O4NPs：在超声下用HCl水溶液(2～12mL，0.1～2M)预处理5～30mg Fe3O4NPs 3～18min。然后用永久磁铁回收磁性NPs，用蒸馏水彻底洗涤数次，再分散于L-半胱氨酸水溶液(5～15mL，2～20g/L)的混合物中，超声处理0.5～2h。随后，通过永磁体分离产物并用蒸馏水洗涤，并再分散于蒸馏水(8～30mL)中。
c.Au-Fe3O4NPs：将氯金酸(1～4mL，10～40mM)滴加到得到的L-半胱氨酸官能化的Fe3O4NPs悬浮液中，将混合物溶液搅拌1～5h，然后加入L-抗坏血酸(1～10mL，0.5～1.5wt％)混合，并将混合溶液再搅拌1～5h。最后，通过使用永磁体，将产物分离并用蒸馏水和乙醇洗涤数次，然后再分散在蒸馏水中。
d.P-Au-Fe3O4：加入底物肽溶液(2.5～7.5μL，50～500μM)，并在4℃下保持过夜，然后用磷酸盐缓冲液洗涤。
(2)信号单元(Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab)的制备
a.NetDNA@Ab的合成
①DNA单链退火：将单链DNA溶液(如：1-net、2-net、3-net、4-net或5-net)升温到85～98℃，2～15min，逐渐冷却到18～25℃，并于18～25℃保持0.5～1.5h，以得到理想的二级结构。
②取有-NH2结构的4-net或5-net(0.2～1.5μL，10～30μM)，加入乙酰基抗体(Ab)溶液(0.2～1.8μL，10-3～10-1mg/mL)，同时加入EDC/NHS偶联试剂(0.3～2μL，30～300μM/3～30μM，pH 6.0)，室温下震摇0.5～3h。处理好的4-net和5-net混合均匀，在88～98℃下水浴反应2～20min，然后2～6℃下迅速降温，使之形成双链结构。
③将1-net(0.2～1.2μL，5～35μM)、2-net(0.2～1.2μL，5～35μM)、3-net(0.2～1.2μL，5～35μM)、TM缓冲液(1～7μL)、TCEP(0.5～2μL，10～40mM)加入到②溶液中，总体积为10μL，在85～97℃下，反应3～10min。在PCR中逐渐冷却至18～28℃，并在该温度下孵育1～3h，以得到理想的二级结构。
④制备TdT反应液：0.5～3μL蒸馏水、1～6μL TdT缓冲液、dTTP(2～6μL，2～50mM)、TdT(2～6μL，1～50U/mL)，总体积为20μL。将TdT反应液混合均匀加入③溶液中，29～40℃水浴0.5～2h。
b.Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab合成
再取Ru(phen)3Cl2·H2O(1～15μL，5～100mM)的PBS(0.1M，7.4)溶液，与NetDNA@Ab溶液混合均匀，总体积25μL，4℃冰箱储存备用。
(3)传感器的制备
MGCE：为获得镜面状表面，用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉末仔细轻柔地抛光MGCE，并分别用水和乙醇超声冲洗1～6min，然后在室温下用N2干燥MGCE。
PAc-Au-Fe3O4/MGCE：体积为2.5～7.5μL的捕获单元在MGCE表面覆盖0.5～5min，得到P-Au-Fe3O4/MGCE，然后用磷酸盐缓冲液冲洗表面。之后，将电极浸入0.1～2mM巯基己醇溶液中10～50min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗表面。之后将HAT p300反应液(总体积200μL，涉及不同浓度的HAT p300，100～1000μM Ac-CoA和缓冲液)。滴到电极表面并在28～38℃下孵育60～120min，用磷酸盐缓冲液洗涤电极缓缓除去过量的试剂，标记为PAc-Au-Fe3O4/MGCE。
Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab/PAc-Au-Fe3O4/MGCE：取信号单元(Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab)2.5～7.5μL滴涂于PAc-Au-Fe3O4/MGCE，27～40℃静置10～50min，传感器不使用时，储存于4℃冰箱中。
所述TM缓冲液配制：20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，50mM氯化镁(MgCl2)，pH 8.0。
所用到的DNA序列(5’-3’)：
1-net：TGT TGA TAG TCT AGA ACA TGA AAA GAT TG GG ATA TAG TAT AAG GAT
2-net：TGT TGA TAG TCT AGA ATC CTT ATA CTA TAT CC CAC CTG ACT CCT GAGGAG AAG
3-net：TGT TGA TAG TCT AGA CTT CTC C AC CCC CCC AGG AGT CAG GTG CA ATCTTT TCA TGT
4-net：H2N-ATC GCA TCT AGA CTA TCA ACA ACT AGA TAC ATA CAG
5-net：H2N-ATC GCA TCT AGA CTA TCA ACA CTG TAT GTA TCT AGT
所述的电化学参数条件如下：电位阶跃计时电流法，脉冲宽度：0.25s；脉冲间隔：30s；初始电压：-1.5V；脉冲电压：-1.5V。
发明原理：利用上述一种基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的制备方法及应用，采用捕获单元(P-Au-Fe3O4)，通过Au-S键固定底物肽，再通过进行乙酰化反应从Ac-CoA将乙酰基转移到底物多肽的赖氨酸残基上，通过抗原-抗体相互作用，进而与信号单元(Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab)结合。显然，在浓度一定范围内，目标物浓度越大，电化学发光响应越明显。实验结果表明，电化学发光响应大小与目标物浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测。其优点在于：
(1)高灵敏度。实验得出传感器的电化学发光响应对HAT p300浓度对数值的线性相关方程为y＝37241gCp300+8355，R2＝0.9965，线性范围为0.006～60nM，检测限为1pM，由此说明传感器对HAT p300可实现高灵敏检测。
(2)高特异性。常见其他相关酶对本检测体系均无干扰。原因在于：本发明是基于HAT p300催化乙酰化反应生成，生成乙酰化多肽的量影响到与信号单元的结合，其他酶无法催化乙酰化反应，故对本检测体系无干扰。
(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
(4)抑制剂。利用该电化学发光生物传感器对插入发光体的电化学发光响应，实现对HAT p300抑制剂(如漆树酸、C646)的检测，可以得出传感器的电化学发光响应与HATp300抑制剂的相关关系。
(5)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。
综上所述，本发明制备一种基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的制备方法及应用，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度HAT p300的检测及其小分子抑制剂的筛选，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的不同修饰电极对比的电化学发光响应；
图2为本发明传感器的可行性实验图；
图3为本发明传感器对不同浓度HAT p300电化学发光响应对HAT p300浓度的对
数校准曲线图；
图4为本发明传感器的选择性实验图；
图5为本发明传感器的抗干扰实验图；
图6为不同浓度漆树酸对HAT p300活性的抑制作用；
图7为不同浓度C646对HAT p300活性的抑制作用。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1传感器的制备
(1)捕获单元(P-Au-Fe3O4)的制备
a.Fe3O4NPs：将5.2g FeCl3·6H2O和11.5g乙酸钠在搅拌下溶解在100mL乙二醇中。然后将所得溶液转移到聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中并密封以在200℃下加热。反应8h后，将高压釜冷却至室温。将得到的黑色磁铁矿用乙醇彻底洗涤，并在60℃下真空干燥。
b.L-半胱氨酸官能化Fe3O4NPs：在超声下用HCl水溶液(5mL，1M)预处理20mgFe3O4NPs 5min。然后用永久磁铁回收磁性NPs，用蒸馏水彻底洗涤数次，再分散于L-半胱氨酸水溶液(10mL，5g/L)的混合物中，超声处理1h。随后，通过永磁体分离产物并用蒸馏水洗涤，并再分散于蒸馏水(20mL)中。
c.Au-Fe3O4NPs：将氯金酸(2mL，25mM)滴加到得到的L-半胱氨酸官能化的Fe3O4NPs悬浮液中，将混合物溶液搅拌3h，然后加入L-抗坏血酸(5mL，1wt％)混合，并将混合溶液再搅拌3h。最后，通过使用永磁体，将产物分离并用蒸馏水和乙醇洗涤数次，然后再分散在蒸馏水中。
d.P-Au-Fe3O4：加入底物肽溶液(5μL，200μM)，并在4℃下保持过夜，然后用磷酸盐缓冲液洗涤。
(2)信号单元(Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab)的制备
a.NetDNA@Ab的合成
①DNA单链退火：将单链DNA溶液(如：1-net、2-net、3-net、4-net或5-net)升温到95℃，5min，逐渐冷却到20℃，并于20℃保持1h，以得到理想的二级结构。
②取有-NH2结构的4-net或5-net(0.5μL，20μM)，加入乙酰基抗体(Ab)溶液(1μL，10-2mg/mL)，同时加入EDC/NHS偶联试剂(1μL，100μM/10μM，pH6.0)，室温下震摇1h。处理好的4-net和5-net混合均匀，在95℃下水浴反应5min，然后4℃下迅速降温，使之形成双链结构。
③将1-net(0.5μL，20μM)、2-net(0.5μL，20μM)、3-net(0.5μL，20μM)、TM缓冲液(7μL)、TCEP(1μL，30mM)加入到②溶液中，总体积为10μL，在95℃下，反应5min。在PCR中逐渐冷却至20℃，并在该温度下孵育2h，以得到理想的二级结构。
④制备TdT反应液：1μL蒸馏水、3μL TdT缓冲液、dTTP(3μL，10mM)、TdT(3μL，10U/mL)，总体积为20μL。将TdT反应液混合均匀加入③溶液中，37℃水浴1h。
b.Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab合成
再取Ru(phen)3Cl2·H2O(5μL，20mM)的PBS(0.1M，7.4)溶液，与NetDNA@Ab溶液混合均匀，总体积25μL，4℃冰箱储存备用。
(3)传感器的制备
MGCE：为获得镜面状表面，用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉末仔细轻柔地抛光MGCE，并分别用水和乙醇超声冲洗3min，然后在室温下用N2干燥MGCE。
PAc-Au-Fe3O4/MGCE：体积为5μL的捕获单元在MGCE表面覆盖1min，得到P-Au-Fe3O4/MGCE，然后用磷酸盐缓冲液冲洗表面。之后，将电极浸入1mM巯基己醇溶液中30min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗表面。之后将HAT p300反应液(总体积200μL，涉及不同浓度的HAT p300、500μMAc-CoA和缓冲液)。滴到电极表面并在30℃下孵育80min，用磷酸盐缓冲液洗涤电极缓缓除去过量的试剂，标记为PAc-Au-Fe3O4/MGCE。
Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab/PAc-Au-Fe3O4/MGCE：取信号单元(Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab)5μL滴涂于PAc-Au-Fe3O4/MGCE，37℃静置30min，传感器不使用时，储存于4℃冰箱中。
分别检测以上三种电极的电化学发光响应，结果如图1，制得的传感器Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab/PAc-Au-Fe3O4/MGCE相比于其它修饰电极，发光信号明显，证明传感器制备成功。
实施例2可行性实验
制备传感器的过程中，同具体实施例1，探究乙酰化反应中，Ac-CoA、多肽(peptide)及乙酰转移酶三种反应物仅有一种存在或者三缺一时，制得的传感器与三种反应物同时存在时制得的传感器的电化学发光响应对比，结果如图2，证明三种反应物缺一不可，也证明传感器可用于对HAT p300活性的分析检测。
实施例3HAT p300活性检测
传感器的制备过程同具体实施例1，在HAT p300酶活检测时，乙酰化反应中，控制HAT p300的终浓度为(0、0.006、0.01、0.02、0.06、0.2、0.6、2、6、20、60、200、600nM)，然后用于制备传感器。记录传感器在PBS(0.1M，pH 7.0)中的电化学发光响应，根据实验结果，获得一系列不同浓度HAT p300对应的电化学发光响应曲线，建立电化学发光响应信号大小与HAT p300浓度对数之间的线性关系。实验结果如图3所示，说明随着HAT p300浓度增大，传感器的电化学发光响应越明显，线性相关方程为y＝37241gCp300+8355，R2＝0.9965，线性范围为0.006～60nM，检测限为1pM，说明传感器对HAT p300活性可实现高灵敏检测。
实施例4特异性检测
选择性和抗干扰性实验中HAT p300及其他酶的浓度均为60nM，所用到的其他酶的缩写如下：乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱氧化酶(ChOx)、尿酸酶(Uricase)、胆固醇氧化酶(Cho)、蛋白激酶(PK)、碱性磷酸酶(ALP)。
按上述实施例1的传感器制备步骤，乙酰化反应中，用其他相同浓度的酶代替HATp300，制备得到传感器。结果如图4所示，与HAT p300对比，传感器对其他酶的电化学发光响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于HAT p300的检测有很好的选择性。
按上述实施例1的传感器制备步骤，乙酰化反应中，其他相同浓度的酶与HAT p300同时存在，制备得到传感器。结果如图5所示，其他酶的加入基本没有影响传感器的电化学发光响应，说明传感器对于HAT p300的检测有很好的抗干扰性。
实施例5抑制剂检测
HAT p300抑制剂筛选检测时，按上述实施例1的传感器制备步骤，乙酰化反应中，HAT p300的终浓度为60nM，控制漆树酸的终浓度为(0、1、2、5、8、10、20、50、80、100、200、500、800μM)或C646的终浓度为(0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500μM)，然后用于制备传感器。记录传感器在PBS(0.1M，pH 7.0)中的电化学发光响应，根据实验结果，获得一系列不同浓度抑制剂对应的电化学发光响应曲线，建立电化学发光响应信号大小与抑制剂浓度对数之间的关系。实验结果如图6和图7所示，漆树酸和C646的半抑制浓度分别为21.1μM和4.6μM。说明两种抑制剂对HAT p300均有良好的抑制效果。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.一种基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)捕获单元P-Au-Fe3O4的制备
a.Fe3O4NPs：将2～10g FeCl3·6H2O和5～50g乙酸钠在搅拌下溶解在20～200mL乙二醇中，然后将所得溶液转移到聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中并密封以在180～250℃下加热，反应4～12h后，将高压釜冷却至室温，将得到的黑色磁铁矿用乙醇彻底洗涤，并在45～80℃下真空干燥；
b.L-半胱氨酸官能化Fe3O4NPs：在超声下用2～12mL浓度为0.1～2M的HCl水溶液预处理5～30mg Fe3O4NPs 3～18min，然后用永久磁铁回收磁性NPs，用蒸馏水彻底洗涤数次，再分散于5～15mL浓度为2～20g/L的L-半胱氨酸水溶液的混合物中，超声处理0.5～2h，随后，通过永磁体分离产物并用蒸馏水洗涤，并再分散于8～30mL蒸馏水中；
c.Au-Fe3O4NPs：将1～4mL浓度为10～40mM的氯金酸滴加到得到的L-半胱氨酸官能化的Fe3O4NPs悬浮液中，将混合物溶液搅拌1～5h，然后加入1～10mL浓度为0.5～1.5wt％的L-抗坏血酸混合，并将混合溶液再搅拌1～5h，最后，通过使用永磁体，将产物分离并用蒸馏水和乙醇洗涤数次，然后再分散在蒸馏水中；
d.P-Au-Fe3O4：加入2.5～7.5μL浓度为50～500μM的底物肽溶液，并在4℃下保持过夜，然后用磷酸盐缓冲液洗涤；
(2)信号单元Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab的制备
a.NetDNA@Ab的合成
①DNA单链退火：将单链DNA溶液升温到85～98℃，2～15min，逐渐冷却到18～25℃，并于18～25℃保持0.5～1.5h，以得到二级结构；
所述单链DNA溶液中，DNA序列选自如下之一：
1-net：
TGT TGA TAG TCT AGA ACA TGA AAA GAT TG GG ATA TAG TAT AAG GAT；
2-net：
TGT TGA TAG TCT AGA ATC CTT ATA CTA TAT CC CAC CTG ACT CCT GAG GAG AAG；
3-net：
TGT TGA TAG TCT AGA CTT CTC C AC CCC CCC AGG AGT CAG GTG CA ATC TTT TCATGT；
4-net：H2N-ATC GCA TCT AGA CTA TCA ACA ACT AGA TAC ATA CAG；
5-net：H2N-ATC GCA TCT AGA CTA TCA ACA CTG TAT GTA TCT AGT；
②取0.2～1.5μL浓度为10～30Mm的有-NH2结构的4-net或5-net，加入0.2～1.8μL的浓度为10-3～10-1mg/mL乙酰基抗体Ab溶液，同时加入EDC/NHS偶联试剂，室温下震摇0.5～3h，处理好的4-net和5-net混合均匀，在88～98℃下水浴反应2～20min，然后2～6℃下迅速降温，使之形成双链结构；其中所述EDC/NHS偶联试剂总用量为0.3～2μL，浓度分别为30～300μM/3～30μM，pH＝6.0；
③将0.2～1.2μL的浓度为5～35μM的1-net、0.2～1.2μL的浓度为5～35μM的2-net、0.2～1.2μL的浓度为5～35μM的3-net、1～7μL TM缓冲液、0.5～2μL的浓度为10～40mM的TCEP加入到②溶液中，总体积为10μL，在85～97℃下，反应3～10min，在PCR中逐渐冷却至18～28℃，并在该温度下孵育1～3h，以得到二级结构；
④制备TdT反应液：0.5～3μL蒸馏水、1～6μL TdT缓冲液、2～6μL的浓度为2～50mM的dTTP、2～6μL的浓度为1～50U/mL的TdT，总体积为20μL，将TdT反应液混合均匀加入③溶液中，29～40℃水浴0.5～2h；
b.Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab合成
再取1～15μL的浓度为5～100mM Ru(phen)3Cl2·H2O的PBS溶液，与NetDNA@Ab溶液混合均匀，总体积25μL，4℃冰箱储存备用；其中所述PBS溶液浓度为0.1M，pH＝7.4；
(3)传感器的制备
磁性玻碳电极MGCE：为获得镜面状表面，用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉末仔细轻柔地抛光MGCE，并分别用水和乙醇超声冲洗1～6min，然后在室温下用N2干燥MGCE；
PAc-Au-Fe3O4/MGCE：体积为2.5～7.5μL的捕获单元在MGCE表面覆盖0.5～5min，得到P-Au-Fe3O4/MGCE，然后用磷酸盐缓冲液冲洗表面；之后，将电极浸入0.1～2mM巯基己醇溶液中10～50min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗表面；之后将HAT p300反应液，滴到电极表面并在28～38℃下孵育60～120min，用磷酸盐缓冲液洗涤电极缓缓除去过量的试剂，标记为PAc-Au-Fe3O4/MGCE；其中所述HAT p300反应液总体积为200μL，涉及不同浓度的HAT p300，含有100～1000μM Ac-CoA和缓冲液；
Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab/PAc-Au-Fe3O4/MGCE：取信号单元Ru(phen)3 2+-NetDNA@Ab 2.5～7.5μL滴涂于PAc-Au-Fe3O4/MGCE，27～40℃静置10～50min，传感器不使用时，储存于4℃冰箱中；
所述TM缓冲液配制：20mM三羟甲基氨基甲烷Tris，50mM氯化镁MgCl2，pH 8.0。
2.一种基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器，其通过权利要求1所述方法制备获得。
3.根据权利要求2所述的基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的应用，其特征在于：应用于检测低浓度的乙酰转移酶HAT p300，检测限低至1pM。
4.根据权利要求2所述的基于DNA纳米网的美杜莎式p300电化学发光传感器的应用，其特征在于：应用于乙酰转移酶的抑制剂筛选，其中所述抑制剂为漆树酸和C646。
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|---|---|---|---|---|
| CN107101997A (zh) * | 2017-04-25 | 2017-08-29 | 青岛大学 | 一种用于乙酰转移酶活性检测的电化学发光传感器的构建 |
| CN108562738A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-21 | 宁波大学 | 一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器 |
| CN109613093A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-04-12 | 宁波大学 | 基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用 |
| CN110082403A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-08-02 | 宁波大学 | 基于金钯纳米花/石墨烯复合材料的组蛋白乙酰转移酶计时-电流传感器及其应用 |
-
2019
- 2019-10-14 CN CN201911010588.8A patent/CN110895260B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107101997A (zh) * | 2017-04-25 | 2017-08-29 | 青岛大学 | 一种用于乙酰转移酶活性检测的电化学发光传感器的构建 |
| CN108562738A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-21 | 宁波大学 | 一种检测组蛋白乙酰转移酶的电化学发光法拉第笼免疫传感器 |
| CN109613093A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-04-12 | 宁波大学 | 基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用 |
| CN110082403A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-08-02 | 宁波大学 | 基于金钯纳米花/石墨烯复合材料的组蛋白乙酰转移酶计时-电流传感器及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| A novel ECL method for histone acetyltransferases (HATs) activity analysis by integrating HCR signal amplification and ECL silver clusters;Yan Zou et al;《Talanta》;20190125;第198卷;39-44 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110895260A (zh) | 2020-03-20 |
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