CN110841078A - 用于评价病理性组织内大分子转运的动态增强mri成像法和活性剂 - Google Patents

Abstract

本发明一般涉及用于非侵害性评估大分子系抗癌药或前药在病理性组织且尤其是实体瘤内递送和优化抗癌疗法的顺磁性造影剂和动态增强MRI成像法。

Description

用于评价病理性组织内大分子转运的动态增强MRI成像法和 活性剂

本申请是申请日为2013年3月5日、申请号为201380012698.2、发明名称为“用于评价病理性组织内大分子转运的动态增强MRI成像法和活性剂”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明一般涉及用于评价大分子在病理性组织内转运的动态增强MRI成像(DCE-MRI)方法。

更具体地，本发明涉及用于大分子药物或前药在病理性组织且尤其是在癌性区域和实体瘤内递送的非侵害性评价和用于选择和优化抗癌疗法的造影剂和DCE-MRI方法。

背景技术

癌症仍然是发达国家中主要的死亡原因且癌症的风险随人口年龄的增加而递增。手术摘除、特别是在小的恶性肿瘤或限于有限区域的手术摘除和通常利用小分子药物的常规的化疗仍然代表了最常用的抗癌疗法。

由于对待治疗的部位和病理性情况缺乏选择性且由此由于因常规化疗剂产生的严重副作用，所以对于生物活性剂存在逐步增加的关注，这些生物活性剂具有可以显著地降低药物毒性和改善常规化疗产生的治疗效力的优化的靶向能力。

适合的实例包括靶向活性剂，即在其结构上包含选择性肿瘤靶向单元、典型地是肽或肽模拟物部分的药物，目的在于使治疗活性部分选择性地定向于肿瘤。然而，尚未证实这种类型的药物始终有效，且在一些情况中，它们甚至已经导致了严重的副作用。

近年来获得逐步增加的关注的不同策略基于开发大的大分子或纳米大小的药物，即具有大于40KDa分子量或基于具有2-400nm大小的颗粒的治疗化合物，经证实它们在临床前和临床环境中具有优良的治疗效力与最少的副作用。实际上，经证实大分子药物或前药可自发地和选择性地随时间集中于恶性肿瘤组织，且尤其是实体瘤内，结果是表征其结构且尤其是其脉管系统的解剖学和病理生理学异常。到了这一程度，值得记忆的是血管发生在大部分病理性组织和实体瘤中导致紊乱和增量调节的血管形成，其典型地展示出导致进入血管外肿瘤组织的大分子化合物广泛渗漏的渗透性显著增强与其他功能性异常。同时，对所述大分子化合物的网状内皮组织和/或淋巴管清除局部缺少乃至缺乏确保其长期保留在肿瘤组织内，就大分子药物而言，这产生了延长的局部治疗活性(例如，参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1998,4607-4612；R.K.Jain,Transport of molecules,particles and cells in solid tumors,Annu.Rev.Biomed.Eng.,1,1999,241-263)。

作为实例，经证实抗癌药物例如SMANCS(具有大于40KDa的分子量的新制癌菌素(neocarzinostatin)和聚(苯乙烯-共-马来酸)缀合的聚合物)自发蓄积在肿瘤组织内高于在正常组织和器官内观察到的至多200倍(例如，参见：Maeda等人,Cancer Res.1986；46,6387-6392；Maeda等人,Adv.Drug Deliv.Rev.2001；46,169-185)。

这解释了近10年以来对致力于利用聚合物或纳米大小的药物用于治疗策略的关注逐步增加，实际上，它们中的一些已经得到快速地批准用于临床应用且已经在市场上销售，而许多其他药物是很快地可预期的。

然而，尤其在使用纳米大小的药物时在治疗的数个月内遇到了失败或有效性有限和抗药性的情况(例如，参见Northfelt,D.W.等人Pegylated-liposomal doxorubicinversus doxorubicin,bleomycin,and vincristine in the treatment of AIDS-relatedKaposi’s sarcoma：results of a randomized phase III clinicaltrial.J.Clin.Oncol.16,1998,2445-2451；O’Brien,M.E.等人Reduced cardiotoxicity和comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicinHCl(CAELYX/Doxil)versus conventional doxorubicin for first line treatment ofmetastatic breast cancer.Ann.Oncol.15,2004,440-449)。

对这些失败的解释最可能地在于由不同癌组织展示出的罕见解剖学和病理生理学。就此而言，实际上以下是清楚的：为了有效地发挥其在病理性组织中的治疗作用，药物必须能够通过血液循环系统达到相关组织，从血管中外渗并且深入地在组织的血管外-细胞外空间扩散。

而在临床实践中遇到大量几乎不或不均匀灌注的肿瘤，它们显示对使用大分子抗癌药物的药理学治疗的抗性，这主要归因于它们在待治疗的病理性区域或组织内的递送不足。例如，其中通常包含典型地展示出更致密和过高渗透性的微血管化的外层和通常包括坏死区域的内部核心的较大或晚期的实体瘤几乎不血管化且难以被大分子治疗剂渗透。

视为和解释有利于大分子溶质在肿瘤块内递送和蓄积的所有参数的现象是增强的渗透性和保留(EPR)效应，其首先由Maeda和合作者报道和讨论(se Maeda等人,CancerRes.1986；46,6387-6392)。

更具体地，EPR效应是复杂的分子量依赖性现象，其涉及恶性组织的罕见解剖学和病理生理学，且其定量会翻译成大分子溶质渗透和蓄积其中的合理可靠的评估值(特别地参见Adv.Drug Del iv.Rev.2011；63,136-151和引述的文献)。在实际情方面，所观察到的EPR效应越高，则大分子药物或前药在肿瘤内的预期递送越多。相反，如果所观察到的EPR效应过低，则预期在恶性肿瘤中的药物渗透仅有限或受到抑制，导致所谓的肿瘤抗药性。

因此，当今EPR效应被科学界接受为评价药物递送入肿瘤块中的关键因素且由此用于鉴定显示对使用大分子药物或前药的药理学治疗的接受性有限或受到抑制的患者，由此成为使用大分子活性剂的抗癌药物设计和治疗策略中的“金标准”。

然而，由于基于和影响这一现象的参数的数量和复杂性(例如上述引述的文献且尤其是在Adv.Drug Deliv.Rev.2011,63,136-151中详细描述的，引入本文参考)，所以用于通过使用临床相关成像技术的非侵害性体内定量EPR效应的公认的方法仍然无法利用。

实际上将基于荧光显微镜检查的组织学方法提出为定量血液灌注和在显微水平上表征所关注的化合物从血管外渗至血管外空间的有价值的工具。

用于该方法的适合的活性剂是荧光化合物，其自身有荧光或因为与荧光团缀合，从而能够通过荧光强度测定它们在显微图像中增强的其浓度。

可以通过这种组织学方法计算的重要参数是血管面积，即血管所占据的显微切片的百分比。就此而言，该参数值越高，肿瘤灌注越好，则溶质转运入该组织得到改善。尽管血管面积是可以通过所关注的化合物渗透入所述组织建立EPR效应的重要参数，但是可使用荧光显微镜检查得到的最有意义的信息是代表作为其距最接近灌注血管的距离的函数的化合物浓度衰减的曲线。该曲线可通过将来自大量显微图像的荧光强度I表示为其距最接近灌注血管的距离的函数得到，即为I＝f(x)(就此而言，例如，参见F.Tannock等人,2005.Clin Cancer Res,11,8782-8788和Tong,R.T.等人,2004Cancer Res,64,3731-3736)。

或者，伊文斯蓝的应用也公开在相关文献中，即它是蓝色染料，在静脉内注射后，蓄积在一些肿瘤部位，而不会在正常组织中产生这一结果。

然而，由于所涉及的技术是中度灵敏的，所以染料仅有利地在对得自处死动物的样品进行的离体研究或在对肿瘤进行手术可观察到的体内试验中使用。

放射性标记的试剂也已用于通过使用PET技术体内评估大分子化合物在肿瘤内的蓄积。然而，除需要患者暴露于危险放射中外，后者仅提供了弱的空间分辨率，其低于使用得到的MRI的空间分辨率一个数量级，且由此难以对小肿瘤利用。

特别地，还将利用油造影剂即碘化油(lipiodol)的基于CT的方法公开为用于溶解且由此选择性地递送抗癌药物的有价值的介质(例如，参见Cancer,August 15,1985)。

例如，使用DCE-MRI技术、通过使用B22956/1(钆考酸三钠盐)得到的K^trans测量值对血管渗透性进行评价公开在专利申请US 2007/0059246中。

在使用贝伐单抗(Avastin^TM)进行血管发生抑制的实验性异种移植物肿瘤中内皮渗透性(通过DCE-MRI技术测定，为渗透性-表面积乘积的系数，K^PS)与组织学测定的化疗剂长春瑞滨浓度之间的相关性由Brasch等人在Fortschr.Rontgenstr 2010；182：133-139中分析。

特别地，该文章讨论了所观察到的在使用白蛋白(Gd-DTPA)₃₀即因其免疫原性应答升高而未被批准用于临床应用(Brasch R.等人,JMRI 1997；7:331-338)的一种大分子增强造影剂在肿瘤边缘中得到的K^PS值与HPLC测定的在检查的肿瘤部位内化疗剂的总浓度之间的相关性，所述的K^PS值与化疗剂的总浓度是在任选地仍然在血管隔室内部或在所涉及的肿瘤区域的血管外-细胞外空间内扩散的活性剂之间未区分的情况下计算的。相反，这种类型的测定使得鉴定基本上未达到或非均匀性灌注的肿瘤区域完全不切实可行。

而为了鉴定可以得益于使用大分子抗癌药物或前药治疗的肿瘤患者，必须能够评估后者必须渗透入和均匀地渗透入待治疗的患病区域，作为关键步骤，通过测定处于外渗(从血液脉管系统)的量及其在病理性区域血管外部空间中扩散的深度和均匀性来进行(Freeman等人Molecular Cancer 2012；11:47)。

在这方面，实际上值得记忆的是基于单克隆抗体(mAbs)的抗癌药在肿瘤部位中的分布不足和/或不均匀在目前被科学界公认为使用mAbs衍生的药物的治疗失败的主要原因之一。实际上，药物以显微等级的空间分布、尤其是当从血池(blood pool)中清除前全身施用时mAb可以从灌注的血管所达到的距离是mAbs治疗效力的决定性因素。

因此，对改进的造影剂和诊断方法仍然存在需求，它们能够以非侵害性方式验证待治疗的病理性组织中存在的那些允许大分子药物有效递送的条件，以便识别抗性肿瘤和由此因待治疗的组织中的分布不足或受损而难以得益于使用大分子药物或前药治疗的患者。

发明内容

本发明公开的解决方案涉及顺磁性造影剂和诊断方法，它们能够以非侵害性方式通过使用MRI技术体内评估病理性组织对于所关注的大分子化合物的渗透性。

更具体地，本发明涉及一类顺磁性造影剂和MRI方法，基于这些活性剂在所述相关区域中展示出的药代动力学，它们用于非侵害性评估基于关注的大分子溶质外渗和扩散的条件和定量评价其递送入病理性身体区域、部位、组织、肿瘤或癌肿块，或更一般地是发炎区域。

就此而言，已经鉴定了一类顺磁性造影剂，尽管具有合理的低分子量，但是已经证实它们在体内遵循广泛地与MRI诊断成像时间一致的时间，与人血清白蛋白(HSA)即一种具有约67KDa分子量的血液大分子溶质相同的药代动力学结局。

特别地，我们已经观察到，具有低于5,000道尔顿的分子量并且展示出至少85％的与HSA的体内非共价结合的顺磁性造影剂在人血浆中显示严格地与人血清白蛋白相差无几的药代动力学持续适合的时间，即广泛地与MRI成像一致的时间，并且能够对后者的递送和分布入关注的病理性身体区域或组织提供合理的评估，基于它们在所述相关区域或组织中展示出的药代动力学，正如通过使用MRI-成像技术所评价的。

有意义地，此外，通过提供HSA局部递送的体内定量，所述HSA便利地被视为关注的大分子溶质的有代表性的实例，已经有利地证实这些造影剂由此能够对基于关注的大分子溶质例如药物或前药的外渗和扩散的条件提供可靠的评价，且甚至更有意义地，提供对其递送入患病身体区域或组织且尤其是肿瘤或癌肿块的定量评价。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及这类非共价HSA结合造影剂在以非侵害性方式通过MRI成像技术体内评估关注的大分子溶质在病理性身体区域、组织或肿块中递送和局部大分子转运程度中的应用。

在另一个实施方案中，本发明涉及DCE-MRI方法，其包括根据适合的顺磁性造影剂在所述相关病理性组织、部位或肿块中展示出的药代动力学、更具体地根据与这种活性剂在相关身体区域或肿块中展示出的药代动力学相关的DCE-MRI评估值以非侵害性方式得到关注的大分子溶质递送入病理性身体区域、部位、组织或实体肿块的体内评价。

在一个不同的实施方案中，本发明涉及本发明的顺磁性活性剂和DCE-MRI方法在鉴定渗透-抗性肿瘤中的应用，所述渗透-抗性肿瘤即显示对于大分子溶质的渗透性差或受损的病理性组织，由此所述病理性组织难以得益于使用大分子抗癌药物或前药的治疗。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于对肿瘤患者分层次(stratification)的诊断方案，其利用本发明的活性剂和DCE-MRI方法用于鉴定和识别对依赖于应用大分子药物或前药的抗癌疗法存在抗性的患者，这种抗性归因于在待治疗的肿瘤区域中所述大分子药物或前药的渗透力不足或受损。

此外，本发明进一步涉及本发明的活性剂和DCE-MRI方法在抗癌疗法的选择、处置和优化中的应用，所述抗癌疗法使用大分子抗癌药物或前药单独地或与其他协同作用的活性剂组合，所述其他协同作用的活性剂包括致力于增强大分子药物吸收的任意活性剂例如EPR增强剂，以及在监测EPR增强疗法或包括抗癌和EPR增强药物的联合疗法的有效性中的应用，或在测试在最佳递送方面新抗癌药物或前药在所关注的病理性组织内的效力中的应用。

附图说明

图1.实施例3使用钆考酸钠盐在小鼠中的体内试验的时间安排。

图2.显微图像采样方案。

图3.用于实验性测试的组织学方法的图解表示，所述实验性测试用于鉴定显微图像中的血管(1和2)和表示计算荧光强度时距最接近血管的每个像素的距离的等距(isodistance)线。例如，在该图中，点A距离血管1为20-30μm，点B距离血管2为10-20μm，点C距离血管2为40-50μm，而仅距离血管1为30-40μm，因此，将其距离设定至距最接近血管(血管1)30-40μm。

图4.得自对距血管壁的给定距离(x)处的每个像素计算的荧光强度值的荧光强度衰减曲线。通过在选择(choise)的间隔对强度衰减曲线进行数值积分计算荧光强度衰减曲线下的面积，所述选择的间隔为从血管壁到荧光接近背景值时的距离。

图5.在实施例3的体内试验中对每只动物的肿瘤边缘计算的FITC-白蛋白衰减AUC(1-200μm)的组织学评估值(平均值)和使用回归线绘制的k^trans mL\(min x g)x 100的相应值的相关性。

图6.在体内实施例3中对每只动物的肿瘤核心计算的FITC-白蛋白衰减AUC(1-200μm)的组织学评估值(平均值)和使用回归线绘制的k^trans mL\(min x g)x 100的相应值的相关性。

图7.在体内实施例4中使用B22956/1分别在PTX治疗的肿瘤核心和边缘测定的血浆容量分数f_PV和转换系数K^trans的DCE-MRI值的增加的图解表示(方框-图)。

图8.来自实施例4的体内试验的对比参数图像，其报告了在用PTX(左侧图像)和媒介物(右侧图像)治疗后24小时病理性组织(异种移植肿瘤)中记录的解剖学MRI图像上过度加强的逐个像素DCE-MRI测量K^trans值。所述图像显示用PTX治疗的异种移植肿瘤中白蛋白的空间分布增加。

图9.来自实施例5的体内试验的组织学图像。小图A：FITC-白蛋白染色的组织学图像；小图B：有边界的血管区域；小图C：距最接近血管的距离的图；小图D：Cy5-CTX染色的组织学图像。

图10.来自实施例5的体内试验的对比参数图像，其展示出在相应解剖学MRI图像上过度加强的K^trans、fPV、早期AUC比、晚期AUC比、平均增强(Avg.Enh.)的逐个像素的DCE-MRI测量值。还报告了1个小图，其显示肌肉和AIF(动脉血)部位。在参数图像中，过度加强的像素的亮度用作参数值的测量值：测量的参数值越高，则图像中的像素越亮。

图11.来自实施例5的体内试验的对比图像，其在左侧的小图中显示的是小鼠的腹部部位的MRI切片(其中箭头表示A431异种移植的肿瘤块)，而在右侧小图中显示的是与具有AVGENH>57的肿瘤的像素过度加强相同的切片(其中57是测量的阈值)，该切片显示为图像中的白色区域。该图能够直接鉴别肿瘤部位内“有利”或“阳性”像素的量和分布。

图12.实施例5的体内试验中通过在裸鼠NCR中使用Cy5-CTX计算的平均荧光衰减曲线，所述裸鼠NCR带有用PTX或媒介物预处理的皮下A431人表皮样癌异种移植物。约20μm范围内的分开的两个曲线之间的差异的统计学显著性如图下的线所示。

图13.使DCE-MRI结果和组织学评估值建立相关性的实施例5的对比试验的图解表示。该图还显示在“有利的”(或“可渗透的”)肿瘤与“不利的”(或“不可渗透的”)肿瘤之间基于DCE-MRI的区分的结果和用于区分的选择标准。在该图中，具有AVGENH>57的像素分数(根据每个肿瘤ROI的所有像素计算)显示具有fAUC_350.550值的统计学意义的相关性(斜线p-值<0.01,皮尔逊相关性检验)。实际上，“有利的”肿瘤(白色斑点，为具有AVGENH>57的像素分素超过0.5)显示在“不利的”方面较高的fAUC值(放置垂直线表示截断值)。

发明详述

本发明涉及DCE-MRI方法基于适合类型的顺磁性造影剂在所述相关病理性区域或组织内展示出的药代动力学在非侵害性评估涉及大分子溶质在病理性组织或肿块内渗透入和扩散或换句话说其在病理性组织或肿块内转运的条件以及定量评价其局部递送的一般适用性。

因此，提出的方法允许非侵害性识别肿瘤和患者，其中基于大分子溶质外渗和扩散的递送条件适合地满足注定展示出对使用大分子抗癌药物的药理学治疗产生抗性的患者，所述抗性的原因在于所述大分子抗癌药物在待治疗的病理性组织内的递送不足。

特别地，本发明的目的在于用于非侵害性评价大分子转运入病理性身体区域、组织或肿块的DCE-MRI方法，包括根据适合类型的顺磁性造影剂在所述相关病理性区域或组织中展示出的药代动力学或更具体地根据与这些活性剂在相关组织、区域或肿块内展示出的药代动力学相关的那些参数的DCE-MRI评估值得到所关注的大分子溶质的体内评估值。

就此而言，动态增强MRI成像技术(DCE-MRI)是新出现的诊断成像技术，目前被视为可最佳地对不同组织内的药代动力学参数进行定量并且评价对癌症治疗、尤其是对抗血管生成药物响应的进展(例如，参见Preda等人JMRI 2004；20:865-873；Haacke E.M.,Magnetic Resonance Imaging 1999；Physical Principles and Sequence DesignWiley-Liss；和Fortschr.

2009；181：536-542)。尽管其选择不应被视为限制或排除MRI技术领域中已知的不同顺序设置或成像方案的可选应用，但是DCE-MRI技术在执行本发明方法中的应用被视为优选的，即得到与所涉及的造影剂在相关病理性组织或肿瘤块内展示出的药代动力学相关的参数的评估值。

除非另有提供，否则关于大分子溶质在相关病理性身体部位、组织或肿瘤块内的术语“递送”(或在本文中可互换使用的“分布”或“渗透”)，我们指的是其在相关组织或肿块的间质间隙中分布的程度，典型地包括其从血液循环中外渗至血管外空间及其局部(即间质)扩散。

而关于术语大分溶质在相关身体区域、部位、组织或肿瘤块内的“转运”，我们指的是其在述相关区域或肿块内(典型地通过局部血管化)渗透的程度及其在相关组织或肿块间质内扩散的程度。

所谓“递送条件”，我们是指基于大分子溶质从血液循环中外渗和在病理性组织间质内扩散的那些病理生理学条件和功能参数，例如在上述引述的文献中找到并且更好地详细描述的那些(特别地参见Adv.Drug Deliv.Rev.2011,63,136-151，引入参考)。

所谓“病理性”或“患病”组织、区域、身体部位或实体块，我们是指被病理学情况侵害的区域，其可以得益于使用大分子药物或前药治疗，例如，优选癌或肿瘤身体区域、组织或部位或肿瘤块，或更一般地是慢性发炎的区域，例如关节炎区域或身体部位。

所谓“患者”，我们是指哺乳动物患者，且优选患有疾病例如慢性炎症状态、癌症或肿瘤的人，或更一般地，是可以得益于使用大分子药物或前药治疗的病理学情况。

除非另有提供，否则本发明范围内的大分子溶质是：化合物，其具有与白蛋白相差无几或大于它的大小即具有至少约50Kda的分子量的化合物；或药物，所述药物例如在静脉内注射时因与血浆蛋白或血液成分非共价结合而达到的所述尺寸的抗癌药物。

本发明特别关注的大分子溶质是大分子药物或前药，尤其是抗癌药物或前药，典型地包括单克隆抗体或抗体片段或蛋白质缀合物乃至治疗分子的聚合物衍生物。

例如，适合的实例包括蛋白质的聚合物缀合物，例如SMANCS、PEG-天冬酰胺酶和聚乙二醇化的抗VEGFR2；低分子药物与合成聚合物的缀合物，所述合成聚合物例如SMA(苯乙烯-马来酸/酸酐共聚物)、HPMA(N-2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺共聚物)、DIVEMA(二乙烯基醚-马来酸缀合物)、PVA(聚乙烯醇)、PEG(聚乙二醇)、琥珀酰明胶、OXD(氧化右旋糖酐70)，所述低分子药物与合成聚合物的缀合物例如包括SOD-SMA(其中SOD表示超氧化物歧化酶)、SOD-DIVEMA、DIVEMA-NCS(其中NCS表示新制癌菌素)、Pyran-NCS、SOD-PVA、SOD-suc-明胶、PEG胆红素氧化酶、DOX-HPMA(其中DOX表示多柔比星)、OXD-DOX、PEG-多西他赛(NKTR-105)、PEG-伊立替康(NKTR-102)、PEG-纳洛酮(NKTR-118)、HPMA共聚物palatinate(ProLindac)和聚合物-环糊精纳米粒-喜树碱(IT-101)；或低分子药物与蛋白质例如IgG或白蛋白的缀合物；或，此外，还有基于单克隆抗体或抗体片段的药物，例如公开在Critical Review inOncology Hematology 2005；54 11-29和引述的文献中；和展示出与血浆成分且尤其是白蛋白至少90％的体内非共价结合的药物。优选的基于单克隆抗体/抗体片段的大分子药物包括，例如(抗体：阿仑珠单抗；靶标：CD52)、(抗体：贝伐珠单抗；靶标：血管内皮生长因子,VEGFR)、Adcetris^TM(Brentuximab Vedotin；靶标：CD30),

(抗体：Cetuximab；靶标：表皮生长因子受体),(抗体：吉妥珠单抗；靶标CD33),

(Ipilimumab或MDX-101；靶标：阻断CTLA-4)、(抗体：Panitumumab；靶标：表皮生长因子受体)、

(抗体：曲妥珠单抗；靶标：HER2/neu)、(抗体：托西莫单抗；靶标：CD20)、

(抗体：利妥昔单抗；靶标CD20)。

在本发明的方法中，对大分子转运入所关注的病理性身体区域或组织的评价尤其得自通过使用DCE-MRI技术对一种或多种参数进行的定量评价，所述的那些参数紧密地与所开发的造影剂在局部展示出的药代动力学相关取且由此对那些基于所述造影剂在所述相关组织或区域内外渗和扩散的异常解剖学和病理生理学条件有响应。

就此而言，许多是可以根据DCE-MRI实验数据和一般可在大部分临床和临床前环境中得到的数据计算的参数，此外，用于计算它们的药代动力学(PK)方法是不同的。例如，这些方法和量的一些列举在Tofts P.S.等人,JMRI,1999；10,223-232中，而赞同其评价的方法例如描述在Yankeelov TE等人Magn.Reson.Imaging 2005；23,519-29中。

本发明的适合的药代动力学参数的非限制性实例(除非一般鉴定为p)包括，例如：

·K^trans(min^-1)，其为血浆与血管外细胞外空间(EES)之间的容量转运常数。它与所涉及的活性剂从血液的脉管系统外渗至血管外-细胞外空间(EES)相关；

·f_PV，血浆容量分数，其提供血液容量的指示，且由此表示局部(肿瘤)血管化；

·K_ep(min^-1)，其为EES与血浆之间的速率常数(更精确地是从EES到血液，且由此到溶质洗涤掉)且与所关注的组织或部位内血管外-细胞外空间(EES)的部分相关；

·AUC_t1,t2(曲线下的面积，min x mol/L)，其为造影剂浓度时间分布图的积分。例如，AUC_20.30和AUC_10.20是注射造影剂后20－30分钟和10－20分钟计算的AUC；

·AUCE_t1,t2(信号增强曲线下的面积，min)，其为MRI信号增强时间分布图的积分。例如，AUCE_20.30和AUCE_10.20是注射造影剂后20－30分钟和10－20分钟计算的AUCE；

·IAUC_T(时间-浓度曲线下的起始面积，min x mol/L)，其为对经过在造影剂注射后获取的第一个时间点和结束时间点T计算的造影剂浓度的积分；

·IAUCE_T(时间-信号增强曲线下的起始面积(min)，其为对经过在造影剂注射后获取的第一个时间点和结束时间点T计算的信号增强曲线的积分；

·AVGENH(本文所用的平均信号增强或Ave.Enh.可互换使用)，其为对注射后获取的所有时间点计算的平均信号增强；

·EARLYAUCRATIO(或早期AUC比，在本文中可互换使用)，其用所关注的ROI(例如肿瘤或肌肉)中的IAUC₁除以血液中的IAUC₁(造影剂注射后第一分钟期间计算的)来计算。对于具有在注射后第一分钟期间可忽略不计的外渗(从脉管系统中)的造影剂，作为本发明活性剂的情况，EARLYAUCRATIO值与肿瘤血浆容量分数相关；

·LATEAUCRATIO(或晚期AUC比，在本文中可互换使用)，将其计算为注射后20－30分钟所关注的区域内增强曲线下的面积(AUC_20,30)除以血液中测定的IAUC₁。该量与外渗的造影剂的量相关，且由此间接地与k^trans和k_ep值相关。

·早期和晚期ENHANCEMENT在运算方面不同，但基本上等同于(即表示相同的量)晚期和早期AUCRATIO。

然而，在一定程度上与上述鉴定的DCE-MRI药代动力学参数相关或可衍生自它们的每个药代动力学参数必须被视为在本发明范围内。

一般而言，本发明DCE-MRI方法的主要步骤包括：a)得到适合的造影剂在所关注的病理性身体区域或部位内通过期间获取的MRI图像集并且根据获取的MRI图像计算造影剂浓度-时间分布图(或随时间变化的浓度-曲线，在本文中可互换使用)；b)从计算的浓度-时间分布图中提取数字描述符，其与所述造影剂在所述病理性组织内展示出的药代动力学相关；和c)根据计算的参数值获得大分子在相关组织内转运的评价。

上述方法的关键点包括鉴定采集的各DCEMRI图像内关注的部位。所谓所关注的部位或ROI在本文中可互换使用，对此，我们指的是诊断方法所施用的身体部位(或组织或它们的部分)，即在组织水平上研究与大分子分布相关的生理学特征的特定部位。典型地，在记录的图像中所关注的部位(ROI)表示为病理性部位(典型地为肿瘤部位；或肿瘤ROI，在本文中可互换使用)，但参比部位例如由健康肌肉表示的部位(其中关注的大分子溶质的外渗基本上不存在或至少可忽略不计)和任选的血管区域(或血液区域)因计算和/或对比原因也通常被鉴定。

根据一个优选的实施方式，本发明的DCE-MRI方法主要依赖于在DCE-MRI实验过程中获取的信号时间曲线的药代动力学模型且包括如下步骤作为主要步骤：

i)得到来自所研究的适合的顺磁性造影剂在病理性区域、组织或肿块内通过期间获取的DCE-MRI图像集合的信号强度曲线和任选地来自参比部位和/或血管部位的等同曲线，并且将MRI信号强度转化成造影剂浓度且得到浓度曲线；

ii)通过药代动力学模型拟合所述浓度曲线，以得到那些药代动力学参数p_i的评估值，它们与所述造影剂在血管组织、区域或肿块内的转运相关；

iii)根据得到的药代动力学参数值评价所研究的关注的大分子溶质在所述相关组织或区域内的递送。

优选地，上述DCE-MRI方法还包括例如获取所研究的病理性身体区域或部位的形态MRI图像，然后开始动态成像方法，从而能够以良好的解剖学分辨率鉴定所关注的ROI(s)，典型地是肿瘤部位、参比部位和任选的记录的DCE-MRI图像内的血液区域。

根据该方法步骤i)的DCE-MRI图像集合可以在将造影剂施用于MRI获取终点T后在整个采集时间窗(T)内、典型地在1－30分钟或优选在1－20分钟时间且更优选1－15分钟适当地获取，或在造影剂施用与MRI获取结束之间包含的任意连续或不连续时间窗内获取。

可以在该方法步骤ii)得到的适合的药代动力学参数的实例包括转运常数K^trans、速率常数K_ep和血浆容量分数f_PV。

然而，尽管其选择不应被视为对任何不同参数评估的限制或排斥，但是上述方法的优选实施方式包括得到基于DCE-MRI的K^trans和f_PV评估值且更优选K^trans的评估值，它们通过典型地通过使用本领域公知的两隔室药代动力学模型拟合步骤i)得到的浓度曲线计算，且例如公开在Brasch R.C.等人,1998,AJR 171,941-949和Tofts P.S.等人,JMRI,1999,10,223-232中。

就此而言，DCE-MRI衍生的K^trans值与所观察到的大分子溶质在同一成像组织内的递送之间的基本上线性的相关性能够对前者的后者形式DCE-MRI评估值进行评价。实际上，测定的K^trans越高，则在检查中大分子药物或前药在病理性组织内的递送越多和/或约均匀，而相反，较低的K^trans评估值表明大分子溶质在所述组织内的外渗和扩散差或受损。

将本发明DCE-MRI方法的可选的、但等同于优选的实施方式在本文中鉴定为无模型方法。

该方法没有基于测定与肿瘤脉管系统血管的那些生理学参数，而是基于与造影剂达到所关注的组织内并且反映出血流、血管渗透性和间质间隙部分的参数(GeoffreyJ.M.Parker等人Comparative Study into the Robustness of Compartmental Modelingand Model-Free Analysis in DCE-MRI Studies.JMRI 2006,23:554-563)。

这种实施方式主要依赖于提取(从DCE-MRI实验过程中采集的MRI数据)数字描述符，所述数字描述符例如在造影剂注射后在对不同时间计算的AUC和/或AUCE值且包括，例如对造影剂注射后第一个时间点和DCE-MRI获取结束前不同时间点T(以分钟计)限制的几个时间窗计算的时间-浓度曲线下的起始面积值(IAUC_T)和/或时间-信号强度增强曲线下的起始面积值IAUCE_T和/或对注射后采集的所有时间点计算的平均信号增强。

更具体地，这种可选的实施方式包括如下步骤为主要步骤：计算造影剂浓度(和/或可选地信号增强)曲线，该曲线覆盖造影剂注射后来自所述造影剂在所关注的区域或组织内通过期间获取的MRI图像组的第一个T分钟，例如在整个获取时间窗内，通过如前所述，取最高30分钟和优选1－20分钟的时间，或可选地在例如注射后20-30分钟的t₁-t₂时间窗内，乃至在造影剂施用与MRI获取结束之间包含的任意连续或不连续时间窗内；和/或对获取时间窗的所有注射后时间点计算的平均信号增强。

可以通过使用本领域公知的数值积分方法测定覆盖从所述造影剂施用开始的相关时间T的造影剂浓度(或信号增强)曲线积分，例如下列梯形积分规则：

其中IAUC_T是对注射后第一个T分钟计算的IAUC，F(i)是在动态时间点i时造影剂的组织浓度(或AUCE的信号增强)，t_i是时间点i时的时间，N是t_i＝T前最后的时间点；

或如下等式：

其中AUC在t₁-t₂时间窗内计算(即更精确地，通过使用在t1-t2之间的时间间隔期间获取的所有DCE-MRI图像)，F(i)是在时间点i测定的造影剂的组织浓度(或AUCE的信号增强)。

而例如可以通过使用下列等式测定AVEGH：

其中Enh(i)是在动态时间点i的信号增强，N是最后获取的时间点。

一般而言，可以通过使用本发明的这种可选的实施方式的方法适当地从记录的DCE-MRI图像中提取上述DCE-MRI描述符AVGENH、AUC、AUCE、IAUC_T、IAUCE_T和可以通过运算获得自它们或其任意的运算组合的任意其他数字描述符，且例如包括LATEAUCRATIO和EARLYAUCRATIO。然而，尽管其选择不应被视为对任何不同参数的评估的限制或排除，但是上述方法的优选实施方式包括得到基于DCE-MRI的AVGENH、AUC和/或AUCE中的至少一种或可选地IAUC_T和/或IAUCE_T的评估值，其中如上所述，最后的这些是上述的具体实施方式；更具体地，该方法包括从采集的DCE-MRI图像数字评估值中提取AVGENH，原因在于其稳定且易于测定。

上述两种实施方式的方法即药代动力学模型化和无模型方法可以被视为彼此替代的，因为作为结果，它们各自提供了至少一种药代动力学参数的测定，例如，分别为K^trans和/或f_PV(使用药代动力学模型化方法)和AVEGH、IAUC_T、IAUCE_T、AUC、AUCE、LATEAUCRATIO和/或EARLYAUCRATIO(使用无模型方法)，其涉及所述造影剂在病理性组织内的转运和由此对这种转运的响应，且由此能够提供对关注的大分子溶质在所述相关组织内递送的评价。

然而，尽管测定一种以上参数不应被视为必要的限制，但是本发明DCE-MRI方法的优选实施方式包括测定两种或多种乃至所有上述药代动力学参数p，且然后比较获得的结果，以便提供所研究的更精确和真实的对大分子递送入相关身体区域或组织的评估。

因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及DCE-MRI方法，其中适合的顺磁性造影剂用于得到对关注的大分子溶质递送入病理性身体区域、部位、组织或实体肿块的体内评估，该方法包括下列步骤作为主要步骤：

a)获取所述造影剂在相关病理性身体区域、组织、部位或肿块内通过期间的DCE-MRI图像集合和任选的另外的具有良好解剖学分辨率的MRI图像；鉴定所关注的部位、典型地是肿瘤部位、参比部位和任选的采集的DCE-MRI图像内的血管部位；和得到所鉴定部位内的信号强度曲线；

b)任选地测定造影剂施用与MRI获取结束之间包含的任意连续或不连续时间窗内的AVGENH和/或AUCE值；

c)将步骤a)得到的MRI信号强度值转化成造影剂浓度值并且绘制浓度-时间曲线；

d)任选地测定造影剂施用与MRI获取结束之间包含的任意连续或不连续时间窗内的AUC值；

e)用药代动力学模型拟合所述得到的浓度曲线以得到K^trans评估值；

f)根据得到的所评价的参数的评估值评价关注的大分子溶质的递送。

就此而言，值得关注的是上述方法可以任选地还包括在步骤a)前的步骤1a)，其涉及对需要的患者或该患者的器官或其他身体部位或组织施用有效量的选择的顺磁性造影剂。而在一个可选的实施方案中，上述方法可以包括从对在用适量顺磁性造影剂预处理的患者获取的MRI图像集合中得到信号强度曲线，或仍然可选地，该方法可以包括从在适合的时间获取的MRI图像集合中得到信号强度曲线(和由此的上述基于DCE-MRI的参数的至少一种的评估值)，所述获取的MRI图像集合获自用有效量的顺磁性造影剂处理的患者且然后以数字方式储存在x射线断层摄影机的操作台储存器中或本地或远端数字资料储存设备中。

所谓本文所用的“有效量或适量”，我们是指本发明的造影剂或其药物组合物的任意剂量或用量，该剂量或用量足以满足其预期的诊断目的：即，例如在所述造影剂在相关病理性身体区域、组织、部位或肿块内通过期间获取MRI图像集合，并且根据获取图像得到信号强度曲线。

根据一种优选的实施方式，在上述方法中，基于定期进行大分子递送评价。

就此而言，按照逐个像素(或按照逐个体素，这取决于二维或三维的所涉及的图像或体容量)测定采集的DCE-MRI图像各自的病理性(肿瘤)部位和参比部位中上述DCE-MRI衍生的各药代动力学参数p例如包括K^trans、f_PV、AVEGNH、IAUC_T IAUCE_T、AUC、AUCE、LATEAUCRATIO和/或EARLYAUCRATIO且优选K^trans、AVEGNH、AUC和AUCE，所采集的DCE-MRI图像是对所有病理性区域或肿瘤体积采样。

来自展示出使用本发明方法测定并且对相应解剖学MRI图像过度加强的K^trans、fPV、EARLYAUCRATIO、LATEAUCRATIO、增强平均值(AVEGNH)逐个像素的DCE-MRI测量值的实施例5的体内试验的对比参数图像例如如图10中所示，其中还报道了显示参比(肌肉)和AIF(动脉血)部位的小图。在该图的参数图像中，将过度加强的像素亮度用作参数值的测量值：测定的参数值越高，则图像中的像素越亮。

因此，得到了基于定期对于所评价的参数的两组参数值：一组来自所关注的ROI(s)，即病理性部位，而另一组来自参比部位。

然后通过比较在关注的病理性组织或部位中的所评价的各参数在每个像素(或体素)处测定的估计值与参比健康部位得到相应值并且通过评价像素/体素分数(病理性部位内)对大分子递送进行评价，所述像素/体素分数具有在统计学上显著高于那些在非病理性(健康)部位中估计的值。

就此而言，在参比(非病理性)部位内测定的药代动力学参数值用于定义特征在于平均值(μ)和标准偏差(σ)的参比统计分布。对于估计的各药代动力学参数，然后在得自病理性ROI(s)与相应来源于参比ROI的参比统计分布的逐个像素值之间进行对比检验，许可对每一记录的DCE-MRI图像的每个肿瘤ROI鉴定和统计像素分数，导致参数值大于μ+3σ(即像素/体素，其中p_i>μ+3σ)，其中p_i是相关药代动力学参数的测量值(在病理性ROI的每个像素/体素中)，且μ和σ分别是相应参比统计分布的平均值和标准偏差。

在这方面，认为满足上述要求即大于μ+3σ的p_i值是本发明"有利的"，或换句话说，表示渗透性明显不同于非病理性ROI中观察到的，且其中验证了上述条件的像素/体素被标记为对于大分子溶质“可渗透的”(P)。相反，当对比检验导致p_i值小于μ+3σ时(或换句话说，该检验回到了错误指令)，则像素/体素被标记为对于大分子溶质“不利的”或“不渗透的”(NP)，在本文中可互换使用。大分子溶质适当地被递送至病理性组织的可能性随后被表示为如下之比：D＝P/(P+NP)，根据所有采集的DCE-MRI图像计算，所述图像对所有病理性身体部位或肿瘤体积采样。在这方面，有效的大分子溶质递送入病理性组织的最佳D值是优选大于0.5的D值，实际上，它相当于这样的身体组织或部位，其中基于定期考虑的50％以上的组织或部位自身具有高于非病理性参比区域的渗透性，其特征在于血管化可以忽略不计。

就此而言，有意义的是，对相应形态MRI图像标记为在病理性区域内“可渗透的”的像素/体素的适合的过度加强(例如为图8和11中的情况中)允许便利地得到大分子溶质在病理性区域中递送的即时和确定有效的视图，从而许可对测定的递送程度可视化，并且通过适当的比较，因使用适当的药物的对于病理性区域的适合的治疗导致的增加或减少，从而改善了大分子在病理性组织内部的转运。

从上述描述中显而易见的是，上述方法的优选实施方式还包括将导致D值等于或大于0.5且优选0.5-0.6的病理学情况识别和选择为展示出对于大分子溶质的充分的渗透性，由此从导致D值小于0.5的病理学情况和患者难以得益于依赖于使用大分子药物或前药的疗法(所述大分子药物或前药不能有效地达到患病区域)合理地得出与使用大分子药物或前药治疗一致。

更概括而言，步骤f优选地通过如下实施：

1.计算各相关DCE-MRI参数p，且优选包括选自K^trans、AVGENH、f_PV、AUCE、AUC、EARLYAUCRATIO和LATEAUCRATIO、基于像素在步骤a)采集的DCE-MRI图像各自的参比部位内测定的值的平均值(μ)和标准偏差(σ)的参数；

2.对DCE-MRI参数各自计算μ+3σ阈值；

3.在采集的各DCE-MRI图像中鉴定那些在病理性或肿瘤ROI(s)中的像素，其显示相关的参数值p_i>μ+3σ；

4.根据对整个病理性区域或肿瘤体积采样的所有DCE-MRI图像的肿瘤ROI(s)计算显示超过阈值(μ+3σ)的参数值的像素的分数D；

5.固定截断值，例如0.5并且定义为具有D≥0.5的“可渗透的”或“有利的”病理性身体部位或肿瘤。

用于上述DCE-MRI方法的适合的造影剂典型地包括顺磁性造影剂，其具有与关注的大分子溶质类似或接近的理化特性。

实际上，在这种情况中，所研究的所述造影剂在身体区域内展示出的药代动力学可以合理地被认定相差无几，且由此被认定为对关注的大分子溶质、例如优选大分子药物或前药局部显示的药代动力学行为有响应；因此，与这些活性剂在相关身体部位或组织展示出的药代动力学相关的那些参数的测量值可以合理地被视为与大分子溶质局部转运等同地相关或对其有响应，并且便利地用于得到其在所述相关身体区域或部位中递送的可靠评估值。

本发明的造影剂典型地包括大分子活性剂，其具有与那些所关注的大分子药物或前药的大小和表面电荷类似或接近的大小和表面电荷，所述所关注的大分子药物或前药例如白蛋白(Gd-DTPA)₃₀ 其在相关领域中常用作大分子溶质的典型。

相反，不能合理地预期商购的小分子造影剂(SMCM)例如Magnevist^TM或MultiHance^TM与大分子药物或前药的转运和递送相关，所述大分子药物或前药具有的流体半径通常至少大于小分子造影剂50-100倍。

有意义的是，我们已经发现，存在本文公开的一类顺磁性造影剂，尽管它们具有合理的低分子量，从而允许它们克服影响相关领域大分子活性剂的缺陷，但是已经有利地证明它们能够在体内持续适合的时间，遵从大分子溶质即血清白蛋白的药代动力学结局。

实际上，具有低于5,000道尔顿分子量且在体内展示出至少85％的与HSA的体内非共价结合(在平衡条件下)的顺磁性造影剂已经有意义地证实在人血浆中显示适合的时间，即广泛地与MRI诊断成像时间一致，在药代动力学方面严格地与血清白蛋白即一种具有约65KDa分子量的血液成分相当。

这类体内白蛋白结合造影剂在上述公开的本发明DEC-MRI方法中的应用必须被视为本发明的特别优选的实施方案。

本发明优选的白蛋白结合剂包括顺磁性造影剂，其具有低于5,000Da、优选低于3,000Da且更优选800－3,000Da的分子量，其进一步展示出等于或大于85％、优选大于90％且更有效大于95％的与人血清白蛋白(或HSA或白蛋白，在本文中可互换使用)的体内非共价蛋白质结合，表示为对来自活性剂在

中的0.5mM溶液进行离心超滤

测定的与血清白蛋白非共价结合的活性剂的量的％，所述活性剂在

中的0.5mM溶液在37℃根据例如Invest.Radiol.2006,41：279-291；WhitlamJB,Brown KF.Ultrafiltration in serum protein bindingdeterminations.J.Pharm.Sci.1981；70:146-150和实验部分的实施例2中公开的方法温育。

其中，特别优选白蛋白结合剂，其显示在血液系统中有利的持久性，在终末人血浆半衰期方面(即达到假平衡后血浆浓度除以2所需的时间，或末期的半衰期，J.vet.Pharmacol.Therap.2004；27：427-439)从活性剂施用开始至少为4小时，且优选4-15小时，更优选至多20小时，而所有施用的活性剂在从施用开始1个月内且优选在2周内适当地被排泄掉。

这种选择类型的非共价白蛋白结合造影剂有意义地显示在体内持续足够的时间、与人白蛋白相同的药代动力学并且提供与其在病理性身体区域或组织内转运相关的那些参数的DCE-MR成像衍生的测量值，已经令人意外地证实它们与这种大分子溶质在相同相关组织或区域内的递送呈线性相关性，或者换句话说，已经证实它们与来自病理性组织的血管外空间中的血液血管化的白蛋白外渗及其作为组织学观察到的局部扩散的量呈线性相关性。

因此，通过提供有效地在相关组织或区域内递送的可靠的体内白蛋白量的评估值，本发明鉴定的选择类型的非共价白蛋白结合顺磁性造影剂能够以非侵害性方式得到基于可靠的DCE-MRI的大分子在病理性组织或肿块内的转运评估值，且由此区分展示出对使用大分子抗癌药物的药理学治疗的渗透-抗性的病理学情况与展示出充分的渗透性且由此与利用大分子药物或前药的治疗于一致性的病理学情况。因此，它们可以有利地应用于目的在于区分对使用大分子药物治疗而言合格的患者与可能对这这种治疗具有抗性的患者的方案或预测方法中。

这种具体类型的白蛋白结合造影剂在本发明DCE-MRI方法中的应用必须被视为本发明特别优选的，所述本发明的DCE-MRI方法用于以非侵害形式方式得到关注的大分子溶质递送入病理性身体区域、部位、组织或实体肿块的体内评估值，不过，决不应将其视为限制或排除任意其他适合的顺磁性造影剂的应用。

因此，本发明的一个尤其优选的实施方案涉及DCE-MRI方法，其包括使用本发明的体内白蛋白结合顺磁性造影剂以非侵害性方式得到关注的大分子溶质递送入病理性身体区域、部位、组织或实体肿块的体内评估值。

对于上述范围特别优选的是白蛋白结合造影剂，其展示出在人血液循环内的终末半衰期至少为4小时。

本发明白蛋白结合顺磁性造影剂的适合的实例包括血池造影剂，其具有低于5,000Da的分子量并且展示出至少85％的与HSA的体内非共价结合(在平衡条件下)。优选地，这些造影剂在其结构上包括一个顺磁性配合单元，其优选在生理学pH下展示出一个或一个以上残留负电荷和至少一个、但任选两个(或多个)促进造影剂与HSA结合的亲脂性部分。任选地，它们还可以包括亲水性部分，例如任选带负电荷的基团，例如磷酸酯(例如磷酸一-或二酯基)、羧酸酯或磺酸酯或杂原子例如氧、氮或硫原子，它们增加形成的氢键数量并且延长造影剂的血液保留。上述亲脂性和任选的亲水性部分和造影剂分子的螯合配合物可以彼此直接连接、通过单键或通过适合的连接基或连接基团连接。

就此而言，所述亲水性部分可以便利地与亲脂性部分连接，或可选地与可以任选为整体部分的连接基连接。

所述造影剂的亲脂性部分优选表示为胆汁酸的衍生物，例如，选自胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸的残基；或为这样的部分，包括1或2个乃至2个以上且例如3个芳族或脂环族环，例如优选苯基、联苯基、环己基、环己基-苯基或环己基-联苯基残基。

其中，特别优选具有下式(I)的造影剂：

X-L-Y(I)

其中X是选自如下的螯合配体的顺磁性螯合配合物：二乙烯三氨基五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、4-羧基-5,8,11-三(羧甲基)-1-苯基-2-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-酸(BOPTA)或WO03/008390或EP 1904460中公开的多齿AAZTA螯合配体；Y是选自胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸的胆汁酸残基，或是环或多环残基，其包含1、2或3个芳族和/或脂环族环，L是连接基。

本发明优选例如EP 0806968中公开的造影剂，且特别优选鉴定为钆磷维塞(Gadofosveset)的钆配合物的三钠盐，或可选地鉴定为MS-325、商品名为Ablavar^TM，已经证实其显示约90％的与人血清白蛋白的非共价蛋白质结合(Invest.Radiol.2006；41(3):229-43)。本发明另一组优选的顺磁性造影剂包括例如公开在WO 00/38738或US 2007/0059246中的胆汁酸缀合物。

其中，特别优选[3β(S),5β,12α]-3-[[4双-[双[2-(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羟基去氧胆-24-酸与顺磁性金属离子的螯合配合物及其生理学相容性盐。

就此而言，本发明范围内适合的顺磁性金属离子选自如下：Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Ni(2+)、Rh(2+)、Co(2+)、Cr(3+)、Gd(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、Tb(3+)、Pm(3+)、Nd(3+)、Tm(3+)、Ce(3+)、Y(3+)、Ho(3+)、Er(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(3+)、Mn(2+)。更优选所述顺磁性金属离子为Gd(3+)。

药学可接受的盐是，例如适当地选自：钾、钠、钙或镁盐；乙醇胺、二乙醇胺、吗啉、葡萄糖胺、N-甲基葡糖胺和N,N-二甲基葡糖胺盐；氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、草酸盐；和具有氨基酸例如牛磺酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或天冬氨酸和谷氨酸的阳离子和阴离子的盐。

具有所述[3β(S),5β,12α]-3-[[4双-[双[2-(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羟基去氧胆-24-酸螯合配体的钆配合物的钠盐被视为本发明特别优选的造影剂，其在本文中可选地被鉴定为钆考酸三钠盐或B22956/1，已经证实它展示出约95％的与人血清白蛋白的体内结合(例如，参见de Haen C.等人,Invest Radiol 2006；41(3):279-91和下文的实施例2)和良好的在血管空间的中的保留(例如公开在WO 00/38738中)。

本发明上述式(I)的顺磁性造影剂另一个实例是下式的AAZTA-去氧胆酸的钆配合物二钠盐：

下文称作Gd AAZTA-去氧胆酸，已经证实其展示出大于90％的与人血清白蛋白的结合亲和力。

因此，本发明的一个目的涉及顺磁性造影剂或包含它的适合的药物组合物通过使用DCE-MRI技术在非侵害性体内评价大分子在病理性身体区域、组织、部位或癌肿块中的转运中的应用，所述顺磁性造影剂具有低于5,000Da、优选800－5,000Da且更优选800－3,000Da的分子量且展示出至少85％且优选大于85％的与人血清白蛋白的体内非共价结合且相当于86、87、88、89、90、91、92、93、94或95％且更优选大于95％的与HSA的非共价结合。

特别优选本发明顺磁性造影剂或包含它们的药物组合物的应用，所述顺磁性造影剂选自钆考酸三钠盐、Gd AAZTA-去氧胆酸二钠盐和钆磷维塞，所述药物组合物包含所选择的单独的顺磁性造影剂之一或所选择的顺磁性造影剂之一与任意其他药物或前药、适合的添加剂和/或媒介物的组合。

本发明的另一个目的涉及DCE-MRI方法，其包括使用非共价结合顺磁性造影剂得到关注的大分子溶质递送入病理性身体区域、部位、组织或实体肿块且尤其是肿瘤或癌肿块的体内评估值，所述非共价结合顺磁性造影剂具有低于5,000Da的分子量且展示出至少85％且优选大于90％且更优选大于95％的与人血清白蛋白的体内非共价结合。就此而言，其中特别优选的是具有800－5,000且更优选800－3,000Da分子量的造影剂，其进一步展示出在人体内血液循环中的终末半衰期值证实为4小时。

优选所述的DCE-MRI方法包括上述鉴定并且详细讨论的工艺步骤作为主要步骤，且更优选利用选自钆考酸三钠盐、钆磷维塞三钠盐和Gd AAZTA-去氧胆酸二钠盐的造影剂。

根据上述描述，因为本发明的方法能够得到对关注的大分子溶质递送的评价，其依赖于通过使用DCE-MRI技术进行的白蛋白递送测定，所以可以被视为预测方法。

因此，本发明的另一个目的在于预测方法，其包括使用顺磁性造影剂通过使用DCE-MRI技术以非侵害性方式在体内评估关注的大分子溶质递送入病理性身体区域、部位、组织或实体肿块且尤其是大分子治疗剂在肿瘤、癌组织或慢性发炎的区域例如关节炎区域或身体部位内的递送，所述顺磁性造影剂具有800－5,000Da的分子量且展示出至少85％且优选大于90％的与人血清白蛋白的体内非共价结合。

在另一个实施方案中，本发明涉及本发明选择类型的白蛋白结合造影剂和DCE-MRI方法在以非侵害性方式区分适当地满足基于大分子溶质外渗和扩散的递送条件的病理学情况和患者与恶性肿瘤或相反情况中的患者中的应用，所述恶性肿瘤或相反情况中的患者展示出对使用大分子抗癌药物或前药的药理学治疗的抗性，这归因于所述大分子抗癌药物或前药在待治疗的病理性组织中递送不足。

所述区分可以便利地基于对大分子溶质在影响筛选中的患者的病理学情况中的递送定量进行，例如通过参比相关病理性区域内测量的D值，其中，正如所述的，可以将优选大于0.5、例如0.5－0.6的D值视为预示与利用大分子药物或前药的治疗一致性的充分递送，而相反地，小于0.5的D值预示可能损害使用大分子药物的治疗的差或受损的渗透和递送。

因此，本发明的另一个实施方案涉及对肿瘤患者分层次或换句话说对其进行分类的方案，其包括使用具有800－5,000Da的分子量并且展示出等于或大于85％且优选大于90％的与人血清白蛋白的非共价结合的顺磁性造影剂以非侵害型方式鉴定对于利用大分子药物或前药的抗癌疗法具有抗性的患者，具有抗性的原因在于所述大分子药物或前药在待治疗的病理性区域中的渗透不足或受损。

优选地，上述方案应用于鉴定对依赖于使用单克隆抗体-或肽-乃至聚合物-衍生物抗癌药物或前药的抗癌疗法具有抗性的患者并且对其分层次，和/或应用于优化依赖于其应用的抗癌疗法。

此外，本发明找到了如下方案：本发明的活性剂和DCE-MRI方法在使用大分子药物或前药的抗癌策略的选择、处置和优化中的应用，所述的大分子药物或前药单独使用或与其他协同作用的活性剂组合使用，包括，例如致力于促进大分子药物吸收的任意活性剂或药物，例如EPR增强剂；本发明的活性剂和DCE-MRI方法在监测所述吸收增强剂或药物或包括它们之一的疗法或联合疗法的有效性中的应用；和本发明的活性剂和DCE-MRI方法在测试新抗癌药物或前药在病理性组织内最佳分布方面中的效力中的应用。

因此，本发明还包括使用本发明DCE-MRI方法和活性剂用于如下的方案：利用大分子药物或前药的抗癌策略的选择、处置和优化，所述的大分子药物或前药单独使用或与致力于促进大分子溶质和由此大分子药物或前药吸收进入所关注的病理性身体区域、部位、组织或实体肿块的活性剂组合使用；或用于监测所述联合疗法提供的作用；以及用于监测致力于促进大分子溶质吸收的活性剂提供的作用。

在这方面，本发明选择类型的非共价结合活性剂在遵循大分子化合物的药代动力学结局和由此提供对其在所关注的病理性身体区域内转运中的可能性已经首先通过在对小鼠中的体内实验性前列腺癌模型进行的动态增强MRI成像试验进行了研究。

就此而言，B22956/1用作本发明非限制性的有代表性的造影剂，而荧光标记的牛血清白蛋白(BSA,)用作典型大分子，一旦注入小鼠，则能够模拟具有相差无几的理化特性的大分子药物的行为。

使用植入PC-3细胞(人前列腺癌细胞系)和用

即VEGFRs抑制剂治疗(以调节肿瘤血管渗透性)的NCR无胸腺裸鼠、通过例如图1中图解的时间安排方案进行了对比试验。试验的范围用于比较基于图像的白蛋白在人肿瘤模型中的分布与根据微米级萤光显微镜图像以组织学方式测定的血管内部和外部FITC-BSA(异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白)白蛋白分布的分析，所述白蛋白在人肿瘤模型中的分布的图像是从作为造影剂的B22956/1注射后使用本发明方法获取的时间-系列MRI图像(具有的空间分辨率约为110μm)中提取的。

具体地，根据动态MR数据，通过应用双隔室药代动力学模型计算跨内皮渗透性(K^Trans)和血浆容量分数(f_PV)，同时计算几个时间窗内的曲线下的起始面积(IAUC_T)，所述时间窗典型地包含在造影剂施用与MRI获取结束之间。然后用在最后MRI期间后经尾静脉施用的荧光标记的牛血清白蛋白探查肿瘤内的大分子渗透。显微图像用于使用自动化阈值方法对肿瘤内荧光白蛋白染色的区域百分比进行定量，作为血管密度的测量值。基于来自从肿瘤边缘和核心取得的组织样品的血管外部发现的荧光评价肿瘤血管外空间内的白蛋白外渗，例如正如图2中图解的。特别地，通过使用优化方法对于距最接近血管指定距离处的所有像素求白蛋白荧光的平均值并且作为距血管壁的距离的函数储存，例如图3中图解的，从而提供了对相关肿瘤的血管外空间内白蛋白的利用度的定量，即外渗的FITC-白蛋白的量及其浓度在距最接近血管距离x内的衰减，或换句话说，其在细胞外空间内的实际分布和稀释(例如图4中图解的)。

值得注意地，在显微荧光与MRI数据之间观察到具有统计学意义的相关性，例如在实验部分中提供的表A和B中观察到的。

具体地，根据测量的DCE-MRI参数和抗血管生成治疗所促进的效应验证具有统计学意义的一致性，并且观察治疗组与对照组之间测量的K^trans、IAUCE_T和IAUC_T的显著性差异，如图7中可观察到的，条件是MRI成像期在造影剂注射后持续至少5分钟，其中这证实了所提供的方法和活性剂监测VEGFRs抑制剂在低血管化肿瘤中的治疗作用。

此外，最相关地，概述在下文实验部分中的表A和B中的使用本发明DCE-MRI方法以非侵害性方式测定的K^trans、IAUCE_T和IAUC_T测量值显示了肿瘤边缘与肿瘤核心中与白蛋白从血管中外渗(FITC-BSA)的具有统计学意义的线性相关性，所述从血管外渗的白蛋白通过组织学方式根据使用本文提出的荧光显微镜检查方法得到的衰减曲线下的面积定量。就此而言，将对于各自相当于测量的参数的每一数据栏得到的皮尔逊系数和统计学显著性报道在提供的表中，而将得到的FITC-BSA组织学评估值与相应的在测试动物肿瘤边缘和核心中用回归线绘图的K^trans值之间的相关性提供在图5和6中。

具体地，血管渗透性的组织学分析显示使用VEGFRs抑制剂治疗不仅诱导了接近血管的白蛋白浓度改变，而且诱导了更大的距离处的改变(100-200μm)。与这些结果完全一致，在Axitinib^TM治疗后使用B22956/1测量的k^trans值在治疗的肿瘤边缘中较低，且还发现随时间变化的IAUCE_T/IAUC_T参数值在治疗的肿瘤内也较低，条件是造影剂注射后MRI获取持续至少5分钟。

而使用用作参比的低分子量非白蛋白结合造影剂MultiHance^TM未观察到显著相关性，正如从表C和D中观察到的。

上述内容证实根据本发明选择的非共价蛋白质结合剂类型展示出与大分子溶质例如白蛋白类似的体内行为和相同或紧密相关的药代动力学持续适合的时间期限，且可以有利地用于以非侵害性方式测定其在在所关注的病理性身体区域或组织中的递送。因此，依次地(正如所述的，通过将白蛋白视为所关注的大分子药物的推定)，可以有利地将它们用于以非侵害性方式评价所关注的大分子溶质在同一相关组织或区域中的递送，且更一般地，基于所关注的大分子药物的局部灌注的渗透性和可能性用于对病理性区域分层次。

除确切的优点外，使用这些活性剂的可能性实际上也是令人意外的，它们展示出作为有效的体内典型的大分子溶质的中-低分子量。

实际上，在这方面，远非可预期的是具有中等分子量的活性剂例如B22956/1(MW1056.17)、MS-325(MW 975.88)和Gd AAZTA-脱氧胆酸二钠盐(MW 1019.22)(相当于未结合部分的十分快速地从血液循环中排泄的它们)的百分比可以提供适当地与大分子化合物递送相关的药代动力学参数，这些大分子化合物具有明显不同的大小、结构和在血流中的持久性，例如白蛋白，或甚至较小的大分子肽或抗体-衍生物药物或前药。这种考量尤其是适用于这些后者，公认它们在血管隔室内停留长时间期限，且然后展示出在血管外肿瘤组织内分布，其强烈依赖于参数例如扩散率、抗原密度、抗原-结合动力学、血管渗透性和剂量(G.M.Thurber等人ADV DRUG DELIVER REV 2008,60：1421-1434)。

实际上，通过使用作为本发明有代表性的活性剂B22956/1对使用媒介物或紫杉醇(PTX)治疗的裸鼠中的黑素瘤癌模型异种移植物进行的体内动态增强MRI成像试验研究了本发明非共价蛋白质结合造影剂提供由治疗剂例如EPR-增强剂促进的效果的体内适合的评估的可能性，所述的EPR-增强剂即致力于增强共同施用的大分子药物在肿瘤区域中吸收的活性剂。这种化合物实际上已经显示能够通过降低由局部不存在足够的淋巴系统导致的局部间质液压(IFP)增强药物在实体瘤中的递送，由此恢复传递转运，认为这是大分子在肿瘤内转运的主要驱动者，即被过量的间质液压显著地阻碍(例如，参见PaclitaxelDecreases the Interstitial Fluid Pressure and Improves Oxygenation in BreastCancers in Patients Treated With Neoadjuvant Chemotherapy：ClinicalImplications.Simon N.Powell等人J Clin Oncol 23:1951-1961；Deliveringnanomedicine to solid tumors.Jain,R.K.&Stylianopoulos,T.Nat.Rev.Clin.Oncol.2010,7：653-664)。

有意义的是，对用PTX预治疗的小鼠(带有皮下WM1552/5黑素瘤)用B22956/1进行的肿瘤血管功能性DCE-MRI评价显示药代动力学和PTX-治疗动物与对照组相比在肿瘤边缘和核心中的造影剂分布显著改变。

特别地，在用预治疗的肿瘤中测定了血浆容量分数f_PV的％(％)和K^trans值与施用单独的媒介物测定的值相比具有统计学显著性增加，其完全与已知通过用PTX治疗促进的肿瘤灌注和渗透性增加一致。就此而言，PTX治疗后24h在肿瘤边缘和核心中得到的f_PV(％)和K^trans的DCE-MRI评估值的方框图如图7中所示。实际上，与通过PTX治疗促进的肿瘤灌注改变完全一致，图7的示意图显示在媒介物组的核心和边缘中的药代动力学参数f_PV和K^tran的中位值较低，而在PTX预治疗动物中观察到增加，与用这种EPR增强剂促进的肿瘤灌注改变(灌注增加)一致。

就此而言，值得注意的是，通过上述举出的DCE-MRI方法计算的药代动力学参数可以有利地通过研究中的病理性组织的MRI解剖学参比图像上的颜色分级的参数图像过度加强，例如图8中所示(作为相应的灰度)，从而能够便利地使通过PTX预治疗促进的渗透性增加的空间伸展或以相同方式使关注的大分子溶质的递送程度和深度可视化。

这种试验的结果从一个方面支持和证实了从本发明活性剂能够得到的K^trans评估值(病理性组织内)和致力于增加大分子溶质递送和稀释的活性剂促进的作用存在的显著一致性，从而表明后者的评估值可通过前者的测量值得到。

上述结果表明本发明非共价结合剂展示出的药代动力学参数即f_PV、且尤其是K^trans(此外，还有如上述讨论的IAUC_T和IAUCE_T)已经显示可提供可靠的白蛋白递送评估值并且与在大分子递送时EPR增强剂促进的作用一致，这些参数还可能与不同类型的大分子溶质的递送和扩散相关，例如，包括大分子肽类、荧光抗体，且更一般地是关注的抗体-衍生的抗癌药。

然后进行实验部分的实施例5中详细公开的另一种实验检验，目的在于研究和证实本发明的非共价蛋白质结合造影剂的以下可能性：提供抗体-衍生的抗癌药物在病理性肿瘤区域中的分布的可靠评估值和评价用于改变其在组织内距离血管不同距离处蓄积的活性剂的促进的作用。通过使用

对人表皮样癌(hepidermoid)(A431)的肿瘤异种移植物模型进行实验检验，将所述的人表皮样癌(A431)的肿瘤异种移植物模型植入例如用媒介物或紫杉醇(PTX)治疗的NCR无胸腺裸鼠(两个植入物分别在每只小鼠的左侧和右侧胁腹侧)。

为了这一目的，用荧光酞菁部分Cy5标记

(CTX)，从而能够通过荧光显微镜对其进行检测和定量，并且将(CTX)用作抗体-衍生的大分子药物的非限制性实例，而将B22956/1用作本发明造影剂的非限制性实例。将荧光显微镜技术选作用于评价单克隆抗体(mAb)递送的参比金标准，这归因于其在微观水平分辨CTX分布的灵敏度和能力。对进行的试验典型化并且进行详细描述的组织学图像如图9中所示。

首先使用本发明的方法测定通过用PTX治疗对B22956/1动力学和分布促进的作用。特别地，在用PTX和媒介物治疗后24小时按照逐个像素评价K^trans、fPV、EARLYAUCRATIO、LATEAUCRATIO和AVGENH的值。展示出上述根据PTX治疗的小鼠逐个像素测定并且过度加强在相应解剖学MRI图像上的参数值的参数图像如图10中所示，其中较明亮的信号表示较高的参数值。该图中还报道了小图，其显示用于统计学评价结果的肌肉和AIF(动脉血)部位(ROIs)。而将得自PTX-治疗小鼠和对照小鼠的上述药代动力学参数的数值评估值概括在实施例的表G中并且进行了比较，其显示在PTX治疗的肿瘤中观察到了参数例如K^trans、LATEAUCRATIO、AUC_20-30和AVGENH的具有统计学显著性的增加，这与已知活性剂对组织扩散率的促进作用一致(参见上述引述的有关PTX作用的文献)。

甚至更有意义地，上述结果与标记的

(即Cy5-CTX)在A431肿瘤异种移植物外渗且尤其是分布一致，正如通过荧光显微镜以组织学方法测定的。

在这方面，PTX对CTX渗透和分布促进的作用通过荧光显微镜、使用适当用酞菁Cy5标记的

评价。显微图像用于对标记的mAb染色的区域和染色区域距最接近血管壁的距离定量。

特别地，通过荧光组织学方法将PTX和媒介物注射后24小时荧光标记的抗体Cy5-CTX在肿瘤中的蓄积量测定为距血管壁的距离的函数。得到的结果图示在图12中。正如可以从该图中显而易见的，在PTX治疗的小鼠中观察到的施用的荧光标记的抗体的分布比对照组更好和更均匀，而对照组显示CTX在血管周围空间中蓄积的更多。

因此，发现使用本发明的非共价结合造影剂和方法测定的DCEMRI参数增加与在PTX治疗的肿瘤异种移植物中以组织学方法测定的mAb-衍生的CTX的更好分布之间存在实质的一致性。另一方面，还验证了相关文献提供的PTX对肿瘤组织扩散率促进的作用的教导(例如，参见F.Marcucci等人,Advanced Drug Delivery Review 2011,64,53-68)与使用本发明的活性剂和方法测定的肿瘤生理学方面的改变之间的实质一致性。总之，得到的结果一方面支持了使用本发明提出的造影剂和DCEMRI方法在评价EPR增强剂促进的作用方面和利用抗癌药与有利于抗癌药在待治疗肿瘤内递送的EPR增强药物的组合的抗癌方案的效力的切实可行性。另一方面，它们还有意义地表明，尽管在分子量和由此的其从身体系统中全身清除率方面存在显著差异，但是本发明选择的非共价结合造影剂可以提供基本上与单克隆抗体-衍生的抗癌药物转运一致的数值DCE-MRI参数和由此它们有利地用于非侵害性评价渗透-抗性肿瘤的切实可行性。

为了进一步支持后面的这种推断，本发明的DCE-MRI评估值用于区分展示出对CTX-标记的药物的渗透不足或受损的“不利的”或“无渗透性”肿瘤(和由此的小鼠)与“有利的”或“可渗透的”肿瘤，并且将得到的结果与组织学评估值比较。

就此而言，将AVGENH选作本发明药代动力学参数的非限制性实例，这归因于其稳定和便于测定。其值在对整个肿瘤体积采样的各MRI图像中抽取的肿瘤ROI中按照逐个像素测定。具有AVGENH>57的像素被鉴定为“有利的”或“可渗透的”，其中后面的值是根据记录的MRI图像的参比(肌肉)部位测定的相关参数的阈值。显示具有AVGENH>57的肿瘤像素过度加强的解剖学图像如图11中所示，其允许鉴定肿瘤ROI内“有利的”像素的量和分布。

然后在分析的肿瘤中将施用的mAb的转运评价为特征在于AVGENH值超过57的总像素部分。特别地，固定为0.5截断值的像素(相当于这样的肿瘤，其中超过阈值的像素数量至少等于总肿瘤像素的50％)的具有大于0.5的“可渗透”像素分数的肿瘤被鉴定为“有利的”或“可渗透的”，而将“不利的”或“无渗透的”定义为产生较低分数的肿瘤。得到的结果图示在图13中，其中将超过阈值的像素分数(各自在测试的肿瘤中)与相应地通过荧光显微镜(fAUC)测定的肿瘤中的抗体量比较。正如该图中所示的，发现了来自具有大于57的AVGENH的像素分数与测定的fAUC_350.550值之间具有统计学意义的相关性(斜线p-值<0.01，皮尔逊相关性检验)，且由此与以组织学方式测定了外渗的CTX分布具有所述的统计学意义的相关性。实际上，“有利的”肿瘤(白色斑点，为具有AVGENH>57的像素分数超过0.5)显示高于“不利的”肿瘤的fAUC_350.500值(放置垂直线表示截断值)。

这些结果与使用提出的造影剂和方法的切实可行性一致，所述的造影剂和方法用于区分“有利的”或“可渗透的”肿瘤与注定展示出对抗体衍生的药物治疗产生抗性的“不利的”肿瘤，产生抗性的原因在于所述抗体衍生的药物在待治疗的肿瘤部位内的渗透不足或受损。

相反，由于在PTX-治疗组和对照组小鼠中记录的相当的信号强度可能归因于可检测区域饱和，所以体内光学成像技术在区分媒介物或PTX治疗肿瘤和评价后者对Cy5-CTX在肿瘤部位内分布的作用中的应用无法得到任何有效的结果。

从所有上述描述中，可以表明，尽管具有相当低的分子量，但是本发明鉴定的非共价白蛋白结合造影剂的类型可以用于评价大分子溶质例如、特别是抗癌药物或前药在所关注的肿瘤区域、部位、组织或肿块中的递送。

此外，得到的结果进一步表明本发明的白蛋白结合造影剂和DCE-MRI方法在监测利用大分子药物例如基于单克隆抗体或基于抗体的片段的药物或前药的抗癌疗法的有效性，以及评价使用抗癌剂与与有利于其在待治疗肿瘤内递送的EPR增强药物的组合的抗癌疗法的有效性。

此外，表明本发明的活性剂和DCE-MRI方法可以用于鉴定渗透抗性病理学情况且尤其是实体瘤和难以得益于使用大分子抗癌药物或前药且尤其是抗体衍生的药物治疗的患者(例如图13的方案中截断线左侧小鼠所代表的)与使用大分子抗癌药物治疗相容的患者并且对其分层次，对于使用大分子抗癌药物治疗相容的患者，归因于存在基于后者在待治疗肿瘤间质内外渗和深度扩散的那些条件，这样的患者例如图13的方案中截断线右侧小鼠所代表的。

因此，本发明的另一个目的包括顺磁性造影剂在使用DCE-MRI技术非侵害性体内评价基于单克隆抗体或抗体-片段的抗癌药物或前药通过在递送入所关注的病理性身体区域、部位、组织或实体肿块中的应用，所述顺磁性造影剂具有800－5,000Da的分子量并且展示出等于或大于85％且优选大于90％的与人血清白蛋白的体内非共价结合。

此外，根据另一个实施方案，本发明还涉及预测性临床前或临床治疗方案，其包括在其任意步骤中使用本发明的造影剂和DCE-MRI方法，例如在临床或治疗试验中，以便区分对使用大分子药物或前药的治疗方案的“阳性”或“响应患者”与“阴性”或“无响应”患者，或用于评价抗癌药物或前药的作用或辅助药物的协同作用或任意其他与大分子在肿瘤组织内分布相关的目标生物学终点(TBE)。

本发明的非共价的白蛋白结合顺磁性造影剂及其生理学可接受的盐为本领域公知的且由此可以由本领域技术人员通过使用公知合成方法制备，同样适用于其药学可接受的组合物。

作为非限制性实例，AAZTA-去氧胆酸的钆配合物的制备描述在实施例1中。

本发明的造影剂可以以可注射的药物组合物形式对需要的患者施用，该药物组合物包括本发明的顺磁性造影剂与或其生理学可接受的盐与生理学可接受的载体，优选将该药物组合物配制成0.001-1.0M浓度，且更优选0.01-0.5M，为具有pH 6.0-8.5的无菌水溶液。这些组合物例如制剂是可即刻用于胃肠外施用的，且最优选用于静脉内或动脉内施用。或者，可以将这些制剂冻干，在使用前重构。

一般地和特别地，当施用于静脉内或动脉内时，可以将药物组合物作为快速推注，或作为两次或多次单独的剂量及时施用，或作为恒定或非线性的流量输注。

在如下实验部分报道了涉及本发明的DCE-MRI方法和实践进一步详细描述，唯一的目的在于更好地示例本发明，而不代表对本发明的任何限定。

实施例1：[[6-[[双(羧甲基)]氨基]-6-[5-[[(3β,5β,12α)-23-羧基-7-羟基-24-去氧胆酰-3-基]氨基]5-氧代戊-1-基]-四氢-1H-1,4-二吖庚因-1,4-(5H)-二乙酸酯(5-)]钆塞酸(gadolinate)(2-)]二钠(Gd AAZTA-去氧胆酸二钠盐)的制备

已经通过使用如下方案1中代表的合成方法制备了Gd AAZTA-去氧胆酸。

方案1

包括下列步骤作为主要步骤：

a)6-[双[2-[(1,1二甲基)乙氧基]-2-氧代乙基]氨基]-6-[5-[[(3β,5β,12α)-23-(甲氧基羰基)-7-羟基-24-去氧胆酸去氧胆酰-3-基]氨基]5-氧代戊-1-基]-四氢-1H-1,4-二吖庚因-1,4-(5H)-二乙酸双[(1,1-二甲基)乙基]酯(3)的制备

将(3β,5β,12α)-3-氨基-12-羟基去氧胆-24-酸甲酯1(7.3g,18.0mmol；如WO95/32741中公开的制备)、2(11.0g,16.4mmol，如WO2008/071679中公开的制备)和N-羟基苯并三唑(HOBt)(2.21g,16.4mmol,Product Aldrich,art.157260)溶于CH₂Cl₂(105ml)，冷却至0-5℃，然后在40分钟内加入N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)(3.71g,18.0mmol；ProductMerck,art.802954)在CH₂Cl₂(60ml)中的溶液。在0-5℃2h和在室温22h后，过滤该混悬液，浓缩至一半体积，用饱和NaHCO₃(3x 30ml)和H₂O(2x 30ml)洗涤。干燥有机相(Na₂SO₄)，过滤，蒸发。通过快速色谱法(硅胶60(0.040-0.063mm)(Merck KGaA art.109385)柱，h＝20cm,

洗脱液97：3CHCl3/MeOH)纯化粗产物(17.1g)，得到期望的化合物3(13.36g；12.6mmol)，为固体。收率77％

分析数据

Mr：1059.49(C₅₉H₁₀₂N₄O₁₂)

HPLC：90.8％(面积％)

¹H-NMR和¹³C-NMR(CDCl₃)与预期的结构一致。

b)6-[[双(羧甲基)]氨基]-6-[5-[[(3β,5β,12α)-23-羧基-7-羟基-24-去氧胆酰-3-基]氨基]5-氧代戊-1-基]-四氢-1H-1,4-二吖庚因-1,4-(5H)-二乙酸(AAZTA-去氧胆酸)的制备

将2M NaOH(74.5ml,149mmol)加入到化合物3(12.6g,11.9mmol)在i-PrOH(30ml)中的溶液中，将该溶液在室温搅拌24h，然后在55℃搅拌30h。通过添加37％HCl将该溶液的pH调整至7.7，蒸发溶液，得到残余物，然后溶于H₂O(50mL)。通过添加37％HCl在pH 3沉淀粗配体，过滤，用H₂O洗涤(至洗涤液的pH为中性)。通过添加1N NaOH将由此得到的粗酸(8.1g)在pH 6.9溶于H₂O(30mL)，通过色谱法纯化(Amberchrome CG161树脂，洗脱液：梯度H₂O/CH₃CN。用3：2H₂O/CH₃CN回收期望的产物)。采集包含产物的级分，浓缩以除去CAN，然后用HCl37％酸化至pH 3。过滤沉淀，用H₂O洗涤(至洗涤液的pH为中性)，干燥(30℃和15mbar)，得到期望的酸(4.78g；5.8mmol)，为白色固体。收率49％。

分析数据

Mr：821.02(C₄₂H₆₈N₄O₁₂)

HPLC：89.1％(面积％)

¹H-NMR和¹³C-NMR：(D₂O/KOD)：与预期的结构一致。

配位滴定度：(0.01M CuSO₄)：93,4％

KF：5.17％.

c)[[6-[[双(羧甲基)]氨基]-6-[5-[[(3β,5β,7α)-23-羧基-7-羟基-24-去氧胆酰-3-基]氨基]5-氧代戊-1-基]-四氢-1H-1,4-二吖庚因-1,4-(5H)-二乙酸酯(5-)]钆塞酸(2-)]二钠盐(Gd AAZTA-去氧胆酸)的制备.

将AAZTA-去氧胆酸(2.0g；2.31mmol)混悬于H₂O(pH 3.8)，通过添加1N NaOH(2.7ml；2.7mmol)在pH 4.1溶解；分部分加入Gd(acac)3(1.05g；2.31mmol；由Alfa-Aesarart.013204提供)，通过HPLC-ELSD(参见附录1)并且使用Xilenol Orange测定法监测配位。用CH2Cl2(3x 150ml)萃取2,4-戊二酮；浓缩含水层，通过添加0.1N NaOH(19.2ml；1.92mmol)调整至pH 6.5(总NaOH 4.62mmol,2当量)，冻干，得到期望的配合物二钠盐(2.3g；2.26mmol)，为白色固体。收率98％。

分析数据

Mr：1019.21(C₄₂H₆₃GdN₄ Na₂O₁₂)

HPLC-ELSD：99.7％(面积％)(参见下文)

MS：与提出的结构一致。

C₄₂H₆₃GdN₄ Na₂O₁₂的元素分析(％)

色谱方法磷脂类RXSIL

固定相:Zorbax RX-SIL,4.6mm ID x 250mm(5μm)

温度:40℃

流动相:梯度洗脱

A：CH2Cl2/CH3CN/CH3OH/25％NH4OH 237:237:25:1(v/v)

B:CH2Cl2/CH3CN/CH3OH/H2O/25％NH4OH 150:150:125:70:5(v/v)

流速:1.2mL/min

检测:UV(254nm)

ELSD(增益值＝4；温度＝42℃)

注射:50μL

样品浓度:2mg/mL

仪器：VW Elite LaChrom-Hitachi高压梯度泵系统(L-2100),VWR EliteLaChrom-Hitachi L-2200自动采样器,VWR Elite LaChrom-Hitachi L-2300柱加热炉,VWRElite LaChrom-Hitachi L-2400UV检测器,SEDERE SEDEX 75ELSD型.

实施例2

顺磁性配合物与人血清白蛋白结合(为结合百分比(％))的测定

已经通过如下列文献中所述的离心超滤的方法测定了结合(％)：Whitlam JB,Brown KF Ultrafiltration in serum protein binding determination.J.PharmSci.1981；70:146-150；Bowers WF,Fulton S,thompson J.Ultrafiltration vsequilibrium dialysis for determination of free fraction.ClinPharmacokinet.1984；9:49-60。

材料和方法

B22956/1(Bracco Imaging S.p.A.,例如如WO00/37738中所述制备)

Gd AAZTA-去氧胆酸二钠盐(Bracco Imaging S.p.A.)

Human(Nycomed Phama)

一般方法

分析了人血清溶液(Seronorm Human,Nycomed Phama)中的白蛋白血清蛋白结合，其中以0.5mM的Gd(III)离子浓度加入每种配合物。将该溶液在配有超滤再生的纤维素膜(30KDa MWCO)的保持在37℃在Innova 4230温育振荡器(New Brunswick Scientific,Edison NJ USA)中的Amicon ultracentifugation装置中温育。在37℃样品温育10min后进行超滤。

通过下列等式测定Gd(III)-配合物结合百分比(％B)：％B＝[(C_t-C_f)/C_t]*100，其中C_t是温育溶液中Gd(III)的总量，C_f是在渗透溶液中发现的游离Gd(III)配合物。根据一式三份进行的超滤实验评价平均结合分数。从使用每种配合物的水溶液进行的回收实验中排除每种Gd(III)-配合物与超滤膜的非特异性相互作用。

实施例A.B22956/1与血清蛋白的结合百分比(％B)。

通过将31.8mg配合物溶于milliQ水(1mL)制备B22956/1溶液，然后在微波烘箱内(25.07±0.41mM)在硝酸中进行样品消化后通过ICP-MS分光光度计(Elan 6000,PerkinElmer)对Gd(III)的量进行定量。

将上述溶液(0.300mL)加入到15mL重构的人血清中。超滤后，采集溶液(0.5mL)用于Gd(III)含量(C_t)的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定(0.460mM±0.015)。混合制备的溶液(4.5mL)，在37℃在温育振荡器中加热，在37℃温育10min后用再生的纤维素膜(30KDa MWCO)超滤。采集不含蛋白质的渗透溶液(0.4mL)，通过ICP-MS分析测定C_f。一式三份重复超滤操作。

表a.分析的渗透溶液中的C_f值。

通过应用下列等式由得到的C_f值测定结合的Gd-配合物百分比值。

％B＝[(C_t-C_f)/C_t]*100

其中C_t是0.460mM(S.D.：0.015)。

表b.％结合的B22956/1

实施例B.Gd AAZTA-去氧胆酸二钠盐与血清蛋白的结合百分比(％B)。

通过将20.8mg配合物溶于milliQ水(0.63mL)制备Gd-AAZTA去氧胆酸钠盐的溶液。通过ICP-MS测定的Gd(III)的量为26.06mM(S.D.：1.13mM)。

将该溶液(0.290mL)加入到15mL重构的人血清中，采集0.5mL，然后超滤以评价总Gd(III)(C_t＝0.464mM,SD：0.014mM)。

如上述实施例中所述研究基于AAZTA的Gd配合物与血清蛋白的结合相互作用，得到：

表c.分析的渗透溶液中的C_f值。

如上所述操作，从其中我们得到：

表d.％结合的Gd-AAZTA去氧胆酸钠盐

实施例3：通过使用非共价蛋白质结合造影剂和DCE-MRI成像技术对肿瘤中大分子转运的定量

动物

对购自Harlan Laboratories S.r.l.,S.Pietro al Natisone(UD),Italy的20NCR无胸腺裸鼠进行实验。

全部涉及动物的操作均根据国家和国际法和政策Care and Use of LaboratoryAnimals(L.D.116/92；Authorization n.19/2008-A，2008年3月6日由Italian Ministryof Health颁布；EEC Council Directive 86/609CEE和EEC Council Directive 2010/63/EU)进行。

肿瘤细胞培养物和植入物的制备

人前列腺腺癌细胞(PC-3)由ATCC(美国模式培养物保藏所(American TypeCulture Collection))提供并且使其生长在补充了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素(均来自Lonza,Verviers,Belgium)的Hams F-12培养基中。然后采集PC-3细胞，用PBS洗涤2次；将5百万细胞再混悬于0.1mL磷酸盐盐水缓冲液(PBS)，经皮下注入每只5周龄雄性小鼠的右侧胁腹侧。肿瘤发育后进行触及，每隔2-3天用测径器测量，直到实验结束为止。通过公式(π/6)x(L x W)^3/2计算肿瘤体积，其中L和W是肿瘤的最大长度和宽度。在平均肿瘤体积达到400-600mm³时，在开始药物治疗的当天将小鼠随机分成2组(治疗组和对照组)。

使用阿昔替尼的抗血管生成治疗

将

(来自LC Laboratoires,Woburn,MA,USA)以5mg/mL混悬于聚乙二醇400，在室温超声处理10-20min，得到精细混悬液。使用0.1N HCl将该混悬液的pH调整至2-3，然后进行二次超声处理。通过添加酸化水(pH 2-3)得到聚乙二醇400:H₂O最终的3:7(v/v)之比。每隔4-5天新鲜制备备用的注射溶液，贮存在4℃下的黑暗中。每日通过以25mg/kg剂量腹膜内注射给带有肿瘤的小鼠施用阿昔替尼，相当于施用体积为5mL/kg。对照组小鼠每日接受腹膜内注射相同施用体积的用于测试制品的媒介物溶液(30％聚乙二醇400:70％酸化水,pH 2-3)。

将动物连续治疗7天。

实验方案

以下表1中指定的剂量和体积施用造影剂和药物治疗。

在使用阿昔替尼的6-天治疗期开始和结束时，用作为参比使用的

非白蛋白结合化合物首次和使用B22956/1后24小时使对照组和治疗组的每只动物MRI成像。

实验时间安排的图示如图1中所示，其中：第0天是使用阿昔替尼治疗的开始天，第6天是治疗的最后1天，使用

治疗开始前的当天即第-1天是使用

成像的当天，第7天是取出肿瘤用于组织学检查的当天。

表1

DCE-MRI实验

在MR成像实验过程中，用33％O₂和66％N₂O混合物中的异氟烷气体(约1％)麻醉动物。在实验期间，通过调整呼吸频率功能中的气体水平维持麻醉。

以约1mL/min的注射速率通过置于动物尾静脉内的导管经静脉内注射造影剂。

DCE-MRI成像方案

使用以针对小动物研究专用的3T操作的安装有BGA12S2梯度线圈(12cm内径)的BioSpec-Bruker分光光度计进行MR实验。

使用用于具有良好对比的高分辨率的优化参数获取冠状和轴罕有T₂-加权图像，以便检测肿瘤块。

通过造影剂注射前获取具有可变的翻转角θ(FA＝5-90°)的系列3D FLASH MR图像(快速小角度激发,TR约6-7毫秒)、通过使用下列参数测定对比前区域纵向弛豫时间(T1)：矩阵256x128x8，层面厚度1.875mm，FOV 3x3 cm。两个饱和带恰好位于测量的层面的上部和下部，以避免流程中的人为现象。

T1值通过曲线-拟合方程测定：

其中

其中TR是重复时间，T1是纵向弛豫时间，S(θ)是使用翻转角θ得到的信号，k是考虑到质子密度和接收器增加的比例常数。

当注射造影剂B22956/1时(扫描时间45min)，获取由5个起始注入造影剂前和约315个动态注射造影剂后图像组成的动态3D FLASH(FA＝20°,TR约6-7毫秒,获取时间≈7.5s)。当注射造影剂

时(扫描时间30min)，获取5个起始注入造影剂前和约235个动态注射造影剂后图像。

两个饱和带恰好位于测量的层面的上部和下部，以避免流程中的人为现象。

组织学方案

在最后MRI获取结束时，以100mg/kg(施用体积：10mL/kg)的剂量将荧光染料溶液(FITC-白蛋白,10mg/mL,Sigma-Aldrich)注入尾静脉。注射后20min，通过脱颈椎处死小鼠。沿颅骨/尾侧方向将切除的肿瘤切成3片。

将样品固定在4％福尔马林中过夜，然后在30％蔗糖盐水溶液中温育过夜。最终，将样品包埋在OCT(最佳切片温度)化合物中。将整个组织块冷冻在用液氮冷却的异戊烷中。

约1600个5-μm厚度的冰冻切片(选择的组织切片)得自OCT块。在与那些用于MR图像近似平行的平面内的中段片中每隔100-μm切下5片连续切片(25-μm)。

为了使白蛋白-FITC显影，将切片固定在2％中性缓冲的福尔马林中10min，用添加了0.1M甘氨酸的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤20min，在固定培养基中固定。

从在肿瘤边缘和核心部位中得到的选择的组织切片中以10x的放大倍数采集对来自每只动物的约70个图像，例如如图2中图解的。将边缘定义为肿瘤切片的1-mm周围边缘。核心相当于肿瘤切片的中心部分。

使用Leica荧光显微镜DM2500和LAS软件在Biology Laboratories俘获组织学图像。

DCE-MRI数据分析

抽取关注的部位(ROIs)并且对血液(下腔静脉或腹主动脉中)和肿瘤边缘(肿瘤的1-mm周围边缘)、肿瘤核心(肿瘤中心部分)和整个肿瘤部位记录信号强度。

然后根据本发明DCE-MRI方法提供的两种不同的实施方法进行两种类型的分析：

1.肿瘤中作为时间函数的信号增强和造影剂浓度的无模型分析。

2.作为时间函数的纵向弛豫时间的药代动力学(模型化)分析(3个切片)，基于两隔室药代动力学模型。

分析的最终结果为包含获自肿瘤的每个MRI切片的无模型和药代动力学参数的数据组，例如在表A和B中提供的。

用Windows计算机、使用公众域NIH ImagJ程序(在U.S.National Institutes ofHealth研发并且例如可在互联网上利用http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)分析图像。通过Phyton版本精制采集的图像数据。使用SPSS(SPSS,Inc.,Chicago IL)进行统计分析。

造影剂浓度评估

根据可变的翻转角FLASH图像测定肿瘤部位和血液的造影剂注射前R1值。该方法在于作为θ函数的最小二乘法拟合的逐个像素的测量值S(θ,i,j)的线性形式，其中S(θ,i,j)是具有翻转角等于θ的像素(i,j)中测定的信号。

根据造影剂施用之前和之后得到的注射造影剂前R1平均值和动态3D图像的平均信号强度R1值对ROI逐一、通过使用下列等式计算肿瘤ROIs和血液的造影剂注射后的R1值：

其中R₁(ROI,t)是在时间t对ROI ROI计算的平均值R₁，S(ROI,t)是在在时间t对ROIROI计算的平均信号强度，S^pre(ROI)是来自造影剂注射前图像的ROI ROI中测定的平均信号。一旦评价了造影剂注射前后的R₁，则通过众所周知的关系式计算作为时间函数的平均CA组织浓度：

其中r_1,CA是CA松弛性(relaxivity)，C_CA(ROI,t)是在时间t对ROI ROI测定的造影剂浓度。

无模型时间分析

时间-浓度曲线下的起始面积(IAUC_T)用于表征肿瘤微脉管系统。在造影剂注射后的1、5、10、15、20和30分钟内的不同时间点使用造影剂浓度和信号增强的梯形积分法计算IAUC_T：

其中IAUC_T是在注射后的T分钟内计算的IAUC，F(i)是在动态时间点i的造影剂的组织浓度或信号增强，t_i是在时间点i的的时间，N是t_i＝T前最后的时间点。将t₀定义为注射后的第一个时间点。

在下文中，IAUC_T表示在注射后的T分钟内计算的造影剂浓度曲线下的起始面积，而IAUCE_T是指的是相同的计算，但基于信号增强曲线。

药代动力学模型

两室药代动力学模型(Daldrup H,等人,1998Correlation of Dynamic ContrastEnhanced MR Imaging with Histologic Tumor Grade：Comparison of Macromolecularand Small-Molecular Contrast Media.AJR；171:941-949；Tofts P.S.等人,1999,Estimating Kinetic Parameters From Dynamic Contrast-Enhanced T1-Weighted MRIof diffusible Tracer：Standardized Quantities and Symbols.JMRI；10:223-232，将这两篇文献中的内容引入本文参考)用于描述造影剂在肿瘤组织内的动力学行为，精确地描述肿瘤中血浆与血管外细胞外隙(EES)之间的交换动力学。

将描述CA在所关注的组织内的动力学行为的微分方程在包括血管术语时指定如下：

通过解析3个参数，该微分方程得到：

其中C_tis(t)和C_P(t)是分别作为肿瘤组织和血浆中的时间函数的钆浓度，K^trans是转运常数，K_ep是速率常数，f_PV是血浆容量分数。

可以使用常规的线性最小二乘法根据DCE-MRI数据评估K^trans、K_ep和f_PV的值(例如，参见Kenya Murase,2004,MRM；51:858-862和上述引述的文献)。

就此而言，除非另有提供，否则K^trans在本文中可选地称作kTrans或kTrans mL\(min x g)x 100，在后者的情况中表示为单位测量值。另一方面，f_PV在本文中也称作fPV或fPV(％)。

组织学图像分析

将血管密度定量为使用下述基于阈值的分段方法在所关注的组织内用白蛋白染色的区域百分比，另外，将由于FITC-白蛋白的外渗分数的荧光定量，以表征局部微血管渗透性。

分段方法

拉伸RGS直方图以增加图像对比度且然后应用亮度公式将RGB像素强度转化成8-比特灰度：亮度值＝0.3红色+0.59绿色+0.11蓝色

通过Otsu阈值算法将相当于血管的像素(血管像素)分段。分段的结果由我们的组织学家进行内部验证。

将血管面积计算为血管像素占据的视图视野的百分比(FITC-白蛋白阳性面积％)。

外渗定量

为了分析肿瘤组织内的FITC-白蛋白分布，对与每个图像最接近血管的指定距离处的所有像素求FITC-白蛋白荧光的平均值并且作为距最接近血管的距离的函数储存(荧光衰减曲线)(Daldrup H,等人,1998 Correlation of Dynamic Contrast Enhanced MRImaging with Histologic Tumor Grade：Comparison of Macromolecular和Small-Molecular Contrast Media.AJR；171:941-949)。根据荧光衰减曲线下1-200μm的面积(FITC-Alb.衰减AUC(1-200μm))对外渗的FITC-白蛋白的总量进行定量。

统计学

为了评价DCE-MRI评估值与组织学参数之间存在的相关性，在各个MRI参数kTrans、fPV、IAUCE1、IAUCE5、IAUCE10和组织学FITC-白蛋白阳性面积％、FITC-Alb.衰减AUC(1-200μm)中计算皮尔逊相关性。p-值<0.05被视为具有统计学显著性。

结果

将来源于使用钆考酸三钠盐在肿瘤边缘和核心中得到的荧光显微镜检查图像和基于MRI成像的结果而得到的白蛋白分布组织学评估值以及皮尔逊相关性分别概述在下表A和B中，而表E提供了表A和B的标记定义，其证实了根据组织学和MRI-衍生的评估值在核心和边缘中均存在基本上线性的相关性。表C和D报道了使用造影剂

得到的数据，使用这种造影剂未发现DCE-MRI与组织学数据之间存在相关性。

特别地，4个表格对每只测试动物报道并且比较了分别在造影剂施用后5、10、20和30分钟在肿瘤边缘(表A和C)和核心(表B和D)中使用本发明DCE-MRI方法评估的参数值，其中在同一动物中通过荧光显微镜检查、使用FITC-BSA对外渗的白蛋白以组织学方式进行了定量。外渗的白蛋白的量与基于MRI的使用B22956/1测定的参数之间的相关性的图解表示如图5和6中所示，其中将每个肿瘤的肿瘤边缘和核心中测定的FITC-Alb.衰减AUC(1-200μm)的值对kTrans绘图。

对各自相当于测定的参数的每个DCE-MRI数据栏得到的皮尔逊系数包含在提供的表中，其证实在基于DCE-MRI的使用B22956/1得到的值与组织学数据之间存在基本上线性的相关性，即通过p-值始终小于0.05进一步证实。而使用造影剂

未发现具有统计学显著性的相关性。

表A.使用造影剂B22956/1在肿瘤边缘中测定的组织学和MRI原始数据。最后一行：皮尔逊相关性,*p-值<0.05。

表B.使用造影剂B22956/1在肿瘤核心中测定的组织学和MRI原始数据。最后一行：皮尔逊相关性,*p-值<0.05。

表C.使用造影剂

在肿瘤边缘中测定的组织学和MRI原始数据。最后一行：皮尔逊相关性。

表D.使用造影剂

在肿瘤核心中测定的组织学和MRI原始数据。最后一行：皮尔逊相关性.

表E.标记定义

实施例4：本发明的非共价蛋白质结合造影剂在评价使用

预治疗对于对带有皮下WM1552/5的裸鼠的作用中的应用

细胞系

将来源于来自患者黑素瘤的ATCC WM15(Silini A,等人Regulator of G-proteinsignalling 5(RGS5)protein：a novel marker of cancer vasculature elicited andsustained by the tumor's proangiogenic microenvironment.Cell Mol LifeSci.2011DOI 10.1007/s00018-011-0862-8)的黑素瘤细胞系在补充了10％热灭活胎牛血清(Sigma,St.Louis,MO,USA)和1％L-谷氨酰胺(Gibco)的RPMI 1640(Roswell ParkMemorial Institute 1640)(Gibco,Paisley,UK)中培养并且维持在37℃、具有5％CO2的加湿气氛中。收集呈指数生长的细胞，反复洗涤，再混悬于不含血清的培养基中，然后注射。

小鼠和异种移植物肿瘤模型

将得自Harlan(Correzzana,Italy)的6-8-周龄的雌性NCr-nu/nu小鼠维持在特定的不含病原体的条件下并且在整个研究自始至终使用无菌方法进行操作。以实验室动物的护理和使用(Care and Use of Laboratory Animals)为标准进行与上述举出的国家和国际法和政策一致的涉及动物及其护理的程序。将WM1552/5细胞(2x106细胞)经皮下注入裸鼠右侧胁腹侧，然后在肿瘤达到约100-150mg时，将它们随机分入治疗组(N＝10-12只/组)。

药物

将PTX(Indena S.p.A.,Milan,Italy)溶于50％Cremophor EL(Sigma)和50％乙醇并且用盐水进一步稀释，此后即刻使用。以20mg/kg的剂量经静脉内(i.v.)施用PTX。

MRI成像

试剂

B22956/1(Bracco Imaging S.p.A；如WO 00/38738中公开的得到)，用作MRI造影剂。

体内DCE-MRI成像

在PTX施用后24h通过DCE-MRI分析带有WM1552/5黑素瘤异种移植物的PTX-和媒介物-治疗的裸鼠(N＝4只小鼠/组)。为了防止灌注和渗透性受损害大小影响，将PTX-和媒介物-治疗的肿瘤进行重量匹配(平均值分别＝603mg和503mg)。使用专用于小的啮齿动物的安装有7Tesla/30-cm磁体和35-mm鸟笼形RF线圈的BioSpec AVIII系统(Bruker BioSpin)进行磁共振成像扫描。在扫描期间的自始至终，将动物保持在受控麻醉下(约30％O2、70％N2和0.8-1％异氟烷)。通过动态造影剂增强(DCE)系列研究肿瘤血管化，所述的动态造影剂增强(DCE)系列包含作为本发明造影剂的非限制性实例的B22956/1(Bracco Imaging SpA)0.1mmol/kg注射后获取的74次横向FLASH(快速小角度激发)2-维(2D)T1加权扫描，其中使用如下参数：TR/TE 100/3.5ms，翻转角(FA)90°，矩阵大小128x 256，视野2.5x 2.5cm2(相当于约200x 100mm²面内分辨率)，6个2mm厚度的切片，获取时间59秒/图像。在CA注射前进行一次使用相同参数的扫描。使用多层可变翻转角FLASH测定肿瘤中造影剂注射前的T1值。通过使用扫描仪软件ParaVision对所有MRI实验进行图像2D重建。通过在ImageJ下(Abramoff,M.D.,Magalhaes,P.J.,Ram,S.J."Image Processing with ImageJ".Biophotonics International,第11卷,第7版,pp.36-42,2004)的室内显影的常规运行对图像进行后处理和数据分析。将得到的评估值提供在图7中方框图中，其展示出在PTX治疗的肿瘤的核心和边缘中DCE-MRI-评估的B22956/1血浆容量分数fPV和转换系数kTrans都得到增加。

统计学分析

通过曼-惠特尼u检验分析造影剂分布的动力学差异(DCE-MRI)。

实施例5：本发明的非共价蛋白质结合造影剂在评价抗体衍生的抗癌药物在带有皮下A431的媒介物治疗或用紫杉醇预治疗的裸鼠中转运中的应用

动物

使用购自Harlan Laboratories S.r.l.,S.Pietro al Natisone(UD),Italy的8只雌性NCR无胸腺裸鼠进行实验。以与符合上述涉及的用于护理和使用实验室动物的国家和国际法和政策的公共机构指导原则一致性的方式进行涉及动物及其护理的全部程序。

肿瘤细胞培养物和肿瘤植入物

将人表皮样癌细胞系(A431)(由ATCC提供)在补充了10％热灭活的胎牛血清(Lonza,Verviers,Belgium)、2mM谷氨酰胺(Lonza,Verviers,Belgium)、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Lonza,Verviers,Belgium)的DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基)高葡萄糖培养基(4.5g/L葡萄糖)(Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany)中培养并且维持在37℃下、具有5％CO₂的加湿气氛中。收集呈指数生长的细胞并且用PBS洗涤2次。将2百万A431细胞重新混悬于0.1mL PBS并且经皮下注入6周龄雌性小鼠每只的右侧和左侧胁腹测。在接种后每日都发生肿瘤发育，开始触及，然后每日用测径器确立1次肿瘤，直到处死当天为止。在通过测径器测量肿瘤平均直径达到7-8mm时，在开始药物施用的当天将小鼠随机分成2个组(治疗组和对照组)。

药物

(PTX)(Indena S.p.A.,Milan,Italy)：如实施例4中所述用50％Cremophor EL和50％乙醇制备PTX溶液，进一步用盐水稀释，此后即刻以2mg/mL最终浓度使用。经静脉内以20mg/kg的剂量施用(i.v.,单一施用)PTX。

用媒介物溶液(用盐水稀释的50％Cremophor EL和50％乙醇)以与用于测试制品的相同施用体积经腹膜内治疗对照组小鼠。

实验设计和方案

设计本实验以测定PTX诱导的对抗体

(CTX)在人表皮样癌(A431)肿瘤模型中的蓄积和分布的作用，并且比较得到的结果与使用B22956/1得到的DCE-MRI数据。就此而言，将8只小鼠分成2个组；用PTX治疗2个得到的组中每个的2只动物，用媒介物(CTRL)治疗2个得到的组中每个的2只动物。在肿瘤植入后14天开始治疗，此时通过测径器测量肿瘤达到7-8mm直径。从肿瘤植入后第14天开始(视为第1天)将PTX或CTRL施用于动物。使用PTX或CTRL后24小时(第2天)，给每只动物注射B22956/1(用作本发明造影剂的非限制性实例)并且用DCE-MRI成像。在造影剂施用前和造影剂施用后不同时间进行MRI成像。在MRI实验后，经腹膜内注射荧光标记的

(Cy5-CTX)。在第3天，通过光学成像(OI)对全部小鼠进行体内成像；然后注射FITC-白蛋白(10mg/mL)，5分钟后，处死动物。切下肿瘤，离体进行第二次光学成像获取。最终制备用于组织学检查的肿瘤。

DCE-MRI实验

使用专用于小动物研究的3T操作的安装有BGA12S2梯度线圈(12cm内径)的BioSpec-Bruker分光光度进行MR实验。

试剂

将B22956/1(Bracco Imaging S.p.A.,如上述涉及的得到)用作MRI造影剂(CA)。以100μmol/kg的剂量与4mL/kg的施用体积经静脉内注射B22956/1。

DCE-MRI成像方案和顺序

在使用PTX或CTRL治疗后24小时，给每只动物注射CA(B22956/1)并且用DCE-MRI成像。以约1mL/min的注射速率通过置于动物尾静脉内的导管经静脉内注射造影剂。为了进行MR成像实验，给动物用在33％O₂和66％N₂O混合物中的异氟烷气体(约1％)预先麻醉，然后通过调整呼吸频率功能中的气体水平维持麻醉。在造影剂施用后的不同时间点进行MRI成像。特别地，使用用于具有良好对比的高分辨率的优化参数获取造影剂施用前冠状和轴罕有T₂-加权解剖学图像，以便检测肿瘤块。在造影剂注射前获取具有可变的翻转角θ(FA＝5-90°)的3D FLASH图像(快速小角度激发,TR约6-7毫秒)，以便通过使用矩阵128x128x8、层面厚度～1.5mm、FOV～3.0x3.0 cm评估肿瘤和肌肉纵向弛豫时间。然后获取相同的顺序(FA＝20°,TR约6-7毫秒)以继续追踪CA i.v.注射后肿瘤和血管中的CA动态。通过将两个厚饱和带恰好置于测定的层面的上部和下部避免流程中的人为现象。

光学成像实验和方案使用Pearl Impulse,LiCor,USA进行光学成像(OI)。使用ScanScope FL Aperio(USA)在CRB/Z实验室进行组织学检查。

试剂

ERBITUX(溶液；MW～152kDa)：(ImClone LCC,5mg/mL(0.033mM)，在缓冲溶液中，该缓冲溶液由100mM氯化钠、100mM甘氨酸、0.01％聚山梨醇酯80和10mM柠檬酸在pH 5.5组成).

酞菁Cy5：(Cy5,NHS酯,GE Heal thcare,MW 792,10mg/mL)。

Cy5-CTX：在室内通过经使用本领域公知的典型和充分验证的方法使单克隆抗体(在柠檬酸盐-TEA缓冲液中3.51mg/mL，通过与商购mAb的甘氨酸溶液进行缓冲液交换得到)与商购荧光酞菁Cy5-NHS酯缀合制备荧光标记的单克隆抗体(mAb)。缀合产物中染料/mAb的摩尔比＝2。

白蛋白-异硫氰酸荧光素：(白蛋白-FITC,Sigma-Aldrich,10mg/mL溶液)。

光学成像方案

在PTX或媒介物施用后24小时经腹膜内以1mg单克隆抗体(mAb)/小鼠的剂量注射标记的抗体，相当于约7nmol荧光染料/小鼠。

用在98％O₂中的异氟烷气体(2％)预先麻醉动物，然后进行光学成像实验，在获取期间通过调整呼吸频率功能中的气体水平维持麻醉。在OI期间，将动物维持在37℃。

注射Cy5-缀合的

后24小时，使用上述能够检测荧光强度的光学成像系统分析小鼠。仪器配有在650nm波长处的激发激光器和具有770nm的通带波长的长通路过滤器。典型的激发功率为100μW。整个胸部的体内荧光图像的获取(1mm分辨率)持续约10min。将荧光强度测定为获取部位的每个位置中的光子计数数量。在体内OI实验结束后，以100mg/kg的剂量将FITC-白蛋白的荧光溶液(10mg/mL,Sigma-Aldrich)注入(施用体积：10mL/kg)尾静脉。注射后5分钟通过脱颈椎处死动物，切下肿瘤。选择注射与处死之间的5分钟短暂衰减时间是为了避免对因细胞外空间中外渗的白蛋白部分导致的血管尺寸评价过高。还对取出的肿瘤进行了离体OI实验。

组织学实验和方案

将切下的肿瘤包埋在OCT(最佳切片温度)包埋剂中并且即刻冷冻在用液氮冷却的异戊烷中。然后从OCT块中得到10-μm厚度的冷冻切片。特别地，从每个肿瘤中每隔500-μm切下6个切片(每个载玻片3个切片，两个系列载玻片)，近似地在与用于MR图像的那些平行的面内。为了进行白蛋白-FITC和其他荧光信号显影，将切片固定在10％中性缓冲福尔马林中10min，用PBS+0.1M甘氨酸洗涤20min，固定在具有DAPI的固定培养基中。

数据分析

组织学图像分析

为了在微观水平分析DCE-MRI数据、PTX对肿瘤微环境中的作用和CTX在肿瘤内的分布中的相关性，将荧光显微镜检查选作参比方法，这归因于其高灵敏度和高空间分辨率。实际上，基于mAbs的药物显示作为CTX的对膜抗原的高度特异性，这可以生成显著不均匀的空间分布，而这种显著不均匀的空间分布可以抑制药物的治疗活性。通过荧光显微镜检查，能够空间分辨CTX的分布，即在微观水平上对mAb的量进行定量，且由此不仅对PTX对递送入组织的CTX总量、而且对其分布是否均匀的作用进行了研究。

方法

获取45个组织学图像，相当于约3个切片/肿瘤。每个图像由两个相当于得自染料酞菁5(Cy5)和异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光信号的通道组组成。使Cy5与mAb

缀合并且用于生成Cy5-CTX图像(图9，小图D)，而与白蛋白缀合的染料FITC用于生成FITC-Alb图像(图9，小图A)。

来自FITC-白蛋白图像的灌注血管的鉴定.通过在每个FITC-Alb图像中选择具有指定阈值内的信号强度的全部像素来鉴定每个切片内部灌注的血管(图9，小图B)。选择阈值并且通过视觉检查由组织学专家验证。

CTX信号衰减曲线.分析Cy5-CTX染色的空间分布，以便使用FITC-Alb图像(距离图的图9，小图c)计算对于每个像素的距最接近血管壁的距离。在相应的Cy5-CTX图像中，然后将Cy5-CTX信号表示为距血管壁的像素距离的函数(CTX衰减曲线)。(就适用的方案，例如，参见F.Tannock等人,2005.Clin Cancer Res,11,8782-8788和Tong,R.T.等人,2004CancerRes,64,3731-3736)。使用该方法得到的空间分布数据覆盖距最接近血管壁0-约700μm。

DCE-MRI图像分析

使用ImageJ软件进行整个图像分析，同时精制R统计学分析环境内采集的数据(RDevelopment Core Team(2011).R:A language and environment for statisticalcomputing.R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria.ISBN 3-900051-07-0,URL.http:/www.R-projact.org/.，引入参考)。

造影剂浓度评估

根据可变的翻转角FLASH图像测定造影剂施用前肿瘤、肌肉和血液的R₁值。该方法在于作为θ函数的S(θ)值的最小二乘法拟合，其中S(θ)是根据使用等于θ的翻转角获取的图像测定的信号。造影剂施用后的R₁值使用造影剂施用前的R₁值和在造影剂施用之前和之后得到的动态3D图像的信号强度、应用下列等式计算：

其中R1(t)是在时间t时计算的R1，S(t)是在时间t时计算的信号强度，S_pre是在来自造影剂注射前图像中测定的平均信号。一旦评价了造影剂注射前和注射后的R1，则通过下列关系式计算作为时间函数的平均CA组织浓度：

其中r_1,CA是CA松弛性，C_CA(t)是在时间t时的造影剂浓度。对于每只动物的肿瘤、肌肉和血液以逐个roi-方式计算1个参比R_1pre值，作为根据接近RF线圈中心的层面的可变-翻转角FLASH图像计算的1/T1值，目的在于将因RF视野不均匀性导致的误差减小至最低限度。

药代动力学分析.类似地将例如上述实施例3和引述的文献中公开的两隔室药代动力学模型用于描述造影剂在肿瘤组织中的动力学行为，且更精确地描述肿瘤中血浆与血管外细胞外空间(EES)之间的交换动力学。利用相同的微分方程描述CA在包括血管术语时在所关注的组织内的动力学行为：

以相同方式得到如下方程：

其中C_tis(t)和C_P(t)是分别作为时间的函数的肿瘤组织和血浆中的钆浓度，K^trans是转运常数，K^ep是速率常数，fPV是血浆容量分数。然后根据DCE-MRI数据、例如使用常规的线性最小二乘法评估K^trans、K^ep和fPV的值(就此而言，参见上述引述的文献)。

此外，通过以逐一roi-方式分析血液中的MRI信号来计算作为时间函数的动脉输入函数(AIF)，即注射的造影剂B22956/1在血浆中的浓度。求测量的每只动物的AIF(集合的AIF或基于群体的AIF)的平均值，来得到用于药代动力学分析的AIF。

对所关注的部位相当于接种在右侧和左侧胁腹侧中的肿瘤和肌肉内进行逐个像素分析。

无模型分析。

该方法的优点在于简便性、计算的迅速性，尤其是在应用于对数以千计个像素内进行逐个像素分析时有价值，以及因其不依赖于最小二乘拟合法而具有的稳定性。

实际上，对以数值方式积分造影剂浓度和信号强度曲线的不同时间窗内计算时间-浓度曲线下的面积(AUC)。通过下列等式定义AUC值：

其中在t₁－t₂时间窗内计算AUC。F(i)是在时间点i测定的造影剂浓度或信号增强。当从注射后的第一个时间点开始计算AUC时，将该参数称作浓度曲线下的起始面积(IAUC_T)，其中T表示时间窗的上限。在该实验研究中，计算AUC_10,20、AUC_20,30和IAUC₁，即分别在注射后10－20分钟、20－30分钟的时间窗内和第一个时间点到第1分钟内计算曲线下的面积。然后计算两个另外的参数，通过合并在肿瘤和血液中测定的AUC值得到。特别地，通过用所关注的ROI和参比部位(肿瘤和肌肉)中的IAUC₁除以在血液中测定的IAUC₁得到EARLYAUCRATIO。就此而言，值得注意的是，当注射后第一分钟内的造影剂外渗可忽略不计时，就B22956/1而言(用于试验)，EARLYAUCRATIO的值与肿瘤血浆容量分数(fPV)相关。

此外，正如所述的，因为在本实验中，我们使用了集合的AIF(因此推定为恒定值)，所以EARLYAUCRATIO的值(通过上述比得到)直接与IAUC₁相关。第二个是LATEAUCRATIO，将其定义为注射后20－30分钟内肿瘤中增强曲线下的面积(AUC_20,30)除以在血液中测定的IAUC₁。该量与外渗的造影剂的量相关，且由此与ktrans和kep值间接相关。此外，由于在本实验中因为上述原因而使用了集合的AIF，所以LATEAUCRATIO的值与AUC_20,30直接相关。

还计算了参数AVGENH，作为根据下式在所有获取的时间点内计算的增强平均值：

其中Enh(i)是在动态时间点i的信号增强，N是获取的最后时间点。测试该参数是因为其极易于计算和稳定。

在这方面，下文提供该相关性表F，包括如根据本实施例试验的实验性DCE-MRI数据计算的DCE-MRI参数值以及配对皮尔逊相关性。等于或接近1的相关因子表示2个参数基本上表示相同的信息。作为特殊情况，参数EARLYAUCRATIO和LATEAUCRATIO显示与IAUC₁和AUC_20.30的皮尔逊相关性分别等于1，这是因为使用基于群体的(集合的)AIF，且作为结果，它遵循EARLYAUCRATIO和LATEAUCRATIO的定义，参数仅在倍增因子方面不同。

该表基本上证实，所有这些参数最终与相同的主要身体现象即施用造影剂的药代动力学相关，而与其计算进行的操作无关，且由此它们在一些测量中彼此相关和因此所有可合理地利用本发明方法。另外的情况可以表示为K_ep，其表示从EES到血液的速率常数并且与(肿瘤)组织中血管外-细胞外空间的部分和大分子溶质的洗涤掉而不是从血液中外渗至EES相关。

表F

*相关性等于1，因为使用集合的AIF。它遵循EARLY和LATEAUCRATIO的定义。

阈值内的像素。以逐个像素的方式在来自DCE-MRI图像的所关注的病理性部位、在本实施例中的肿瘤部位内计算上述DCE-MRI参数值。对在相应解剖学图像上过度加强的评价参数各自显示逐个像素DCE-MRI分析的参数图像例如如图10中所示。

然后以逐个像素方式对于关注的参数(p)计算阈值，通过对未治疗的小鼠的健康肌肉中的相关参数考虑到逐个像素测定的值的平均值(μ)和标准偏差(σ)来进行，典型地通过将其视为阈值μ+3σ来进行。

例如，当将AVGENH视为相关DCE-MRI参数p时，本文将其视为本发明的DCE-MRI参数的非限制性实例，这归因于其易于测定和稳定，得到的值为：

得到阈值为57。

然后对每一具有超过评价的阈值的参数值的ROI鉴定像素数量。例如图11中所示的在相应解剖学图像上具有AVGENH>57的肿瘤部位的像素的过度加强能够鉴定ROI中“可渗透的”或“有利的”像素的量和分布。在作为总像素部分(对所有肿瘤体积采样的所有记录的MRI图像的肿瘤ROIs的部分)的分析的肿瘤中评价施用的mAb在肿瘤组织中的转运，所述总像素部分的特征在于测定的DCE-MRI参数值(在实例AVGENH中)与相应的在参比组织中计算的即具有大于57的AVGENH的值具有统计学差异。

然后通过将0.5固定为截断值(相当于这样的肿瘤，其中超过阈值的像素的数量至少等于总肿瘤像素的50％)，将具有超过57的AVGENH的像素与大于0.5的总肿瘤像素范围之比的肿瘤鉴定为“有利的”或“可渗透的”，而将产生较低比的肿瘤定义为“不利的”或“无渗透的”。

光学图像分析

使用1mm分辨率获取PTX治疗组和对照组小鼠的整个胸部的荧光图像持续约10min。

记录治疗组和对照组动物中的高强烈信号面积。

结果和结论

PTX对DCE-MRI参数的作用的分析

对DCE-MRI数据进行统计学分析以比较使用PTX治疗后24h的治疗和未治疗肿瘤。对于每一肿瘤，计算按照逐个像素计算的DCE-MRI参数的平均值，且然后比较两个治疗组的平均值分布。使用曼-惠特尼u检验检验差异的统计学显著性。将p-值小于0.05(5％)视为具有统计学显著性差异。

将得到的结果概述在表G中，其报道用于得到DCE-MRI参数的CTRL和PTX肿瘤的平均值、标准偏差和数量。还报道了曼-惠特尼u检验的结果。

表G

*p-值<0.05,**p-值<0.01,曼-惠特尼u检验

得到的数据与造影剂B22956/1在PTX治疗的小鼠中比在对照组中的血液灌注增加且外渗增强一致。特别地，已经证实PTX治疗诱导对那些与CA外渗相关的DCE-MRI参数例如trans、AUC_20-30、LATEAUCRATIO的作用，这种作用从统计学观点来看是特别显著的。

已知PTX在与mAbs联合施用时发挥促进活性(F.Marcucci和A.Corti,AdvancedDrug Delivery Reviews 2011,64：53-68)，这可能归因于其在降低间质液压的能力且由此促进大分子在肿瘤内的对流-介导的转运(A.

A.Berg和R.K.Reed.Am JPhysiol Heart Circ Physiol 2004,287：H963-H968)。测试了提出的DCE-MRI方法在评价药物能够改变作为PTX的大分子在肿瘤内分布的作用的可利用性。从一方面得到的结果证实使用提出的DCE-MRI方法可测定PTX在肿瘤生理学中诱导的改变。另一方面，得到的结果进一步支持和表明本发明的活性剂和DCE-MRI方法可以有利地用于评价利用抗癌药与EPR增强药的组合的抗癌方案的效力，从而有利于其在待治疗的肿瘤内递送。

通过光学成像对PTX作用的分析

在进行的试验中，可能归因于可检测区域饱和的PTX-治疗组和对照组小鼠中记录的信号的相当强度无法评估PTX对施用的mAb的作用。实际上，已知在高剂量下，例如1mg/小鼠，mAb

可以饱和来自A431肿瘤异种移植物中的血管壁的肿瘤组织的前100μm，不过，在位于肿瘤中心部分的低氧区中仍然存在最少的药物渗透(Lee和Tannock BMCCancer 2010,10:255)。OI证实在mAb蓄积在PTX-治疗和未治疗的肿瘤内。由于这项技术限于观察来源于充分灌注的肿瘤浅部的荧光信号，所以未观察到PTX治疗在中心灌注不足的肿瘤区域的显著作用。

PTX对CTX分布的作用的分析

对于每一通过荧光显微镜检查获取的肿瘤切片在距最接近血管壁0－约700μm的距离范围内确定荧光CTX衰减曲线。分析治疗与未治疗肿瘤之间分开的几乎等同的45条荧光衰减曲线。将0－700μm之间的距离分成约20μm宽的间距并且对于每一间隔计算荧光信号曲线下的面积(fAUC)值。通过曼-惠特尼u检验比较fAUC值的分布以评价治疗与未治疗肿瘤之间是否存在显著性差异。将得到的结果图示报道在图12中，其中使用得自曼-惠特尼u检验的p值报道对于每一距离间距计算的PTX和CTRL组的fAUC的中位值。

正如从该图中显而易见的，未治疗的肿瘤显示距最接近血管壁0－约200μm之间有更多CTX蓄积。治疗的肿瘤显示距最接近血管壁400－约700μm之间较高的荧光。通过分析0－700μm的完整测试范围内计算的值的fAUC分布，在治疗与未治疗肿瘤之间未发现差异。然而，可以无可争议地从得到的结果中衍生PTX治疗的小鼠与对照组小鼠相比施用的荧光标记的抗体的分布更均匀和改善，例如可在图12中观察到的。

这些结果强化了有关PTX在肿瘤部位中对于mAb的总体分布促进的作用的一些发现，即尤其是在以高饱和剂量施用mAb时，PTX可以增加肿瘤内部的mAb分布体积，并且导致对蓄积在组织中的mAb总量的有限作用(F.Marcucci和A.Corti,Advanced Drug DeliveryReviews 2011,64 53-68；Lee和Tannock BMC Cancer 2010,10:255；A.A.Berg,和R.K.Reed.Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004,287：H963-H968；G.M.Thurber等人Advanced Drug Delivery Reviews 2008,60：1421-1434)。这对改善大分子药物的治疗作用而言是重要的必不可少的。

此外，显而易见，通过对肿瘤区域中的mAB分布的组织学评估得到的图12的行为与药代动力学参数的增加一致，这种行为支持了通过使用PTX治疗促进的mAb更好和更均匀分布，所述药代动力学参数例如、尤其是使用本发明DCE-MRI方法在PTX治疗的肿瘤中测定的Ktrans、fPV、AUC_20-30和LATEAUCRATIO。

DCE-MRI与组织学数据和肿瘤区分之间的相关性

分析使用本发明方法得到的DCE-MRI参数与组织学数据之间相关性的存在。参比观察结果是组织学结果，其显示对于PTX-治疗和未治疗肿瘤的差别CTX蓄积，这取决于测定荧光时距血管的距离。将本发明方法的具体实例应用于可得到的数据，以便证实本发明DCE-MRI方法在区分特征在于抗体CTX有利外渗的肿瘤与那些显示mAb外渗有限的肿瘤中的切实可行性。就此而言，将CTX的外渗定量为根据350－550μm计算的fAUC(fAUC_350.550)。

应用的方法主要包括下列步骤：

1.按照逐个像素分析MRI信号强度时间分布图，以便计算ROI(在下列实施例中，皮下植入的肿瘤)中的造影剂浓度时间分布图和/或信号增强时间分布图。

2.按照逐个像素计算所关注的DCE-MRI参数值。在下列实施例中，因上述解释的原因将参数AVGENH用作本发明有代表性的非限制性的DCE-MRI参数。

3.计算参比部位(在下列实施例中，背侧肌)中AVGENH的值的平均值(μ_AVGENH)和标准偏差(σ_AVGENH)。

4.鉴定显示AVGENH>(μ_AVGENH+3σ_AVGENH)的ROI(肿瘤)中的像素分数(D_AVGENH)。

5.将显示D_AVGENH>0.5的每个肿瘤指定入“有利的”组，否则，将其指定入“不利的”组。

实际上，如上所述，对于DCE-MRI参数AVGENH，由肌肉定义参比阈值57。具有AVGENH>57的像素由此被鉴定为具有对于CTX外渗的有利的生理学的肿瘤ROIs的像素。换句话说，D_AVGENH表示“有利的”像素分数，其属于通过分析所有可得到的展示出至少部分肿瘤ROI的MRI层面确定的肿瘤体积。将D_AVGENH对fAUC_350.550绘图，并且计算fAUC_350.550与D_AVGENH之间的皮尔逊相关。得到的结果图示提供在图13中。

特别地，正如从图13中显而易见地，D_AVGENH显示与fAUC_350.550(斜线p-值<0.01,皮尔逊相关性检验)和由此与在距最接近血管350－550μm的组织部位内通过组织学方法测定的CTX的量的具有统计学意义的相关性。

然后选择D_AVGENH的截断值为0.5，其相当于推定的肿瘤，其中ROI内部的所有像素的50％显示“有利的”生理学。将具有大于0.5的D_AVGENH的肿瘤鉴定为“有利的”或“可渗透的”，而将导致较低比的肿瘤定义为“不利的”或“无渗透的”。

实际上，正如从图13的示意图中显而易见的，“有利的”肿瘤(白色斑点，D_AVGENH>0.5)显示相对于“不利的”较高的fAUC_350.550值(放置垂直线表示截断值)。这种相关性观察结果提供了提出的方法的可靠性表示并且表明它在用于区分肿瘤患者时的有效性。

具体地，本发明包括下述实施方案：

1.顺磁性造影剂，其具有800－5,000Da的分子量并且展示出等于或大于85％的与人血清白蛋白HSA的非共价蛋白结合，该顺磁性造影剂用于通过使用DCE-MRI技术体内非侵害性评价关注的大分子溶质在病理性身体区域、部位或组织中的转运。

2.实施方案1的顺磁性造影剂，具有800－3,000Da的分子量和至少4小时的在人血液循环中的终末半衰期值。

3.实施方案1或2的顺磁性造影剂，其中所述评价包括得到与所述造影剂在所关注的病理性区域、部位或组织内展示出的药代动力学相关的参数的体内DCE-MRI评估值。

4.实施方案3的顺磁性造影剂，其中测定的参数选自f_PV、K^trans、AVGENH、AUC、AUCE、IAUC_T、IAUCE_T、EARLYAUCRATIO和LATEAUCRATIO。

5.实施方案4的顺磁性造影剂，其中测定的参数选自K^trans、AVGENH、AUC和AUCE或其组合。

6.实施方案3－5的顺磁性造影剂，其中基于定期在对整个病理性区域采样的DCE-MRI图像集合的关注的病理性部位(ROI)中测定参数和独立地在参比健康部位中测定参数。

7.实施方案3－6任一项的顺磁性造影剂，其中所述非侵害性评价通过下列步骤进行：计算参比部位中测定的参数各自的阈值，且然后在各自采集的DCE-MRI图像中识别那些显示超出了测定的阈值的相关参数值的病理性ROI(s)中的像素。

8.实施方案7的顺磁性造影剂，其中根据显示超出阈值的参数值的像素的分数D计算关注的大分子溶质转运的评估值。

9.实施方案1－8的顺磁性造影剂，其中所述病理性身体区域、部位或组织是肿瘤或癌肿块或慢性发炎的区域。

10.实施方案1－9任一项的顺磁性造影剂，其中所述关注的大分子溶质是具有等于或大于50kDa的分子量的大分子药物或前药。

11.实施方案10的顺磁性造影剂，其中所述大分子药物或前药是大分子抗癌药物或前药。

12.实施方案11的顺磁性造影剂，其中所述大分子抗癌药物或前药是基于抗体或抗体片段的抗癌药物。

13.实施方案12的顺磁性造影剂，其中所述大分子抗癌药物选自

Adcetris^TM、

和

14.实施方案1－13任一项的顺磁性造影剂，用于识别展示出对利用大分子药物或前药的药理学治疗渗透抗性的病理性组织或区域或肿瘤块，所述识别基于D的测量值进行，其中使得D值大于0.5的病理性区域或肿瘤部位被认为展示出对于大分子溶质的充分的渗透性。

15.实施方案14的顺磁性造影剂，用于鉴定渗透-抗性肿瘤，即显示出难以透过大分子溶质或透过性受损的病理性组织。

16.上述实施方案任一项的顺磁性造影剂，用于对肿瘤患者分层次的方案或预测方法，通过下列步骤进行：鉴定对利用大分子药物或前药的抗癌疗法具有抗性的患者，这种抗性归因于在待治疗的病理性部位或肿瘤块中所述大分子药物或前药的渗透力不足或受损。

17.实施方案1的顺磁性造影剂，其用于抗癌策略的选择、处置和优化，所述抗癌策略使用大分子药物或前药单独地或与其他协同作用的活性剂组合，所述其他协同作用的活性剂包括致力于增强大分子药物吸收的任意活性剂或药物，该顺磁性造影剂还用于监测吸收增强活性剂或药物或包括它们之一的疗法或联合疗法的有效性。

18.实施方案1的顺磁性造影剂，其展示出大于90％的与人血清白蛋白的非共价蛋白结合。

19.上述实施方案任一项的顺磁性造影剂，其选自顺磁性螯合配合物的生理学可接受的盐，所述顺磁性螯合配合物选自钆考酸、MS 325的钆配合物和AAZTA-去氧胆酸的钆配合物。

20.为肿瘤患者分层次的基于DCE-MRI的诊断方案，包括使用顺磁性造影剂对使用大分子药物或前药的抗癌疗法具有抗性的患者进行非侵害性鉴定，所述顺磁性造影剂具有800－5,000Da的分子量并且展示出等于或大于85％的与人血清白蛋白的体内非共价蛋白结合，患者对抗癌疗法产生抗性归因于所述大分子药物或前药在待治疗的病理性区域中的渗透力不足或受损。

21.用于对大分子溶质递送入病理性身体区域、部位、组织、肿瘤或癌肿块或发炎区域进行非侵害性评价的DCE-MRI方法，该方法包括：

i)将有效量的顺磁性造影剂施用于患者或该患者的器官或其他身体部位或组织，所述顺磁性造影剂具有800－5,000Da的分子量并且展示出至少85％且优选90％的与人血清白蛋白的体内非共价蛋白结合；和

ii)从通过使用DCE-MRI技术得到的与造影剂在所述病理性区域、部位、组织或肿块中展示出的药代动力学相关的一个或多个参数的评估值获得对递送的体内评价。

22.实施方案21的DCE-MRI的方法，其中所述顺磁性造影剂具有800－3,000Da的分子量和至少4小时的在人血液循环中的终末半衰期值。

23.实施方案21或22任一项的DCE-MRI方法，包括：

a)得到在所述造影剂在所关注的病理性身体区域或部位内通过期间获取的MRI图像集合并且从获取的MRI图像计算造影剂浓度-时间分布图(或随时间变化的浓度-曲线，在本文中可以互换使用)；

b)从所计算的浓度-时间分布图中衍生与所述造影剂在所述病理性组织内展示出的药代动力学相关的数值参数；和

c)从计算的参数值评价所涉及的组织内预计的大分子转运。

24.实施方案21-23的DCE-MRI方法，其中评估的参数选自：f_PV、K^trans、AVGENH、AUC、AUCE、IAUC_T、IAUCE_T、EARLYAUCRATIO和LATEAUCRATIO。

25.实施方案24的DCE-MRI方法，其中测定的参数选自K^trans、AVGENH、AUC和AUCE或其组合。

26.实施方案18－22任一项的DCE-MRI方法，包括：

a)获取所述造影剂在所涉及的病理性身体区域、组织、部位或肿块内通过期间的DCE-MRI图像集合和任选的另外的具有良好解剖学分辨率的MRI图像；鉴定所关注的部位，典型地是肿瘤部位、参比部位和任选的在采集的DCE-MRI图像内的血管部位；并且得到在所鉴定部位内的信号强度曲线；

b)任选地测定任意连续或不连续的所述造影剂施用与MRI获取结束之间的时间窗内的AVGENH和/或AUCE的值；

c)将步骤a)得到的MRI信号强度值转化成造影剂浓度值并且绘制浓度-时间曲线图；

d)任选地测定任意连续或不连续的所述造影剂施用与MRI获取结束之间的时间窗内的AUC的值；

e)用药代动力学模型拟合所述得到的浓度曲线，以得到K^trans评估值；

f)根据得到的K^trans、AVGENH、AUC和/或AUCE参数的评估值评价所关注的大分子溶质的递送。

27.实施方案26的DCE-MRI方法，其中基于定期在对整个病理性区域或肿瘤体积采样的步骤a)采集的DCE-MRI图像各自的关注的病理性部位(ROI)和参比健康部位中测定参数值。

28.实施方案27的DCE-MRI方法，还包括对各测定的DCE-MRI参数计算阈值，通过测定它们各自在采集的DCE-MRI图像的参比部位中基于定期测定的值的平均值(μ)和标准偏差(σ)来进行。

29.实施方案26的DCE-MRI方法，其中通过下列步骤确定评价：在步骤a)各自采集的DCE-MRI图像中识别那些显示超出了测定的阈值的相关参数值的病理性ROI(s)中的像素，且然后对来自对整个肿瘤体积或关注的病理性区域采样的所有DCE-MRI图像的病理性或肿瘤ROI(s)计算具有超过所述阈值的参数值的像素分数D。

30.实施方案29的DCE-MRI方法，还包括识别病理性区域或肿瘤，其中基于大分子溶质外渗和扩散的递送条件适合地满足恶性肿瘤，相反，基于得到的D值，这些恶性肿瘤展示出对使用大分子抗癌药物的药理学治疗的抗性，其中展示出对于大分子溶质的充分的渗透性的病理性区域或肿瘤部位是那些导致D值至少等于0.5的病理性区域或肿瘤部位。

31.实施方案26的DCE-MRI方法，还包括在步骤a)前的步骤1a)，该步骤涉及将有效量的顺磁性造影剂施用于需要的患者或该患者的器官或其他身体部位或组织。

32.实施方案26的DCE-MRI方法，包括得到信号强度曲线，该信号强度曲线来自通过用适量的顺磁性造影剂预处理的患者而获取的MRI图像集合；或者可选地来自通过用有效量的顺磁性造影剂适当处理患者且然后以数字方式储存在x射线断层摄影机的操作台储存器中或本地或远端数字资料储存设备中的获取的MRI图像集合。

33.实施方案21－32任一项的DCE-MRI方法，其中所关注的大分子溶质是大分子药物或前药。

34.实施方案21－33任一项的DCE-MRI方法，其中所述顺磁性造影剂选自顺磁性螯合配合物的生理学可接受的盐，所述顺磁性螯合配合物选自钆考酸、MS 325的钆配合物和AAZTA-去氧胆酸的钆配合物。

35.实施方案30的DCE-MRI方法，还包括鉴定对利用大分子药物或前药的抗癌疗法具有抗性的患者，对抗癌疗法具有抗性归因于所述大分子药物或前药在基于得到的D值的待治疗的肿瘤区域中的渗透力不足或受损。

36.实施方案35的DCE-MRI方法，其用于抗癌策略的选择、处置和优化，所述抗癌策略使用大分子药物或前药单独地或与其他协同作用的活性剂组合，所述与其他协同作用的活性剂包括致力于增强大分子药物吸收的任意活性剂或药物，该方法还用于监测吸收增强活性剂或药物或包括它们之一的疗法或联合疗法的有效性。

Claims (12)

1.顺磁性造影剂在制备药物中的用途，所述顺磁性造影剂具有800－3,000Da的分子量并且展示出等于或大于85％的与人血清白蛋白HSA的非共价蛋白结合，该药物用于区分使用大分子药物或前药治疗的合格的肿瘤患者与注定对这种治疗展示出抗性的患者的预测方法中，其中通过使用DCE-MRI技术获得的HSA局部递送的体内定量获得关注的大分子药物或前药的预期递送入病理性身体区域、部位、组织或肿块的体内非侵害性定量评价，其中所述顺磁性造影剂选自下述的生理学可接受的盐：钆考酸的顺磁性螯合配合物、MS 325的钆配合物和AAZTA-去氧胆酸的钆配合物。

2.权利要求1的用途，其中所述定量评价包括得到与所述造影剂在病理性身体区域、部位、组织或肿块内展示出的药代动力学相关的参数的体内DCE-MRI评估值。

3.权利要求2的用途，其中所述定量评价包括：

a)得到在所述造影剂在病理性身体区域、部位、组织或肿块内通过期间获取的MRI图像集合并且从获取的MRI图像计算造影剂浓度-时间分布图；

b)从所计算的浓度-时间分布图中衍生与所述造影剂在所述病理性身体区域、部位、组织或肿块内展示出的药代动力学相关的数值参数；和

c)从计算的参数值评价所涉及的组织内预计的大分子递送。

4.权利要求3的用途，其中测定的参数选自f_PV、K^trans、AVGENH、AUC、AUCE、IAUC_T、IAUCE_T、EARLYAUCRATIO和LATEAUCRATIO。

5.权利要求2-4中任一项的用途，其中所述定量评价包括：

a)获取所述造影剂在所涉及的病理性身体区域、组织、部位或肿块内通过期间的DCE-MRI图像集合和任选的另外的具有良好解剖学分辨率的MRI图像；鉴定至少一种所关注的部位，典型地是肿瘤部位、参比部位和任选的在采集的DCE-MRI图像内的血管部位；并且得到在所鉴定部位内的信号强度曲线；

b)任选地测定所述造影剂施用与MRI获取结束之间的任意连续或不连续的时间窗内的AVGENH和/或AUCE的值；

c)将步骤a)得到的MRI信号强度值转化成造影剂浓度值并且绘制浓度-时间曲线图；

d)任选地测定所述造影剂施用与MRI获取结束之间的任意连续或不连续的时间窗内的AUC的值；

e)用药代动力学模型拟合所述得到的浓度曲线，以得到K^trans评估值；和

f)根据得到的评估参数的评估值评价所关注的大分子药物或前药的预期递送。

6.权利要求2－5任一项的用途，其中基于定期在对整个病理性区域采样的DCE-MRI图像集合的关注的病理性部位(ROI)中测定参数和独立地在参比健康部位中测定参数。

7.权利要求6的用途，其中所述非侵害性评价通过下列步骤进行：计算参比部位中测定的参数各自的阈值，且然后在各自采集的DCE-MRI图像中识别那些显示超出了测定的阈值的相关参数值的病理性ROI(s)中的像素。

8.权利要求7的用途，其中根据显示超出阈值的参数值的像素的分数D计算关注的大分子药物或前药的预期递送的评估值。

9.权利要求1－8任一项的用途，其中所述大分子药物或前药具有等于或大于50kDa的分子量。

10.权利要求9的用途，其中所述大分子药物或前药是大分子抗癌药物或前药，所述大分子抗癌药物或前药选自基于抗体或抗体片段的抗癌药物。

11.权利要求8－10任一项的用途，进一步包括基于D的测量值识别病理性身体区域、组织、部位或肿瘤块,其中基于大分子药物或前药外渗和扩散的递送条件被恶性肿瘤适当地满足，所述恶性肿瘤相反地展示出对使用大分子抗癌药物或前药的药理学治疗的渗透抗性，其中使得D值大于0.5的病理性区域或肿瘤部位被认为展示出对于大分子药物或前药的充分的渗透性。

12.上述权利要求任一项的用途，其中所述药物用于对肿瘤患者分层次的方案或预测方法，所述肿瘤患者被注定对利用大分子药物或前药的抗癌疗法具有抗性，这种抗性归因于在待治疗的病理性部位或肿瘤块中所述大分子药物或前药的渗透力不足或受损。

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