CN110859866A - 一种抗菌消炎组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药开发技术领域，具体涉及一种抗菌消炎组合物及其制备方法。所述抗菌消炎组合物包括组分X和组分Y，其中组分X和组分Y的质量比为0~20：1；所述组分X为蒲公英或蒲公英根部的提取分离组分，所述组分Y为忍冬藤的提取分离组分。基于一个总的发明构思，本发明包括上述组合物的制备方法，及其在抗菌消炎药物制备中的应用。利用本发明所述提取分离方法对蒲公英（根）和忍冬藤进行处理后，所得分离组分的抗菌性能均高于普通市售蒲公英颗粒制剂，优化后的组合物性能甚至比蒲公英颗粒制剂高出数倍，为中药材的现代化开发利用提供了一种可行的技术方案。

Description

一种抗菌消炎组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于医药开发技术领域，具体涉及一种抗菌消炎组合物及其制备方法。
背景技术
蒲公英，菊科植物蒲公英Tacaxacum mongolicum Hand.-Mazz、碱地蒲公英Tacaxacum borealisinense Kitam.或同属数种植物的干燥全草，在我国分布广泛，具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋之功效。忍冬藤，忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥茎枝，是河南省道地药材金银花的另一入药部位，具有清热解毒，疏风通络之功效。药理研究表明，蒲公英和忍冬藤均具有抗菌、消炎作用；而物质基础研究表明，蒲公英主要含有黄酮、多糖等多类成分，忍冬藤则主要含有有机酸、环烯醚萜苷等多类成分。
蒲公英和忍冬藤在制药领域，尤其是中药制剂领域应用广泛。专利CN109908345A公开了一种治疗十二指肠溃疡的药物组合物及其制备方法，该药物组合物包括卵黄免疫球蛋白组合物、黄连、忍冬藤、蒲公英、冰片、白矾、乙酰水杨酸、白芨、血竭；通过将黄连、忍冬藤、蒲公英、白芨和血竭混合，按照料液比1:6～8与水混合，采用声波震荡提取法提取得到药液，再将药液与白矾、冰片混合后，浓缩得到浸膏；然后将浸膏与卵黄棉衣球蛋白组合物、乙酰水杨酸混合，真空干燥即得所述药物组合物；所制备药物抗菌消炎作用强，对多种致病菌具有很好的杀菌作用。专利CN105125909B公开了一种治疗小儿疱疹性咽颊炎的中药口服液及其制备方法，所述口服液由100-120g板蓝根、100-120g石膏、50-80g芦根、80-100g地黄、150-160g石菖蒲、100-120g广藿香、60-80g连翘、20-30g忍冬藤、60-80g蒲公英、100-120g白芷、80-100g胖大海、80-100g罗汉果、100-120g金银花、50-60g橘梗、30-60g葛根、50-60g荆芥、10-15g川贝、60-80g甘草、50-60g柴胡、10-20g防风、30-60g蔗糖、1-5g防腐剂加入水中制得。所述药剂用药量小，见效快、无副作用，可代替传统抗生素治疗小儿疱疹性咽颊炎。
但是，在上述专利以及传统中药制药领域，蒲公英和忍冬藤一般采用整棵入药，或者将其制备成提取物整体入药，药物研发更关注组分之间的整体配伍，并不对药材中的有效成分进行分离提取及纯化。随着生物医药领域的发展，利用现代化的药物分析手段对传统中药材进行研究，研究其中的活性成分并对其进行分离筛选，从而使中药材的利用和开发符合现代化医药学的发展趋势，是一条提高中药材资源利用率，提高中药市场竞争力的必经之路。
发明内容
为了解决现有技术中存在的中药材利用整体化、经验化的问题，本发明目的是提供一种抗菌消炎的组合物，并且基于一个总的发明构思，本发明还提供了该组合物的制备方法，通过对蒲公英、忍冬藤的主要活性物质进行分析、提取和配伍，从而获得一种抗菌、抗炎效果优异的组合物，有效提高原药材的利用率和抗菌抗炎效果。
为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种抗菌消炎组合物，包括组分X和组分Y，其中组分X和组分Y的质量比为0～20：1；
所述组分X为蒲公英或蒲公英根部的提取分离组分，组分X通过以下方法制得：
用乙醇回流提取蒲公英或蒲公英根部，料液比为1g：5～20mL；提取1-10h后，将提取液过滤并浓缩至乙醇完全挥发；所得浓缩液加水稀释，上大孔树脂层析柱吸附；依次用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得所述组分X；
所述组分Y为忍冬藤的提取分离组分，组分Y通过以下方法制得：
用乙醇回流提取忍冬藤，料液比为1g：5～20mL；提取1-10h后，将提取液过滤并浓缩至乙醇完全挥发；所得浓缩液加水稀释后，上大孔树脂层析柱吸附；依次用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得所述组分Y。
一种制备上述抗菌消炎组合物中组分X的方法，包括以下步骤：用乙醇回流提取蒲公英或蒲公英根部，料液比为1g：5～20mL；提取1-10h后，将提取液过滤并浓缩至乙醇完全挥发；所得浓缩液加水稀释，上大孔树脂层析柱吸附；依次用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得所述组分X。
优选的，所述洗脱液为乙醇洗脱所得的洗脱液。
进一步优选的，所述乙醇的浓度为30％-70％。
一种制备上述抗菌消炎组合物中组分Y的方法，包括以下步骤：用乙醇回流提取忍冬藤，料液比为1g：5～20mL；提取1-10h后，将提取液过滤并浓缩至乙醇完全挥发；所得浓缩液加水稀释后，上大孔树脂层析柱吸附；依次用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得所述组分Y。
优选的，所述洗脱液为乙醇洗脱所得的洗脱液。
进一步优选的，所述乙醇的浓度为50％-70％。
基于一个总的发明构思，本发明还包括上述组合物在抗菌消炎药物制备中的应用。
本发明将蒲公英(根)和忍冬藤进行醇提，然后利用大孔树脂柱层析技术对蒲公英和忍冬藤的醇提物进行分离，通过对蒲公英和蒲公英根部提取分离组分的研究发现，用水洗脱得到的分离组分，蒲公英根部提取物分离组分比蒲公英提取物的抗菌性能更优，但是用乙醇洗脱之后，蒲公英提取物的抗菌性能更优，这说明分离方法不同导致得到的分离组分中的有效成分不同，获得的产品抗菌性能也就不同，因而只有利用合适的提取分离方法才能获得蒲公英和蒲公英根部抗菌活性较高的组分。另外发明人发现，蒲公英或蒲公英根部提取物的分离组分中，总黄酮含量最高的分离组分并不是抗菌活性最好的，这与现有技术中将蒲公英的抑菌抗炎功效归因于其中含有的总黄酮略有出入，说明蒲公英中可能还有其他具有抗菌活性的物质，虽然其含量可能不高，但是影响蒲公英的整体抗菌效果，而利用本发明所述提取分离方法可以将其分离获得；通过对忍冬藤提取分离组分的研究发现，忍冬藤作为根茎类药材，用乙醇提取后有效物质的得率仅为12.0％，经大孔树脂柱分离后得率更低，但是忍冬藤的提取物抗菌活性优异，不经过层析树脂分离，所得提取物的最小抑菌浓度均不大于15.63mg/mL，表现出优异的抗菌性能。
对比不同分离组分的抗菌、抗炎性能，发明人发现对于蒲公英(根)提取物，利用大孔树脂层析并用水和70％乙醇洗脱所得乙醇分离组分的抗菌性能最优，而对于忍冬藤提取物，树脂吸附后用水和50％乙醇洗脱所得乙醇分离组分的抗菌性能最优；上述乙醇分离组分对小鼠巨噬细胞Raw264.7炎症因子IL-6的分泌量和转录水平以及对IL-1β的转录水平均具有明显的抑制作用，表现出优异的抗炎性能。
在上述研究过程中发明人发现，仅通过提高单一分离组分的使用量无法突破该组分的抗菌抗炎阈值，因此发明人选择将上述提取物的分离组分按照不同比例进行复配，从而使所得组合物达到单一组分所不能达到的抗菌性能；结果表明，组合物A16D1，也就是PGY-D70分离组分和RDT-D50分离组分质量比为16:1时，所得到的组合物抑菌性能比单一组分更高，是一种抗菌性能极为优异的组合物；而组合物PT-0.2～20:1，也就是PGY-D70分离组分和RDT-D50分离组分质量比为0.2～20:1时，是一系列抗炎效果优异的组合物。
利用本发明所述提取分离方法对蒲公英(根)和忍冬藤进行处理后，所得分离组分的抗菌性能均高于普通市售蒲公英颗粒制剂，优化后的组合物性能甚至比蒲公英颗粒制剂高出数倍，这为其他中药材的现代化开发利用提供了一种可行性的技术路线。
附图说明
图1不同药物浓度对小鼠巨噬细胞Raw264.7生长的影响；
图2不同分离组分对小鼠巨噬细胞Raw264.7中IL-6分泌量的影响；
图3不同分离组分对小鼠巨噬细胞Raw264.7中IL-6转录水平的影响；
图4不同分离组分对小鼠巨噬细胞Raw264.7中IL-1β转录水平的影响；
图5 PGY-D70和RDT-D50的复配组合物对小鼠巨噬细胞Raw264.7中IL-6转录水平的影响；
图6 PGY-D70和RDT-D50的复配组合物对小鼠巨噬细胞Raw264.7中IL-1β转录水平的影响；
图7 PGYG-D70和RDT-D50的复配组合物对小鼠巨噬细胞Raw264.7中IL-6转录水平的影响；
图8 PGYG-D70和RDT-D50的复配组合物对小鼠巨噬细胞Raw264.7中IL-1β转录水平的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
1、材料
1)样品来源
蒲公英、蒲公英根、忍冬藤，均购于河南郑州药材市场，标本存放于河南省科学院天然产物重点实验室，标本编号：No.180304、180305、180402；
2)抗菌抗炎研究所用菌种
标准菌株：鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311，批号14030301；肺炎链球菌ATCC 49619，批号14040201；大肠杆菌ATCC 25922，批号14030301；化脓性链球菌ATCC 19615，批号14031401；金黄色葡萄球菌ATCC 29213，批号14030701，购自南京便诊生物科技有限公司；
临床菌株：鸡大肠杆菌CVCC 1555，批号2009.3.12；鸡金黄色葡萄球菌CVCC 548，批号2008.4.26；鸡白痢沙门氏菌CVCC 1887，批号2007.2.1；牛无乳链球菌CVCC 540，批号2007.7.10，购自中国兽医药品监察所；
供试细胞株：小鼠巨噬细胞Raw264.7(ATCC TIB-71)；
本发明所用蒲公英颗粒为江西心诚药业有限公司生产，批号18013702；其他试剂及材料均为普通市售产品，或者通过本领域技术人员公知的方法或者现有技术中公开的方法获得。
2、实验方法
2.1提取分离方法
1)蒲公英(根)中有效成分的提取和分离
用70％乙醇回流提取蒲公英3次，每次1h，提取时料液比分别为1g：12mL、1g：10mL和1g：10mL；趁热抽滤，将3次滤液合并，并浓缩至无醇味；加水稀释至药材质量数5倍的体积，混匀，将滤液于4000rpm转速下离心10min；取上清，用3倍柱体积每小时的流速上D101大孔树脂柱层析，吸附9h；然后分别用水、30％乙醇和/或70％乙醇按照一定顺序对层析柱进行洗脱，洗脱速度3倍柱体积每小时；将得到的分离物质浓缩、冻干，冷藏保存；
2)忍冬藤中有效物质的提取和分离
用70％乙醇回流提取忍冬藤3次，每次1h，提取时料液比分别为1g：10mL、1g：8mL、1g：8mL，趁热抽滤，将3次滤液合并，并浓缩至无醇味；加水稀释至药材质量的3倍体积，混匀，将滤液于4000rpm离心10min；取上清，用3倍柱体积每小时的流速上D101大孔树脂柱层析，吸附9h；依次用水和/或50％乙醇于3倍柱体积每小时流速下洗脱；将所得分离物质浓缩、冻干，冷藏保存。
2.2分析方法
1)总黄酮含量的测定
对照品溶液的制备：精密称取干燥芦丁对照品0.0112g，用30％乙醇溶解并定容至50mL，得质量浓度为207μg·mL-1的对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取各待测样品适量，用30％乙醇溶解并定容至50mL，摇匀，备用；
标准曲线的制备：精确吸取对照品溶液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL分别至25mL容量瓶，各加入5％NaNO2溶液1.0mL，放置6min；加入10％Al(NO3)3溶液1.0mL，放置6min；再加入4％NaOH溶液10.0mL，用30％乙醇定容，放置15min，在波长510nm处测定各个溶液的吸光值(A)。以吸光值A为纵坐标、质量浓度C(μg·mL-1)为横坐标，建立标准曲线；
总黄酮质量分数的测定：分别量取各供试品溶液5.0mL并转移至对应的25mL容量瓶中，参照“标准曲线的制备”中方法对各待测液进行显色，再在波长510nm处测定吸光值，每个样品平行测定3次，取平均值代入下式计算各待测样品总黄酮的质量分数；总黄酮质量分数计算公式如下：
Figure BDA0002319687110000051
2)有机酸含量的测定
分别称取各待测样品适量，加蒸馏水50mL，取续滤液25mL，再加水50mL，加酚酞溶液2滴，用0.1mol/L的NaOH滴定液滴定，每1mL NaOH滴定液相当于5.945mg的咖啡酸(C9H8O4)；
3)多糖含量的测定
标准曲线的制备：称取葡萄糖对照品适量，加入蒸馏水制成231.4μg/mL对照品溶液，精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8mL于10mL具塞试管中，加水至2mL，在冰水浴中精密加入0.2％硫酸蒽酮6mL，摇匀，置沸水中加热15min，取出，于冰水中冷却15min，在625nm处测其吸光度。以葡萄糖质量浓度C(μg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，建立标准曲线，得到回归方程A＝0.0423+0.0248，相关系数为R2＝0.9991；
多糖质量分数的测定：称取样品适量，用蒸馏水溶解并定容至50mL，摇匀，取5mL滤液，加无水乙醇75mL，在4℃放置12h，4000rpm离心10min，弃上清液，沉淀加水定容至25mL，从中取2mL于10mL试管中，加入6mL硫酸蒽酮溶液，摇匀，在沸浴水中加热15min，取出，于冰水中放置15min，即得待测样品溶液；在625nm测定吸光度，得到其浓度值C；多糖含量计算公式如下：
多糖含量(％)＝(C×8×25×50)/(2×5×取样量m)×100％；
4)HPLC检测
蒲公英及其提取物中咖啡酸含量测定依照《中国药典》(2015版一部)中蒲公英项下咖啡酸含量测定方法执行，忍冬藤及其提取物中绿原酸含量测定依照《中国药典》(2015版一部)中忍冬藤项下绿原酸含量测定方法执行。
实施例1蒲公英中有效成分的分离与抗菌活性测定
在中药领域，蒲公英和蒲公英根均可入药，因此发明人将蒲公英和蒲公英根中的有效成分进行分别提取；首先，为了将蒲公英提取物中的有效成分进行分离，分别用水、30％乙醇、70％乙醇依次洗脱和水、70％乙醇依次洗脱两种方式对吸附了蒲公英提取物的D101大孔树脂柱层析进行洗脱；将上述洗脱过程中得到的不同分离组分进行分别浓缩、干燥，测定并计算分离组分的洗脱得率(相对于原药材而言)、总黄酮含量、有机酸含量、多糖含量和咖啡酸含量，具体对比结果见表1；
表1不同洗脱方式得到的分离组分中有效成分的对比
Figure BDA0002319687110000061
注：-表示未检出；
从上表可以看出，两种洗脱方式得到的蒲公英提取物分离组分的得率、总黄酮含量、有机酸含量、多糖含量和咖啡酸含量均不相同，其中，洗脱液为水时有机酸和多糖含量高，洗脱液为乙醇时总黄酮和咖啡酸含量高。
为了考察上述组分的实际抗菌活性，将得到的分离组分分别进行MIC和MBC测定，具体实验过程及结果如下：
将9种供试菌(标准菌株+临床菌株)先进行斜面复苏，复苏后接种于固体平板培养基上，37℃培养12～24h；从固体平板上挑取单个菌落接种到液体培养基中，制成浓度为106～108CFU/mL的菌悬液，备用；
采用倍半稀释法测定各样品的最小抑菌浓度(Minimum InhibitoryConcentration，MIC)：
由于上述分离组分中有效物质的得率和活性各不相同，因此将上述分离组分制成初始质量浓度分别为500mg/mL和250mg/mL的水溶液，再用液体培养基依次倍半稀释，共稀释7个浓度；以阳性药物蒲公英颗粒(江西心诚药业)为对照组(初始浓度500mg/L)；
将上述各溶液按质量浓度大小依次加入96孔板中，每孔100μL；再分别加入各供试菌液100μL；每种菌液分别设置空白对照(100μL液体培养基+100μL菌液)和阴性对照(只加100μL液体培养基)；将添加好样品的96孔板于37℃恒温培养16～18h；
观察96孔板中各孔溶液状态：细菌无明显生长的孔呈澄清状，有明显生长的孔呈浑浊状；而澄清的孔所对应的最小样品质量浓度即为该样品的最小抑菌浓度(MIC)；
MIC实验结束后，分别从各澄清孔中取样液涂布于固体培养基上，37℃培养24h后观察结果；完全没有细菌生长的各平板所对应的样品最小质量浓度即为该样品的最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)；
上述五种分离组分的MIC结果见表2，MBC结果见表3；
表2蒲公英提取物中不同分离组分的MIC(mg/mL)结果对比
Figure BDA0002319687110000071
表3蒲公英提取物中不同分离组分的MBC(mg/mL)结果对比
Figure BDA0002319687110000081
从上表可以看出，用不同浓度的乙醇洗脱所得分离组分的MIC和MBC均低于水洗脱的分离组分；对比不同浓度乙醇洗脱所得分离组分的总黄酮含量、咖啡酸含量和抑菌效果可知，水和70％乙醇依次洗脱方式下，70％乙醇所得分离组分的总黄酮含量和咖啡酸含量虽然低于水、30％、70％乙醇依次洗脱时30％乙醇所得分离组分，但是，其MIC和MBC也低，且与30％乙醇洗脱后再用70％洗脱所得分离组分的活性一致，即70％洗脱所得分离组分的抗菌性最强；综合考虑各分离组分的得率与活性，水洗脱后再用70％乙醇对蒲公英提取物进行洗脱，得到的分离组分量多且抗菌活性高；
另外，需要注意的是，上述实验结果与现有技术中将蒲公英的抑菌抗炎功效归因于其中含有的总黄酮略有出入，因为总黄酮含量最高的分离组分并不是抗菌活性最高的，这也说明蒲公英中可能还有其他具有抗菌活性的物质，虽然其含量可能不高，但是影响蒲公英的整体抗菌效果，而利用水和70％乙醇依次洗脱的方式可以将其分离出来。
实施例2蒲公英根中有效成分的分离与抗菌活性测定
为了将蒲公英根提取物中的有效成分进行分离，分别用水、30％乙醇、70％乙醇依次洗脱和水、70％乙醇依次洗脱两种方式对吸附了蒲公英根提取物的D101大孔树脂柱进行洗脱；将上述洗脱过程中不同洗脱液得到的分离组分进行分别浓缩、干燥，测定并计算分离组分的得率、总黄酮含量、有机酸含量、多糖含量和咖啡酸含量，具体对比结果见表4；
表4不同洗脱方式得到的蒲公英根提取物分离组分中的有效成分对比
Figure BDA0002319687110000091
为了考察上述组分的实际抗菌活性，将得到的分离组分分别进行MIC和MBC测定，具体实验过程见实施例1，以阳性药物蒲公英颗粒为对照组；具体结果如表5和表6所示；
表5蒲公英根部提取物中不同分离组分的MIC(mg/mL)结果对比
Figure BDA0002319687110000092
表6蒲公英根部提取物中不同分离组分的MBC(mg/mL)结果对比
Figure BDA0002319687110000093
Figure BDA0002319687110000101
从上表可以看出，用不同浓度乙醇洗脱所得分离组分的MIC和MBC均高于水洗脱的分离组分；对比不同分离组分中的总黄酮含量、咖啡酸含量和抑菌效果可知，水和70％乙醇依次洗脱方式下，70％乙醇所得分离组分的总黄酮含量和咖啡酸含量虽然略低于另一洗脱方式中30％乙醇和70％乙醇中的洗脱分离组分，但是，其MIC和MBC也低，即水洗脱后再用70％乙醇对蒲公英提取物进行洗脱，得到的分离组分量多且抗菌活性高；
对比实施例1、2中MIC和MBC可以看出，蒲公英和蒲公英根部的提取物水分离组分抗菌效果相似，其抗菌性能与各自的乙醇分离组分相比均比较差；但是蒲公英提取物乙醇分离组分的MIC、MBC值比蒲公英根部提取物的乙醇分离组分要小，说明蒲公英提取物乙醇分离组分的抗菌性能更优；出现这种情况的原因是，提取所用药材部位的不同，导致所得到的分离组分中的有效成分不同，因而所获得的产品抗菌性能也就不同。
实施例3忍冬藤中有效成分的分离与抗菌活性测定
将忍冬藤用70％乙醇回流提取后，利用D101大孔树脂柱进行吸附；为了将忍冬藤提取物中的有效成分进行分离，依次用水和50％乙醇对层析柱进行洗脱，将不同洗脱液洗脱所得分离组分进行浓缩、干燥；忍冬藤作为根茎类药材，提取率较低，因此将乙醇回流提取所得忍冬藤提取物作为对照组；不同洗脱分离组分中的有效成分测定及对比见表7；
表7不同洗脱方式得到的忍冬藤提取物分离组分中的有效成分对比
Figure BDA0002319687110000102
从上表可以看出，忍冬藤醇提的得率仅为12.0％；经大孔树脂柱分离后得率更低，尤其是经50％乙醇洗脱后，所得分离组分的得率仅为2.8％；
对各分离组分进行抗菌活性研究，具体方法参照实施例1，不同分离组分对9种供试菌的MIC和MBC检测结果见表8和表9；
表8忍冬藤提取物中不同分离组分对9种供试菌的MIC(mg/mL)检测结果
Figure BDA0002319687110000111
表9忍冬藤提取物中不同分离组分对9种供试菌的MBC(mg/mL)检测结果
Figure BDA0002319687110000112
从上表可以看出，虽然忍冬藤提取率较低，但是其醇提物的抗菌活性较好：乙醇回流提取后，所得提取物对9种供试菌MIC均≤15.63mg/mL；而经D101大孔树脂柱层析后，用50％乙醇洗脱所得分离组分的抗菌活性最高。
实施例4抗炎活性研究
从实施例1-3的结果可以看出，对于蒲公英(根)提取物，D101大孔树脂吸附后依次用水和70％乙醇洗脱后，70％乙醇中所得分离组分的抗菌性能最优；而对于忍冬藤提取物，树脂吸附后用水和50％乙醇洗脱，50％乙醇中所得分离组分的抗菌性能最优；为了进一步获得各分离组分的抗炎效果，发明人对上述分离组分对小鼠巨噬细胞Raw264.7炎症因子的影响进行了分析，具体实验过程如下：
1、实验方法
1)细胞复苏与传代培养
向15mL离心管中加入2mL含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL青霉素的1640培养液，37℃预热；取出冻存的小鼠巨噬细胞Raw264.7，37℃快速消融，然后转至上述离心管中，轻轻吹匀，800rpm离心3min，弃上清液，再加入2mL培养液，同时向6cm细胞培养皿中预先加入3mL培养液，轻轻吹匀细胞悬液后取适量加入其中，轻轻震匀后在37℃5％CO2细胞培养箱中培养；
当培养皿中细胞密度达到80％～90％时，弃去培养基，用2mL生理盐水清洗2次，加入1mL培养液轻轻吹打，直至细胞完全吹落，800rpm离心3min，弃上清液；重新加入2mL培养液，轻轻吹匀后取适量细胞悬液，加入已准备好的培养皿中，轻轻震匀后于细胞培养箱中培养，即为传代，传代2～3代后可用于后续实验操作；
2)药物浓度筛选
待小鼠巨噬细胞Raw264.7生长至80％～90％时，手机细胞并检测细胞浓度，用培养基将其稀释成5×104个/mL的细胞悬液；
向96孔板每孔加入100μL细胞悬液，实验孔外围每孔加100μL生理盐水保湿。上述蒲公英(根)和忍冬藤待测组分用培养液溶解并稀释成4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL的溶液，待细胞培养24h之后，分别加入各待测液100μL/孔，以不含待测样的培养液为空白对照，每组设5个重复；另设5个调零孔，每孔只添加200μL培养液；继续培养24h之后对各组进行MTT细胞毒性检测：即在培养结束后，每孔中加入5mg/mL的MTT溶液30μL，继续培养4h后，轻轻吸去培养液，每孔加150μL DMSO并轻轻摇匀，在570nm波长下测定各孔的吸光值(A)，记录结果并计算抑制率或存活率；
计算公式如下：
Figure BDA0002319687110000121
Figure BDA0002319687110000122
3)抗炎实验
如上所述，向6孔板内加入处于生长对数期的细胞悬液3mL/孔，每孔5×105个细胞，每组设3个重复，培养24h之后，弃去原培养液，每孔加入含不同药物与1μg/mL脂多糖(LPS)的培养液3mL，设置对照组和LPS模型组，继续培养24h后先收集上清，再用1mL生理盐水清洗每孔2次，再加入0.5mL细胞裂解液收集细胞，-80℃保存；
4)细胞炎症因子检测
根据BD公司CBA细胞因子检测试剂盒中说明书进行操作；
5)RNA提取
按照福际生物培养细胞总RNA提取试剂盒说明书进行操作；提取RNA之后，检测RNA的浓度；
6)逆转录
根据各组RNA的浓度，计算合适的逆转录用量，参照诺唯赞逆转录试剂盒(
Figure BDA0002319687110000131
II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper))说明书进行操作；
7)q-PCR检测
引物设计如下表，由擎科生物公司合成；
Figure BDA0002319687110000132
依照Bio-rad SsoAdvancedTM Universal
Figure BDA0002319687110000133
Green Supermix说明书，添加适量引物及模板，按照如下程序进行q-PCR实验；
Figure BDA0002319687110000134
2、结果与分析
1)药物浓度筛选结果
不同浓度蒲公英(根)、忍冬藤分离组分处理小鼠巨噬细胞Raw264.7 24h之后，各处理组细胞生长情况见图1；
可以看出，随着药物浓度的增加，蒲公英(根)、忍冬藤提取物的水分离组分对Raw264.7几乎无毒性，但是不同乙醇分离组分对Raw264.7的细胞毒性逐渐增加；为了进一步证明本发明蒲公英(根)、忍冬藤提取分离组分的抗菌抗炎性能，在后续试验中统一采用0.25mg/mL为各分离组分的实验处理浓度。
2)不同分离组分对小鼠巨噬细胞Raw264.7中炎症因子IL-6分泌量的影响
利用流式细胞仪测定不同分离组分处理后对小鼠巨噬细胞Raw264.7炎症因子IL-6分泌量，具体结果如图2所示，其中0为不加药物的空白对照组，LPS为只添加LPS的模型组，PGY-D0为水洗脱所得蒲公英分离组分的处理组，PGY-D70为70％乙醇洗脱所得蒲公英分离组分的处理组，PGYG-D0为水洗脱所得蒲公英根部分离组分的处理组，PGYG-D70为70％乙醇洗脱所得蒲公英根部分离组分的处理组，RDT-D0为水洗脱所得忍冬藤分离组分的处理组，RDT-D50为50％乙醇洗脱所得忍冬藤分离组分的处理组；
从图中可以看出，加入蒲公英、蒲公英根和忍冬藤提取物分离组分后，Raw264.7中炎症因子IL-6的分泌量均小于模型组，其中，用有机相(蒲公英和蒲公英根为70％乙醇，忍冬藤为50％乙醇)洗脱得到的分离组分对Raw264.7中炎症因子IL-6分泌的抑制作用更明显。
3)不同分离组分对小鼠巨噬细胞Raw264.7炎症相关转录因子的影响
不同分离组分处理后，对小鼠巨噬细胞Raw264.7炎症转录因子IL-6和IL-1β的具体影响见图3至图4；从图中可以看出，蒲公英、蒲公英根提取物的分离组分对Raw264.7炎症因子IL-1β和IL-6转录水平有明显的抑制作用，其中，PGY-D70和PGYG-D70均可以将炎症因子IL-6和IL-1β的转录表达量降低到空白对照的水平，表现出极佳的抗炎性能；忍冬藤分离组分RDT-D50的抗炎性能稍差，但是与模型组相比，RDT-D50对Raw264.7炎症因子IL-6和IL-1β转录水平抑制作用明显，尤其是对炎症因子IL-6的转录表达抑制效果更优。
综上，蒲公英、蒲公英根和忍冬藤提取物的乙醇洗脱分离组分对小鼠巨噬细胞Raw264.7中炎症因子IL-6和IL-1β能够起到明显的抑制作用，具有优异的抗炎性能；其中，蒲公英和蒲公英根提取物用70％乙醇洗脱所得分离组分的抗炎性能最优。
实施例5复配组合物抗菌性能研究
上述实验结果表明，利用大孔树脂柱层析并用水和70％乙醇洗脱，70％乙醇洗脱所得蒲公英(根)分离组分的抗菌抗炎性能最优；为了进一步提高所得分离组分的抗菌性能，研究药物复配带来的效果，发明人将蒲公英与忍冬藤的分离组分按照不同的配比进行复配，分别测定不同复配组合物对9种供试菌MIC和MBC；为了能够更清楚的表明复配组合物的抗菌效果，以蒲公英颗粒为对照组，具体结果见表10和表11；
表10不同配比所得复配组合物对9种供试菌的MIC(mg/mL)结果对比
Figure BDA0002319687110000151
表11不同配比所得复配组合物对9种供试菌的MBC(mg/mL)结果对比
Figure BDA0002319687110000161
注：A为蒲公英提取物70％乙醇洗脱所得分离组分；B为蒲公英根部提取物70％乙醇洗脱所得分离组分；C为忍冬藤提取物水洗脱所得分离组分；D为忍冬藤提取物50％乙醇洗脱所得分离组分；数字代表各组分的质量比例；
从上表可以看出，所有复配组合物的MIC和MBC均比蒲公英颗粒的值要小，也就是说，利用本发明所述蒲公英(根)和忍冬藤提取物的分离组分进行复配，所得组合物的抗菌性能明显优于蒲公英颗粒；
以组分A和C的组合为例，就最小抑菌浓度MIC而言，A1C1组合物的MIC与实施例1中A组分的MIC值相当；提高组分A的含量，如A4C1、A8C1、A16C1的MIC均比A1C1的MIC要小，也就是说，抑菌性能有所提高，但是随着组分A添加比例的增加，A4C1、A8C1、A16C1之间MIC并没有明显区别；而就最小杀菌浓度MBC而言，A1C1组合物的MBC比实施例1中单独A组分的MBC值略高，杀菌性能稍差；随着组分A含量的提高，A4C1、A8C1、A16C1的MBC逐渐下降，在A8C1条件下，复配组合物的MBC值最小，杀菌性能最高，之后再提高组分A的含量MBC值并不再减小；这说明，就单一组分而言，有其最低MIC和MBC阈值，到了一定范围即使提高添加量也不能使其抗菌性再提高。
结合实施例1-3和上表中数据可以看出，组分A、B、C、D的抗菌性能为A>B≥D>C；单一组分的抗菌性能有阈值，提高添加含量并不能使其突破其阈值，但是将各组分按照不同比例进行复配可以使所得组合物达到单一组分所不能达到的抗菌性能：组合物A16D1的MIC和MBC是所有条件中最小的，因而其抑菌性能最优，A8C1次之。
实施例6复配组合物抗炎性能研究
为了进一步提高所得分离组分的抗炎性能，研究药物复配带来的效果，发明人将蒲公英(根)70％乙醇分离组分与忍冬藤50％乙醇分离组分按照不同的配比进行复配，分别测定不同复配组合物对巨噬细胞Raw264.7炎症相关转录因子IL-6和IL-1β的影响；具体试验方法同实施例4，具体结果见图5至图8；
其中PT(GT)-0表示无药物处理的空白对照组，PT(GT)-LPS表示仅用1μg/mL的LPS处理的模型组，PT表示PGY-D70和RDT-D50以不同比例配伍的处理组，GT表示PGYG-D70和RDT-D50以不同比例配伍的处理组；
从图中可以看出，与模型组相比，PGY-D70和RDT-D50以及PGYG-D70和RDT-D50的所有复配组合物IL-6和IL-1β的转录水平均明显低于模型组；与空白组相比，当PGY-D70和RDT-D50以0.2～20:1比例配制时，炎症因子IL-6和IL-1β的转录水平均与空白对照组接近；而当PGYG-D70和RDT-D50以1:1的比例进行配伍时IL-6和IL-1β的转录水平与空白对照组接近，这说明复配组合物PT-0.2～20:1和GT-1/1，即PGY-D70和RDT-D50配比为0.2～20:1或PGYG-D70和RDT-D50配比为1:1时所得组合物的抗炎性能优异。

Claims (8)

1.一种抗菌消炎组合物，其特征在于：包括组分X和组分Y，其中组分X和组分Y的质量比为0~20：1；
所述组分X为蒲公英或蒲公英根部的提取物分离组分，组分X通过以下方法制得：
用乙醇回流提取蒲公英或蒲公英根部，料液比为1g：5~20mL；提取1~10h后，将提取液过滤并浓缩至乙醇完全挥发；所得浓缩液加水稀释，上大孔树脂层析柱吸附；依次用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得所述组分X；
所述组分Y为忍冬藤的提取物分离组分，组分Y 通过以下方法制得：
用乙醇回流提取忍冬藤，料液比为1g：5~20mL；提取1-10h后，将提取液过滤并浓缩至乙醇完全挥发；所得浓缩液加水稀释后，上大孔树脂层析柱吸附；依次用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得所述组分Y。
2.一种制备权利要求1所述抗菌消炎组合物中组分X的方法，其特征在于：用乙醇回流提取蒲公英或蒲公英根部，料液比为1g:5~20mL；提取1~10h后，将提取液过滤并浓缩至乙醇完全挥发；所得浓缩液加水稀释，上大孔树脂层析柱吸附；依次用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得所述组分X。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述洗脱液为乙醇洗脱所得的洗脱液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述乙醇的浓度为30%~70%。
5.一种制备权利要求1所述抗菌消炎组合物中组分Y的方法，其特征在于：用乙醇回流提取忍冬藤，料液比为1g:5~20mL；提取1~10h后，将提取液过滤并浓缩至乙醇完全挥发；所得浓缩液加水稀释后，上大孔树脂层析柱吸附；依次用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得所述组分Y。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述洗脱液为乙醇洗脱所得的洗脱液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述乙醇的浓度为50%~70%。
8.权利要求1所述组合物在抗菌消炎药物制备中的应用。
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