CN110836967A - 一种基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒 - Google Patents
一种基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述试剂盒包括DNA1‑cPL抗体1偶联物、DNA2‑cPL抗体2偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3和氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)。利用本发明的试剂盒进行检测，其操作简单、结果准确、耗时短、精密度高，并且能够定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及化学发光免疫分析法技术领域，特别是涉及一种基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒。
背景技术
犬急性胰腺炎是临床上对犬危害较大的一种内科疾病，急性胰腺炎发病急、病程短、临床症状严重、难以治愈，甚至导致死亡。有很多急性病例由于未得到确切的诊断，耽误治疗而发展为慢性或亚漫性胰腺炎。病情反复发作，给患犬带来极大的痛苦，也给犬主带来了很多麻烦。
现在国内外的兽医临床上，对急性胰腺炎的诊断主要是依靠体检和实验室诊断指标相结合的办法，但是大量的临床统计数据包括病史调查、光检查、超声检查等在内的体检方法对犬胰腺炎的诊断特异性和敏感性均不强，无法单纯通过这些方法建立对犬急性胰腺炎的准确诊断。在人医上现在有研究开始检测来源于胰腺的胰淀粉酶来进行检测，试验证实其对人急性胰腺炎的特异性增高，但是目前还没有见到对犬进行该项检测的效果评估报告，其具体特异性和敏感性还有待进一步证实。
而现在随着国内兽医对胰腺炎的了解加深和可用医疗资源的增多，在临床上使用脂肪酶进行胰腺炎筛查的比例逐渐增加。但是现在有兽医的研究结果称因为在犬的体内有很多不同的细胞会合成和分泌脂肪酶，而以往一直使用的化学催化检测法所测试的脂肪酶是来源于不同细胞的脂肪酶总和，因而在胰腺外的细胞出现病变时也可见到脂肪酶浓度升高，脂肪酶对犬急性胰腺炎的诊断特异性仅为50％左右。
目前，国内外公司已经研发出几种犬胰脂肪酶(cPL)的检测方法，例如酶联免疫吸附实验法(美国IDEXX)，荧光免疫层析法(韩国Bionote)。IDEXX ELISA由于其需要显色观察结果，灵敏度不够；荧光免疫层析法属于半定量检测，结果准确度不高。迫切需要精准、快速和定量的犬胰脂肪酶(cPL)检测产品，化学发光法是最好的选择，尤其是均相化学发光法。
由此可见，上述现有的犬胰脂肪酶在检测方法与使用上，显然仍存在有不便与缺陷，而亟待加以进一步改进。为了解决犬胰脂肪酶的检测方法中存在的问题，相关厂商莫不费尽心思来谋求解决之道，但长久以来一直未见适用的设计被发展完成，而一般方又没有适切的方法能够解决上述问题，此显然是相关业者急欲解决的问题。
有鉴于上述现有的犬胰脂肪酶的检测方法中存在的缺陷，本发明人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种新的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，能够改进一般现有的检测方法，使其更具有实用性。经过不断的研究、设计，并经反复试作及改进后，终于创设出确具实用价值的本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于，克服现有的检测方法中存在的缺陷，而提供一种新的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，所要解决的技术问题是使其检测结果精准、快速并且能够定量，从而更加适于实用，且具有产业上的利用价值。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
依据本发明提出的一种基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述试剂盒包括DNA1-cPL抗体1偶联物、DNA2-cPL抗体2偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3和氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)。
前述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA1-cPL抗体1偶联物的浓度为1～20nM；所述DNA2-cPL抗体2偶联物的浓度为1～20nM；所述标记吖啶酯(AE)的DNA3的浓度为0.05～0.2μM；以及所述氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)的浓度为20μg/ml。
前述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA1-cPL抗体1偶联物的浓度为10nM；所述DNA2-cPL抗体2偶联物的浓度为10nM；所述标记吖啶酯(AE)的DNA3的浓度为0.15μM。
前述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA1含有54个碱基，3’端修饰NH2C7，通过偶联剂二(磺基琥珀)辛二酸(BS3)与cPL抗体1上的氨基共价结合，形成DNA1-cPL抗体1偶联物。
前述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA2含有52个碱基，5’端修饰NH2C6，通过偶联剂BS3与cPL抗体2上的氨基共价结合，形成DNA2-cPL抗体2偶联物。
前述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA3含有21个碱基，5’端修饰吖啶酯衍生物(AE)；所述DNA3从5’端开始的3-10与所述DNA2从3’端开始的3-10碱基位点的碱基互补；所述DNA3从3’端开始的5-12与所述DNA1从5’端开始的3-10碱基位点的碱基互补。
前述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA1与所述DNA2有7个碱基互补。
前述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA3分别有8个碱基与所述DNA1、所述DNA2互补。
前述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA1的序列(5’-3’)如下：ACGCTGAGTTATCAACGACTTTTTTTATCACATCAGGCTCTAGCGTATGCTATTG-NH2C7；
所述DNA2序列(5’-3’)如下：NH2C6-TACGTCCAGAACTTTACCAAACCACACCCTTTTTTTGTCGTTGGCTGAGATTC；
所述DNA3序列(5’-3’)如下：AE-NH2C6-CGATCTCAGCAACTCAGCAGCG。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。
依据本发明提出的一种应用如上所述的试剂盒检测犬胰脂肪酶的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(1)将不同浓度的校准溶液或者含有cPL抗原的全血样本与试剂盒中的检测液按照体积比为1:10的量混合，将混合液置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃下温育5min；
(2)在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s，根据记录的化学发光值(RLU)，获得cPL抗原的校准曲线和待测样本中cPL抗原的浓度。
借由上述技术方案，本发明(名称)至少具有下列优点：本发明的试剂盒操作简单，可以全血上样，在5分钟左右出检测报告，大大缩短了临床检验标本周转时间(TAT)，适合兽医急诊检测需求。使用本发明的试剂盒在基于均相化学发光免疫分析法的基础上检测犬胰脂肪酶，能够实现样品的定量检测，其结果准确，精密度高，耗时短。
综上所述，本发明特殊的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，能够有效解决现有技术中检测犬胰脂肪酶的方法中存在的检测结果准确度不高、灵敏度不够的问题。其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类方法中未见有类似的设计公开发表或使用而确属创新，其不论在方法上或功能上皆有较大的改进，在技术上有较大的进步，并产生了好用及实用的效果，且较现有技术具有增进的多项功效，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值，诚为一新颖、进步、实用的新设计。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
本发明的具体方法及组成由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1示出了本发明基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒检测犬胰脂肪酶的原理图；
图2示出了本发明中DNA3和DNA1、DNA2互补配对图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒其具体实施方式、方法、步骤、结构、特征及其功效，详细说明如后。
如本文所述，本发明的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其包括DNA1-cPL抗体1偶联物、DNA2-cPL抗体2偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3和氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)。
其中，DNA1含有54个碱基，3’端修饰NH2C7，通过偶联剂二(磺基琥珀)辛二酸(BS3)与cPL抗体1上的氨基共价结合，形成DNA1-cPL抗体1偶联物；DNA2含有52个碱基，5’端修饰NH2C6，通过偶联剂BS3与cPL抗体2上的氨基共价结合，形成DNA2-cPL抗体2偶联物；DNA3含有21个碱基，5’端修饰吖啶酯衍生物(AE)；DNA3从5’端开始的3-10与DNA2从3’端开始的3-10碱基位点的碱基互补；DNA3从3’端开始的5-12与DNA1从5’端开始的3-10碱基位点的碱基互补。DNA1与DNA2有7个碱基互补；DNA3分别有8个碱基与DNA1、DNA2互补。抗氧化剂(AOD)包括但不限于大麻二酚、维生素C、维生素E、茶多酚、谷胱甘肽等。氧化石墨烯偶联AOD：氧化石墨烯上的羧基通过氧化亚砜缩合剂与AOD上羟基结合；氧化石墨烯上的羧基通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化与AOD上氨基结合。
具体而言，DNA1的序列(5’-3’)如下：ACGCTGAGTTATCAACGACTTTTTTTATCACATCAGGCTCTAGCGTATGCTATTG-NH2C7；DNA2序列(5’-3’)如下：NH2C6-TACGTCCAGAACTTTACCAAACCACACCCTTTTTTTGTCGTTGGCTGAGATTC；DNA3序列(5’-3’)如下：AE-NH2C6-CGATCTCAGCAACTCAGCAGCG。
具体的检测方法如下：
1、将全血//血清/血浆/其它样本和检测试剂混合，并在37℃条件下温育5-10分钟；
2、加入化学发光底物，通过化学发光检测仪中PMT检测模块进行光信号采集；
3、仪器自动调用标准曲线，从而报出样品中物质的浓度。
实施例1
配置检测试剂：将DNA1-cPL抗体1偶联物、DNA2-cPL抗体2偶联物、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为1nM、1nM、0.05μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、50、100、200、400、1000、2000ng/ml)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得cPL抗原的校准曲线和待测样本中cPL抗原的浓度。具体结果见表1。
实施例2
配置检测试剂：将DNA1-cPL抗体1偶联物、DNA2-cPL抗体2偶联物、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为5nM、5nM、0.1μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、50、100、200、400、1000、2000ng/ml)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得cPL抗原的校准曲线和待测样本中cPL抗原的浓度。具体结果见表1。
实施例3
配置检测试剂：将DNA1-cPL抗体1偶联物、DNA2-cPL抗体2偶联物、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为1 0nM、10nM、0.15μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、50、100、200、400、1000、2000ng/ml)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得cPL抗原的校准曲线和待测样本中cPL抗原的浓度。具体结果见表1。
实施例4
配置检测试剂：将DNA1-cPL抗体1偶联物、DNA2-cPL抗体2偶联物、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为20nM、20nM、0.2μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、50、100、200、400、1000、2000ng/ml)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得cPL抗原的校准曲线和待测样本中cPL抗原的浓度。具体结果见表1。
表1.不同试剂盒检测液浓度下，不同浓度的标准溶液所得到的RLU(发光值)及S/S0(信噪比)数据比较。
基于表1的数据可知，利用本发明的试剂盒并结合均相化学发光免疫分析法技术，即：在同一检测液的情况下，随着检测样品溶液的浓度的增加，RLU(发光值)和S/S0(信噪比)均呈上升趋势；在同一检测样品溶液浓度的情况下，检测液中各物质浓度分别为10nM、10nM、0.15μM和20μg/ml的情况下，RLU(发光值)和S/S0(信噪比)数据最优。
综上所述，本发明的试剂盒操作简单，可以全血上样，在5分钟左右出检测报告，大大缩短了临床检验标本周转时间(TAT)，适合兽医急诊检测需求。使用本发明的试剂盒在基于均相化学发光免疫分析法的基础上检测犬胰脂肪酶，能够实现样品的定量检测，其结果准确，精密度高，耗时短。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述试剂盒包括DNA1-cPL抗体1偶联物、DNA2-cPL抗体2偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3和氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)。
2.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA1-cPL抗体1偶联物的浓度为1～20nM；所述DNA2-cPL抗体2偶联物的浓度为1～20nM；所述标记吖啶酯(AE)的DNA3的浓度为0.05～0.2μM；以及所述氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)的浓度为20μg/ml。
3.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA1-cPL抗体1偶联物的浓度为10nM；所述DNA2-cPL抗体2偶联物的浓度为10nM；所述标记吖啶酯(AE)的DNA3的浓度为0.15μM。
4.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA1含有54个碱基，3’端修饰NH2C7，通过偶联剂二(磺基琥珀)辛二酸(BS3)与cPL抗体1上的氨基共价结合，形成DNA1-cPL抗体1偶联物。
5.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA2含有52个碱基，5’端修饰NH2C6，通过偶联剂BS3与cPL抗体2上的氨基共价结合，形成DNA2-cPL抗体2偶联物。
6.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA3含有21个碱基，5’端修饰吖啶酯衍生物(AE)；所述DNA3从5’端开始的3-10与所述DNA2从3’端开始的3-10碱基位点的碱基互补；所述DNA3从3’端开始的5-12与所述DNA1从5’端开始的3-10碱基位点的碱基互补。
7.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA1与所述DNA2有7个碱基互补。
8.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA3分别有8个碱基与所述DNA1、所述DNA2互补。
9.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫分析法检测犬胰脂肪酶的试剂盒，其中，所述DNA1的序列(5’-3’)如下：ACGCTGAGTTATCAACGACTTTTTTTATCACATCAGGCTCTAGCGTATGCTATTG-NH2C7；
所述DNA2序列(5’-3’)如下：NH2C6-TACGTCCAGAACTTTACCAAACCACACCCTTTTTTTGTCGTTGGCTGAGATTC；
所述DNA3序列(5’-3’)如下：AE-NH2C6-CGATCTCAGCAACTCAGCAGCG。
10.一种应用权利要求1-9中任一项所述的试剂盒检测犬胰脂肪酶的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(1)将不同浓度的校准溶液或者含有cPL抗原的全血样本与试剂盒中的检测液按照体积比为1:10的量混合，混合液置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃下温育5min；
(2)在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s，根据记录的化学发光值(RLU)，获得cPL抗原的校准曲线和待测样本中cPL抗原的浓度。
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