CN110872306A

CN110872306A - 一种从藤构中提取的化合物及其在制药中的用途

Info

Publication number: CN110872306A
Application number: CN201811005159.7A
Authority: CN
Inventors: 侯爱君; 雷春; 俞媚华; 薛静静; 李亚楠
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2018-08-30
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2038-08-30
Also published as: CN110872306B

Abstract

本发明属医药技术领域，涉及式(I)结构的异戊烯基黄酮类化合物及其用途。具体涉及所述化合物8‑(3，4‑二羟基苯)‑5‑羟基‑7‑甲氧基‑2‑羟甲基‑2‑甲基‑10‑(3‑甲基‑2‑丁烯基)‑2H，6H‑苯并[1,2‑b:5,4‑b']二吡喃‑6‑酮及其在制备蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂中的用途。该化合物从藤构中提取得到，实验证实，该化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶1B具有很强的抑制活性，可作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂以及研制新的预防或治疗2型糖尿病的先导化合物，也可用于制备预防或治疗临床常见多发的2型糖尿病的药物。

Description

一种从藤构中提取的化合物及其在制药中的用途

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及一种从藤构中分离得到的异戊烯基黄酮类化合物及其在制备蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂中的用途。

背景技术

现有技术公开了糖尿病是一种慢性代谢性疾病，该疾患患者的主要表现为高血糖。持续的高血糖将导致若干并发症，如视网膜、肾脏、神经系统及微血管并发症等。据统计，我国糖尿病患者其中2型糖尿病患者占糖尿病患者的90％以上。研究显示，2型糖尿病以葡萄糖和脂类的异常代谢为特征，导致胰岛素抵抗和β细胞胰岛素分泌功能障碍，致使机体能量代谢失衡。目前临床上用于治疗2型糖尿病的常用药物，如双胍类、磺酰脲类、二肽基肽酶-4抑制剂、过氧化物体增殖剂活化受体γ激动剂、α-糖苷酶抑制剂、胰高血糖素样肽-1类似物等，虽然具有一定的降糖疗效，但常伴随有低血糖、体重增加、水肿、乳酸血症等不良反应。因此，寻找新靶点的、安全有效的降糖药物引起本领域技术人员的关注。

研究报道了蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)是一个细胞内非受体型的蛋白酪氨酸磷酸化酶，可使激活的胰岛素受体或底物去磷酸化，在胰岛素和瘦素的信号转导过程中起着重要的负调控作用。PTP1B的过表达或其酶活性的增加将最终使胰岛素的敏感度降低，导致糖尿病发生。因此，临床实践中，PTP1B是治疗2型糖尿病的重要靶点，其抑制剂在2型糖尿病的治疗中发挥重要作用。

藤构(Broussonetia kaempferi Sieb.var.australis Suzuki)分布于我国南方多个省区，资源丰富，其化学成分和生物活性的研究均未见报道。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种从藤构中提取的化合物及其在制药中的用途，尤其是在制备预防或治疗2型糖尿病的药物中的用途。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种从藤构中提取的化合物及其在制药中的用途，尤其是在制备预防或治疗2型糖尿病的药物中的用途。

本发明提供了用于制备蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂的异戊烯基黄酮类化合物，其结构如式(I)所示的化合物，尤其是化合物8-(3，4-二羟基苯)-5-羟基-7-甲氧基-2-羟甲基-2-甲基-10-(3-甲基-2-丁烯基)-2H，6H-苯并[1,2-b:5,4-b']二吡喃-6-酮。该化合物是从藤构Broussonetia kaempferi Sieb.var.australis Suzuki的茎枝中分离得到的天然化合物。

式(I)所示结构的异戊烯基黄酮类化合物从藤构茎枝中分离得到，

本发明的另一目的是提供所述化合物的药用用途，经试验显示，该化合物具有明显的蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性，可作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂以及研制新的预防或治疗2型糖尿病的先导化合物，也可用于制备预防或治疗2型糖尿病的药物。

本发明所述的化合物通过以下方法制得：

将藤构Broussonetia kaempferi Sieb.var.australis Suzuki的干燥茎枝粉碎后，用有机溶剂或/和水提取制备得到总提取物，所用的有机溶剂可采用醇类，如乙醇，甲醇等，其中优选95％(体积比)乙醇；将总提取物溶于水后，用有机溶剂萃取，所用的有机溶剂可选用卤代烃类或酯类，如二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯等，其中优选乙酸乙酯；

将卤代烃类或酯类提取物进行聚苯乙烯凝胶MCI柱层析，以含水甲醇梯度洗脱；其中90％(体积比)甲醇流份经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮(30:1～1:1)梯度洗脱，然后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以甲醇洗脱后，再经高效液相制备得到化合物8-(3，4-二羟基苯)-5-羟基-7-甲氧基-2-羟甲基-2-甲基-10-(3-甲基-2-丁烯基)-2H，6H-苯并[1,2-b:5,4-b']二吡喃-6-酮；用波谱方法鉴定其结构，如式(I)所示。

本发明对式(I)化合物进行了蛋白酪氨酸磷酸酶1B活性测试，结果显示，所述化合物(I)具有很强的蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制作用，可作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂，以及研制新的预防或治疗2型糖尿病药物的先导化合物，也可用于制备预防或治疗2型糖尿病的药物。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

实施例1从藤构中提取本发明化合物

(1)提取：藤构茎枝部分3.3公斤粉粹后，用95％含水乙醇60升渗漉提取，收集渗漉液，减压浓缩，得到浸膏100克。将此浸膏溶于水后用乙酸乙酯萃取，回收溶剂浓缩至干，得乙酸乙酯提取物74克；

(2)分离：将乙酸乙酯提取物74克进行MCI gel CHP-20P柱层析，用甲醇-水(50:50→60:40→70:30→80:20→90:10→100:0)梯度洗脱，每个梯度用量15升，收集流份；其中甲醇-水90:10流份(8克)经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮(30:1～1:1)梯度洗脱，每个梯度溶剂用量2升，薄层层析检测合并流份，得到7个流分；将其中的第6个流分经Sephadex LH-20柱层析，以甲醇(用量2升)进行洗脱后，再经高效液相分离纯化得到化合物8-(3，4-二羟基苯)-5-羟基-7-甲氧基-2-羟甲基-2-甲基-10-(3-甲基-2-丁烯基)-2H，6H-苯并[1,2-b:5,4-b']二吡喃-6-酮(I)4.0mg。色谱仪为岛津Essentia LC-16，紫外检测波长为210nm和254nm；色谱柱为YMC C18柱(150×10mm,5μm)，流速为3ml/min，洗脱剂为甲醇-水(75:25)，保留时间为24min；

化合物(I)的理化性质及光谱数据如下：分子式为C₂₆H₂₆O₈；分子量466；其性状为黄色粉末；比旋光：[α]²⁵ _D-7.7(c 0.10，甲醇)；紫外光谱最大吸收波长值(甲醇)：293(4.85)，359(4.68)nm；红外光谱最大吸收频率值(溴化钾)：3390，2977，1653，1606，1515，1470，1433，1347，1295，1209，1176，1120，1052cm^-1；高分辨电喷雾电离质谱(质荷比)：正离子模式467.1686[M+H]⁺(示分子式C₂₆H₂₆O₈)；核磁共振氢谱(400MHz)数据(化学位移：ppm，偶合常数：Hz,溶剂：氘代丙酮)：δ_H 6.77(1H,d,J＝10.0Hz,H-11)，5.76(1H,d,J＝10.0Hz,H-12)，3.44(2H,s,H₂-14)，1.43(3H,s,H₃-15)，3.55(1H,dd,J＝14.4,7.2Hz,H-16a)，3.46(1H,dd,J＝14.4,6.8Hz,H-16b)，5.24(1H,t,J＝7.0Hz,H-17)，1.81(3H,br s,H₃-19)，1.66(3H,brs,H₃-20)，7.73(1H,d,J＝2.0Hz,H-2')，7.01(1H,d,J＝8.0Hz,H-5')，7.60(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz,H-6')，3.87(3H,s,3-OCH₃)，13.13(s,5-OH)；核磁共振碳谱(150MHz)数据(化学位移：ppm，溶剂：氘代丙酮)：δ_C 156.9(C,C-2)，139.2(C,C-3)，179.9(C,C-4)，155.0(C,C-5)，105.6(C,C-6)，157.5(C,C-7)，108.0(C,C-8)，154.3(C,C-9)，106.2(C,C-10)，117.7(CH,C-11)，126.2(CH,C-12)，81.8(C,C-13)，68.7(CH₂,C-14)，23.5(CH₃,C-15)，22.1(CH₂,C-16)，123.2(CH,C-17)，132.2(C,C-18)，18.2(CH₃,C-19)，25.9(CH₃,C-20)，123.1(C,C-1')，116.4(CH,C-2')，146.1(C,C-3')，149.3(C,C-4')，116.3(CH,C-5')，122.0(CH,C-6')，60.2(CH₃，3-OCH₃)。

实施例2本发明化合物(I)对蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosinephosphatase 1B,PTP1B)的抑制活性测定

(1)蛋白酪氨酸磷酸酶1B蛋白的制备

将含有PTP1B催化域的重组质粒转入大肠杆菌Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)进行表达；将含有重组质粒的BL21-CodonPlus(DE3)细胞接种在含有氨苄青霉素(ampicillin)100mg/l的Luria-Bertani(LB)培养基上，37℃下振荡培养，当细胞浓度达到600nm下吸光度值在0.4-0.6之间时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至500nM来诱导蛋白的表达；用GSTrap FF柱进行蛋白样品的纯化；用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分析，蛋白浓度通过考马斯亮蓝法(Bradford)确定，以牛血清蛋白(BSA)作为对照；

(2)蛋白酪氨酸磷酸酶1B的活性测试

通过监测30℃下对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，pNPP)的水解情况确定PTP1B催化域的酶活性，在96孔板上用比色法测定PTP1B的抑制作用；待测化合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，起始浓度为1mg/ml，随后以3倍比依次稀释6次，在测试体系的终浓度再被稀释50倍；每个样品设3个复孔。活性测试最终体系为100μl，包括50mM的3-吗啉丙磺酸(3-[N-morpholino]propane-sulfonic acid，MOPs)，pH 6.5，2mM pNPP，30nM的GST-PTP1B和2％的DMSO；通过检测底物pNPP的水解产物对硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)在405nm处光吸收的变化以观察酶活性的变化以及化合物对酶活性的抑制情况；用齐墩果酸(oleanolic acid)作为阳性对照，用DMSO作为阴性对照。IC₅₀值通过抑制率(％inhibition)对抑制浓度([I])进行非线性拟合得到，计算所用软件为Graphpad Prism 4，计算公式如下：

抑制率(％)＝100/{1+(IC₅₀/[I])^k}，k是Hill系数。将酶抑制率(％)达到50％时的浓度测定为IC₅₀值；

测试结构式(I)化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶1B活性抑制作用结果，IC₅₀为5.08±0.60(μM)，阳性对照齐墩果酸的IC₅₀为2.52±0.22(μM)，表明化合物(I)对蛋白酪氨酸磷酸酶1B具有显著的抑制作用。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B的过表达或其酶活性的增加将最终使胰岛素的敏感度降低，导致糖尿病发生；因此，所述化合物(I)作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂，可用于制备预防或治疗2型糖尿病的药物。

Claims

1.式(I)结构的异戊烯基黄酮类化合物，

所述化合物是8-(3，4-二羟基苯)-5-羟基-7-甲氧基-2-羟甲基-2-甲基-10-(3-甲基-2-丁烯基)-2H，6H-苯并[1,2-b:5,4-b']二吡喃-6-酮；其分子式为C₂₆H₂₆O₈；分子量为466；

通过下述方法制备：

将藤构Broussonetia kaempferi Sieb.var.australis Suzuki的茎枝粉碎后，用有机溶剂或/和水提取制备得到总提取物，将总提取物溶于水后，用卤代烃类或酯类有机溶剂萃取，回收溶剂后干燥，即得到卤代烃类或酯类提取物；

将卤代烃类或酯类提取物进行聚苯乙烯凝胶MCI柱层析，以含水甲醇梯度洗脱，收集流分；将90％体积比甲醇流份经过硅胶、Sephadex LH-20凝胶柱层析后，再经高效液相制备得到式(I)化合物。

2.按权利要求1所述的异戊烯基黄酮类化合物，其特征在于，所述的制备方法中，有机溶剂选自乙醇或甲醇。

3.按权利要求2所述的异戊烯基黄酮类化合物，其特征在于，所述的制备方法中，有机溶剂为体积比95％的乙醇。

4.按权利要求1所述的异戊烯基黄酮类化合物，其特征在于，所述的制备方法中，卤代烃类或酯类溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯。

5.按权利要求1所述的异戊烯基黄酮类化合物，其特征在于，所述的制备方法中，卤代烃类或酯类溶剂为乙酸乙酯。

6.权利要求1的式(I)化合物作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂在制备预防或治疗2型糖尿病药物中的用途。