CN110862917A - 细胞单集落挑选装置及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于显微操作装置技术领域，本发明公开了一种细胞单集落挑选装置及制备方法和应用。其中制备方法包括如下步骤：取长度为2‑3cm，外径0.5‑1mm，壁厚0.15mm规格的透明材质毛细管，将所述的透明材质毛细管的第一端0.3‑0.5cm处弯曲形成弯头，所述的弯头的弧度为0‑90°，挤压所述的弯头成铲形开口；将所述的透明材质毛细管的第二端与200μL移液枪头尖端连接，将所述的透明材质毛细管与200μL移液枪头尖端的连接处密封得到所述的细胞单集落挑选装置。本发明装置简单、无毒。

Description

细胞单集落挑选装置及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及显微操作装置技术领域，具体涉及一种细胞单集落挑选装置及制备方法和应用。
背景技术
本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。
基因修饰是细胞研究常用的方法。其中，基于慢病毒介导的基因转染是最常用的稳定基因修饰方法，可以介导目标基因整合的宿主细胞基因组，并随宿主基因组稳定遗传到子代细胞中，获得稳定基因修饰的细胞株，从而满足长期、重复性研究需求，在生物医学研究领域具有广泛用途。
慢病毒颗粒具有非常广谱的转染能力，对大多数细胞类型，包括增殖、非增殖的细胞，均能进行成功转染。然而，即使对于最容易转染的细胞，如293T细胞，其转染效率也不可能达到100％；对于一般细胞而言，其转染效率是较为有限的，甚至不足10％，如人诱导型多能干细胞(iPSC)等。慢病毒转染直接获得的是成功转染与未转染细胞的混合物，未转染的细胞对于后续研究存在严重干扰。因此，筛选纯化成功转染的细胞成为必不可少的步骤。
以往的研究中，普遍采用的筛选方法包括流式细胞分选与药物筛选。流式细胞分选利用所转染的报告基因，如GFP(绿色荧光蛋白)、RFP(红色荧光蛋白)等，筛选阳性细胞，进一步用于扩增培养；药物筛选是基于所转染的抗性基因，如嘌呤霉素(Puro)抗性基因，通过加入药物杀死未转染的细胞。在流式分选中，首先需要专业的流式细胞仪，价格昂贵。分选前需要将细胞分散成单细胞悬液，分选过程也将对细胞造成一定的损伤，且由于复杂的操作出现污染的几率较高。不仅如此，对于不能分散成单细胞的类型，如人ESC/iPSC，一般也不适合流式分选。药物筛选相对简便，如加入Puro，尽管成功转染的细胞具有一定的药物抗性，但也不可避免将造成一定的潜在损伤，甚至影响细胞的功能。除上述局限外，流式分选与药物分选还具有共同的问题：分选的细胞可能具有较高的异质性。如在慢病毒介导的基因转染中，由于慢病毒的随即插入，细胞个体之间外源基因的插入位点、拷贝数等差异显著，流式分选与药物筛选均无法克服这一问题，筛选的细胞具有较高的异质性，可能严重影响后续实验结果与可重复性。建立简便、无创性以及减小细胞异质性的筛选方法，将具有重要科学意义与实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞单集落挑选装置及制备方法和应用。基于该装置进行基因标记细胞的筛选，不仅简便、对细胞无毒性，且能够显著降低甚至克服细胞的异质性，具有重要用途。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明第一方面的实施例提供了一种细胞单集落挑选装置的制备方法，包括如下步骤：
取长度为2-3cm，外径0.5-1mm，壁厚0.15mm规格的透明材质毛细管，将所述的透明材质毛细管的第一端0.3-0.5cm处弯曲形成弯头，所述的弯头的弧度为0-90°，挤压所述的弯头成铲形开口；
将所述的透明材质毛细管的第二端与200μL移液枪头尖端连接，将所述的透明材质毛细管与200μL移液枪头尖端的连接处密封得到所述的细胞单集落挑选装置。
进一步的，所述的透明材质毛细管的材质为玻璃或透明树脂。
进一步的，所述的将所述的透明材质毛细管的第一端0.3-0.5cm处弯曲形成弯头为将所述的透明材质毛细管的第一端加热软化后进行弯曲。
本发明第二方面的实施例提供了一种细胞单集落挑选装置，所述的细胞单集落挑选装置由上述的制备方法制备而得，包括200μL移液枪头，所述200μL移液枪头的尖端连接有透明材质毛细管，所述的毛细管上与所述的200μL移液枪头相对的一端设有铲形开口。
本发明第三方面的实施例提供了一种细胞单集落挑选装置的应用，所述的细胞单集落挑选装置由上述的制备方法制备而得，将所述的细胞单集落挑选装置应用到细胞单集落的挑去扩增。
进一步的，所述的细胞单集落的挑取扩增为人胚胎干细胞或人诱导型多能干细胞。
进一步的，包括如下步骤：将细胞接种于培养板中，平均每平方毫米少于0.5个细胞；正常生长条件下培养细胞，直至单细胞扩增形成明显集落；根据标记基因特征，显微镜下识别阳性的集落；使用200uL移液枪，佩带上所述的细胞单集落挑选装置，在低倍显微镜下轻轻铲起目标集落；吸取铲起的细胞集落，转移到加有新鲜培养液的培养孔中；补充培养液，正常生长环境下培养扩增，获得筛选细胞。
借由上述方案，本发明细胞单集落挑选装置及制备方法和应用至少具备如下有益效果：
本发明的有益效果是单集落挑选装置制作简单、成本低廉，细胞纯化过程不需专业设备、操作简便、纯化效率高。此外，筛选的细胞由于从单个集落扩增而来，具有较高的一致性。
附图说明
图1为本发明一实施例中细胞单集落挑选装置结构示意图；
图2为本发明一实施例中RFP转染的iPSC图；
图3为本发明一实施例中分散培养后在混合细胞群中标出RFP阳性iPSC克隆图；
图4为本发明一实施例中挑取RFP阳性ESC单克隆的操作过程图；
图5为本发明一实施例中经本发明装置挑选后的细胞图；
图6为本发明一实施例中RFP转染的人ESC图；
图7为本发明一实施例中分散培养后在混合细胞群中标出RFP阳性ESC克隆图；
图8为本发明一实施例中经本发明装置挑选的ESC细胞图；
图9为本发明一实施例中转染后的MCF-7细胞混合细胞群中标出的RFP阳性克隆图；
图10为本发明一实施例中经本发明装置挑选的MCF-7细胞图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
慢病毒介导的基因转染是细胞生物学常用的稳定基因修饰方法，由于转染效率一般有限，甚至仅有较低的水平，转染后细胞的筛选与纯化成为必不可少的步骤。流式分选与药物筛选是最常用的纯化方法。然而，流式分选需要专业的设备，操作复杂，会造成一定的细胞损伤，且对于不能分散成单细胞的细胞类型并不适用；药物筛选可能对细胞具有一定的毒性作用。不仅如此，由于慢病毒的随机插入特点，流式分选与药物筛选获得的细胞异质性均较高。本发明设计了一种简易的细胞单集落挑选器件，在普通荧光显微镜下即可完成基因修饰细胞的单集落挑选与纯化，制作简单，操作简便，对细胞无损伤作用，且获得的细胞一致性高。
一种细胞单集落挑选装置的制备方法，包括如下步骤：
取长度为2-3cm，外径0.5-1mm，壁厚0.15mm规格的透明材质毛细管，将所述的透明材质毛细管的第一端0.3-0.5cm处弯曲形成弯头，所述的弯头的弧度为0-90°，挤压所述的弯头成铲形开口；
将所述的透明材质毛细管的第二端与200μL移液枪头尖端连接，将所述的透明材质毛细管与200μL移液枪头尖端的连接处密封得到所述的细胞单集落挑选装置。
在本发明的一些实施例中，所述的透明材质毛细管的材质为玻璃或透明树脂。
在本发明的一些实施例中，所述的将所述的透明材质毛细管的第一端0.3-0.5cm处弯曲形成弯头为将所述的透明材质毛细管的第一端加热软化后进行弯曲。
一种细胞单集落挑选装置，所述的细胞单集落挑选装置由上述的制备方法制备而得，包括200μL移液枪头，所述200μL移液枪头的尖端连接有透明材质毛细管，所述的毛细管上与所述的200μL移液枪头相对的一端设有铲形开口。
本发明第三方面的实施例提供了一种细胞单集落挑选装置的应用，所述的细胞单集落挑选装置由上述的制备方法制备而得，将所述的细胞单集落挑选装置应用到细胞单集落的挑去扩增。
在本发明的一些实施例中，所述的细胞单集落的挑取扩增为人胚胎干细胞或人诱导型多能干细胞。
在本发明的一些实施例中，包括如下步骤：将细胞接种于培养板中，平均每平方毫米少于0.5个细胞；正常生长条件下培养细胞，直至单细胞扩增形成明显集落；根据标记基因特征，显微镜下识别阳性的集落；使用200uL移液枪，佩带上所述的细胞单集落挑选装置，在低倍显微镜下轻轻铲起目标集落；吸取铲起的细胞集落，转移到加有新鲜培养液的培养孔中；补充培养液，正常生长环境下培养扩增，获得筛选细胞。
借由上述方案，本发明细胞单集落挑选装置及制备方法和应用至少具备如下有益效果：
本发明的有益效果是单集落挑选装置制作简单、成本低廉，细胞纯化过程不需专业设备、操作简便、纯化效率高。此外，筛选的细胞由于从单个集落扩增而来，具有较高的一致性。
一种用于细胞单集落挑选扩增的装置，其制备方法包括如下步骤：
1)显微操作器件由毛细玻璃管和200uL移液枪头两种原部件制作而成；
2)外径0.5-1mm/壁厚0.15mm规格的毛细管，截取约2-3cm长度；
3)在酒精灯上灼烧一端，使其加热软化，使用镊子在据端口约0.3-0.5cm处轻轻弯曲一定弧度；
4)使用镊子轻轻挤压开口处，使其由圆形挤压成铲形开口；
5)将200uL的移液枪头，尖端切除适当长度，将上述制作的毛细玻璃管的另一直端插入枪头尖端约0.5mm；
6)酒精等加热枪头与毛细管连接处，使其密封并固定连接。
本实施例的装置用于细胞单集落的挑取扩增；
1)将细胞以较稀的密度接种于培养板中，平均每平方毫米少于0.5个细胞；
2)正常生长条件下培养细胞，直至单细胞扩增形成明显集落；
3)根据标记基因特征，显微镜下识别阳性的集落；
4)使用200uL移液枪，佩带上述制备的器件，在低倍显微镜下轻轻铲起目标集落；
5)吸取铲起的细胞集落，转移到新的加有新鲜培养液的培养孔中；
6)补充培养液，正常生长环境下培养扩增，获得筛选细胞。
在另外一个实施方案中，挑选单集落的细胞，可以是ESC、iPSC等多能干细胞，也可以是能够形成集落的其他细胞类型。
实施例1：显微操作器件的制备；
1)显微操作器件如图1所示，包括200uL移液枪头1和毛细玻璃管2；
2)外径0.5-1mm/壁厚0.15mm规格的毛细管，截取约2-3cm长度；
3)在酒精灯上灼烧一端，使其加热软化，使用镊子在据端口约0.3-0.5cm处轻轻弯曲一定弧度；
4)使用镊子轻轻挤压开口处，使其由圆形挤压成铲形开口3；
5)将200uL的移液枪头，尖端切除适当长度，将上述制作的毛细玻璃管的另一直端插入枪头尖端约0.5mm；
6)酒精等加热枪头与毛细管连接处，使其密封并固定连接。
实施例2：荧光蛋白标记人iPSC细胞的筛选
(1)携带红色荧光蛋白(RFP)的慢病毒转染的人iPSC细胞株iPSC0100，在Matrigel包被的培养板上，mTesR1无血清培养基培养；如图2所示，RFP转染的iPSC，仅有少部分细胞被成功转染表达RFP阳性，形成RFP阳性与阴性细胞混合的培养物；
(2)按常规传代要求，将生长汇合的细胞分散成小细胞团(人iPSC与ESC传代分散成单细胞将不易存活)，以平均每平方毫米少于0.5个细胞团的密度接种于新的Matrigel包被的6孔培养板中，添加10μM的Y-27632；
(3)传代的细胞按常规要求培养7-10天，每天更换新鲜培养液(无需添加Y-27632)，直至形成典型的细胞集落；
(4)集落挑选前一天，Matrigel包被12孔培养板1小时备用，去除Matriel并晾干备用；
(5)荧光显微镜下观察所有细胞均表达RFP的阳性集落并标记；如图3所示在混合细胞群中标出的RFP阳性克隆；
(6)12孔板中提前加入1mL新鲜培养液，并补充10μM的Y-27632；
(7)100倍显微镜视野下，使用200uL移液枪佩戴所制备显微操作器件，轻轻剥离集落；如图4所示使用本发明器件挑取RFP阳性iPSC克隆的过程；
(8)吸取剥离的集落，转移到新的Matrigel包被的12孔培养板中，每孔一个集落；
(9)常规培养条件下进行培养，挑取的细胞再次形成明显集落后，荧光显微镜观察RFP表达情况，并按常规方法培养扩增。如图5所示，经本发明方法挑选后的细胞，RFP阳性率基本达100％。
实施例3：荧光蛋白标记人ESC细胞的筛选
(1)携带红色荧光蛋白(RFP)的慢病毒转染的人ESC细胞株H1ESC，在Matrigel包被的培养板上，mTesR1无血清培养基培养；如图6所示，RFP转染的H1ESC，仅有少部分细胞被成功转染表达RFP阳性，形成RFP阳性与阴性细胞混合的培养物；
(2)按常规传代要求，将生长汇合的细胞分散成小细胞团，以平均每平方毫米少于0.5个细胞团的密度接种于新的Matrigel包被的6孔培养板中，添加10μM的Y-27632；
(3)传代的细胞按常规要求培养7-10天，每天更换新鲜培养液，直至形成典型的细胞集落；
(4)集落挑选前一天，Matrigel包被12孔培养板1小时备用，去除Matriel并晾干备用；
(5)荧光显微镜下观察所有细胞均表达RFP的阳性集落并标记；如图7所示在混合细胞群中标出的RFP阳性克隆；
(6)12孔板中提前加入1mL新鲜培养液，并补充10μM的Y-27632；
(7)100倍显微镜视野下，使用200uL移液枪佩戴所制备显微操作器件，轻轻剥离集落；
(8)吸取剥离的集落，转移到新的Matrigel包被的12孔培养板中，每孔一个集落；
(9)常规培养条件下进行培养，挑取的细胞再次形成明显集落后，荧光显微镜观察RFP表达情况，并按常规方法培养扩增。如图8所示，经本发明方法挑选后的细胞，RFP阳性率基本达100％。
实施例4：荧光蛋白标记人乳腺癌细胞MCF-7的筛选
(1)红色荧光蛋白(RFP)标记的MCF-7细胞株，以平均每平方毫米少于0.5个细胞接种于6孔培养板中；
(2)传代的细胞按常规方法培养5-7天，每两天更换新鲜培养液一次，直至形成明显的细胞集落；
(3)荧光显微镜下观察所有细胞均表达RFP的阳性集落并标记；如图9所示在混合细胞群中标出的RFP阳性克隆；
(4)100倍显微镜视野下，使用200uL移液枪佩戴所制备显微操作器件，轻轻剥离集落；
(5)吸取剥离的集落，转移到新的6孔培养板中，每孔一个集落；
(6)常规培养条件下进行培养，挑取的细胞大量增殖后，荧光显微镜观察RFP表达情况，并按常规方法培养扩增。如图10所示，经本发明方法挑选后的细胞，RFP阳性率基本达100％。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种细胞单集落挑选装置的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取长度为2-3cm，外径0.5-1mm，壁厚0.15mm规格的透明材质毛细管，将所述的透明材质毛细管的第一端0.3-0.5cm处弯曲形成弯头，所述的弯头的弧度为0-90°，挤压所述的弯头成铲形开口；
将所述的透明材质毛细管的第二端与200μL移液枪头尖端连接，将所述的透明材质毛细管与200μL移液枪头尖端的连接处密封得到所述的细胞单集落挑选装置。
2.根据权利要求1所述的细胞单集落挑选装置的制备方法，其特征在于，所述的透明材质毛细管的材质为玻璃或透明树脂。
3.根据权利要求1所述的细胞单集落挑选装置的制备方法，其特征在于，所述的将所述的透明材质毛细管的第一端0.3-0.5cm处弯曲形成弯头为将所述的透明材质毛细管的第一端加热软化后进行弯曲。
4.一种细胞单集落挑选装置，其特征在于，所述的细胞单集落挑选装置由权利要求1-3任一项所述的制备方法制备而得，包括200μL移液枪头，所述200μL移液枪头的尖端连接有透明材质毛细管，所述的毛细管上与所述的200μL移液枪头相对的一端设有铲形开口。
5.一种细胞单集落挑选装置的应用，其特征在于，所述的细胞单集落挑选装置由权利要求1-3任一项的制备方法制备而得，将所述的细胞单集落挑选装置应用到细胞单集落的挑去扩增。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的细胞单集落的挑取扩增为人胚胎干细胞或人诱导型多能干细胞。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
将细胞接种于培养板中，平均每平方毫米少于0.5个细胞；正常生长条件下培养细胞，直至单细胞扩增形成明显集落；根据标记基因特征，显微镜下识别阳性的集落；使用200uL移液枪，佩带上所述的细胞单集落挑选装置，在低倍显微镜下轻轻铲起目标集落；吸取铲起的细胞集落，转移到加有新鲜培养液的培养孔中；补充培养液，正常生长环境下培养扩增，获得筛选细胞。
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