CN110892265A - 通过荧光灵敏的流式细胞术检测白细胞来源的微泡 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于使用经标记抗体的混合物来表征微泡的方法。本发明还提供了可用于该目的的试剂盒。

Description

通过荧光灵敏的流式细胞术检测白细胞来源的微泡
相关申请
本申请要求保护2017年6月13日提交的美国临时申请No.62/519,059的权益。所述临时申请的全部内容出于所有目的在此通过引用并入。
技术领域
本发明涉及用于检测和表征微泡的组合物和方法。
背景技术
白细胞来源的微泡(Leukocyte-derived microvesicle，LMV)已被鉴定为多种疾病(例如心血管疾病、炎症和脓毒症)的重要生物标志物。因此，准确并及时地检测LMV对于心血管疾病的诊断、预防和治疗是重要的。流式细胞术是用于检测细胞结构的有用工具。然而，由于LMV的稀少性、小尺寸和低抗原密度，已显示该方法在检测LMV中存在困难。目前的流式细胞术方法还受到仪器灵敏度和高背景噪声的限制。
发明简述
本发明提供了用于表征微泡的方法和试剂盒。在一方面，本公开内容提供了用于表征微泡的方法，其包括用混合物(cocktail)对包含微泡的样品进行染色以形成经染色的微泡；通过流式细胞术测量经染色的微泡以获得信号组；以及当所测量微泡的信号组在信号区域内时，将经染色的微泡鉴定为白细胞来源的微泡。
在另一方面，本公开内容提供了试剂盒，其包含混合物，所述混合物包含针对HLADR、CD11c、CD66c、CD18和CD157中的至少一种的经标记的抗体。还提供了试剂盒，其包含混合物，所述混合物包含以下的至少一种：针对HLA DR和CD11c的第一组经标记的抗体，针对CD66c的第二组经标记的抗体，针对CD18和CD157的第三组经标记的抗体，以及针对TIA-1的第四组经标记的抗体。
在以下对实施方案及其附图的描述中以及从权利要求书中，本发明的其他特征和优点将变得更加明显。
附图简述
图1举例说明了微泡(microvesicle，MV)的产生和纯化程序。
图2A至2C示出了来自包含LMV的样品的流式细胞术分析的结果。样品用以下进行染色：PE标记的HLA DR抗体和FITC标记的膜联蛋白V(图2A)；PE标记的CD15抗体和FITC标记的膜联蛋白V(图2B)；或者PE标记的CD18抗体和FITC标记的膜联蛋白V(图2A)。
图3A示出了在用血浆连续稀释的样品中检测LMV。样品用PE标记的CD15抗体和FITC标记的膜联蛋白V进行染色。图3B示出了其中将双阳性LMV的量相对于每个样品的稀释因子绘图的图。
图4A示出了使用包括通过尺寸排阻色谱洗涤经染色的LMV以去除未结合的抗体的方法来检测LMV。图4B示出了通过对用不同抗体，即HLA-DR、CD45、CD66c、CD14、CD31、CD18、CD157、CD11C和CD15抗体中的每一种染色的样品引入洗涤步骤而在降低背景噪声上的改善。
图5A示出了在同一测定中使用PE标记的抗体CD 18、CD147和CD45抗体的组对LMV进行染色来检测LMV的结果。所述测定在无洗涤的条件下进行，即在流式细胞术分析之前，未使用尺寸排阻色谱去除未结合的抗体。图5B显示三抗体组合比单独使用三种抗体中的任何一种检出更高的LMV量，并且图5C显示来自使用三抗体组合进行的测定的平均荧光强度(mean fluorescent intensity，MFI)也略高于来自单独使用任何单独抗体进行的测定的MFI。
图6A和6B示出了来自在与图5A和5B中相同的条件下进行的测定的结果，不同之处在于其包括在流式细胞术分析之前使用尺寸排阻色谱去除未结合的抗体的洗涤步骤。与图5A和5B中的结果类似，三抗体组合比单独使用三种抗体中的任何一种检出更多的LMV。图6C显示三抗体组合还比单独使用三种抗体中的任何一种显著提高了MFI。
图7A至7C比较了来自使用Gallios与CytoFLEX分析的相同样品的LMV计数的结果。除用FITC标记的膜联蛋白V染色之外，样品还用PE标记的HLA DR抗体(图7A)或PE标记的CD11c(图7B)染色。图7C显示通过CytoFLEX检出的MV计数显著高于通过Gallios检出的MV计数。
发明详述
1.概述
本发明提供了在流式细胞术分析中使用一种或更多种抗体以期望的灵敏度和特异性来检测生物样品中的LMV的组合物、试剂盒和方法。在一些实施方案中，所公开的组合物、试剂盒和方法利用独特的抗体组、洗涤步骤和/或在检测荧光方面超灵敏的仪器来检测LMV。
2.定义
本文中所使用的“经标记的分子”是指与可在流式细胞术中鉴定的可检测标记物连接的分子。分子与可检测标记物之间的连接可以是直接或间接的。在一些优选实施方案中，分子与可检测标记物之间的连接是通过直接缀合形成的。
本文中所使用的术语“信号区域”是指流式细胞术图中的区域，来自表达目的标志物的MV的信号将落入其中。在一些情况下，标志物是MV上的分子(例如抗原)，其可被用于对MV进行染色的混合物的组分(例如抗体)识别。流式细胞术领域的技术人员可容易地确定每种标志物的信号区域，例如，通过将来自阳性对照(即已知表达标志物的样品)的结果与来自阴性对照(即未经染色的样品或已知不表达标志物的样品)的结果进行比较。
本文中所使用的术语“阳性”是指指示在MV中存在目的标志物的信号。
本文中所使用的术语“信号组”是指由混合物的与样品中的MV结合的组分产生的一组信号。
术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体和嵌合抗体，例如通过组合诱变和噬菌体展示产生。术语“抗体”还包括抗体的模拟物或肽模拟物。肽模拟物是基于或来源于肽和蛋白质的化合物。本发明的肽模拟物通常可通过使用非天然氨基酸、构象限制、电子等排取代(isosteric replacement)等对已知肽序列进行结构修饰来获得。在一些实施方案中，抗体的片段可用于代替抗体。
3.具体实施方案
样品
本发明可用于表征样品中微泡的来源。用于通过本发明的方法来测定LMV的存在的样品包括例如，人和动物体液，例如全血、血清、血浆、脑脊液、痰、支气管冲洗液、支气管抽吸物、尿、淋巴液，以及呼吸道、肠道和泌尿生殖道的多种外分泌物、眼泪、唾液、乳、白细胞、骨髓瘤等；生物流体，例如细胞培养上清液；组织样本；胸膜液或匀浆。
白细胞
白细胞(leukocyte)通常被称为白细胞(white blood cell)，通常基于染色时的形态学和着色特征分为数类：粒细胞(包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、单核细胞和淋巴细胞。粒细胞和单核细胞二者均属于骨髓细胞的类别。
微泡(MV)
MV是从静息细胞或受刺激细胞的质膜脱落的100nm至1000nm的质膜片段。其用于转运蛋白质、RNA和包含生物学信息的其他分子。其还可从细胞去除错误折叠的蛋白质、细胞毒剂和代谢废物，并且在细胞间通讯中发挥重要作用。
白细胞来源的MV是从白细胞的质膜脱落的MV。在一些实施方案中，LMV来源于骨髓细胞，例如来自粒细胞或单核细胞。在一些实施方案中，LMV来源于基础条件或刺激条件下的白细胞。LMV反映了其起源的白细胞的抗原含量并且可以是潜在的生物标志物，特别是对于患有动脉粥样硬化、糖尿病或脓毒症的患者。因此，检测和表征来源于白细胞的特定亚型和特定条件的LMV具有重要的临床意义。
混合物
本文中公开了可用于检测LMV的混合物。所述混合物包含HLA DR抗体、CD11c抗体、CD18抗体、CD157抗体、膜联蛋白V和TIA-1抗体中的一种或更多种，每一种用可在流式细胞术中检测的标记物(如下文所讨论的)标记。在一些实施方案中，所述混合物包含第一组、第二组和/或第三组。第一组包含各自用第一标记物标记的HLA DR的抗体和CD11c的抗体；第二组包含用第二标记物标记的CD66c的抗体；并且第三组包含CD18的抗体和CD157的抗体。在一些实施方案中，第二组还包含CD15的经标记的抗体。在一些实施方案中，第三组还包含CD45的经标记的抗体。在一些实施方案中，混合物还包含用第四标记物标记的膜联蛋白V。膜联蛋白V识别磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)。在完整细胞中，PS位于质膜的内小叶上。从完整细胞脱落的微泡，并且其中的一些具有暴露的并可接近膜联蛋白V的PS。因此，膜联蛋白V可用于将所有相关的MV与非特异性染色的颗粒、未活化的血小板和碎片区分开。TIA-1是存在于受刺激细胞表面的标志物。在一些实施方案中，用于检测LMV的混合物还包含用第五标记物标记的TIA-1的抗体。
在一些情况下，检测LMV的方法包括用包含来自第一组的至少一种抗体和经标记的膜联蛋白V的混合物对样品进行染色，条件是第一标记物(用于标记第一组抗体)与第四标记物(用于标记膜联蛋白V)是可区分的。如果LMV对被来自第一组的至少一种抗体识别的标志物和被膜联蛋白V识别的标志物呈阳性，则将该LMV指定为单核细胞来源的。在一些实施方案中，第一组经标记的抗体包含HLA-DR、CD44、CD31、CD45、CD11b、CD157和CD18抗体。在一些实施方案中，来自第一组的至少一种抗体是HLA DR和/或CD11c抗体。
在一些情况下，所述方法包括用包含来自第二组经标记的抗体的至少一种抗体和经标记的膜联蛋白V的混合物对样品进行染色，条件是第二标记物(用于标记第二组抗体)和第四标记物(用于标记膜联蛋白V)是可区分的。如果LMV对被来自第二组的至少一种抗体识别的标志物和被膜联蛋白V识别的标志物呈阳性，则将该LMV指定为粒细胞来源的。在一些实施方案中，选自第二组的所述至少一种抗体是CD15和/或CD66c抗体。在一些实施方案中，第二组包含CD15、CD18、CD24、CD66c、CD59、CD157、CD66b、CD11b、CD45、CD65和乳铁蛋白抗体。
在一些情况下，所述方法包括用包含来自第三组经标记的抗体的至少一种抗体和经标记的膜联蛋白V的混合物对样品进行染色，条件是第三标记物(用于标记第三组抗体)和第四标记物(用于标记膜联蛋白V)是可区分的。如果LMV对被来自第三组的至少一种抗体识别的标志物和被膜联蛋白V识别的标志物呈阳性，则将该LMV指定为骨髓来源的。在一些实施方案中，第三组包含CD18、CD157和CD45抗体。
在一些情况下，所述方法包括用包含经标记的TIA-1抗体和经标记的膜联蛋白V的混合物对样品进行染色，条件是第五标记物(用于标记TIA-1)和第四标记物(用于标记膜联蛋白V)是可区分的。如果LMV对被TIA-1识别的标志物和被膜联蛋白V识别的标志物呈阳性，则将该LMV指定为来源于活化细胞。
在一些情况下，所述方法包括用包含经标记的膜联蛋白V和来自以下项中的两项或更多项的抗体的混合物对包含LMV的样品进行染色：i)第一组，ii)第二组，iii)第三组，和iv)TIA-1抗体，条件是用于染色的抗体上的标记物彼此可区分。例如，方法可包括用来自第一组的至少一种抗体、一种TIA-1抗体、和膜联蛋白V(各自用彼此可区分的标记物标记)对样品进行染色；如果LMV对所有三种标志物呈阳性，则可将该LMV指定为来源于活性单核细胞。
标记物
本发明中使用的标记物可以是可通过流式细胞术检测的任何标记物。标记物的非限制性实例包括下表1中列出的那些。
表1.用于标记抗体的一些示例性标记物。
Figure BDA0002364145600000061
可用于标记抗体的其他标记物包括量子点。量子点是具有宽吸收谱并因此可被一系列不同波长激发的荧光纳米晶体。其发射波长也是变化的，并且可从蓝色至深红色。本领域技术人员可根据测定的目的容易地确定使用哪种类型的标记物。在一些实施方案中，用于标记抗体的第一、第二、第三标记物中的至少一种是PE，并且用于标记膜联蛋白V的第四标记物是FITC。
方法
在一些实施方案中，本公开内容提供了表征MV的方法，所述方法包括用混合物对包含MV的样品进行染色以形成经染色的MV，测量经染色的MV，以及当所测量微泡的信号组在信号区域内时将经染色的微泡鉴定为白细胞来源的微泡。如上所述，用于对样品进行染色的混合物可包含一种或更多种经标记的抗体和/或经标记的膜联蛋白V。在一个实施方案中，通过流式细胞术测量经染色的MV。
在一些实施方案中，通过使用ficoll梯度法分离全血，随后进行超滤以浓缩MV来制备包含MV的样品。在一些实施方案中，在超滤之后还使用尺寸排阻色谱对MV进行纯化。
在一些实施方案中，可通过将经标记的抗体和/或膜联蛋白V添加至样品并将混合物孵育一段时间(通常20分钟至1小时)来对样品进行染色。孵育通常在室温(例如，18℃至25℃，例如20℃至25℃)下进行。
在一些实施方案中，所述方法还包括在测量来自经染色的MV的信号之前，从经染色的MV分离未结合的物质(例如抗体)的步骤。分离未结合的物质可包括在具有含钙缓冲剂的尺寸排阻色谱柱上洗涤经染色的混合物。可用于分离的合适的尺寸排阻色谱(SEC)柱包括可从Izon商购获得的qEV。在一些实施方案中，含钙缓冲剂中钙的量可为0.5至2.5mM，例如1至2mM。在一个实施方案中，含钙缓冲剂是膜联蛋白V结合缓冲剂，其可容易地从多种商业来源获得。对于制备在一些实施方案中，SEC柱上负载有琼脂糖基质和膜联蛋白V结合缓冲剂。然后将经染色的MV加载到柱上以分离未结合的物质。然后使用洗脱缓冲剂从柱上洗脱经染色的MV。优选地，洗脱缓冲剂包含钙。在一个实施方案中，洗脱缓冲剂是膜联蛋白结合缓冲剂。
如上所述在尺寸排阻色谱柱上洗涤经染色的混合物可显著降低荧光背景噪声，并因此可检出更多经染色的LMV，包括产生低信号的那些。改善的程度可根据用于染色的抗体的类型以及抗体的浓度而变化。在一些实施方案中，在流式细胞术分析之前包括在SEC柱上洗涤经染色的混合物的步骤可将检出的LMV的计数提高10％至330％，例如50％至330％、90％至200％、或170％至210％。在一个具体实施方案中，如图4A所示，所述方法包括用经标记的CD45抗体和经标记的膜联蛋白V对样品进行染色，以及通过在SEC柱上洗涤经染色的混合物来分离未结合的物质；与未使用用SEC的洗涤步骤的方法相比，检出的骨髓来源的LMV的计数提高约150％。在另一个具体实施方案中，如图4B所示，所述方法使用经标记的HLADR和经标记的膜联蛋白V对样品进行染色，以及通过在SEC柱上洗涤经染色的混合物来分离未结合的物质；与未使用洗涤步骤的方法相比，检出的单核细胞来源的LMV的计数提高约100％。
流式细胞术
流式细胞术可用于在流体通过流式细胞仪内部的一个或多个激光时测量和表征流体内的细胞和结构(例如，MV)。经标记的MV在被特定激光激发并发射之后发出不同波长的光。流式细胞仪记录和/或分析相对荧光、细胞大小和相对粒度，并因此可特别用于生物标志物检测，例如MV上的标志物。
本文中公开的方法和试剂盒可用于任何流式细胞仪以检测经染色的LMV。流式细胞仪的非限制性实例包括Gallios、CytoFLEX和Navios。由于LMV的稀少性和LMV上抗原性位点的低密度，优选具有高荧光检测灵敏度的流式细胞仪，例如来自Beckman Coulter的CytoFLEX。如图7A至7C中所示，与Gallios相比，当使用cytoFLEX检测时观察到LMV计数显著提高。
试剂盒
本发明还提供了试剂盒，其包含混合物，所述混合物包含针对HLA DR、CD11c、CD66c、CD18和CD157中的至少一种的经标记的抗体。在一些实施方案中，试剂盒包含混合物，所述混合物包含以下的至少一种：i)针对HLA DR和CD11c的第一组经标记的抗体；ii)针对CD66c的第二组经标记的抗体；iii)针对CD18和CD157的第三组经标记的抗体；以及iv)针对TIA-1的第四组经标记的抗体。在一些实施方案中，第二组还包含针对CD15的经标记的抗体，并且其中第三组还包含针对CD45的经标记的抗体。在一些实施方案中，第一组中的每种抗体用第一标记物标记，其中第二组中的每种抗体用第二标记物标记，其中第三组中的每种抗体用第三标记物标记，并且其中第四组中的每种抗体用第四标记物标记。在一些实施方案中，混合物还包含用第五标记物标记的膜联蛋白V。
在一些实施方案中，试剂盒还包含洗脱缓冲剂和/或关于如何使用该试剂盒的说明书。
系统
本发明还提供了系统，其包含：用于用混合物对包含微泡的样品进行染色以形成经染色的微泡的组件，用于测量经染色的微泡的组件，以及用于当所测量微泡的信号组在信号区域内时将经染色的微泡鉴定为白细胞来源的微泡的组件。在一些实施方案中，用于测量经染色的微泡的组件包括流式细胞仪。在一些实施方案中，系统的一个或更多个组件包括一个或更多个计算机处理器，其执行指令以实施如上所述的表征微泡的任何方法的步骤。
实施方案
以下是本公开内容的一些示例性实施方案。
1.表征微泡的方法，其包括：
用混合物对包含微泡的样品进行染色以形成经染色的微泡；
通过流式细胞术测量经染色的微泡以获得信号组；以及
当所测量微泡的所述信号组在信号区域内时，将所述经染色的微泡鉴定为白细胞来源的微泡。
2.实施方案1所述的方法，其中所述混合物包含针对HLA DR、CD11c、CD66c、CD18和CD157中的至少一种的经标记的抗体。
3.实施方案2所述的方法，其中所述混合物包含经标记的膜联蛋白V。
4.实施方案2或3所述的方法，其中所述混合物包含以下的至少一种：
i)第一组经标记的抗体，其包含各自用第一标记物标记的针对HLA DR的抗体和针对CD11c的抗体；
ii)第二组经标记的抗体，其包含用第二标记物标记的针对CD66c的抗体；
iii)第三组经标记的抗体，其包含各自用第三标记物标记的针对CD18的抗体和针对CD157的抗体。
5.实施方案4所述的方法，其中第二组还包含针对CD15的经标记的抗体，并且其中所述第三组还包含针对CD45的经标记的抗体。
6.实施方案4所述的方法，其中所述经标记的膜联蛋白V用第四标记物标记。
7.实施方案5或6所述的方法，其中所述混合物还包含用第五标记物标记的针对TIA-1的抗体。
8.实施方案5或6所述的方法，其中鉴定步骤包括：当所述信号组指示所述第一组中的至少一种抗体的结合时，将所述微泡指定为单核细胞来源的。
9.实施方案5或6所述的方法，其中鉴定步骤包括：当所述信号组指示所述第二组中的至少一种抗体的结合时，将所述微泡指定为粒细胞来源的。
10.实施方案5或6所述的方法，其中鉴定步骤包括：当所述信号组指示所述第三组中的至少一种抗体的结合时，将所述微泡指定为骨髓来源的。
11.实施方案7所述的方法，其中鉴定步骤包括：当所述信号组指示TIA-1的抗体的结合时，将所述微泡指定为来源于活化细胞。
12.实施方案1所述的方法，其还包括从所述经染色的微泡分离未结合的物质。
13.实施方案12所述的方法，其中分离未结合的物质的步骤包括在负载有含钙缓冲剂的尺寸排阻色谱柱上洗涤经染色的混合物。
14.试剂盒，其包含混合物，所述混合物包含针对HLA DR、CD11c、CD66c、CD18和CD157中的至少一种的经标记的抗体。
15.试剂盒，其包含混合物，所述混合物包含以下的至少一种：
针对HLA DR和CD11c的第一组经标记的抗体；
针对CD66c的第二组经标记的抗体；
针对CD18和CD157的第三组经标记的抗体；以及
针对TIA-1的第四组经标记的抗体。
16.实施方案15所述的试剂盒，其中所述第二组还包含针对CD15的经标记的抗体，并且其中所述第三组还包含针对CD45的经标记的抗体。
17.实施方案15或16所述的试剂盒，其中所述第一组中的每种抗体用第一标记物标记，其中所述第二组中的每种抗体用第二标记物标记，其中所述第三组中的每种抗体用第三标记物标记，并且其中所述第四组中的每种抗体用第四标记物标记。
18.实施方案14至17中任一项所述的试剂盒，其中所述混合物还包含用第五标记物标记的膜联蛋白V。
19.实施方案14至18中任一项所述的试剂盒，其还包含洗脱缓冲剂。
20.用于表征微泡的系统，其包含一个或更多个处理器和偶联至一个或更多个处理器的存储器，所述存储器编码有一组指令，所述指令被配置成执行包括以下步骤的方法：
从流式细胞仪获得经混合物染色的微泡的测量，以及
当所测量微泡的所述信号组在信号区域内时，将经染色的微泡鉴定为白细胞来源的微泡。
21.用于表征微泡的系统，其包含一个或更多个处理器和偶联至一个或更多个处理器的存储器，所述存储器编码有一组指令，所述指令被配置成执行实施方案1至13中任一项所述的方法中的一个或更多个方法步骤。
IV.实施例
通过参照以下实施例来描述本发明，这些实施例是通过举例说明的方式提供的，并且不旨在以任何方式限制本发明。利用了本领域公知的标准技术或以下具体描述的技术。
实施例1.方法
图1中举例说明了用于产生和纯化单核细胞和粒细胞微泡的程序。简单地说，将新鲜全血通过ficoll梯度然后免疫-磁性分离来分离，以提取单核细胞和粒细胞。使用该方法获得的单核细胞和粒细胞的纯度大于94％。然后，将细胞在补充有LPS的培养基中孵育24小时时间段以产生单核细胞，以及在补充有fMLP的培养基中孵育24小时时间段以产生粒细胞。然后收集来自细胞培养的上清液，并在连续离心之后，使用超滤浓缩MV并使用尺寸排阻色谱纯化MV来对MV进行纯化。将获得的MV重悬于PBS缓冲剂中，进行等分并在-80℃下冷冻用于研究。
实施例2.LMV的抗体筛选
将从实施例1制备的MV用于筛选抗体组。将表2中列出的每种白细胞特异性抗体与膜联蛋白V组合用于对样品进行染色。膜联蛋白V可区分MV与完整的细胞，用于对MV进行染色。在该实验中，每种抗体与PE缀合并且膜联蛋白V与FITC缀合。对所有抗体进行5种不同浓度的滴定。为了避免聚集，在使用之前将抗体以13,000g离心2分钟。另外，对于每种浓度使用荧光匹配的同种型对照。对于每种抗体，计算总的膜联蛋白V阳性MV群体中PE和膜联蛋白V双阳性群体的百分比，并且将20％认为是截断值-如果百分比是20％或更高，则抗体可用于检测MV群体。
如表2中所示，显示11种抗体(即，CD15、CD18、CD24、CD66c、CD59、CD157、CD66b、CD11b、CD45、CD65、乳铁蛋白的抗体)符合用于检测粒细胞来源的MV的标准，并且7种抗体(即，HLA-DR、CD44、CD31、CD45、CD11b、CD157、CD18的抗体)符合用于检测单核细胞来源的MV的标准。基于检出的LMV的百分比，从高到低对抗体进行排序。表3中示出了可用于检测单核细胞来源的MV的表现最好的抗体，并且表4中示出了可用于检测粒细胞来源的MV的表现最好的抗体。表5中示出了可用于检测骨髓MV(即，单核细胞来源的MV和粒细胞来源的MV二者)的抗体。已知这些抗体识别白细胞不同亚群上的特异性标志物；例如，HLA-DR是单核细胞的标志物，CD15是粒细胞的标志物，而CD18是单核细胞和粒细胞二者的标志物。图2A示出了对HLA DR抗体染色和膜联蛋白V染色二者均呈阳性的群体，其对应于单核细胞来源的MV。图2B示出了对CD15抗体染色和膜联蛋白V染色二者均呈阳性的群体，其对应于粒细胞来源的MV。图2C示出了对CD18抗体染色和膜联蛋白V染色二者均呈阳性的群体，其对应于骨髓来源的MV。
表2可用于检测LMV上的标志物的抗体的筛选
标志物 Mono NS Mono S Gran NS Gran S
CD18 49，3 57，7 52，9 47，6
CD45 39，1 45，0 25，4 26，7
HLA-DR 38，6 43，0 0，8 0，6
CD157 37，9 41，7 30，0 27，2
CD31 27，9 24，3 11，0 12，2
CD44 24，7 27，8 9，7 10，3
CD11b 21，9 17，3 25，8 24，0
CD36 17，0 16，1 5，5 5，4
CD11c 13，6 15，2 4，0 4，3
CD40 11，4 6，6 4，0 3，9
CD55 9，4 9，2 8，9 8，1
CD33 9，2 8，9 5，5 5，4
CD15 7，4 8，0 81，0 79，1
CD59 6，5 6，2 41，2 37，9
CD32 6，5 5，3 17，9 19，6
CD66b 6，2 4，8 27，9 26，5
CD29 6，2 7，9 1，3 1，7
CD65 5，7 3，9 21，7 22，7
CD11a 5，5 8，9 2，5 2，7
CD49d 4，8 4，9 7，1 5，2
CD13 4，7 6，2 8，9 8，4
CD66c 4，7 4，3 50，8 52，8
CD24 4，7 5，2 52，4 48，2
CD69 4，1 2，4 3，0 2，3
CD86 3，9 4，4 1，9 1，9
CD58 3，5 3，5 2，9 4，1
CD85j 3，5 3，7 4，6 2，8
CD328 3，1 2，4 1，7 2，4
CD14 2，6 2，4 1，7 1，9
TIA-1 2，2 1，7 12，7 23，3
CD16 2，2 1，5 19，0 17，3
CD10 2，1 1，5 7，6 13，3
CD48 2，1 2，3 1，0 0，7
CD85k 2，0 0，9 0，4 0，6
CD184 2，0 1，7 2，0 2，3
CD300a 1，9 2，5 1，9 2，5
CD116 1，9 1，8 0，7 1，2
CD43 1，8 2，5 6，1 7，6
CD26 1，7 1，1 2，5 1，9
CD126 1，5 1，3 1，9 1，1
乳铁蛋白 1，5 1，7 20，5 23，9
CD120b 1，5 1，4 2，0 1，4
CD64 1，4 1，0 1，2 0，9
CD54 1，4 0，9 0，4 0，4
CD90 1，4 1，2 0，9 1，2
CD85d 1，3 1，1 1，7 1，5
CD62P 1，3 0，8 0，7 0，9
CD166 1，0 0，8 1，1 0，8
CD106 0，9 0，3 0，5 0，3
CD62L 0，9 0，2 0，8 0，3
OSCAR 0，7 1，0 0，9 0，9
CD105 0，6 0，4 0，3 0，4
CD123 0，6 0，8 1，1 1，1
CD122 0，5 0，6 0，5 0，5
CD109 0，4 1，0 1，4 1，0
注意：“Mono”代表来源于单核细胞的MV。“Gran”代表来源于粒细胞的MV。“NS”代表来源于非刺激或基础条件下的细胞的MV。“S”代表来源于刺激条件下的细胞的MV。在该表2至5中的数值代表总的膜联蛋白V阳性MV群体中PE和膜联蛋白V双阳性MV群体的百分比。
表3检测单核细胞来源的MV上的标志物的表现最好的抗体
标志物 Mono NS Mono S Gran NS Gran S
HLA-DR 38.6 43.0 0.8 0.6
CD11c 13.6 15.2 4.0 4.3
表4检测粒细胞来源的MV上的标志物的表现最好的抗体
标志物 Mono NS Mono S Gran NS Gran S
CD15 7.4 8.0 81.0 79.1
CD66c 4.7 4.3 50.8 52.8
表5检测骨髓来源的MV的模范抗体
标志物 Mono NS Mono S Gran NS Gran S
CD18 49.3 57.7 52.9 47.6
CD157 37.9 41.7 30.0 27.2
CD45 39 45 25 27
为了验证所述测定并评估其线性，将使用实施例1中所述的方法获得的MV在不含MV的血浆中从1∶2至1∶32进行连续稀释。使用计数珠进行MV的绝对量化。将包含MV的样品用PE标记的CD15抗体和FITC标记的膜联蛋白V进行染色，并且通过流式细胞术进行分析(图3A)。用HLA DR和CD66c抗体进行类似的实验。结果表明，即使当样品中MV的浓度非常低，例如小于50MV/μl，例如30至50MV/μl，使用HLA DR、CD66c和CD15抗体中的每一种的测定也是线性的(图3B)。
实施例3.用于洗涤经染色的MV的尺寸排阻色谱
将用如实施例2中鉴定的特异性标志物的抗体标记的样品与膜联蛋白V结合缓冲剂(其包含钙)一起加载到具有琼脂糖基质的尺寸排阻色谱(SEC)柱上。结果表明，总的来说，在SEC柱上洗涤经染色的混合物降低了背景荧光，如通过检出的MV计数提高和信号的平均荧光提高所反映的；检出的MV的百分比可提高10％至200％(参见图4B)。提高的程度可取决于染色中所使用的抗体的固有特性和浓度以及MV上的抗原密度而变化。例如，在一个实验中，与未洗涤样品相比，对于使用SEC柱洗涤的经CD 66c染色的样品观察到背景噪声仅略微降低并且双阳性MV计数仅略微提高。在另一个实验中，与未进行洗涤的类似染色的样品相比，用CD45或HLA DR染色的样品的由洗涤步骤引起的检出的LMV和MFI的提高是显著的(图4A)。
实施例4.用于LMV检测的抗体组合
在该实施例中，在相同测定中使用先前鉴定为单独适合用于检测某些MV群体的多种抗体的组合。实验的目的是确定与单独使用的每种抗体相比，抗体的组合是否可以提高测定的灵敏度。在一个实验中，将各自用PE标记并且先前显示出能够检测骨髓来源的MV的CD18、CD157和CD45(参见表5)在同一测定中组合并且用于对样品进行染色。在该实验中，没有洗涤步骤，即没有使用尺寸排阻色谱洗涤经染色的混合物。图5A至5C示出了在这样的无洗涤的条件下，与单独使用的三种抗体中的任何一种相比，三抗体组合检出更高的MV百分比并且产生略高的平均荧光强度(MFI)。在另一个实验中，将相同的三抗体组合用于对包含MV的样品进行染色，并且随后用SEC柱洗涤经染色的混合物，然后进行流式细胞术分析。结果表明，三抗体组合检出更高的MV百分比，并且产生了显著更高的MFI(图6A至6C)。
实施例5.用于LMV检测的荧光灵敏细胞仪
该实施例中的实验是比较通过不同的流式细胞仪Gallios和CytoFLEX在同一样品中检测MV。与Gallios相比，CytoFLEX具有在检测荧光方面超灵敏的优势，尤其是具有PE通道。另外，CytoFLEX使用限制FITC与PE通道之间的信号传播的黄绿色激光。
在一个实验中，用PE标记的HLA DR抗体和FITC标记的膜联蛋白V对包含MV的样品进行染色。与使用Gallios相比，当使用CytoFLEX分析时双阳性MV计数的计数高出超过40％(图7A)。在另一个实验中，用PE标记的CD11c抗体和FITC标记的膜联蛋白V对包含MV的样品进行染色。当使用Gallios进行分析时，双阳性群体非常低且难以检出，而且PE通道的MFI也非常低。当使用CytoFLEX进行分析时，PE通道信号的MFI显著提高，并且检出大量的双阳性群体(图7B)。图7C示出了与使用Gallios的分析相比，当使用CytoFLEX对包含MV的样品进行分析时，MV计数在统计学上显著提高。用HLA-DR、CD45、CD66c、CD14、CD31、CD18、CD157、CD11C和CD15抗体中的每一种对样品进行染色。

Claims (20)

1.表征微泡的方法，其包括：
用混合物对包含微泡的样品进行染色以形成经染色的微泡；
通过流式细胞术测量所述经染色的微泡以获得信号组；以及
当所测量微泡的信号组在信号区域内时，将所述经染色的微泡鉴定为白细胞来源的微泡。
2.权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含针对HLA DR、CD11c、CD66c、CD18和CD157中至少一种的经标记的抗体。
3.权利要求2所述的方法，其中所述混合物包含经标记的膜联蛋白V。
4.权利要求2或3所述的方法，其中所述混合物包含以下的至少一种：
i)第一组经标记的抗体，其包含各自用第一标记物标记的针对HLA DR的抗体和针对CD11c的抗体；
ii)第二组经标记的抗体，其包含用第二标记物标记的针对CD66c的抗体；
iii)第三组经标记的抗体，其包含各自用第三标记物标记的针对CD18的抗体和针对CD157的抗体。
5.权利要求4所述的方法，其中第二组还包含针对CD15的经标记的抗体，并且其中所述第三组还包含针对CD45的经标记的抗体。
6.权利要求4所述的方法，其中所述经标记的膜联蛋白V是用第四标记物标记的。
7.权利要求5或6所述的方法，其中所述混合物还包含用第五标记物标记的TIA-1的抗体。
8.权利要求5或6所述的方法，其中鉴定步骤包括：当所述信号组指示所述第一组中的至少一种抗体的结合时，将所述微泡指定为单核细胞来源的。
9.权利要求5或6所述的方法，其中鉴定步骤包括：当所述信号组指示所述第二组中的至少一种抗体的结合时，将所述微泡指定为粒细胞来源的。
10.权利要求5或6所述的方法，其中鉴定步骤包括：当所述信号组指示所述第三组中的至少一种抗体的结合时，将所述微泡指定为骨髓来源的。
11.权利要求7所述的方法，其中鉴定步骤包括：当所述信号组指示针对TIA-1的抗体的结合时，将所述微泡指定为来源于活化细胞。
12.权利要求1所述的方法，其还包括从所述经染色的微泡分离未结合的物质。
13.权利要求12所述的方法，其中分离未结合的物质的步骤包括：在负载有含钙缓冲剂的尺寸排阻色谱柱上洗涤经染色的混合物。
14.试剂盒，其包含混合物，所述混合物包含针对HLA DR、CD11c、CD66c、CD18和CD157中至少一种的经标记的抗体。
15.试剂盒，其包含混合物，所述混合物包含以下的至少一种：
针对HLA DR和CD11c的第一组经标记的抗体；
针对CD66c的第二组经标记的抗体；
针对CD18和CD157的第三组经标记的抗体；以及
针对TIA-1的第四组经标记的抗体。
16.权利要求15所述的试剂盒，其中所述第二组还包含针对CD15的经标记的抗体，并且其中所述第三组还包含针对CD45的经标记的抗体。
17.权利要求15或16所述的试剂盒，其中所述第一组中的每种抗体用第一标记物标记，其中所述第二组中的每种抗体用第二标记物标记，其中所述第三组中的每种抗体用第三标记物标记，并且其中所述第四组中的每种抗体用第四标记物标记。
18.权利要求14至17中任一项所述的试剂盒，其中所述混合物还包含用第五标记物标记的膜联蛋白V。
19.权利要求14至18中任一项所述的试剂盒，其还包含洗脱缓冲剂。
20.用于表征微泡的系统，其包含一个或更多个处理器和偶联至一个或更多个处理器的存储器，所述存储器编码有一组指令，所述指令被配置成执行包括以下步骤的方法：
从流式细胞仪获得经混合物染色的微泡的测量，以及
当所测量微泡的信号组在信号区域内时，将经染色的微泡鉴定为白细胞来源的微泡。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090311715A1 (en) * 2008-05-09 2009-12-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Identifying coronary or soft tissue calcification
US20130040318A1 (en) * 2010-03-03 2013-02-14 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Increase of myeloid microvesicles in the cerebrospinal fluid as biomarker of microglia/macrophage activation in neurological disorders
JP2016522899A (ja) * 2013-05-08 2016-08-04 ナショナル ユニバーシティー オブ アイルランド， ゴールウェイ 半自動化全血免疫効力アッセイ
WO2016197064A1 (en) * 2015-06-04 2016-12-08 Epstein Alan L Lym-1 and lym-2 targeted car cell immunotherapy
EP3165926A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-10 Humanitas Mirasole S.p.A. Method for characterization of cell specific microvesicles

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090311715A1 (en) * 2008-05-09 2009-12-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Identifying coronary or soft tissue calcification
US20130040318A1 (en) * 2010-03-03 2013-02-14 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Increase of myeloid microvesicles in the cerebrospinal fluid as biomarker of microglia/macrophage activation in neurological disorders
JP2016522899A (ja) * 2013-05-08 2016-08-04 ナショナル ユニバーシティー オブ アイルランド， ゴールウェイ 半自動化全血免疫効力アッセイ
WO2016197064A1 (en) * 2015-06-04 2016-12-08 Epstein Alan L Lym-1 and lym-2 targeted car cell immunotherapy
EP3165926A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-10 Humanitas Mirasole S.p.A. Method for characterization of cell specific microvesicles

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANG HUANG等: "Increased CD14+HLA-DR-/low myeloid-derived suppressor cells correlate with extrathoracic metastasis and poor response to chemotherapy in non-small cell lung cancer patients", 《CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER》 *
GRAHAM D. THOMAS等: "Human Blood Monocyte Subsets A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry", 《ARTERIOSCLER THROMB VASC BIOL》 *
SARA M. JOHANSSON等: "Different types of in vitro generated human monocyte-derived dendritic cells release exosomes with distinct phenotypes", 《IMMUNOLOGY》 *

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