CN110872296B - 一种二氢异吲哚-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶酮化合物、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类一种式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其可以作为新一代的Wee1选择性抑制剂，相对于现有的Wee1抑制剂，本发明化合物对于Wee1激酶有更好的选择性，从而更加安全和更高的治疗指数，也有更好的血脑屏障渗透性，因而具有更好的安全性和更广的适应范围，应用于各种肿瘤的治疗，包括脑瘤的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一类二氢异吲哚-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶酮化合物及其制备方法、包含所述化合物的药物组合物，用于制备治疗癌症，癌前综合症的药物或辅助性药物。
发明背景
细胞周期检查点是细胞周期进程中的一套保证DNA复制和染色体分配质量的检查机制。当细胞周期进程中出现异常事件，如DNA损伤或DNA复制受阻时，这类调节机制就被激活，及时地中断细胞周期的进行，待细胞修复或排除故障后，细胞周期才能恢复运转。细胞周期调控系统的核心成分是周期蛋白依赖性激酶(CDKs)与周期蛋白(Cyclins)结合形成的CDKs/Cyclins复合物，能促进细胞进入增殖周期。Cdc2/CyclinB复合体的快速激活，使细胞完成从G2期到M期的转变，而这一快速的转变正是在Wee1和Cdc25等蛋白激酶的调节下进行。
Wee1是一种酪氨酸激酶，它是G2-M细胞周期检查点的一个关键组成部分，可以阻止细胞DNA损伤进入有丝分裂。在细胞有丝分裂前，CDK1通过Wee1磷酸化其酪氨酸15而维持在无活性状态，然后CDK1在苏氨酸14被髓磷脂转录因子(MYT1)磷酸化，因此，WEE1作为在G2-M转变中进入有丝分裂的负调节器，通过细胞质中激活的CDK1与细胞周期蛋白B复合物来保护细胞核。当它超磷酸化时,WEE1的转录合成和活性在S期和G2期增加，在M期降低。当细胞接近G2-M转换时，在没有实质性DNA损伤的情况下，PLK1将WEE1磷酸化，然后通过泛素连接酶的复合物将WEE1降解。PLK1还磷酸化和激活蛋白磷酸酶细胞分裂周期25同系物(CDC25)，然后通过去磷酸化激活CDK1。激活的CDK1则具有结合细胞周期蛋白B的能力，促进细胞进入有丝分裂。
在DNA损伤的情况下，ATM蛋白激酶或ATR蛋白激酶途径选择性地优先激活。Y由于电离辐射和药物引起双链DNA断裂则ATM被激活。它磷酸化和激活CHK2，CHK2使CDC25C的216处丝氨酸磷酸化，促进与14-3-3s蛋白质结合，细胞核输出和CDC25C的细胞质隔离。CDC25C磷酸酶活性的抑制导致CDK1/cyclinB复合体的抑制性磷酸化，使CDK1保持无活性状态并阻止细胞进入有丝分裂。相反，ATR在广泛导致单链DNA断裂的基因毒性应激中被激活。ATR磷酸化并激活CHK1，然后CHK1磷酸化WEE1和CDC25C，由此激活WEE1激酶活性和灭活CDC25C磷酸酶活性。然后，WEE1在CDK1-细胞周期蛋白B复合物的酪氨酸15上磷酸化，并灭活，导致G2中的细胞周期停滞，从而允许有时间进行DNA修复。
G1检查点在许多癌症中失调，这损害了细胞在复制之前停止细胞周期以修复DNA损伤的能力(S期)。这为癌细胞提供了一种积累突变的方法，并增加了有利于增殖的不规则性。因此，癌细胞依赖于G2-M检查点来防止过度的DNA损伤，在那里通过有丝分裂的灾难规避细胞凋亡。这表明废除G2-M检查点将选择性地影响肿瘤细胞，而对具有G1和G2-M检查点功能的正常细胞仅有有限的影响。因此，WEE1激酶活性的抑制和G2-M检查点的废除以促使癌细胞进入非计划的有丝分裂并最终通过有丝分裂灾难发生细胞死亡是很有吸引力的癌症治疗策略。
除了作为G2阻滞门控作用之外，WEE1在细胞分裂的调控中也起关键作用，并且通过CDK1和CDK2上保守的酪氨酸残基的抑制性磷酸化，它控制在S期期间进入有丝分裂和DNA复制。还有证据表明WEE1在协调细胞大小和细胞周期进程的有丝分裂检查点中起作用。此外，最近的研究暗示WEE1稳定复制叉和同源重组修复。WEE1的表观遗传学功能也已被描述，其中WEE1使组蛋白H2B在组蛋白基因簇上游的核小体中磷酸化，抑制S期晚期的组蛋白转录。总之，这些发现支持了WEE1在DNA修复和维持基因组完整性方面的重要作用，WEE1可能是癌症治疗中可行的治疗靶点。
WEE1在多种癌症类型中高度表达，包括肝细胞癌，乳腺癌，宫颈癌，肺癌，鳞状细胞癌，桥内弥漫性脑胶质瘤[DIPG]，胶质母细胞瘤，成神经管细胞瘤，白血病，黑色素瘤和卵巢癌。WEE1的高表达已经在一些癌症中被报道，以响应升高的复制压力，并且已经与肿瘤进展和无病存活率差相关联。而在非小细胞肺癌中，缺乏WEE1表达与预后不良相关。这些研究表明，缺乏WEE1表达的癌症易于发生遗传畸变，并且可能对DNA损伤性药物的敏感性增加，用这些药剂治疗可能诱导WEE1的表达。相比之下，表达WEE1的肿瘤细胞可能更依赖于完整的G2-M检查点得以存活和进行有丝分裂。因此，抑制WEE1激酶活性可能使依赖于功能性G2-M检查点的癌症对DNA损伤疗法更敏感.
虽然WEE1激酶活性对肿瘤细胞的信号传导中起着至关重要的作用。迄今为止，已经开发WEE1小分子抑制剂却很少。在目前报到的WEE1激酶抑制剂中，大部分化合物应为选择性低而未能够进入到临床研究，如：吡啶并嘧啶化合物PD0166285，虽然报道在多种肿瘤胞瘤细胞系和异种移植瘤模型中的展示作用，但其用作WEE1抑制剂却因非选择性而受到限制。同样，包括PD0407824的这些吡咯并咔唑化合物作为WEE1抑制剂尚未进入体内研究，因为这些化合物的核心结构类似于广谱激酶抑制剂星形孢菌素核心结构。
目前进入临床的WEE1抑制剂AZD1775(以前称为MK-1775)同样存在选择性的问题。在报道中，AZD1775在体外放射性标记的ATP激酶试验中显示对1.0mM的八种其他激酶的抑制率大于80％。对于这些激酶中的七种激酶测定的IC50值比WEE1(IC50＝5nM)低10倍，比原癌基因Src家族酪氨酸激酶YES1(IC50＝14nM)低2-3倍。激酶相互作用网络研究将ABL1，LCK，LRRK2，TNK2和SYK鉴定为AZD1775的靶标，Ki值低于1mM。AZD1775与具有不同作用模式的DNA损伤剂联合用药,包括抗代谢物(卡培他滨，5-氟尿嘧啶，吉西他滨和培美曲塞)，DNA交联剂(卡铂，顺铂和丝裂霉素C)或拓扑异构酶抑制剂(喜树碱和多柔比星)在p53缺陷或p53突变的宫颈，结肠，肺和胰腺细胞系中表现出增强的抗肿瘤效力。这些结果支持有丝分裂致死性的基本原理，即p53功能性缺陷的癌症，G1-S检查点的关键组分,更依赖于G2-M检查点以修复DNA损伤，并且通过WEE1抑制消除G2-M检查点使p53缺陷细胞对DNA损伤剂敏感。作为单一药物，AZD1775比一些DNA损伤剂对细胞活力具有更强的作用。围绕AZD1775的核心吡唑并嘧啶环结构的SAR研究揭示其强效的细胞毒性可能与WEE1抑制无关，而可能是由于与其它细胞靶标的相互作用所致。这一点被AZD1775的羧酸甲酯衍生物CJM061的作用所证实，其抑制WEE1的活性达到与AZD1775相同的纳摩尔范围，但显著降低了单药细胞毒性，并且在髓母细胞瘤中显示与顺铂联合用药的协同活性。这些研究支持进一步的药物化学努力是必要的，以产生对WEE1选择性增加的小分子抑制剂。证实了可以开发具有改善的选择性和毒性特征的基于吡唑并嘧啶的WEE1抑制剂的可能性。除了抑制其他激酶之外，AZD1775的细胞毒性作用可能是与其他酶，离子通道或受体的相互作用所导致。
在AZD1775所进行的I期临床研究中(NCT01748825)中的单一药剂的安全性和最大耐受剂量(MTD)为每周口服225mg，每周2.5天，每21天中2周，其剂量限制性毒性为快速性心律失常和骨髓抑制。临床前评估表明AZD1775不太可能分布到神经区室内，这可能会限制其在脑肿瘤中的功效并限制了其适用于化疗急需的脑肿瘤治疗的适用性。因此，可能需要开发另外的WEE1抑制剂，其能够穿透血脑屏障以改善DNA损伤药物对脑部肿瘤治疗的效力。
发明内容
本发明所提供的一类二氢异吲哚-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶酮化合物作为新一代的Wee1选择性抑制剂，相对于现有的Wee1抑制剂，本发明化合物对于Wee1激酶有更好的选择性，从而更加安全和更高的治疗指数，也有更好的血脑屏障渗透性，因而具有更好的安全性和更广的适应范围，应用于各种肿瘤的治疗，包括脑瘤的治疗。
本发明一方面提供了一种式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
X1选自N和C；
X2和X3各自独立地选自C、O、N和S；
Y1和Y2各自独立地选自S、O、C和N；
n为0或1；
R6，R7各自独立地选自H、羟基、羧基、硝基、卤素、氰基、叠氮、氨基、酰基、磺酰基、巯基、-SCH3、-SO2CH3、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基；
R8，R9各自独立地选自H、C1-C3烷基；
R1，R2，R3，R4，R5各自独立地选自H、卤素、未取代或取代的-CO-(C1-C4)烷基、未取代或取代的C1-C4烷基、未取代或取代的C2-C4烯基、未取代或取代的C2-C4炔基、氰基、氨基；其中，所述取代是指被选自如下的一种或多种取代基所取代：C1-C4烷基、羟基、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基取代的氨基；
或者
R1、R5与X2、Y2共同形成未取代或被C1-C4烷基所取代的4-7元饱和环烷烃、未取代或被C1-C4烷基所取代的4-7元饱和杂环烷烃，所述杂环烃为含有1-3个选自O、N的杂原子的环烷烃；
或者
R1、R2与Y2共同形成羰基、未取代或取代的3-7元饱和环烷烃；其中，所述取代是指被选自如下的一种或多种取代基所取代：C1-C4烷基、卤素、羟基、氨基；
或者
R3、R4与Y1共同形成羰基、未取代或取代的3-7元饱和环烷烃；其中，所述取代是指被选自如下的一种或多种取代基所取代：C1-C4烷基、卤素、羟基、氨基；
或者
Y1、Y2、X2、X3、及与Y1和Y2相连的苯基，以Y1和Y2为桥头原子，通过R1形成苯并桥环烷基或含有1～3个选自N、O、S的杂原子的苯并桥环杂烷基；其中，R1优选为亚甲基、-NH-或-CH2-CH2-；
其中，
当
为双键或X2为O或S时，R5不存在；
当
为双键且X2为N时，R5不存在；
当Y1为O时，R3和R4不存在；
当Y2为O时，R1和R2不存在，且
为单键；
当Y1为N时，R4不存在；
当
为双键且Y2为N时，R1和R2不存在；
当
为单键且Y2为N时，R2不存在；
当X3为O或S时，R8和R9不存在；
当X3为N时，R9不存在。
优选地，
X1选自N和C；
X2和X3各自独立地选自S、C、O和N；
Y1和Y2各自独立地选自S、O、C和N；
n为0或1；
R6，R7各自独立地选自H、羟基、F、Cl；
R8，R9各自独立地选自H、甲基；
R1，R2，R3，R4，R5各自独立地选自H、F、Cl、未取代或取代的-CO-(C1-C4)烷基、未取代或取代的C1-C4烷基、(C1-C4)烷基-NH-CN-、NH2-CN-；其中，所述取代是指被选自如下的一种或多种取代基所取代：C1-C4烷基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基取代的氨基；
或者
R1、R5与X2、Y2共同形成未取代或被C1-C4烷基所取代的4-7元饱和环烷烃、未取代或被C1-C4烷基所取代的4-7元饱和杂环烷烃，所述杂环烃为含有1-3个选自O、N的杂原子的环烷烃；
或者
R1、R2与Y2共同形成羰基、未取代或被C1-C4烷基所取代的3-7元饱和环烷烃；
或者
R3、R4与Y1共同形成羰基、未取代或被C1-C4烷基所取代的3-7元饱和环烷烃；
或者
Y1、Y2、X2、X3、及与Y1和Y2相连的苯基，以Y1和Y2为桥头原子，通过R1形成苯并桥环烷基或含有1～3个选自N、O、S的杂原子的苯并桥环杂烷基；其中，R1为亚甲基、-NH-或-CH2-CH2-；
其中，
当
为双键或X2为O或S时，R5不存在；
当
为双键且X2为N时，R5不存在；
当Y1为O时，R3和R4不存在；
当Y2为O时，R1和R2不存在，且
为单键；
当Y1为N时，R4不存在；
当
为双键且Y2为N时，R1和R2不存在；
当
为单键且Y2为N时，R2不存在；
当X3为O或S时，R8和R9不存在；
当X3为N时，R9不存在。
更优选地，式(I)所示的化合物选自如下具体化合物：
本发明还提供了式(I)所示的化合物的制备方法，其包括如下步骤：
Int-1或Int-2与中间体1(苯并胺类化合物)发生缩合反应，生成式(I)所示的化合物；其中，当反应物为Int-1时，其先与氧化剂发生氧化反应，氧化反应产物不经分离纯化直接与中间体1发生缩合反应。所述氧化剂可以为m-CPBA等。
所述缩合反应可以在碱的存在或不存在的情况下进行。
优选地，所述碱选自三乙胺、DIEA、K2CO3等。
所述缩合反应可以在溶剂的存在或不存在的情况下进行。
优选地，所述溶剂选自水、乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲苯等中的一种或多种。
优选地，所述碱的加入量为1-10当量。
所述的反应温度为-80～200℃，反应时间为0～80h。
对反应产物中的有机相用水溶液(如碳酸氢钠溶液、氯化钠水溶液)洗涤，并用干燥剂(如无水硫酸钠、无水硫酸镁、无水硫酸钙等)干燥，过滤，滤液浓缩除去溶剂，得到粗产品，粗产品通过用柱层析,或制备液相,或从结晶等方法分离或纯化出产品。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐。所述药物组合物可以用于人或动物疾病的预防或治疗。在所述药物组合物中，除了本发明的活性成分之外，还可以含有一种或多种可以协同使用的活性成分。在所述药物组合物中，除了活性成分之外，还可以含有药用辅料。这些药用辅料可以由所属领域技术人员根据需要从公知的药用辅料中选取。此外，可以将所述药物组合物制成任意适宜的剂型，包括，但不限于，针剂，口服制剂，皮肤或肌肉注射制剂，眼用制剂，全身或局部施用的剂型。
另一方面，本发明提供了所述式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备Wee1激酶抑制剂中的应用。
另一方面，本发明提供了所述式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防一种或者多种Wee1激酶相关的疾病的药物中的应用。
所述Wee1激酶相关的疾病包括癌症、代谢性疾病、免疫性疾病。
所述癌症包括，但不限于，肺癌，胃癌，乳腺癌，膀胱癌，胰腺癌，直肠癌，肝癌，血液瘤等。所述血液瘤包括，但不限于，各种白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。所述代谢性疾病包括但不限于糖尿病，高血脂，肥胖，冠心病；所述免疫性疾病包括但不限类风湿关节炎，红斑狼疮，,银屑病等。
本发明的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐可以单独用于上述疾病的治疗和/或预防，也可以与其他药物(如生物大分子药物等)联合应用。所述生物大分子药物，包括各种抗体，酶，蛋白和核酸药物或制剂。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
本发明化合物或其药学上可接受的盐可以存在为其水合物，溶剂化物或前药的形式。因此，本发明化合物或其药学上可接受的盐的水合物，溶剂化物或前药也包括在本发明的范围内。
这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐(即药学上可接受的盐)，实例包括无机酸盐以及有机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；所述有机酸包括如苯甲酸、2-羟基乙磺酸、氨基磺酸、苯磺酸、苯乙酸、扁桃酸、丙二酸、丙酸、草酸、对氨基苯磺酸、对甲苯磺酸、多聚半乳糖醛、反丁烯二酸、泛酸、富马酸、谷氨酸、琥珀酸、甲烷磺酸、酒石酸、抗坏血酸、邻苯二甲酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、葡庚糖、葡糖酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、双羟萘酸、水杨酸、辛二酸、亚磷酸等；亚乙酸、依地酸、乙醇酸、乙酸、乙烷磺酸、异丁酸、硬脂酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐(参见Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",Journal of PharmaceuticalScience 66:1-19(1977))。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。化合物的母体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。
术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。关于载体的其他信息，可以参考Remington：The Science and Practice ofPharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins(2005)，该文献的内容通过引用的方式并入本文。
针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，可以包括重氢和氢的变体，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代。酮取代不会发生在芳香基上。
当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被0-2个R所取代，则所述基团可以任选地至多被两个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
本发明所使用的溶剂可经市售获得。
本发明采用下述缩略词：
1H-NMR代表质子核磁共振光谱；
1Ci＝3.70×1010Bq，其中Bq为贝克勒，放射性的SI单位相当于每秒1次崩解(dps)；
CD3OD代表氘甲醇；
CHCl3代表三氯甲烷；
Ci代表居里(非标准放射性单位)；
d代表双峰；
DCM，CH2Cl2，代表二氯甲烷；
DMF代表N,N-二甲基甲酰胺；
DMSO代表二甲基亚砜；
dq代表双四重峰；
EC50代表半数有效浓度(在指定暴露时间后，药物、抗体或毒物诱发反应在基线和最大值之间一半的有效浓度)；
eq代表当量、等量；
HPLC代表高效液相色谱；
J代表NMR偶联常数；
LCMS代表液相色谱-质谱；
LDA代表二异丙基胺基锂；
m代表多重峰；
M代表摩尔每升；
mCi代表毫居里；
m-CPBA代表3-氯过氧苯甲酸；
mM代表毫摩尔每升；
mmol代表毫摩尔；
nL代表纳升；
nM代表纳摩尔每升；
PE代表石油醚；
PY代表吡啶；
q代表四重峰
s代表单峰；
THF代表四氢呋喃；
TLC代表薄层色谱；
TR代表保留时间；
t代表三重峰；
v/v代表体积/体积。
化合物经手工或者
软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。作为新型的Wee1抑制剂，本发明的化合物具有显著的酶学活性，细胞活性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明不限于下述实施例。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
预备实施例：中间体Int-1(2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮，英文名：2-allyl-1-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-2-yl)-6-(methylsulfonyl)-1,2-dihydro-3H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-3-one)的制备：
步骤一：4-(2-烯丙基-2-(叔丁氧基羰基)肼基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(ethyl 4-(2-allyl-2-(tert-butoxycarbonyl)hydrazinyl)-2-(methylthio)pyrimidine-5-carboxylate)(化合物S-2)
向化合物S-1(20g)和4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(24g)的THF(220mL)溶液中加入DIEA(38g)。然后在75℃下搅拌12小时。减压除去溶剂，并向残余物中加入乙醚(100mL)，搅拌10分钟,过滤，滤液在真空下浓缩，残余物(粗品S-2，38g)将直接用在下一步反应中。LCMS(ES,m/z)：369.1
[M+H]+。
步骤二：4-(2-烯丙基肼基)-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(化合物S-3)
将TFA(80mL)在冰浴的条件下加入到化合物S-2(38g)中，并在室温下搅拌5个小时。减压除去溶剂，残余物(粗品S-3，35g)直接用于下一步反应中。
步骤三：2-烯丙基-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物S-4)
将化合物S-3(35g)溶解在乙醇(100mL)中，然后冰水浴下逐滴加入NaOH溶液(172mL，6mol/L)。室温搅拌5小时，冰水浴降温，缓慢加入浓盐酸(80mL)，用CHCl3/EtOH(150mL/30mL)萃取4次，合并起来的有机相用饱和食盐水洗一次，然后用无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂，向残余物中加入乙醚(150mL)，搅拌10分钟，过滤得到黄色固体即目标产物S-4(17g)。LCMS(ES,m/z)：223.1[M+H]+。
步骤四：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物Int-1)
将化合物N1,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(872mg)加入到化合物S-4(2g)，和2-(6-溴吡啶-2-基)丙-2-醇(2.3g)，CuI(1.7g)和碳酸钾(2.5g)的1,4-二氧六环(25mL)中。氮气保护下加热到100℃并搅拌12小时。冷却到室温，向反应体系中加入饱和的氯化铵溶液(50mL)，DCM萃取，有机相用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。残余物用柱层析(DCM/MeOH，45:1，v/v)纯化得到目标产物Int-1(1.8g)为淡黄色固体。LCMS(ES,m/z)：358.1[M+H]+。
步骤五：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲基磺酰基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(Int-2)
在冰水浴下向化合物Int-1(2.0g)的DCM溶液(50mL)中加入m-CPBA(2.95g)，在室温下搅拌过夜，加水稀释，并用DCM 100mL萃取，有机相用碳酸氢钠洗涤3次后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空下浓缩，残余物用柱层析(DCM/MeOH，45:1，v/v)纯化得到目标产物Int-2(1.8g)为淡黄色固体LCMS(ES,m/z)：390.1[M+H]+。
实施例1：2-烯丙基-6-((1,3-二甲基二氢异吲哚-5-基-)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B001)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A01(58mg)和DIEA(100mg)，在室温下搅拌5小时。加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B001(35mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：472.2[M+H]+。
实施例2：2-烯丙基-6-((1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(HY-B002)
向含有化合物Int-1(100mg)的甲苯溶液中加入m-CPBA(72mg)，然后室温搅拌过夜。将DIEA(108mg)和化合物A02(45mg)加到该溶液中，然后室温再搅拌8个小时。加入乙酸乙酯(50mL)，有机相用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤3次，并用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空除去溶剂，向残留物中加入乙酸乙酯(2mL)，析出白色固体，过滤，固体经过干燥得到目标产物HY-B002(23mg)。LCMS(ES,m/z)：445.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.59(s,6H),3.87(br s,1H),4.75(d,J＝6.4Hz,2H),4.93(d,J＝16.4Hz，1H),5.05(d,J＝10.0Hz,1H),5.12(s,4H),5.66-5.73(m，1H),7.21(d,J＝7.6Hz,1H),7.35-7.38(m,2H),7.51(s,1H),7.65(s,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.86(t,J＝8.0Hz,1H),8.87(s,1H)。
实施例3：2-烯丙基-6-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B003)
向含有化合物Int-1(100mg)的甲苯溶液中加入m-CPBA(97mg)，然后室温搅拌20分钟。将DIEA(108mg)和化合物A03(51mg)加到该溶液中，然后室温再搅拌过夜。加入乙酸乙酯(50mL)，有机相用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤3次，并用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空除去溶剂，向残留物中加入石油醚/乙酸乙酯(3mL,2:1)，析出白色固体，过滤，固体经过干燥得到目标产物HY-B003(83mg)。LCMS(ES,m/z)：461.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.59(s,6H),3.91(br s,1H),4.26-4.30(m,4H),4.76(d,J＝6.4Hz,2H),4.94(d,J＝17.2Hz，1H),5.05(d,J＝10.4Hz,1H),5.66-5.72(m，1H),6.83(d,J＝8.4Hz,1H),6.88-6.91(m,1H),7.34-7.38(m,3H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.89(t,J＝8.0Hz,1H),8.84(s,1H)。
实施例4：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3-三甲基异吲哚啉-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B004)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A01(65mg)和DIEA(100mg)，在室温下搅拌5小时。加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B004(51mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：486.3[M+H]+。
实施例5：6-([1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-b]吡啶-6-基氨基)-2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-1氢-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(HY-B005)
第一步：2,3-二羟基5-溴-吡啶(化合物5-2)
向呋喃-2-甲醛(20g)和冰(200g)的混合物中缓慢的加入溴素(11mL),在0℃下搅拌30分钟，再加入浓HCl(11mL)继续搅拌30分钟，然后在-5℃下滴加溴素(11mL)，搅拌1小时。过滤，向滤液中加入氨基磺酸(21g)，然后在50℃下搅拌1.5小时，冷却到室温，过滤，得到的滤饼在冰醋酸中重结晶得到目标化合物5-2(10.1g)为灰色固体。LCMS(ES,m/z)：189.9[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.9(br s,1H),9.6(br s,1H),7.09(d,J＝2.4Hz,1H),6.79(d,J＝2.4Hz,1H)。
第二步：6-溴-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-b]吡啶(化合物5-3)
将化合物5-2(9.5g)，二溴甲烷(17.4g)，K2CO3(13.8g)和CuO(0.8g)溶解在DMF(250mL)中，在130℃下搅拌过夜。冷却到室温，过滤，向滤液中加入水稀释，DCM萃取三次，有机相用饱和食盐水洗涤，干燥，过滤。将滤液浓缩，通过柱层析(PE/EA，5:1,v/v)纯化，最终得到目标化合物5-3(1.1g)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：201.9[M+H]+。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(CDCl3,400MHz)δ7.72(d,J＝2.0Hz,1H),7.11(d,J＝2.4Hz,1H),6.10(s,2H)。
第三步：N-(二苯基亚甲基)-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-b]吡啶-6-胺(化合物5-4)
将化合物5-3(1.0g)，二苯甲基亚胺(1.4g)，Pd2(dba)3(453mg)，di-tBu(xphos)(420mg)和tBuONa(1.2g)溶解在甲苯(30mL)中，在氮气保护下，室温搅拌4小时。反应液通过DCM萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，干燥，过滤。将滤液浓缩，通过制备纯化，最终得到目标化合物5-4(1.3g)为黄色固体。LCMS(ES,m/z)：303.1[M+H]+。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.72(d,J＝6.8Hz,2H),7.48(t,J＝6.8Hz,1H),7.40(t,J＝8.0Hz,2H),7.34-7.31(m,3H),7.14-7.12(m,2H),7.08(d,J＝2.0Hz,1H),6.50(d,J＝2.4Hz,1H),6.00(s,2H)。
第四步：[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-b]吡啶-6-胺(化合物5-5)
向化合物5-4(1.25g)的THF(16mL)中加入浓盐酸(2mL)，室温下搅拌2小时。向反应液中加入水，水相碱化，然后用DCM萃取，将有机相干燥，过滤，浓缩，通过反相Flash纯化，得到化合物5-5(440mg)为棕色固体。LCMS(ES,m/z)：139.0[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ6.90(d,J＝2.0Hz,1H),6.57(d,J＝2.0Hz,1H),5.95(s,2H),4.89(br s,2H)。
第五步：6-([1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-b]吡啶-6-基氨基)-2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-1氢-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B005)
在冰水浴下向化合物5-5(100mg)的甲苯溶液(5mL)中加入m-CPBA(145mg)，在室温下搅拌过夜，然后加入Int-1(58mg)和DIEA(108mg)，在室温下搅拌5小时。加水稀释，DCM萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，制备得到目标产物HY-B005(16mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：448.2[M+H]+。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.86(s,1H),7.91(t,J＝7.6Hz,1H),7.73(s,1H),7.69(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(s,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),6.11(s,2H),5.74-5.67(m,1H),5.05(d,J＝10.6Hz,1H),)4.94(d,J＝14.8Hz,1H),4.74(d,J＝6.4Hz,2H),3.86(s,1H),1.58(s,6H)。
实施例6：2-烯丙基-6-(苯并[d]异恶唑-5-基氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B006)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A06(65mg)和DIEA(100mg)，在室温下搅拌5小时。加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B006(32mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：444.2[M+H]+。
实施例7：2-烯丙基-6-(2,3-二氢-1H-1,3-环亚胺茚-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B007)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A07(70mg)和DIEA(100mg)，在室温下搅拌5小时。加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B007(43mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：456.3[M+H]+。
实施例8：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B008)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A08(78mg)和DIEA(100mg)，在室温下搅拌5小时。加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B008(40mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：470.2[M+H]+。
实施例9：22-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2-甲基-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B009)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A09(78mg)和DIEA(100mg)，在室温下搅拌5小时。加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B009(65mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：484.6[M+H]+。
实施例10：2-烯丙基-6-((2,2-二甲基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B010)
第一步：4-溴-2-((2-甲基烯丙基)氧基)苯酚(化合物10-2)
向含有化合物10-1(2.0g)和碳酸钾(1.6g)的DMF(500mL)溶液中加入化合物3-氯-2-甲基丙-1-烯(963mg)，然后室温搅拌过夜。加入饱和氯化铵溶液后用HCl(1N)调pH到4，然后用DCM萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空下除去溶剂。残留物用柱层析(PE/EA，50:1，v/v)纯化得到目标产物10-2(800mg)为无色油状物。
第二步：6-溴-2,2-二甲基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯(化合物10-3)
将上一步得到的初产物10-2溶在甲酸(12mL，98％)中，然后加热回流5小时。真空下除去甲酸，残余物用柱层析(PE/EA，100:1，v/v)得到初产物10-3，再使用手性拆分的方法得到干净的化合物10-3(160mg)为无色油状物。
第三步：N-(二苯基亚甲基)-2,2-二甲基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧六环-6-胺(化合物10-4)
将叔丁醇钠(160mg)加入到化合物10-3(160mg)，二苯甲基亚胺(156mg)，Pd2(dba)3(61mg)和di-tBu(xphos)(56mg)的甲苯(15mL)溶液中，然后氮气保护下室温搅拌12个小时。向反应体系中加入饱和氯化铵溶液，用DCM萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空下除去溶剂，得到的残余物(250mg，粗品)直接用于下一步反应中。
第四步：2,2-二甲基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-胺(化合物10-5)
将化合物10-4(250mg，粗品)溶在THF(10mL)中，加入HCl(4mL，4N)，室温搅拌3个小时。反应结束后加入饱和氯化铵溶液，用DCM萃取两次，水相再用NaOH(2N)调pH到9，然后用DCM萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，真空下除去溶剂，得到的残余物为黄色的油状物10-5(100mg，粗品)直接用于下一步反应中。
第五步：2-烯丙基-6-((2,2-二甲基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧六环-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B010)
向含有化合物Int-1(100mg)的甲苯(8mL)溶液中加入m-CPBA(97mg)，然后室温搅拌20分钟。将DIEA(108mg)和化合物10-5(60mg)加到该溶液中，然后室温再搅拌36个小时。加入EA(50mL)，有机相用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤3次，并用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空除去溶剂，向残留物中加入PE/EA(3mL，v/v＝1:1)，析出黄色固体，过滤，固体经过干燥得到目标产物HY-B010(66mg)。LCMS(ES,m/z)：489.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.36(s,6H),1.58(s,3H),1.60(s,3H),3.91(s,1H),3.92(s,2H),4.75(d,J＝6.4Hz,2H),4.94(d,J＝16.0Hz，1H),5.04(d,J＝10.0Hz,1H),5.67-5.74(m，1H),6.79(d,J＝8.8Hz,1H),6.93(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),7.33-7.36(m,3H),7.80-7.89(m,2H),8.83(s,1H)。
实施例11：6-((2-乙酰基异吲哚啉-5-基)氨基)-2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B011)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A011(75mg)和DIEA(100mg)，在室温下搅拌14小时。加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B011(60mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：486.2[M+H]+。
实施例12：2-烯丙基-6-((4-氟-1,3-二甲基-1H-吲唑-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B012)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A09(82mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B009(73mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：488.2[M+H]+。
实施例13：2-烯丙基-6-((2-((二甲基氨基)甲基)苯并呋喃-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B013)
第一步：N，N-二甲基-5-硝基苯并呋喃-2-甲酰胺(化合物2)
将化合物1(300mg)和HATU(551mg)溶解在DMF(10mL)中，向其中滴加DIEA(561mg)，室温下搅拌15分钟后，然后将二甲胺(2.2mL,2.0M溶于THF)加入到该反应体系中。室温搅拌20小时，用饱和的氯化铵溶液稀释，乙酸乙酯萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到的残余物2(粗品，320mg)将直接用在下一步反应中。LCMS(ES,m/z)：235.1[M+H]+。
第二步：N，N-二甲基-1-(5-硝基苯并呋喃-2-基)甲胺(化合物3)
向化合物2(粗品，320mg)溶解在THF(10mL)中，室温下滴加硼烷四氢呋喃溶液(7mL，1.0M in THF)，然后升温到60℃反应2小时。冷却到室温，加入盐酸(5mL，6.0M)在60℃下搅拌3小时。用饱和的氯化铵溶液稀释，DCM萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到的残余物(粗品，150mg)将直接用在下一步反应中。LCMS(ES,m/z)：221.1[M+H]+。
第三步：2-((二甲基氨基)甲基)苯并呋喃-5-胺(A13)
将化合物3(150mg)溶解在乙醇(5mL)中，加入Pd/C(15mg，10％)，然后在套上氢气球并室温搅拌15小时。过滤，滤液减压除去溶剂，得到的残余物通过反相制备得到目标产物A13(50mg)为黄色油状物。LCMS(ES,m/z)：191.1[M+H]+。
第四步：2-烯丙基-6-((2-((二甲基氨基)甲基)苯并呋喃-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(HY-B013)
向化合物4(85mg)的甲苯溶液(5mL)中加入m-CPBA(124mg)，在室温下搅拌过夜，然后加入A13(45mg)和DIEA(154mg)，室温下搅拌过夜。冷却到室温，加水稀释，并用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用碳酸氢钠洗涤3次后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空下除去溶剂，残余物用反相制备得到粗品，粗品再用薄层色谱法TLC(DCM/MeOH，15:1，v/v)纯化得到最终产物HY-B013(19mg)。LCMS(ES,m/z)：500.0[M+H]+。
1H NMR(CD3OD,400MHz)δ8.86(s,1H),8.03-7.98(m,2H),7.82(d,J＝8.0Hz,1H),7.67(d,J＝8.0Hz,1H),7.50-7.44(m,2H),6.78(s,1H),5.77-5.71(m,1H),5.06(d,J＝10.4Hz,1H),4.94(d,J＝16.4Hz,1H),4.85(d,J＝6.0Hz,2H),3.79(s,2H),2.43(s,6H),1.59(s,6H)。
实施例14：2-烯丙基-6-((2-((二甲基氨基)甲基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(HY-B014)
第一步：(6-硝基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-2-基)甲基甲磺酸酯(化合物1-2)
在冰水浴下向化合物1-1(360mg)和DIEA(550mg)的二氯甲烷溶液(20mL)溶液中加入MsCl(162mg)，在室温下搅拌过夜。加水稀释，DCM萃取三次，合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，得到目标产物1-2(450mg)为黄色固体。LCMS(ES,m/z)：290.0[M+H]+。
第二步：N，N-二甲基-1-(6-硝基-2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-2-基)甲胺(化合物1-4)
将化合物1-2(360mg)，1-3(112mg)和DIEA(401mg)溶解在DMF(5mL)中，在120℃下封管反应过夜。冷却到室温后加水稀释，DCM萃取三次，合并的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。通过硅胶色谱柱(PE:EA(v/v)＝1:1)分离纯化，得到目标化合物1-4(66mg)为黄色油状液体。LCMS(ES,m/z)：239.1[M+H]+。
第三步：2-((二甲基氨基)甲基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-胺(化合物1-5)
将化合物1-4(66mg)和Pd/C(10mg)溶解在甲醇(10mL)中，室温下搅拌两天。将反应液过滤，浓缩得到目标化合物1-5(60mg)为棕色固体。LCMS(ES,m/z)：209.1[M+H]+。
第四步：2-烯丙基-6-((2-((二甲基氨基)甲基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B014)
在冰水浴下向化合物1-6(60mg)的甲苯溶液(5mL)中加入m-CPBA(87mg)，在室温下搅拌过夜，然后加入1-5(45mg)和DIEA(65mg)，然后在套上氢气球并室温搅拌过夜，加水稀释，DCM萃取三次，合并的有机相用碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，制备得到目标产物HY-B014(16.0mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：518.2[M+H]+。
1H NMR(CD3OD,400MHz)δ8.70(s,1H),7.88(t,J＝8.0Hz,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.36(s,1H),6.92(d,J＝6.8Hz,1H),6.72(d,J＝8.4Hz,1H),5.65-5.59(m,1H),4.94(d,J＝7.6Hz,1H),4.80(d,J＝12.0Hz,1H),4.73(d,J＝7.6Hz,2H),4.25-4.20(m,2H),3.89-3.85(m,1H),2.61-2.48(m,2H),2.28(s,6H),1.48(s,6H).
实施例15：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2-甲基-1,2,3,4-四氢吡嗪并[1,2-a]吲哚-8-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B015)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A05(80mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B015(41mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：511.3[M+H]+。
实施例16：2-烯丙基-6-((2-((二甲基氨基)甲基)苯并[d]恶唑-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(HY-B016)
第一步：2-(氯甲基)-6-硝基苯并[d]恶唑(化合物16-2)
将化合物1(2.0g)溶解在氯苯(25mL)中，冰水浴下向其中滴加化合物2-氯乙酰氯(1.6g)和吡啶(51mg)，室温下搅拌2小时。然后将化合物4-甲基苯磺酸(223mg)加入到该反应体系中并加热到135℃反应15小时，冷却到室温，过滤，滤液用饱和的氯化铵溶液稀释，并用稀盐酸(0.5mol/L)调节pH<7，然后用乙酸乙酯(50mL)萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到的残余物(粗品，700mg)将直接用在下一步反应中。LCMS(ES,m/z)：213.0[M+H]+。
第二步：N，N-二甲基-1-(6-硝基苯并[d]恶唑-2-基)甲胺(化合物16-3)
向25mL的封管中加入化合物16-2(粗品，650mg)，二甲胺(2.8mL，2.0mol/L inTHF)，DIEA(1.1g)和DCM(10mL)，然后封住瓶口并加热到30℃过夜。冷却到室温，用饱和的碳酸氢钠溶液稀释，并用DCM萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到的残余物(粗品，600mg)将直接用在下一步反应中。LCMS(ES,m/z)：222.1[M+H]+。
第三步：2-((二甲基氨基)甲基)苯并[d]恶唑-6-胺(化合物A016)
将化合物16-3(300mg)溶解在乙醇(15mL)中，加入Pd/C(60mg，10％)，然后在套上氢气球并室温搅拌4小时。过滤，滤液减压除去溶剂，得到的残余物通过反相制备得到目标产物A016(200mg)为黄色固体。LCMS(ES,m/z)：192.1[M+H]+。
第四步：2-烯丙基-6-((2-((二甲基氨基)甲基)苯并[d]恶唑-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B016)
向化合物Int-1(100mg)的甲苯溶液(15mL)中加入m-CPBA(150mg)，在室温下搅拌过夜，然后加入化合物A016(80mg)和DIEA(180mg)，室温下搅拌过夜。加水稀释，并用EA萃取，合并的有机相用碳酸氢钠洗涤3次后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空下除去溶剂，向残余物中加入甲醇(3mL)，放在超声清洗机中超声5分钟，过滤，滤饼用甲醇淋洗3次，然后干燥得到最终产物HY-B016(49mg)为黄色固体。LCMS(ES,m/z)：501.3[M+H]+。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.83(s,1H),7.91-7.85(m,2H),7.7.34-7.32(m,1H),7.26-7.25(m,2H),7.66-7.00(m,2H),5.73-5.70(m,1H),5.03(d,J＝10.4Hz,1H),4.94(d,J＝17.2Hz,1H),4.76(d,J＝6.4Hz,2H),4.70(s,2H),3.94(s,1H),3.09(s,6H),1.58(s,6H)。
实施例17：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,3,8-三甲基-2,3-二氢-1H-1,3-环亚胺基茚-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B017)
在冰水浴下向化合物Int-2(117mg)的DMF(5mL)溶液中加入A017(56mg)和DIEA(100mg)，在30℃下搅拌10小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B0017(52mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：497.3[M+H]+。
实施例18：2-烯丙基-6-((1,3-二甲基-2,3-二氢-1H-1,3-环亚胺基茚-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B018)
在冰水浴下向化合物Int-2(118mg)的DMF(5mL)溶液中加入A018(54mg)和DIEA(100mg)，在30℃下搅拌24小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B018(56mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：483.2[M+H]+。
实施例19：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B019)
在冰水浴下向化合物Int-2(117mg)的DMF(5mL)溶液中加入A019(52mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B019(51mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：470.2[M+H]+。
实施例20：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a，5-六氢苯并[b]吡嗪并并[1,2-d][1,4]恶嗪-8-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(HY-B020)
第一步：3-甲基-8-硝基甲基-1,2,3,4,4a，5-六氢苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]恶嗪(化合物1-3)
向化合物1-1(230mg)和氢氧化钾(250mg)的DMSO(6mL)溶液中缓慢加入1-2(225mg)，加热到60℃搅拌2小时。加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，合并的有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，通过制备得到目标产物1-3(170mg)为棕色固体。LCMS(ES,m/z)：250.1[M+H]+。
第二步：3-甲基-1,2,3,4,4a，5-六氢苯并[b]吡嗪并[1,2-d][1,4]恶嗪-8-胺(化合物1-4)
将化合物1-3(140mg)，铁粉(310mg)和氯化铵(304mg)溶解在甲醇和水(12/3mL)的溶液中，在80℃下搅拌反应5小时。加水稀释，DCM萃取三次，合并的有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到目标化合物1-4(130mg)为黄色固体。LCMS(ES,m/z)：220.1[M+H]+。
第三步：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1,2,3,4,4a，5-六氢苯并[b]吡嗪并并[1,2-d][1,4]恶嗪-8-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B020)
在冰水浴下向化合物1-5(80mg)的甲苯溶液(5mL)中加入m-CPBA(78mg)，在室温下搅拌过夜，然后加入1-4(74mg)和DIEA(73mg)，在室温下搅拌过夜，加水稀释，DCM萃取三次，合并的有机相用碳酸氢钠洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，制备得到目标产物HY-B020(43.0mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：529.3[M+H]+。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ8.67(s,1H),7.87(t,J＝8.0Hz,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,1H),7.53(d,J＝8.0Hz,1H),7.23(s,1H),6.90(d,J＝8.0Hz,1H),6.68(d,J＝6.8Hz,1H),5.65-5.56(m,1H),4.93(d,J＝7.6Hz,1H),4.78(d,J＝12.0Hz,1H),4.73(d,J＝7.6Hz,2H),4.15(d,J＝8.8Hz,1H),3.88(t,J＝8.8Hz,1H),3.63(d,J＝8.4Hz,1H),2.99(t,J＝7.6Hz,1H),2.89(d,J＝7.6Hz,1H),2.79(d,J＝8.8Hz,1H),2.63(t,J＝12Hz,1H),2.26(s,3H),2.18(t,J＝9.6Hz,1H),1.79(t,J＝10.8Hz,1H),1.47(s,6H)。
实施例21：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(二氢异吲哚-5-基氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B021)
第一步：5-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)异二氢吲哚-2-羧酸叔丁酯(化合物3)
向化合物Int-1(200mg)的甲苯溶液(15mL)中加入m-CPBA(242mg)，在室温下搅拌过夜，然后加入5-氨基异吲哚啉-2-羧酸叔丁酯(157mg)和DIEA(217mg)，室温下过夜。加水稀释，并用乙酸乙酯萃取，有机相用碳酸氢钠洗涤3次后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空下除去溶剂，残余物用反相制备得到最终产物2(73mg)。LCMS(ES,m/z)：544.3[M+H]+。
第二步：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(二氢异吲哚-5-基氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B021)。
将化合物2(65mg)溶解在二氯甲烷的盐酸气(8mL)中，室温搅拌1小时，用水稀释，1N的氢氧化钠将溶液碱化，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，最终得到目标化合物HY-B021(40mg)。LCMS(ES,m/z)：444.3[M+H]+。1H NMR(CD3OD,400MHz):δ8.77(s,1H),7.91(t,J＝8.0Hz,1H),7.82(s,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.0Hz,1H),7.50(d,J＝6.8Hz,1H),7.24(d,J＝8.4Hz,1H),5.65-5.58(m,1H),4.92(d,J＝7.6Hz,1H),4.79(d,J＝12.0Hz,1H),4.72(d,J＝7.6Hz,2H),4.43(d,J＝7.6Hz,4H),1.47(s,6H)。
实施例22：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2-甲基二氢异吲哚-5-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B022)
在冰水浴下向化合物1-1(100mg)的甲苯溶液(7mL)中加入m-CPBA(121mg)，在室温下搅拌过夜，然后加入1-2(93mg)和DIEA(180mg)，在60℃下搅拌5小时。冷却到室温，加水稀释，DCM萃取三次，合并的有机相用碳酸氢钠洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，制备得到目标产物HY-B022(1.0mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：458.2[M+H]+。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:8.86(s,1H),8.02(t,J＝8.0Hz,1H),8.80(d,J＝8.0Hz,1H),7.76(s,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.46(d,J＝6.8Hz,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,1H),5.77-5.70(m,1H),5.06(d,J＝7.6Hz,1H),4.92(d,J＝12.0Hz,1H),4.85(d,J＝7.6Hz,2H),3.95(d,J＝7.6Hz,4H),2.64(s,3H),1.59(s,6H)。
实施例23：2-烯丙基-6-((4,4-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹-7-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(HY-B023)
第一步：7-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-4,4-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸叔丁酯(化合物HY-B23-2)
向化合物Int-1(168mg)的甲苯溶液(15mL)中加入m-CPBA(219mg)，在室温下搅拌过夜，然后加入化合物2(100mg)和DIEA(187mg)，室温下过夜。加水稀释，并用乙酸乙酯萃取，有机相用碳酸氢钠洗涤3次后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空下除去溶剂，残余物用反相制备得到最终产物3(150mg)。LCMS(ES,m/z)：586.3[M+H]+。
第二步：2-烯丙基-6-((4,4-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹-7-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B023)
将化合物3(150mg)溶解在DCM/TFA(10mL/1mL)中，室温搅拌1小时，用水稀释，1N的氢氧化钠将溶液碱化，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到目标化合物HY-B025(110mg)。LCMS(ES,m/z)：486.3[M+H]+。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:8.73(s,1H),7.91(t,J＝7.6Hz,1H),7.69(d,J＝7.6Hz,1H),7.57(d,J＝7.6Hz,1H),7.45(s,1H),7.28(d,J＝6.8Hz,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,1H),5.65-5.58(m,1H),4.92(d,J＝7.6Hz,1H),4.79(d,J＝12.0Hz,1H),4.72(d,J＝7.6Hz,2H),3.86(s,2H),2.78(s,2H),1.48(s,6H),1.20(s,6H)。
实施例24：5-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)异吲哚啉-2-甲脒(HY-B024)
第一步：5-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)异吲哚啉-2-甲脒(化合物HY-B024)
向化合物HY-B021(30mg)，化合物1(12mg)的乙腈溶液(8mL)中加入三乙胺(13mg)，在65摄氏度下搅拌72小时。将反应液冷却到室温，过滤，用乙腈溶液洗涤得到白色固体，干燥得到最终产物HY-B024(14mg)。LCMS(ES,m/z)：486.3[M+H]+。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:8.86(s,1H),8.06(t,J＝8.0Hz,1H),7.92(s,1H),7.79(d,J＝8.0Hz,1H),7.67(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(d,J＝6.8Hz,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,1H),5.76-5.68(m,1H),5.03(d,J＝7.6Hz,1H),4.89(d,J＝12.0Hz,1H),4.82(d,J＝7.6Hz,2H),4.77(d,J＝7.6Hz,4H),1.56(s,6H)。
实施例25：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氢异喹-7-基基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B025)
第一步：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氢异喹-7-基基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B025)
向化合物HY-B023(90mg)的甲醇溶液(15mL)中加入多聚甲醛(28mg)，在室温下搅拌1.5小时。然后加入醋酸硼氢花钠(24mg)和冰醋酸(57mg)，混合物在25摄氏度下搅拌两天。将反应液液用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制备，得到最终产物HY-B025(14mg)。LCMS(ES,m/z)：499.3[M+H]+。1H NMR(CD3OD,400MHz)8.73(s,1H),7.91(t,J＝7.6Hz,1H),7.69(d,J＝7.6Hz,1H),7.57(d,J＝7.6Hz,1H),7.45(s,1H),7.28(d,J＝6.8Hz,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,1H),5.65-5.58(m,1H),4.92(d,J＝7.6Hz,1H),4.79(d,J＝12.0Hz,1H),4.72(d,J＝7.6Hz,2H),3.86(s,2H),2.78(s,2H),2.33(s,3H),1.48(s,6H),1.20(s,6H)。
实施例26：5-{2-烯丙基-1-[6-(2-羟基丙烷-2-基)-吡啶-2-基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基}-N-甲基-1,3-二氢-异吲哚-2-甲脒(化合物HY-B026)
向化合物S1(70mg)和化合物S2(43mg)的乙腈溶液(10mL)中加入三乙胺(55mg)，在65℃下搅拌5天。将反应液冷却到室温，浓缩，残余物通过制备得到最终产物HY-B026(5mg)。LCMS(ES,m/z)：500.3[M+H]+。1H NMR(CD3OD,400MHz)8.86(s,1H),8.05(t,J＝7.6Hz,1H),7.90(s,1H),7.78(d,J＝7.6Hz,1H),7.67(d,J＝7.6Hz,1H),7.57(d,J＝7.6Hz,1H),7.31(d,J＝7.6Hz,1H),5.73-5.70(m,1H),5.04(d,J＝9.2Hz,1H),4.89(d,J＝12.0Hz,1H),4.82(d,J＝7.6Hz,2H),4.78(s,2H),4.75(s,2H),2.08(s,3H),1.57(s,6H)。
实施例27：2-烯丙基-6-((2-乙基二氢异吲哚-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(HY-B027)
向化合物HY-B021(45mg)的甲醇溶液(5mL)中加入乙醛(14mg)，醋酸硼氢化钠(13mg)和ZnCl2(14mg)，然后在100摄氏度下搅拌过夜。冷却到室温，将反应液用二氯甲烷萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制备，最终得到化合物HY-B027(4.6mg)。LCMS(ES,m/z)：472.2。1H NMR(CD3OD,400MHz)8.91(s,1H),8.08-8.04(m,1H),7.96(s,1H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.72-7.68(m,2H),7.39(d,J＝8.4Hz,1H),5.78-5.71(m,1H),5.07(d,J＝10.4Hz,1H),4.96(s,1H),4.91(s,2H),4.87(s,2H),4.61-4.52(m,2H),3.56-3.52(m,2H),1.60(s,6H),1.50-1.46(m,3H).
实施例28：2-烯丙基-6-((2-(2-羟基乙基)异吲哚啉-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(HY-B028)
第一步：2-(2-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)乙基)-5-硝基异吲哚啉(化合物28-2)
将化合物1(500mg)，化合物1-1(1.2g)和三乙胺(1.3g)溶解在乙腈(10mL)中，然后加热到80℃反应12小时。冷却到室温，减压除去溶剂，得到的残余物通过硅胶色谱柱(PE:EA(v:v)＝5:1)分离纯化得到目标产物2(300mg)为黄色油状物。
第二步：2-(2-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)乙基)异吲哚啉-5-胺(化合物28-3)
将铁粉(522mg)和饱和的氯化铵溶液(5mL)加入到溶有化合物28-2(250mg)的甲醇(15mL)溶液中，然后加热到70℃反应2.5小时。过滤，滤饼用甲醇洗涤2次，向滤液中加入饱和氯化铵溶液(25mL)，并用DCM萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到的残余物(粗品，230mg)将直接用在下一步反应中。LCMS(ES,m/z)：293.1[M+H]+。
第三步：2-烯丙基-6-((2-(2-((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)乙基)异吲哚啉-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物28-4)
向化合物Int-1(200mg)的甲苯溶液(10mL)中加入m-CPBA(291mg)，在室温下搅拌过夜，然后加入化合物3(163mg)和DIEA(361mg)，室温下搅拌过夜。加水稀释，并用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用碳酸氢钠洗涤3次后用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空下除去溶剂，残余物通过硅胶色谱柱(PE:EA(v/v)＝2:1)分离纯化得到目标产物4(60mg)为黄色固体。LCMS(ES,m/z)：602.3[M+H]+。
第四步：2-烯丙基-6-((2-(2-羟基乙基)异吲哚啉-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B028)。
将TBAF(0.4mL,1.0mol/L)加入到化合物28-4(50mg)的四氢呋喃溶液(5mL)，然后室温下搅拌过夜。真空下除去溶剂，残余物通过反相制备得到目标产物HY-B028(21.9mg)为黄色固体。LCMS(ES,m/z)：602.3[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ10.3(s,1H),8.87(s,1H),8.03-8.00(m,1H),7.77-7.74(m,2H),7.62(d,J＝7.6Hz,1H),7.46(dd,J＝8.0Hz,1.6Hz,1H),7.17(d,J＝8.0Hz，1H),5.70-5.61(m,1H),5.32(s,1H),4.98(d,J＝10.4Hz,1H),4.82(d,J＝18.4Hz,1H),4.70-4.68(m,2H)，4.54-4.51(m,1H),3.91(s,2H),3.87(s,2H),3.60-3.56(m,2H),2.81-2.78(m,2H),1.46(s,6H)。
实施例29：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2-(2-甲氧基乙基)异吲哚啉-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B029)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A029(55mg)和DIEA(100mg)，在30℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B029(32mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：488.2[M+H]+。
实施例30：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-氧代异吲哚啉-5-基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮(化合物HY-B030)
向化合物Int-1(100mg)的甲苯溶液(5mL)中加入m-CPBA(146mg)，在室温下搅拌过夜，得到溶液A。将NaH(56mg)加入到溶有化合物A-31(54mg)的DMF(5mL)溶液中，室温下搅拌30分钟得到混合物B。然后将A缓慢加入到B中，室温搅拌过夜。将反应液倾倒入饱和的氯化铵溶液中，析出白色固体，过滤，滤饼用薄层色谱法TLC(二氯甲烷：甲醇(v/v)＝20:1)纯化得到粗品，向该粗品中加入甲醇(2mL),然后放置在超声清洗机中超声5分钟，过滤，滤饼干燥得到标产物HY-B030(5.8mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：458.0[M+H]+。1H NMR(CD3OD+CDCl3,400MHz)δ9.14(s,1H),8.06-7.99(m,2H),7.60(d,J＝7.2Hz，1H),7.42(d,J＝8.0Hz,1H),7.19(s,1H),7.06-7.04(m,2H),5.72-5.67(m,1H),5.07(d,J＝10.0Hz,1H),5.02(s,2H),4.97-4.93(m,3H),1.59(s,6H)。
实施例31：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2-甲基-3-氧代异吲哚啉-5-基)氨基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3(2H)-酮(HY-B031)
向化合物Int-1(100mg)的甲苯溶液(5mL)中加入m-CPBA(146mg)，在室温下搅拌过夜，得到溶液A。将NaH(56mg)加入到溶有化合物A-31(59mg)的DMF(5mL)溶液中，室温下搅拌30分钟得到混合物B。然后将A缓慢加入到B中，室温搅拌过夜。将反应液倾倒入饱和的氯化铵溶液中，析出白色固体，过滤，滤饼用薄层色谱法TLC(二氯甲烷：甲醇(v/v)＝20:1)纯化得到标产物HY-B031(2.6mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：472.0[M+H]+。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ8.87(s,1H),8.47(s,1H),8.15(s，1H),7.87(d,J＝7.6Hz,1H),7.67-7.59(m,3H),7.48(d,J＝7.2Hz,1H),5.74-5.71(m,1H),5.04(d,J＝10.4Hz,1H),4.88-4.86(m,4H),4.46(m,2H),3.16(s,3H),1.56(s,6H)。
实施例32：2-烯丙基-6-((7-氟异吲哚啉-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B032)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A032(79mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B009(73mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：462.2[M+H]+。
实施例33：2-烯丙基-6-((7-氟-2-甲基异吲哚啉-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B033)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A033(80mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B009(73mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：476.2[M+H]+。
实施例34：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢-1,4-环亚胺基萘-6-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B034)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A034(90mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B009(73mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：470.2[M+H]+。
实施例35：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2'-甲基-2'，3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-7'-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B035)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A035(88mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B035(100mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：498.3[M+H]+。
实施例36：2-烯丙基-6-((3,3-二甲基异吲哚啉-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B036)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A036(80mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B036(68mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：472.2[M+H]+。
实施例37：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(螺[环丙烷-1,1'-异吲哚]-6'-基氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B037)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A037(80mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B037(59mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：470.2[M+H]+。
实施例38：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2-异丙基异吲哚啉-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B038)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A038(85mg)和DIEA(100mg)，在40℃下搅拌10小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B038(77mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：486.3[M+H]+。
实施例39：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2,3,3-三甲基异吲哚啉-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B039)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A039(80mg)和DIEA(100mg)，在35℃下搅拌19小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B039(53mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：486.3[M+H]+。
实施例40：7-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮(HY-B040)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A040(80mg)和DIEA(100mg)，在380℃下搅拌20小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B040(66mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：472.2[M+H]+。
实施例41：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B041)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A041(80mg)和DIEA(100mg)，在25℃下搅拌24小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B041(55mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：458.2[M+H]+。
实施例42：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-甲基-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]恶嗪-6-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B042)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A042(90mg)和DIEA(100mg)，在25℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B042(63mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：474.2[M+H]+。
实施例43：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-甲基-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]恶嗪-7-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B043)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A043(90mg)和DIEA(100mg)，在25℃下搅拌24小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B043(60mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：474.2[M+H]+。
实施例44：2-烯丙基-6-((1,3,4,6,7,11b六氢-[1,4]恶嗪并[3,4-α]异喹啉-9-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B044)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A044(90mg)和DIEA(100mg)，在45℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B044(45mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：514.3[M+H]+。
实施例45：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3,4,6,10b四氢-1H-[1,4]恶嗪并[3，4-A]异吲哚-8-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B045)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A045(82mg)和DIEA(100mg)，氮气保护下在25℃下搅拌24小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B045(43mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：500.2[M+H]+。
实施例46 2-烯丙基-6-(苯并[d]异噻唑-5-基氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-酮(HY-B046)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A046(78mg)和DIEA(100mg)，在40℃下搅拌16小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B046(63mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：460.2[M+H]+。
实施例47：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((1-甲基-1H-吲唑-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B047)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A047(82mg)和DIEA(100mg)，在40℃下搅拌10小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B047(73mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：457.2[M+H]+。
实施例48：2-烯丙基-6-((1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B048)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A048(65mg)和DIEA(100mg)，在35℃下搅拌15小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B048(40mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：471.2[M+H]+。
实施例49：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2-甲基苯并[d]恶唑-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B049)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A049(78mg)和DIEA(100mg)，在30℃下搅拌16小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B049(43mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：458.2[M+H]+。
实施例50：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基苯并[d]异恶唑-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B050)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A050(80mg)和DIEA(100mg)，在30℃下搅拌18小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B050(55mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：458.2[M+H]+。
实施例51：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2-甲基苯并[d]噻唑-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B051)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A051(85mg)和DIEA(100mg)，在40℃下搅拌10小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B051(68mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：474.2[M+H]+。
实施例52：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基苯并[d]异噻唑-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B052)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A052(86mg)和DIEA(100mg)，在45℃下搅拌14小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B052(64mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：474.2[M+H]+。
实施例53：6-((-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-5-基)氨基)-2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B053)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A053(78mg)和DIEA(100mg)，在40℃下搅拌16小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B053(35mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：444.2[M+H]+。
实施例54：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B054)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A054(79mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B054(48mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：457.2[M+H]+。
实施例55：2-烯丙基-6-((1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B055)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A055(85mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌8小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B009(63mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：471.2[M+H]+。
实施例56：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((1-甲基-1H-吲唑-6-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B056)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A056(81mg)和DIEA(100mg)，在40℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B056(71mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：457.2[M+H]+。
实施例57：2-烯丙基-6-((1,3-二甲基-1H-吲唑-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B057)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A057(78mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌6小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B057(44mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：471.2[M+H]+。
实施例58：2-烯丙基-6-((1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B058)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A058(80mg)和DIEA(100mg)，在60℃下搅拌5小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B058(65mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：471.2[M+H]+。
实施例59：2-烯丙基-6-((1,2-二甲基-1H-吲哚-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B059)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A059(74mg)和DIEA(100mg)，在30℃下搅拌18小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B059(39mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：470.2[M+H]+。
实施例60：2-烯丙基-6-((3-氟-1,2-二甲基-1H-吲哚-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B060)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A060(90mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B060(55mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：488.2[M+H]+。
实施例61：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((3-甲基-1H-吲唑-6-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B061)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A061(78mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B061(35mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：471.2[M+H]+。
实施例62化合物2-烯丙基-6-((7-氟-1-甲基-1H-吲唑-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,1--1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B062)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A062(81mg)和DIEA(100mg)，在45℃下搅拌15小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B062(80mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：475.2[M+H]+。
实施例63：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((1-甲基-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-5-基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B063)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A063(65mg)和DIEA(100mg)，在30℃下搅拌18小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B063(37mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：458.2[M+H]+。
实施例64：2-烯丙基-6-((4-氟-1,2-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B064)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A064(60mg)和DIEA(100mg)，在50℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B064(47mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：489.2[M+H]+。
实施例65：2-烯丙基-6-((7-氟-1-甲基-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-5-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B065)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A065(75mg)和DIEA(100mg)，在40℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B065(48mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：476.2[M+H]+。
实施例66：2-烯丙基-6-((4-氟基-1-甲基-1H-吲唑-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,1--1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B066)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A066(68mg)和DIEA(100mg)，在40℃下搅拌15小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B066(71mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：475.2[M+H]+。
实施例67：2-烯丙基-6-((4-氟苯并[d]异恶唑-6-基)氨基)-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B067)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A067(67mg)和DIEA(100mg)，在40℃下搅拌10小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B067(48mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：462.2[M+H]+。
实施例68：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)氨基)-1，-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B068)
在冰水浴下向化合物Int-2(120mg)的DMF(5mL)溶液中加入A068(100mg)和DIEA(100mg)，在35℃下搅拌12小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B068(53mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：457.2[M+H]+。
实施例69：2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-((2'-甲基螺[环丙烷-1,1'-异吲哚]-6'-基)氨基基)-1,2-二氢-3H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(HY-B069)
在冰水浴下向化合物Int-2(100mg)的DMF(5mL)溶液中加入A069(50mg)和DIEA(100mg)，在40℃下搅拌7小时。冷却后加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，用HPLC制备得到目标产物HY-B069(66mg)为白色固体。LCMS(ES,m/z)：484.2[M+H]+。
实施例70Weel激酶活性的测定
在测定Weel激酶活性时，使用购自Sigma的合成肽Poly(Lys，Tyr)氢溴酸盐(Lys：Tyr(4：1)作为底物。
反应混合物的量为21.1μL；反应缓冲液的组成为50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)/10mM氯化镁/1mM二硫苏糖醇。将纯化的Wee-l激酶，2.5μg底物肽，10μM未标记的三磷酸腺苷(ATP)和1μCi-33P的ATP(2500Ci/mmol或更高)加入其中。并在30℃孵育30分钟。接下来，向反应混合物中加入10μL的350mM磷酸盐缓冲液以终止反应。用P81纸过滤96孔板吸附底物肽，然后用130mM磷酸盐缓冲液洗涤几次，用液体闪烁计数器计数其放射性。
将测试化合物加入到反应体系中，用二甲基亚砜(DMSO)稀释化合物以制备一系列稀释液。将1.1μL每种稀释液加入到反应体系中。作为阴性对照，将不含有待测化合物的1.1μL二甲基亚砜(DMSO)加入到反应体系中，同时以Wee1抑制剂AZD1775作为阳性对照。将数据转换为抑制百分数，用Graphpad Prism软件进行曲线拟合并得到IC50值。结果如表1所示，本发明化合物表现出优异的Wee1抑制活性，其中，A表示IC50≤100nM；B表示100nM≤IC50≤1000nM；C表示IC50≥1000nM。
表1 Wee1激酶抑制活性
实施例71细胞增殖试验
将MV411细胞按2000细胞、135μL/孔铺96孔板。孵育隔夜后，配制梯度浓度的化合物溶液，分别向各孔细胞中加入15μL各浓度的待测化合物DMSO溶液，化合物终浓度为30000、10000、3333.3、1111.1、370.4、123.5、41.2、13.7、4.6、0nM(DMSO终浓度均为0.5％)。37℃，5％CO2孵育120h。向各孔中加入50μLCell-titer Glo工作液，震荡混匀后室温孵育10min，多功能酶标仪读取Luminescence发光值，将发光值读数转换为抑制百分数：
抑制百分数＝(最大值-读数)/(最大值-最小值)*100。“最大值”为DMSO对照；“最小值”表示无细胞对照组。
用Graphpad Prism软件进行曲线拟合并得到IC50值。本发明实施例化合物对MV411细胞具有良好的抑制活性，其中A表示IC50≤100nM；B表示100nM≤IC50≤1000nM；C表示IC50≥1000nM。对MV411细胞抑制的IC50数据参见表2。
表2：对MV411细胞抑制活性
实施例72 hERG抑制活性的测试
hERG(the human Ether-à-go-go-Related Gene))是一种编码钾离子通道的α亚基Kv11.1蛋白质的基因(KCNH2)。该离子通道最为人所知，因为它对协调心脏跳动的心脏电活动的贡献(即，hERG通道介导心脏动作电位中的复极化IKr电流)。当这种通道穿过细胞膜传导电流的能力受到抑制或损害时，无论是通过药物应用还是通过某些家族的罕见突变，它可能导致一种称为长QT综合征的潜在致命疾病；市场上许多临床上成功的药物都有抑制hERG的倾向，并产生伴随的猝死风险，作为副作用，这使得hERG抑制成为药物开发过程中必须避免的重要目标。因此，提高对Wee1的选择性，降低对hERG的抑制活性，可以提高药物的安全性和治疗指数。
将20mM的化合物母液用DMSO进行3倍连续稀释，得到6个经DMSO连续稀释的化合物中间浓度。然后再取10μL的化合物中间浓度加入到4990μL细胞外液中，再500倍稀释得到需要测试的最终浓度，依次分别为40,13.3,4.4,1.48,0.49和0.16μM。取cisapride为阳性对照物,同样用DMSO进行3倍连续稀释和细胞液稀释,得到需要测试的最终浓度，最高测试浓度为300nM，依次分别为300，100，33.3，11.1和3.70nM共5个浓度。最终测试浓度中的DMSO含量不超过0.2％，此浓度的DMSO对hERG何通道没有影响。
稳定表达hERG钾通道的CHO(Chinese Hamster Ovary)细胞，在室温下用全细胞膜片钳技术记录hERG钾通道电流。尖端电阻为2-5MQ左右的玻璃微电极连接至Axopatch 200B(Molecular Devices)膜片钳放大器。钳制电压和数据记录由pClamp10软件通过电脑控制和记录，采样频率为10kHz，滤波频率为2kHz。在得到全细胞记录后，细胞钳制在-80mV，诱发hERG钾电流(IhERG)的步阶电压从-80mV给予一个2s的去极化电压到+20mV，再复极化到-50mV,持续1s后回到-80mV。每10s给予此电压剌激，确定hERG钾电流稳定后(1分钟)开始给药过程。化合物浓度从低测试浓度开始连续给药，每个测试浓度给予l分钟。
数据分析处理采用pClamp 10、Patch Master、GraphPad Prism 5和Excel软件。不同化合物浓度对hERG饵电流(-50mV时诱发的hERG尾电流峰值)的抑制程度用以下公式计算：Fractional block％＝[1-(I/Io)]×100％；并拟合出IC50。结果如表3所示：
表3：hERG抑制活性
*:表中ND代表没有测试数据
Claims (12)
1.一种式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
X1为N；
X2和X3各自独立地选自C、O、N和S；
Y1和Y2各自独立地选自S、O、C和N；
n为0或1；
R6，R7各自独立地选自H、卤素；
R8，R9各自独立地选自H、C1-C3烷基；
R1，R2，R3，R4，R5各自独立地选自H、卤素、未取代或取代的-CO-(C1-C4)烷基、未取代或取代的C1-C4烷基；其中，所述取代是指被选自如下的一种或多种取代基所取代：C1-C4烷基、羟基、氨基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基取代的氨基；
或者
R1、R5与X2、Y2共同形成未取代或被C1-C4烷基所取代的4-7元饱和环烷烃、未取代或被C1-C4烷基所取代的4-7元饱和杂环烷烃，所述杂环烃为含有1-3个选自O、N的杂原子的环烷烃；
或者，
式(I)中，
X1选自N；
X2和X3各自独立地选自S、C、O和N；
Y1和Y2各自独立地选自S、O、C和N；
n为0或1；
R6，R7各自独立地选自H、F、Cl；
R8，R9各自独立地选自H、甲基；
R1，R2，R3，R4各自独立地选自H、F、Cl、未取代或取代的-CO-(C1-C4)烷基、未取代或取代的C1-C4烷基；其中，所述取代是指被选自如下的一种或多种取代基所取代：C1-C4烷基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基取代的氨基；
且R5选自(C1-C4)烷基-NH-CN-、NH2-CN-；
或者，
式(I)中，
X1为N；
X2和X3各自独立地选自C、O、N和S；
Y1和Y2均为C；
n为0或1；
R6，R7各自独立地选自H、卤素；
R8，R9各自独立地选自H、C1-C3烷基；
R2、R4各自独立地选自H、未取代的C1-C4烷基；
Y1、Y2、X2、X3、及与Y1和Y2相连的苯基，以Y1和Y2为桥头原子，通过R1形成苯并桥环烷基或含有1～3个选自N、O、S的杂原子的苯并桥环杂烷基；其中，R1为-NH-；
其中，
当
为双键或X2为O或S时，R5不存在；
当
为双键且X2为N时，R5不存在；
当Y1为O时，R3和R4不存在；
当Y2为O时，R1和R2不存在，且
为单键；
当Y1为N时，R4不存在；
当
为双键且Y2为N时，R1和R2不存在；
当
为单键且Y2为N时，R2不存在；
当X3为O或S时，R8和R9不存在；
当X3为N时，R9不存在。
2.如权利要求1所述的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
式(I)中，
X1为N；
X2和X3各自独立地选自C、O、N和S；
Y1和Y2均为C；
n为0或1；
R6，R7各自独立地选自H、F、Cl；
R8，R9各自独立地选自H、甲基；
R2、R4各自独立地选自H、未取代的C1-C4烷基；
Y1、Y2、X2、X3、及与Y1和Y2相连的苯基，以Y1和Y2为桥头原子，通过R1形成苯并桥环烷基或含有1～3个选自N、O、S的杂原子的苯并桥环杂烷基；其中，R1为-NH；
其中，
当
为双键或X2为O或S时，R5不存在；
当
为双键且X2为N时，R5不存在；
当Y1为O时，R3和R4不存在；
当Y2为O时，R1和R2不存在，且
为单键；
当Y1为N时，R4不存在；
当
为双键且Y2为N时，R1和R2不存在；
当
为单键且Y2为N时，R2不存在；
当X3为O或S时，R8和R9不存在；
当X3为N时，R9不存在。
3.化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物选自如下具体化合物：
4.权利要求1～2中任一项所述的式(I)所示的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
Int-1或Int-2与中间体1发生缩合反应，生成式(I)所示的化合物；其中，当反应物为Int-1时，其先与氧化剂发生氧化反应，氧化反应产物不经分离纯化直接与中间体1发生缩合反应。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述缩合反应在溶剂的存在或不存在的情况下进行。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述溶剂选自水、乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲苯中的一种或多种。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述缩合反应在碱的存在或不存在的情况下进行。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述碱选自三乙胺、DIEA、K2CO3。
9.权利要求1或2中所述的式(I)所示的化合物、权利要求3所述的化合物，或其药学上可接受的盐在制备Wee1激酶抑制剂中的应用。
10.权利要求1或2所述的式(I)所示的化合物、权利要求3所述的化合物，或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防一种或者多种Wee1激酶相关的疾病的药物中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于：所述Wee1激酶相关的疾病包括癌症、代谢性疾病、免疫性疾病。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于：所述癌症为肺癌，胃癌，乳腺癌，膀胱癌，胰腺癌，直肠癌，肝癌，血液瘤；所述血液瘤为白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤；所述代谢性疾病为糖尿病，高血脂，肥胖，冠心病；所述免疫性疾病为类风湿关节炎，红斑狼疮，银屑病。
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