CN110878332B - 一种酶法间接定量检测非法添加舒巴坦的方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶法分析、生物检测领域，提供了一种去除内源β‑内酰胺酶的方法及其在检测舒巴坦中的应用。同时，本发明提供了一种酶法间接检测内源β‑内酰胺酶抑制剂舒巴坦的方法。

Description

一种酶法间接定量检测非法添加舒巴坦的方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于酶法间接定量检测β-内酰胺酶抑制剂的方法和试剂盒，属于酶法分析、生物检测领域。
背景技术
近年来，滥用抗生素是政府监管机构重点监测和打击的行为。农业部及市场监督管理局等部门多年对乳及乳制品兽药残留的监测过程中，时有发现β-内酰胺类药物残留超标，然而，一些生产经营者通过添加拮抗剂β-内酰胺酶对β-内酰胺类药物进行降解来逃避监测。随着β-内酰胺酶检测方法的建立，部分生产经营者开始非法添加β-内酰胺酶抑制剂，例如舒巴坦，来抑制β-内酰胺酶的活性，从而使有关部门难以检测到β-内酰胺酶。因此，亟需快速、有效的方法来检测食品中非法添加的β-内酰胺酶抑制剂。
目前，国内外主要采用高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等方法来直接检测β-内酰胺酶抑制剂，例如专利CN101852780A涉及用高效液相色谱法(HPLC)直接检测舒巴坦。这些方法的操作复杂，检测设备的价格高昂，导致检测成本居高不下，无法满足检测行业快速发展的需求。另外，全红等人(分光光度法测定注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠药物含量，全红等，山西医科大学学报，2003年12月，34(6)：573-574)采用分光光度计法来直接测定舒巴坦，但由于分光光度法用量较大、浪费较多，极少用于工业化的食品检测。
在食品检测方法中，酶法检测技术的成本相对较低，但由于食品样品成分复杂，干扰很大，导致酶检测的准确度和精确度在很多情况下都达不到行业的要求，例如李亮等(不同条件下酶法测定蜂蜜中甘油含量的研究，李亮等，中国农业科技导报，2018，20(2):86－92)采用酶法测定蜂蜜中甘油含量时发现，酶制剂法的检测精度只能达到基本的要求，即精确度低，只能够基本满足重复性的要求。
发明内容
为了克服上述现有方法的不足，本发明的目的是提供一种可高通量、可标准化的、经济快速、准确检测β-内酰胺酶抑制剂的方法和相关试剂盒。
为了实现上述目的，本发明试图避开直接检测β-内酰胺酶抑制剂，而采用间接酶法检测β-内酰胺酶抑制剂。然而，实现这种方法需要解决如下技术难题：
首先，去除内源β-内酰胺酶。现有的样品预处理技术主要关注去除样品中含量较多的、普遍存在的各类杂质，如一些糖类、脂类或蛋白等，其目的是为了尽量减少反应的本底，降低不相关的非特异结合。然而，样品中内源β-内酰胺酶通常含量很少，即它不是通常意义上的杂质，但却与本发明方法中外加的β-内酰胺酶一样，能直接地、特异地与显色底物进行专一的酶反应，从而极大地影响测定结果的准确性。因此，常规的样品预处理方案只能去除大部分干扰杂质，对微量的内源β-内酰胺酶去除效果不佳。据发明人所知，目前还没有针对性去除样品中(尤其是乳品中)内源β-内酰胺酶的好方法，发明人曾试着采用已有的预处理试剂如丙酮、三氯醋酸、乙酸锌、亚铁氰化钾、硫酸铵、乙醚、乙醇、盐酸胍、SDS等(不一一例举)对样品进行预处理，效果都不理想，原因不明。发明人意外发现以本发明的样品处理液I和样品处理液II联合对样品进行预处理的效果最好，并且进一步找到了适于工业化的、能在微孔板中进行检测的最经济用量。
其次，在微孔板的狭小体系中保证加标回收率及变异系数等均能达到行业要求。与分光光度法不同，使用酶标微孔板能极大地缩小反应体系，从而避免试剂等的浪费，更适合食品检测行业推广使用，但由于体积过小，试剂配制误差、酶活性及浓度、反应温度、反应时间、反应体系组成等细节都可能极大地影响测定结果，难以形成符合行业要求的检测方法。因此，鲜有人用微孔板酶法检测β-内酰胺酶抑制剂的报道。发明人尝试对这一复杂的检测过程进行拆分，对每个细节进行反复实验，力图探索得到每个细节的优化条件，最终获得一套完整的、最佳的、适于标准化检测β-内酰胺酶抑制剂的方法和相关试剂盒。
其中，β-内酰胺酶抑制剂是舒巴坦。待检测的样品可以是液态或固态进行溶解后的溶解液，例如各种乳制品：液态乳品、溶解的固态乳制品(如奶粉等)、酸奶、脱脂奶、生鲜乳、复原乳等。
在一个实例中，本发明的试剂盒含有96孔微孔板、β-内酰胺酶抑制剂标准品溶液、样品处理液I、样品处理液II、β-内酰胺酶溶液、反应缓冲液、显色底物溶液。优选的，β-内酰胺酶抑制剂标准品与待测样品具有相同的基质，以消除乳基质的影响，提高检测结果的准确性。具体的，所述基质为奶基质。
在一个示例中，本发明涉及一种用于酶法间接定量检测乳中非法添加物舒巴坦的测定方法，具体如下：
1)舒巴坦标准品溶液的制备，通过采用样品处理液I和样品处理液II对与奶基质一致的脱脂粉进行处理，形成与奶基质一致的溶剂，该溶剂作为0标准品，其他浓度的标准品由母液进行稀释而成，所有标准品于2～8℃保存；
2)显色底物溶液的制备：用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，溶解头孢噻呋形成浓度为5mg/mL的均质溶液，该溶液避光-20℃保存；
3)反应缓冲液的制备：将NaCl:40g、KCl:1g、KH2PO4:1.2g、Na2HPO4:7.2g溶于1L灭菌水中形成浓缩酶解反应缓冲液；
4)β-内酰胺酶工作溶液的制备：β-内酰胺酶溶液与反应缓冲液按照4:6的体积比进行配比混合；
5)显色底物工作溶液制备：反应缓冲液与显色底物溶液按照57:3的体积比进行配比混合。
优选的，用于所述方法的试剂盒包含96孔微孔板、样品处理液I、样品处理液II。优选的，所述舒巴坦标准品的浓度分别为0mg/L、5mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L，每瓶1mL。优选的，β-内酰胺酶溶液的浓度为16000IU/mL，每瓶4.2mL。优选的，试剂盒中含反应缓冲液、样品处理液I、样品处理液II均为15mL/瓶，显色底物溶液为320μL/瓶。
在一个示例中，样品制备方法如下：
1)取1.5mL均质的奶(若样品为生鲜乳，需8000g 4分钟脱脂处理)置于2mL离心管中，加入147-151μL样品处理液I，混匀；
2)8000g离心10分钟；
3)移取800μL上清液至1.5mL离心管中，加入154-158μL样品处理液II，混匀；
4)8000g离心10分钟，上清液供检测使用。
在一个示例中，本发明的检测方法或流程包括如下步骤：
1)使用前将所有试剂恢复至室温(20℃-25℃)，用完后立即将剩余的试剂保存于2-8℃；
2)取出所需数量的微孔置于微孔架上，记录标准品和样品位置；
3)将40μL标准品溶液或测试样品加入对应的微孔中；
4)向每个微孔中加入100μLβ-内酰胺酶工作溶液；
5)在250rpm振荡器中25℃孵育40分钟；
6)向每个微孔中加入60μL显色底物工作溶液；
7)在250rpm振荡器中25℃孵育110分钟；
8)孵育结束后10分钟内用酶标仪在490nm处测定吸光度值。
结果计算：以标准品的浓度mg/L为X轴，以标准品的吸光度值为Y轴,采用4P算法构建标准曲线，样品计算结果考虑校准因子1.32因素。
整个检测流程恒温、避光、反应彻底、吸光度值稳定、测试结果准确。
在一种实施方式中，舒巴坦标准品溶液的制备方法为：采用样品处理液对具有乳基质的乳粉进行处理，处理后的上清液做为溶剂对标准品进行溶解，溶解后得到的标准品溶液与测试样品具有相同的基质效应，从而确保检测结果的准确性与精密度。
在一种实施方式中，样品处理方法为：使用样品处理液对奶源进行处理，从而去除奶样品中的内源β-内酰胺酶，可确保检测结果的准确性与精密度。
在一种实施方式中，显色底物溶液的制备方法为：对显色底物溶液进行浓缩并冷冻避光保存，以确保显色底物的效价，从而对有效灵敏度及及准确度进行保障。
在一种实施方式中，β-内酰胺酶溶液的制备方法为：对β-内酰胺酶进行浓缩处理以稳定酶活，从而确保检测结果的准确性与精密度。
在一种实施方式中，舒巴坦标准品溶液由如下步骤制备而成：
1)将1g脱脂粉复原于10mL灭菌水，对复原乳按样品制备方法进行样品处理，处理后的上清液做为标准品的溶剂；
2)用1)的溶剂溶解舒巴坦标准品配制成5000mg/L母液于4℃保存。
在一种实施方式中，本发明提供一种检测用的6组试剂组合，其由如下试剂组成：
1)提供96孔微孔板一个；
2)试剂：舒巴坦标准品(6瓶)、β-内酰胺酶溶液(1瓶)、反应缓冲液(1瓶)、显色底物溶液(1瓶)、样品处理溶液I(1瓶)、样品处理溶液II(1瓶)。
在一种实施方式中，本发明还提供一种用于酶法定量检测舒巴坦的酶标仪检测方法，其包括如下步骤：
1)样品制备
a)取1.5mL均质的奶(若样品为生鲜乳，需8000g，4分钟脱脂处理)置于2mL离心管中，加入149μL样品处理液I，混匀；
b)8000g离心10分钟；
c)移取800μL上清液至1.5mL离心管中，加入156μL样品处理液II，混匀；
d)8000g离心10分钟，上清液供检测使用，
2)检测步骤
a)取出所需数量的微孔置于微孔架上，记录标准品和样品位置；(2)将40μL标准品或样品加入对应的微孔中；
b)向每个微孔中加入100μLβ-内酰胺酶工作溶液；
c)在250rpm振荡器中25℃孵育40分钟；
d)向每个微孔中加入60μL显色底物工作溶液；
e)在250rpm振荡器中25℃孵育110分钟；
f)孵育结束后10分钟内用酶标仪在490nm处测定吸光度值，
3)结果计算
以标准品的浓度mg/L为X轴，以标准品的吸光度值为Y轴，采用4P算法构建标准曲线，样品计算结果考虑校准因子1.32因素。检测限：检出限为5mg/L。检测范围：按照酶法检测反应，采用本试剂盒的线性检测范围为0.0～160mg/L舒巴坦。
附图说明
图1为本发明实验例1中获得的样品处理液体积与回收率的关系图；
图2为本发明实验例2中获得的β-内酰胺酶活性与显色底物的关系图；
图3为本发明实验例3中获得的显色底物与β-内酰胺酶活力的关系图；
图4为本发明实验例4中获得的浓度为0-160μg/mL舒巴坦标准曲线；
图5为本发明实验例4中获得的浓度为0-200μg/mL舒巴坦标准曲线；
图6为本发明实验例5中获得的吸光度与第二步孵育反应温度、时间的关系图；
图7为本发明实验例6中获得的第一步孵育反应时间与吸光度的关系图；
图8为本发明实验例7中获得的舒巴坦加标回收实验结果图；
图9为本发明所述的用于酶法定量检测舒巴坦的检测标准曲线；和
图10为本发明提供的检测方法与HPLC-MS相关性实验结果图。
具体实施方式
下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的表示和描述。本发明以舒巴坦为例进行详细阐述，本领域技术人员能够预期，本发明的方法对其他β-内酰胺酶抑制剂的检测同样适用。
下面结合附图对本发明做进一步描述。
实施例
舒巴坦标准品溶液制备：
1)将1g脱脂粉复原于10mL灭菌水，对复原乳按样品制备方法进行样品处理，处理后的上清液做为标准品的溶剂；
2)用1)的溶剂溶解舒巴坦标准品配制成5000mg/L母液于4℃保存。
用1)的溶剂将中的母液稀释，获得浓度为5mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L的标准品，0标准品为1)中的溶剂，将制备的标准品溶液放入棕色瓶中，每瓶1mL。
样品处理液I的制备：配制含0.2M HCl和0.002M HNO3的溶液。
样品处理液II的制备：配制浓度为0.5M的NaOH溶液。
反应缓冲液的制备：
称量NaCl 40g、KCl 1g、KH2PO4 1.2g、Na2HPO4:7.2g加入1L容量瓶中，用灭菌水定容至1L；取15mL装入小瓶中，每个试剂盒含1瓶反应缓冲液。
β-内酰胺酶工作溶液的制备：
将浓度为16000IU/mL的β-内酰胺酶装入小瓶中，每瓶4.2mL。
使用时，将β-内酰胺酶溶液与反应缓冲液按照4:6的体积比进行配比混合，获得6400IU/mL的β-内酰胺酶工作溶液；
显色底物工作溶液的的制备：
称量100mg头孢噻呋，加入20mL二甲基亚砜(DMSO)中，充分混匀，获得浓度为5000mg/L的均质溶液，该溶液避光-20℃保存；每个试剂盒含1瓶显色底物，每瓶320μL。
使用时，将反应缓冲液与显色底物溶液按照57:3的体积比混合，获得浓度为250mg/L的显色底物工作溶液。
为了更好地显示本发明样品处理的先进性，本发明示例用硫酸铵、乙醇、SDS及本案的“样品处理液I和II”对样品处理的效果。保证奶源可靠，向天然牛奶样品(每孔40μL)中分别加入硫酸铵、乙醇、SDS的体积各305μL，以及样品处理液I的体积为149μL，样品处理液II的体积为156μL，其它步骤按照牛奶样品常规处理方法。结果显示：硫酸铵、乙醇、SDS均能明显检测出内源β-内酰胺酶残留，而本发明处理液处理的奶液中几乎检测不到β-内酰胺酶。
为了更好地显示本发明样品处理的先进性，本发明示例用20％三氯乙酸、亚铁氰化钾/硫酸锌、亚铁氰化钾/乙酸锌及本发明的“样品处理液I和II”对100mg/L加标的牛奶样品处理的效果。保证奶源可靠，向天然牛奶样品(每孔40μL)中分别加入等体积的20％三氯乙酸、亚铁氰化钾/硫酸锌、亚铁氰化钾/乙酸锌，以及样品处理液(样品处理液I和样品处理液II)，然后按照说明书提供的检测步骤检测处理后的样品，并计算加标回收率，每种方法做6个平行，结果取平均值。结果见下表A。
表A不同样品处理液的检测结果
序号 样品处理液 检测结果，mg/L 回收率％
1 本发明样品处理液I和II 100.6 100.6
2 20％三氯乙酸 138.7 138.7
3 亚铁氰化钾/硫酸锌 136.4 136.4
4 亚铁氰化钾/乙酸锌 141.3 141.3
从表A可以看出，采用本发明所述的样品处理液I和II所获得的回收率为100.6％，最接近100％，因此，本发明所述的样品处理液最佳。
实验例1
本实验例在于研究样品处理液I和II的最佳体积。
向牛奶样品中加入舒巴坦标准品，获得浓度为100mg/L的样品。对该加标样品(每孔40μL)进行样品处理，加入的样品处理液I的体积为AμL，样品处理液II的体积为BμL，其它步骤按照前述样品处理方法。为了确定A和B的最佳数值，按照说明书提供的检测步骤检测处理后的样品，并计算加标回收率，每种方法做3个平行，结果取平均值。结果见表1。
表1
Figure BDA0002299950390000081
从表1和图1可以看出，当样品处理液I的体积为149μL，样品处理液II的体积为156μL时，回收率为100.6，最接近100，因此，样品处理液I的最佳体积为149μL，样品处理液II的最佳体积为156μL。
实验例2
本实验例在于研究β-内酰胺酶的最佳活力(见表2及图2)。
将40μL反应缓冲液加入每个微孔中，然后分别将100μL8000IU/mL、6400IU/mL、3200IU/mL、1600IU/mL、800IU/mL、400IU/mL、0IU/mL的β-内酰胺酶加入微孔中，每个浓度做6个平行，最后将60μL250mg/L的显色底物加入每个微孔中，在25℃下250rpm振荡孵育110分钟，用酶标仪在490nm下测定吸光度值。在显色底物浓度一定且过量的情况下，不同活力β-内酰胺酶与显色底物的关系见表2。由于β-内酰胺酶的加入量为100μL，反应总体积为200μL，因此反应液中β-内酰胺的实际浓度应为所加入标准品浓度的1/2，分别为4000IU/mL、3200IU/mL、1600IU/mL、800IU/mL、400IU/mL、200IU/mL、0IU/mL；底物浓度为加入浓度的60/200，为75mg/L。
表2β-内酰胺酶活性与显色底物的关系
Figure BDA0002299950390000091
根据上述实验，当β-内酰胺酶活性为4000IU/mL时，其OD值为1.159，当β-内酰胺酶活性为3200IU/mL时，其OD值为1.126，无显著性差异，从而确定最终测定液(或反应液)中的β-内酰胺酶设定为3200IU/mL，因此β-内酰胺酶工作液的浓度为6400IU/mL。
实验例3
本实验例在于研究显色底物溶液的最佳浓度(见表3及图3)。
将40μL反应缓冲液加入每个微孔中，然后分别将100μL 6400IU/mL的β-内酰胺酶加入微孔中，最后分别将60μL 300mg/L、250mg/L、125mg/L、67.5mg/L、33.75mg/L、16.875mg/L、0mg/L的显色底物加入微孔中，每个浓度做6个平行，在25℃下250rpm振荡孵育110分钟，用酶标仪在490nm下测定吸光度值。由于反应缓冲液的加入量为40μL，β-内酰胺酶的加入量为100μL，显色底物的加入量为60μL，反应总体积为200μL，因此，显色底物溶液的浓度为加入浓度的60/200。
表3显色底物与β-内酰胺酶活力的关系
Figure BDA0002299950390000101
根据上述实验，当显色底物溶液的浓度为90mg/L时，OD值为1.115，当显色底物溶液的浓度为75mg/L时，OD值为1.088，结果无显著性差异。因此，将反应液中显色底物溶液的浓度确定为75mg/L，加入的显色底物浓度为250mg/L。
实验例4
本实验例在于研究舒巴坦的线性范围。
设定测定液中β-内酰胺酶的活力为3200IU/mL时，加入不同浓度的舒巴坦溶液及一定浓度的显色底物溶液，以确定舒巴坦的线性范围。结果见表4。
表4舒巴坦标准系列浓度吸光值测定结果
Figure BDA0002299950390000111
由表4可看出，根据对舒巴坦0～200mg/L间分段进行标准曲线拟合，当舒巴坦溶液浓度为0～160mg/L间其相关系数可达0.998(见图4)，呈负相关的要求，当舒巴坦浓度为0～200mg/L间其相关系数可达0.989(见图5)，相关性较差。从而确定了标准曲线的范围为0～160mg/L。
实验例5
本实验例在于研究最佳反应温度与时间。
实验选择已确定的β-内酰胺酶溶液的活性(6400IU/mL)、显色底物溶液(250mg/L)、舒巴坦溶液(5mg/L)进行最佳反应温度与时间的确定，反应需要两步孵育，第一步孵育为加入舒巴坦和β-内酰胺酶后，为了使酶的抑制彻底，暂定孵育时间为60分钟(时间足够)。第二步孵育为加入显色底物后，此步孵育温度和时间的确定更为关键。共设计15℃、20℃、25℃、30℃、40℃；时间设计为30min、60min、110min、150min4个时间段。其方法是每个实验温度下按上述时间分别进行吸光度的测定，实验结果见表5和图6。
表5吸光度与第二步孵育反应温度、时间的关系
Figure BDA0002299950390000121
综合实验结果可知，在考虑应用中实验室温度的基础上，在温度25℃、反应110min条件下为最适实验条件。
实验例6
本实验例在于研究加入β-内酰胺酶后的孵育时间。
实验选择已确定的β-内酰胺酶活性(6400IU/mL)、显色底物(250mg/L)、舒巴坦(5μg/mL)进行第一步孵育最佳反应时间的确定，第二步孵育温度和时间按照实验例5确定的25℃110分钟。时间设计为20min、30min、40min、50min和60分钟5个时间段。其方法是25℃下按上述时间分别进行吸光度的测定，实验结果见表6和图7。
表6第一步孵育反应时间与吸光度的关系
Figure BDA0002299950390000131
由图7可以看出，随着时间的延长，吸光度值逐渐降低，当孵育时间为40分钟时，吸光度值的变化趋于平稳，孵育40分钟、50分钟和60分钟的吸光度值虽有降低，但无显著差异，因此确定孵育时间为40分钟。
实验例7
本实验例在于研究本发明的检测限。
当舒巴坦的含量过低起不到抑制β-内酰胺酶作用，从而不影响β-内酰胺酶对显色底物降解，为了确定舒巴坦标准曲线最佳范围及检出限，分别在六个时间点对10个浓度点(0、1、3、5、10、30、50、100、160、200mg/L)对每个浓度进行6个平行测试，每次测试数据见表4。
根据实验例4所确定的标准曲线范围，按照操作方法测定浓度为0mg/L、1mg/L、3mg/L、5mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L和160mg/L时的吸光度值，每个浓度做4个平行，结果见表7。
表7 t配对实验
Figure BDA0002299950390000141
当舒巴坦的浓度小于5mg/L时，对应的吸光度值为1.052-1.146，变化不明显。经t配对检验，当舒巴坦浓度分别为1mg/L和3mg/L时，td＝0.000723＜t0.05,3＝2.353；当舒巴坦浓度分别为3mg/L和5mg/L时，td＝0.00911＜t0.05,3＝2.353，吸光度值均无显著性差异，因此，确定本方法的检测限为5mg/L。
实验例8
本实验例在于研究本发明所述试剂盒的准确度。
对检出限5mg/L、两倍检出限10mg/L、四倍检出限20mg/L、十倍检出限50mg/L共4个浓度进行加标，分别在3个时间点进行加标测试，每个时间点对每个浓度进行3个技术重复，检测结果均值如下表8和图8。
表8舒巴坦加标回收实验结果
Figure BDA0002299950390000151
根据GB27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中检验方法确认的技术要求，当被测组分含量为1-100mg/kg时，回收率范围应为90～110％；当被测组分含量为1-10mg/kg时，实验室内变异系数(CV％)应<11％，当被测组分含量为10-100mg/kg时，CV应<7.5％，由此可判定本方法的加标回收率及变异系数均符合GB27404-2008的技术要求。
实验例9
本实验例在于研究本发明所述试剂盒的精密度。
使用3批次试剂盒(实施例制备的试剂盒)检测牛奶加标样品(共6个浓度)，每个浓度做3个平行，检测结果取平均值，结果见表9。
表9
Figure BDA0002299950390000152
测定牛奶加标的6个浓度的变异系数均非常小(0.07-2.28％)，表明精密度高。
校准曲线
该检测标准曲线的范围为0-160mg/L。为了得到样品中舒巴坦的含量，必须将从标准曲线读取的样品结果乘以稀释倍数1.32。数据处理软件在最终计算时包含稀释系数，并输出结果为mg舒巴坦/L样品。典型的曲线如图9所示。
实验例10
本实验例在于研究本发明提供的检测方法与HPLC方法的相关性。
分别采用本发明提供的检测方法和HPLC-MS方法检测3个盲样，以及对5mg/L、10mg/L和20mg/L三个浓度进行加标，每个样品及加标做3个平行，检测结果取平均值，结果见表10和图10。
表10本发明提供的检测方法与HPLC-MS相关性实验结果
Figure BDA0002299950390000161
本发明的优点：
1.简单易于操作，经济实用，极大地节省了成本，便于工业推广及应用。
2.摸索出了一套完整的、内源β-内酰胺酶干扰小、适于标准化检测的最佳流程。
3.本发明的方法重复测定变异系数在8％以内，保证了测定结果的准确性与精密度。
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。

Claims (5)

1.一种检测β-内酰胺酶抑制剂的方法，包括采用样品处理液对样品进行处理以去除样品中的内源β-内酰胺酶，所述样品处理液包括样品处理液I和样品处理液II，所述样品处理液I为盐酸和硝酸的混合液，样品处理液II为氢氧化钠；所述检测通过酶法间接定量检测来实现，其中包括使用β-内酰胺酶抑制剂的标准品，并用样品对应的吸光值与标准品的吸光标准曲线进行比较；
其中，所述β-内酰胺酶抑制剂为舒巴坦、他唑巴坦或克拉维酸钾；所述盐酸为0.2M，硝酸为0.002M；所述氢氧化钠为0.5M；
所述对样品进行处理的方法为：取1.5mL均质的奶置于2mL离心管中，加入147-151μL样品处理液I，混匀；8000g离心10分钟；移取800μL上清液至1.5mL离心管中，加入154-158μL样品处理液II，混匀；8000g离心10分钟，上清液供检测使用；
所述定量检测包括如下流程：
a)使用前将所有试剂恢复至室温，用完后立即将剩余的试剂保存于2-8℃；
b)取出所需数量的微孔置于微孔架上，记录所述标准品和样品位置；
c)将40μL上述标准品的溶液或测试样品加入对应的微孔中；
d)向每个微孔中加入100μL β-内酰胺酶工作溶液；
e)在250rpm振荡器中25℃ 孵育40分钟；
f)向每个微孔中加入60μL显色底物工作溶液；
g)在250rpm振荡器中25℃孵育110分钟；
h)孵育结束后10分钟内用酶标仪在490nm处测定吸光度值；
结果计算：以标准品的浓度mg/L为X轴，以标准品的吸光度值为Y轴，采用4P算法构建标准曲线，样品计算结果考虑校准因子1.32因素，将从标准曲线读取的样品结果乘以1.32；
所述检测的过程中包括采用避光、恒温手段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法采用微孔板。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微孔板为96孔微孔板。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-内酰胺酶抑制剂的标准品与样品具有相同的基质。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基质为奶基质。
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