CN110809718A - 利用血液生物标志物诊断肌肉衰弱相关疾病的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒包含用于测量凝溶胶蛋白和四连接素的表达水平的试剂，并且本发明涉及通过使用所述组合物和试剂盒来诊断肌肉衰弱相关疾病的方法。根据本发明的用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物、试剂盒和方法使得可以通过分子诊断以容易和快速的方式诊断肌肉衰弱相关疾病，从而系统地管理肌肉衰弱相关疾病，同时提高针对肌肉衰弱相关疾病的治疗功效。

Description

利用血液生物标志物诊断肌肉衰弱相关疾病的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物和试剂盒，该组合物和试剂盒包含用于测量凝溶胶蛋白或四连接素的表达水平的试剂，并且本发明涉及通过使用所述组合物和试剂盒来诊断肌肉衰弱相关疾病的方法。
背景技术
每个人的肌肉质量在50至70岁时减少约10％至15％，在70至80岁时减少至少30％，这会导致肌肉力量和功能下降。特别地，肌肉减少症是指由于衰老而导致的肌肉力量的减少和骨骼肌质量的减少。肌肉减少症最重要的特征不仅是肌肉质量的减少，而且还观察到了肌纤维类型的变化。1型和2型肌纤维的厚度以相似的速率下降，而在肌肉减少症下，2型肌纤维的厚度没有明显变化，但1型肌纤维的厚度却明显减小。据报道，这种肌肉减少症在老年人中引起衰老和功能障碍(Roubenoff R.,Can.J.Appl.Physiol.26,78-89,2001)。
导致肌肉衰弱的疾病包括：随年龄发展的肌肉减少症；由蛋白质代谢失衡和肌肉使用减少引起的肌肉萎缩；肌营养不良症；恶病质；和随着饥饿、衰弱疾病(例如癌症等)和衰老而发展的心肌萎缩(acardiotrophy)。
肌肉萎缩或肌肉消耗可以定义为由于肌肉本身的疾病、控制肌肉的神经损伤或肌肉废用而发生的肌肉组织的消耗或损失。常见原因可能是由于肌肉废用而发生的所谓的“废用性萎缩”。即，在社交活动减少的人的情况下，肌张力本身降低，从而导致进行性萎缩。通过积极运动可以在某种程度上使这种萎缩恢复。
与此不同，如果一个人必须躺在床上，就会发生严重的肌肉消耗。此外，居住在没有重力(没有摩擦力)的地方的人也由于钙和肌肉力量减少而表现出肌肉力量下降的症状。
另外，除了废用以外的原因可以大致分为两种。
首先，由控制肌肉的神经损伤引起的肌肉萎缩包括以下疾病。
肌萎缩性侧索硬化症(ALS；也称为卢贾里格氏症(Lou Gehrig's disease))是一种由于使肌肉移动的运动神经周围的髓鞘异常而没有发生对肌肉的神经传导，造成肌肉运动性丧失，从而导致肌肉萎缩的疾病。吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)(急性炎症性脱髓鞘性多神经病)是一种类似ALS的由于髓鞘的结构缺陷而发生在儿童中的疾病。吉兰-巴雷综合征是一种从腿部肌肉开始渐进爬升至上身肌肉，最终使呼吸肌(隔膜肌)瘫痪，导致由于呼吸困难而死亡的疾病。
第二，由肌肉疾病引起的肌肉萎缩本身包括以下疾病。
重症肌无力是一种导致将电信号传输至肌纤维的神经递质乙酰胆碱传输异常的疾病。发生这种疾病的原因是，由于突触后肌纤维中乙酰胆碱受体的先天性或获得性缺乏或抗体攻击引起的受体数量减少，神经冲动没有传递至肌肉。
肌营养不良症是一种发生在肌肉本身中而不会损害中枢神经系统或周围神经系统的遗传性疾病。这种疾病仅在出生后一年或一年半内就可以被诊断出来，但在大多数情况下在2至4岁时出现，在某些情况下也可能会在成熟年龄出现。肌营养不良症是指30多种遗传性疾病的集合，这些遗传性疾病会导致在自主运动中使用的骨骼肌渐进性衰弱和退化。在所有类型的肌营养不良症中，肌肉渐进性退化和衰弱，最终许多患者失去行走能力。
这种肌营养不良症分为九大类。具体地，根据肌肉衰弱的程度和分布、发作的年龄、进展速度、症状的严重程度、家族史等将肌营养不良症分为杜氏肌营养不良症、贝克尔肌营养不良症、肢带肌营养不良症、埃-德二氏肌营养不良症(Emery-Dreifuss musculardystrophy)、面肩胛肱型肌营养不良症、强直性肌营养不良症、眼咽肌营养不良症、远端肌营养不良症和先天性肌营养不良症。
恶病质或消耗综合症的特征是体重减轻、肌肉萎缩疲劳、虚弱、食欲降低等。在恶病质的情况下，即使摄入营养也不能使体重减轻得到恢复。恶病质可能发生在患有癌症、AIDS、乳糜泻、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多发性硬化症、充血性心力衰竭、肺结核、家族性淀粉样多神经病、汞中毒(肢端疼痛)和激素缺乏等疾病的患者中。恶病质在这些患者中的发生可被认为是患者疾病严重程度的增加，并且患有恶病质的患者由于虚弱和疲劳的增加而可能使不活动性增加，并且他们可能无法有效响应常规治疗。肌肉减少症也是恶病质的病理症状。
肌肉减少症是由多种因素引起的，但是对每种因素的研究仍然不足。它是由生长激素的减少或神经学改变，生理活动的改变，新陈代谢的改变，性激素、脂肪或分解代谢性细胞因子的数量增加，以及蛋白质的合成和分化之间的平衡变化所引起的(RoubenoffR.and Hughes V.A.,J.Gerontol.A.Biol.Sci.Med.Sci.55,M716-M724,2000)。
另外，由于人口老龄化，肌肉减少症正在迅速增加，并且最近已在ICD-10-CM(临床修订版)中进行了编号，分配了疾病代号M62.84，因此其重要性已经提高。但是，尚未开发出用于诊断可能在整个老年人群中出现的肌肉老化的测试工具。目前，使用物理测试(手握力度、步行速度等)和双能X射线吸收计量法(DEXA)射线照相术(或CT)作为测试工具。但是，上述测试的问题在于它们非常不方便，引起辐射危害，并且不经济。
因此，迫切需要研究和开发能够通过分子诊断工具代替如上所述的常规方法来以简单的方式诊断包括肌肉减少症的肌肉衰弱相关疾病的方法。
现有技术文献
专利文件
KR 10-2015-0131556(2005年11月25日)；
KR 10-2011-0001068(2011年1月6日)。
发明内容
技术问题
本发明涉及用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物，所述组合物包含用于测量四连接素蛋白表达水平的试剂。
本发明还涉及用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物，所述组合物包含用于测量凝溶胶蛋白表达水平的试剂。
本发明还涉及用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物，所述组合物包含用于测量四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平的试剂。
本发明还涉及用于诊断肌肉衰弱相关疾病的试剂盒，所述试剂盒包含用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物，所述组合物包含用于测量四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平的试剂。
本发明还涉及用于提供诊断肌肉衰弱相关疾病的信息的方法，该方法包括以下步骤：(a)测量获自对象的生物样品中四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平；和(b)当四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平高于正常组时，确定该对象患有肌肉衰弱相关疾病。
本发明还涉及用于提供诊断肌肉衰弱相关疾病的信息的方法，该方法包括以下步骤：(a)测量从对象获得的生物样品中的四连接素、凝溶胶蛋白和以下任何一种或多种蛋白的表达水平，该一种或多种蛋白选自巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白介素6(IL-6)、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)；(b)根据步骤(a)中测得的表达水平计算风险评分；(c)将计算出的风险评分与参考水平进行比较，当风险评分等于或高于参考水平时，确定对象患有肌肉衰弱相关疾病。
技术方案
通过分子诊断技术而非诸如物理测试或射线照相术的方法，本发明人已经为诊断肌肉衰弱相关疾病做出了大量的努力，结果发现，可以通过测量血液中的凝溶胶蛋白或四连接素蛋白的浓度并根据测得的蛋白浓度计算风险评分来诊断肌肉衰弱相关疾病，从而完成了本发明。
本发明旨在提供用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物，该组合物包含用于测量四连接素蛋白表达水平的试剂。
四连接素是属于C型凝集素结构域家族的血浆蛋白，由CLEC3B基因编码，并且由四条多肽链组成，每条多肽链由181个氨基酸组成(基因序列：NM_001308394；氨基酸序列：NP_001295323)。
根据本发明的用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物的使用使得可以通过测量四连接素的表达水平的变化来以高准确性诊断肌肉衰弱相关疾病。
本发明还旨在提供用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物，该组合物包含用于测量凝溶胶蛋白的表达水平的试剂。
凝溶胶蛋白是肌动蛋白结合蛋白，由六个亚结构域组成，分子量约为82kDa(基因序列：NM_000177；氨基酸序列：NP_000168)。
根据本发明的用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物的使用使得可以通过测量凝溶胶蛋白的表达水平的变化来以高准确性诊断肌肉衰弱相关疾病。
本发明还旨在提供用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物，该组合物包含用于测量四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平的试剂。根据本发明的用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物的使用使得可以通过测量四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平的变化，以比四连接素和凝溶胶蛋白的单一标志物显著更高的准确性来诊断肌肉衰弱相关疾病。
如本文所用，术语“肌肉衰弱相关疾病”是指一种病症，该病症中一块或多块肌肉的力量降低。肌肉衰弱可以限于任何一块肌肉、身体的任一侧、上肢或下肢等，并且也可以出现在整个身体中。此外，可以通过身体检查以客观方式量化包括肌肉疲劳疼痛的主观肌肉衰弱症状。
本发明中肌肉衰弱相关疾病是指可由肌肉衰弱引起的所有疾病。例如，肌肉衰弱相关疾病可以是选自肌肉减少症、肌肉萎缩、肌营养不良症、恶病质和心肌萎缩中的任何一种或多种，但不限于此。根据本发明的一种实施方式，肌肉衰弱相关疾病可以是肌肉减少症或肌肉萎缩。
本发明中的肌肉减少症是指由于衰老而导致的肌肉力量降低伴随骨骼肌质量降低。例如，肌肉减少症是指由衰老引起的疾病，例如肌肉量减少、肌纤维类型的改变和肌纤维厚度的减少。
本发明中的肌肉萎缩是指这样的疾病：四肢的肌肉几乎匀称地持续收缩，并且是由于肌肉本身的疾病、控制肌肉的神经损伤或肌肉废用而发生的肌肉组织的消耗或损失。具体地，肌肉萎缩包括肌肉废用性萎缩、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓进行性肌萎缩(SPMA)、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力等。
本发明中的肌营养不良症是指发生在肌肉本身中而不会损害中枢神经系统或周围神经系统的遗传性疾病。这种疾病可以仅在出生后一年或一年半内被诊断出来，但在大多数情况下在2至4岁时出现，在某些情况下也可能会在成熟年龄出现。肌营养不良症是指30多种遗传性疾病的集合，这些遗传性疾病会导致在自主运动中使用的骨骼肌的渐进性衰弱和退化。
本发明中的恶病质是指高度的全身虚弱，恶病质的特征是体重减轻、肌肉萎缩、疲劳、虚弱、食欲降低等，并且在恶病质中即使通过摄取营养也不能使体重减轻得到恢复。
本发明的心肌萎缩是指由于外部或内部因素引起的心脏萎缩。由于饥饿、衰竭性疾病或衰老，心肌纤维变得更薄更细，从而导致引起脂肪组织减少的心脏褐色萎缩。
如本文所用，术语“诊断”包括对象对特定疾病或病症的易感性的确定，对象当前是否受到特定疾病或病症的影响的确定，确定受特定疾病或病症影响的对象的预后，以及治疗法(therametrics)的使用(例如，监测对象的状况以提供有关治疗效果或功效的信息)。为了本发明的目的，诊断包括确定肌肉衰弱相关疾病是否会发展、确定发展该疾病的可能性(风险)、以及疾病的进展程度等。
如本文所用，术语“生物标志物”、“标志物”或“诊断标志物”是指能够区分正常和病理状况或预测和客观测量治疗反应的标志物。特别地，就本发明中的肌肉衰弱相关疾病而言，该术语是指蛋白质表达水平或基因表达水平在患有肌肉衰弱相关疾病或有发展为肌肉衰弱风险的个体中与正常对照(没有肌肉衰弱相关疾病的个体)相比显著升高或降低的标志物。
如本文所用，“测量蛋白质的表达水平”是指为了诊断肌肉衰弱相关疾病，确定肌肉衰弱相关疾病诊断标志物(蛋白质)或编码该标志物的基因在生物样品中的存在和表达水平的过程。
如上所述的用于测量蛋白质表达的试剂包括抗体、底物、肽适体、与标志物特异性相互作用的受体、配体、辅因子等。具体地，该试剂包括对由基因编码的蛋白质具有特异性的抗体，所述抗体是指针对抗原位点的特异性蛋白质分子，并且包括所有多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体等。
蛋白质表达水平的测量可以使用本领域已知的定量和定性蛋白质分析方法来进行。这些分析方法的示例包括但不限于酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选(FACS)、质谱分析、MRM(多重反应监测)测定、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定(iTRAQ，同位素标记相对和绝对定量)、蛋白质芯片测定等。
根据本发明的包含用于测量四连接素、凝溶胶蛋白、或四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平的试剂的用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物可以进一步包含用于测量选自巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白介素6(IL-6)、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)中的任何一种或多种蛋白质的表达水平的试剂。
当本发明的组合物进一步包含用于测量MIF、IL-6、SPARC或IGF-1的表达水平的试剂时，该组合物可以以高特异性和灵敏性更准确地诊断肌肉衰弱相关疾病。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是由115个氨基酸组成并且分子量为12.5kDa的二聚体多肽，并且是一类淋巴因子(基因序列：NM_002415.1；氨基酸序列：NP_002406.1)。
白介素6(IL-6)是诱导B细胞最终分化为产生抗体的细胞的B细胞刺激物2(BSF-2)，并且是由183个氨基酸组成且分子量为22至28kDa的糖蛋白。它也是在包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等的各种细胞中产生的细胞因子(基因序列：NM_000600.4；氨基酸序列：NP_000591.1)。
SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)，也称为BM-40，是一种由286个氨基酸组成的43kDa蛋白质，也是一种参与细胞黏附和运动、细胞分化、细胞增殖、血管形成等的基质细胞糖蛋白(基因序列：NM_003118.3；氨基酸序列：NP_003109.1)。
胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，也称为生长调节素C，是一种由70个氨基酸组成的7,649Da的蛋白，并且对儿童生长、成年人同化作用等具有影响的蛋白质(基因序列：NM_000618.4；氨基酸序列：NP_000609.1)。
在本发明中，肌肉减少症患者组中四连接素、凝溶胶蛋白、MIF、IL-6和SPARC的表达水平可以显著高于正常组，而肌肉减少症患者组中IGF-1蛋白的表达水平可以显著低于正常组。肌肉减少症患者组比正常组少。
本发明还提供了用于诊断肌肉衰弱相关疾病的试剂盒，该试剂盒包含用于诊断肌肉衰弱相关疾病的诊断的组合物，所述组合物包含用于测量四连接素、凝溶胶蛋白、或四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平的试剂。
具体地，该试剂盒可以是用于诊断肌肉衰弱相关疾病的试剂盒，该试剂盒包含用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物，所述组合物还包含用于测量选自巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白介素6(IL-6)、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)、和胰岛素样生长因子1(IGF-1)中的任何一种或多种蛋白质的表达水平的试剂。
在根据本发明的用于诊断肌肉衰弱相关疾病的试剂盒中，肌肉衰弱相关疾病可以是选自肌肉减少症、肌肉萎缩、肌营养不良症、恶病质和心肌萎缩中的任何一种或多种，但是不限于此。根据本发明的一种实施方式，肌肉衰弱相关疾病可以是肌肉减少症或肌肉萎缩。
根据本发明的用于诊断肌肉衰弱相关疾病的试剂盒可以通过定量或定性分析蛋白质来诊断肌肉衰弱相关疾病。蛋白质的测量可以使用诸如酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选(FACS)、质谱分析、MRM(多重反应监测)测定、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定(iTRAQ，同位素标记相对和绝对定量)、蛋白质芯片测定等方法进行。
例如，根据本发明的用于诊断的试剂盒可包含进行ELISA所需的必需元件。ELISA试剂盒包含对蛋白质具有特异性的抗体。该抗体是对标志物蛋白具有高特异性和亲和性，并且与其他蛋白有极少或没有交叉反应的单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。另外，ELISA试剂盒可包含对对照蛋白具有特异性的抗体。另外，ELISA试剂盒还可包含可检测结合的抗体的试剂，例如，标记的二抗、生色团、酶(例如与抗体缀合)及其底物或能够结合抗体的其他物质。
本发明还提供了一种用于提供诊断肌肉衰弱相关疾病的信息的方法，该方法包括以下步骤：(a)测量从对象获得的生物样品中四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平；和(b)当四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平高于正常组时，确定该对象患有肌肉衰弱相关疾病。
如本文所用，步骤(a)中的术语“生物样品”包括由于肌肉衰弱相关疾病而显示出蛋白质或基因表达差异的样品。具体而言，该术语是指血液、血清或血浆。生物样品可以是从人体分离的生物样品。
在步骤(a)中测量蛋白质表达的方法包括但不限于酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选(FACS)、质谱分析、MRM(多重反应监测)测定、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定(iTRAQ，同位素标记相对和绝对定量)、蛋白质芯片测定等。
步骤(b)中的“正常组”包括尚未发展肌肉衰弱相关疾病或已从该疾病中恢复的组，包括未患肌肉衰弱相关疾病的正常组以及已从肌肉衰弱相关疾病中恢复且肌肉质量和肌纤维保持在正常组所示的水平的组。根据本发明，当四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平高于正常组中的表达水平时，可以将该对象分类为患有肌肉衰弱相关疾病的患者组。
本发明还提供一种用于提供信息以诊断肌肉衰弱相关疾病的方法，该方法包括以下步骤：(a)测量从对象获得的生物样品中的四连接素、凝溶胶蛋白和选自巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白介素6(IL-6)、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)和胰岛素样生长因子(IGF-1)中的任何一种或多种蛋白的表达水平；(b)根据步骤(a)中测得的表达水平计算风险评分；(c)将计算出的风险评分与参考水平进行比较，当风险评分等于或高于参考水平时，确定对象患有肌肉衰弱相关疾病。
在本发明中，当进行测量MIF、IL-6、SPARC或IGF-1的表达水平，再加上测量四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平的步骤(a)时，可以提供以显著提高的特异性和灵敏性诊断肌肉无力相关疾病的信息。
在测量生物样品中四连接素、凝溶胶蛋白以及选自巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白介素6(IL-6)、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)中的任何一种或多种蛋白的表达水平的步骤(a)中蛋白质表达水平的测量如上所述。
根据本发明的用于诊断肌肉衰弱相关疾病的方法包括基于步骤(a)中测得的蛋白表达水平计算风险评分的步骤(b)。基于MIF、IL-6、SPARC或IGF-1以及四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平，计算风险评分，从而诊断肌肉衰弱相关疾病。
风险评分可以基于预定参考水平值来计算。例如，参考水平可以是预先确定的，并且可以被设置为在特异性、灵敏度和/或准确性方面满足常规要求。例如，可以将灵敏性或特异性设置为某些极限，例如分别为60％、70％、80％、90％或95％。这些要求也可以根据正或负的预测值来限定。参考水平可以在来自健康个体(例如，没有肌肉衰弱相关疾病的相同年龄的正常组)的参考样品中预先确定，或者从患者所属的疾病实体预先确定。
在本发明中，可以使用统计分析方法例如平均值计算或ROC曲线分析来确定表达的参考水平。
使用显示诊断性能的曲线在灵敏性、特异性和准确性方面进行根据本发明的一种实施方式的ROC曲线分析。
当特异性和灵敏度都高时，测试结果的准确性提高。因此，ROC曲线中的x轴是1-特异性(假阳性率)，y轴是灵敏性(真阳性率)，指示准确性的AUC(曲线下面积)是指曲线下的面积。
根据本发明的一种实施方式，“参考水平”是显示对肌肉衰弱相关疾病的诊断的作用的阈值。
根据本发明的一种实施方式，对在正常组和疾病组中各自测量的每种蛋白质的浓度(表达水平)进行对数转换，然后乘以每种蛋白质相对应的线性回归系数以获得每种生物标志物的风险评分，并将灵敏性和特异性乘积的最大值确定为临界值。
另外，当将所测量的蛋白质的组合作为多个生物标志物应用时，可以通过校正每种蛋白质的风险评分来使多个生物标志物的风险评分标准化。具体而言，如以下方程式1所示，可以通过将单个标志物的风险评分的总和乘以与每种蛋白质相对应的线性回归系数来使多种生物标志物的风险得分标准化。
等式1
多种标志物的风险评分＝∑分子Mi的逻辑回归系数×log2转化的分子Mi的血清水平
根据本发明的用于诊断肌肉衰弱相关疾病的方法包括步骤(c)：将计算出的风险评分与参考水平进行比较，当风险评分等于或高于参考水平时，确定对象患有肌肉衰弱相关疾病。
如本文所用，术语“大于”或“高于”是指与参考样品中的表达水平相比，通过本文描述的方法检测的表达水平高于参考水平1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的水平或是指与参考样品中的表达水平相比，通过本文描述的方法检测的表达水平总体增加1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。如本文所用，术语“小于”或“低于”是指与参考样品中的表达水平相比，通过本文描述的方法检测的表达水平低于参考水平1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的水平或是指与参考样品中的表达水平相比，通过本文描述的方法检测的表达水平总体下降1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。
在确定对象患有肌肉衰弱相关疾病的步骤中，当风险得分等于或高于参考水平时，可以将从中获得样品的对象诊断为患有肌肉衰弱相关疾病。
有益效果
根据本发明的用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物使得可以通过分子诊断以容易和快速的方式诊断肌肉衰弱相关疾病，从而系统地管理肌肉衰弱相关疾病，同时增加针对肌肉衰弱相关疾病的治疗功效。
附图说明
图1显示了在正常对照组和肌肉减少症患者组中进行的血清MIF、IL-6、SPARC、IGF-1、凝溶胶蛋白和四连接素水平的ELISA结果。
图2描绘了接收者工作特征(ROC)图，其示出了正常对照组和肌肉减少症患者组的血清MIF、IL-6、SPARC、IGF-1、凝溶胶蛋白和四连接素水平。
图3示出了用两种生物标志物(凝溶胶蛋白和四连接素)的组合进行的ROC曲线分析以确认肌肉减少症患者的分类的结果。
图4示出了用三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和MIF)的组合进行的ROC曲线分析以确认肌肉减少症患者的分类的结果。
图5示出了用三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和IL-6)的组合进行的ROC曲线分析以确认肌肉减少症患者的分类的结果。
图6示出了用三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和SPARC)的组合进行的ROC曲线分析以确认肌肉减少症患者的分类的结果。
图7示出了用三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和IGF-1)的组合进行的ROC曲线分析以确认肌肉减少症患者的分类的结果。
图8示出了用六种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素、IL-6、SPARC、MIF和IGF-1)的组合进行的ROC曲线分析以确认肌肉减少症患者的分类的结果。
图9示出了测量肌肉萎缩小鼠模型中的血清凝溶胶蛋白和四连接素水平的ELISA结果。
具体实施方式
参考以下描述的实施例，本发明的优点和特征以及实现它们的方式将变得显而易见。然而，本发明不限于以下公开的实施例，并且可以以各种不同的形式来实施；相反，提供这些实施例是为了使本公开透彻和完整，并将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。本发明的范围将由所附权利要求书限定。
实施例1.测试对象的选择和血清蛋白水平的测量
为了开发利用血液生物标志物诊断肌肉衰弱相关疾病的方法，在60岁或以上的老年人中，选择肌肉质量正常的老年人和患有肌肉减少症的老年人作为试验对象。肌肉减少症的选择标准设定如下：
阑尾骨骼肌质量(ASM)–ASM(kg)/身高(m)2：男性<7.0kg/m2，女性<5.7kg/m2
为了测量血清蛋白，通过ELISA技术测量血清蛋白水平。具体而言，使用R&Dsystems Quantikine Elisa试剂盒(人IL-6，Cat#D6050；人MIF，Cat#DMF00B；人SPARC，Cat#DSP00；人IGF-1，DG100)和MyBioSource Elisa试剂盒(凝溶胶蛋白，Cat#MBS7228324；四连接素，Cat#MBS762655)，并使用每种试剂盒中提供的方案测量每种血清蛋白水平，从而确定四连接素、凝溶胶蛋白、MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)、IL-6(白介素6)、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)和IGF-1(胰岛素样生长因子-1)的血清水平。
实施例2.风险评分计算和统计分析
为了比较实施例1中测量的蛋白质水平，将每种蛋白质水平进行log2转化，并进行逻辑回归分析。
结果示于图1。
从图1中可以看出，在肌肉质量正常的老年人和患有肌肉减少症的老年人中，血清四连接素、凝溶胶蛋白、MIF、IL-6、SPARC和IGF-1的水平均存在显著差异。具体而言，肌肉质量正常的老年人的血清四连接素、凝溶胶蛋白、MIF、IL-6和SPARC的水平高于肌肉减少症患者组，而血清IGF-1水平在肌肉质量正常的老年人中较高。
此外，为了将测得的蛋白质作为多种生物标志物应用，根据每种血清蛋白质水平对肌肉减少症风险评分进行校正。具体而言，通过乘以与每种蛋白质相对应的线性回归系数以减少标志物之间的变量来计算每种蛋白质的风险评分。每种蛋白质的线性回归系数在图1中示出。多种标志物的风险评分定义为各个标志物的风险评分之和，并使用以下公式1计算：
等式1
多种标志物的风险评分＝∑分子Mi的逻辑回归系数×log2转化的分子Mi的血清水平
另外，每种蛋白质水平表示为接受者工作特征(ROC)图，结果示于图2。
从图2中可以看出，四连接素、凝溶胶蛋白、MIF、IL-6、SPARC和IGF-1均具有较高的灵敏性、特异性和AUC值，表明它们可作为诊断肌肉减少症的单一标志物。
此外，所有统计分析均使用GraphPad Prism5(GraphPad Software,Inc.,USA)和R语言环境(3.2.5版)进行。通过未配对双尾Student T检验对对照组和测试组之间的差异进行统计分析，并计算生物标志物组合的灵敏性和特异性，并使用ROC曲线计算AUC值。此外，将灵敏性和特异性乘积的最大值确定为截止值，P值<0.05确定为具有统计学意义。
实施例3.分析多种生物标志物对诊断的意义
(1)分析两种生物标志物(凝溶胶蛋白和四连接素)组合对诊断的意义
根据以上实施例2中描述的方法，分析了两种生物标志物(凝溶胶蛋白和四连接素)的组合对于诊断的意义。结果示于图3。
如图3所示，肌肉质量正常的老年人和患有肌肉减少症的老年人的两种生物标志物组合(凝溶胶蛋白和四连接素)的AUC值为0.741，灵敏性和特异性的乘积的最大值为0.549，截止值为2.512。
这些结果表明，根据本发明的两种生物标志物组合(凝溶胶蛋白和四连接素)可以以高准确性诊断肌肉减少症。
(2)分析三种生物标志物(包括凝溶胶蛋白和四连接素)的组合对诊断的意义
分析三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和MIF)组合对诊断的意义
根据以上实施例2中所述的方法，分析了三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和MIF)的组合对于诊断的意义。结果示于图4。
如图4所示，在肌肉质量正常的老年人和患有肌肉减少症的老年人中，三种生物标志物组合(凝溶胶蛋白、四连接素和MIF)的AUC值为0.813，灵敏性和特异性乘积的最大值为0.669，而截止值为3.886。
分析三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和IL-6)组合诊断的意义
根据以上实施例2中描述的方法，分析了三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和IL-6)的组合对于诊断的意义。结果示于图5。
如图5所示，在肌肉质量正常的老年人和患有肌肉减少症的老年人中，三种生物标志物组合(凝溶胶蛋白、四连接素和IL-6)的AUC值为0.822，灵敏性和特异性乘积的最大值为0.617，截止值为2.746。
分析三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和SPARC)组合对诊断的意义
根据以上实施例2中描述的方法，分析了三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和SPARC)的组合对于诊断的意义。结果示于图6。
如图6所示，在肌肉质量正常的老年人和患有肌肉减少症的老年人中，三种生物标志物组合(凝溶胶蛋白、四连接素和IL-6)的AUC值为0.788，灵敏性和特异性乘积的最大值为0.612，截止值为3.287。
分析三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和IGF-1)组合对诊断的意义
根据以上实施例2中描述的方法，分析了三种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素和SPARC)的组合对于诊断的意义。结果示于图7。
如图7所示，在肌肉质量正常的老年人和患有肌肉减少症的老年人中，三种生物标志物组合(凝溶胶蛋白、四连接素和IGF-1)的AUC值为0.776，灵敏性和特异性乘积的最大值为0.549，截止值为1.822。
这些结果表明，与凝溶胶蛋白和四连接素的两种生物标志物组合相比，包含MIF、IL-6、SPARC或IGF-1与凝溶胶蛋白和四连接素的三种生物标志物组合的AUC值显著增加。
(3)分析多种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素、IL-6、MIF、SPARC和IGF-1)的诊断意义
根据以上实施例2中所述的方法，分析了多种生物标志物(凝溶胶蛋白、四连接素、IL-6、MIF、SPARC和IGF-1)对诊断意义。结果如图8所示。
如图8所示，在肌肉质量正常的老年人和患有肌肉减少症的老年人中，凝溶胶蛋白、四连接素、IL-6、MIF、SPARC和IGF-1的总AUC值为0.877，这是最高的AUC值。另外，灵敏性和特异性的乘积的最大值为0.668，截止值为3.946。
从这些结果中发现，根据本发明的包括凝溶胶蛋白和四连接素的多种生物标志物均具有高灵敏性、特异性和AUC值，表明它们可以用作检测肌肉减少症的诊断生物标志物。
实施例4.肌肉萎缩小鼠模型的构建和标志物分析
为了诱导C57BL/6J雄性小鼠的肌肉萎缩(韩国生命工学研究院实验动物资源中心)，使用了TA(胫前肌)肌肉固定方法(Caron AZ,J Appl Physiol.106(6)2049-2059,2009)。此方法使用的原理是，当将腿放在石膏中并且使腿的肌肉固定(即不经常使用)时，肌肉会损失。这是一种诱导肌肉再生的方法，其中，在由于固定小腿肌肉而导致肌肉损失之后，通过释放固定的肌肉使肌肉再生，从而使肌肉可以再次运动。具体而言，使用医用钉皮钉固定小鼠双腿的大腿和胫骨，从而使腿固定，将固定的小鼠单独放置5天后，释放被固定的腿，从而构件肌肉萎缩小鼠模型。
为了测量通过引起肌肉萎缩导致的血清蛋白水平的变化，在使小鼠腿固定之前、固定后5天、释放小鼠腿后2和4天从小鼠中分离血清。使用MyBioSource Elisa试剂盒(凝溶胶蛋白，Cat#MBS2886136四连接蛋白，Cat#MBS2885296)分析血清中四连接素和凝溶胶蛋白的水平。结果示于图9中。
如图9所示，当通过使腿固定引起肌肉萎缩时，血清四连接素和凝溶胶蛋白水平与固定前和恢复期间(腿释放后2天和4天)相比均显著增加。这些结果表明，根据本发明的四连接素和凝溶胶蛋白可以用作检测肌肉萎缩的标志物。
上述结果表明，通过测量四连接素、凝溶胶蛋白或包括它们的血液生物标志物，可以有效地以高准确性诊断肌肉衰弱相关疾病。

Claims (16)

1.一种用于诊断肌肉衰弱相关疾病的组合物，所述组合物包含用于测量凝溶胶蛋白和四连接素蛋白表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含用于测量选自巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白介素6(IL-6)、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)中的任何一种或多种蛋白质的表达水平的试剂。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述肌肉衰弱相关疾病是选自肌肉减少症、肌肉萎缩、肌营养不良症、恶病质和心肌萎缩中的任何一种或多种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于，用于测量蛋白质表达水平的试剂是对基因编码的蛋白质具有特异性的抗体。
5.一种用于诊断肌肉衰弱相关疾病的试剂盒，所述试剂盒包含用于测量凝溶胶蛋白和四连接素蛋白表达水平的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包含用于测量选自巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白介素6(IL-6)、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)中的任何一种或多种蛋白质的表达水平的试剂。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述肌肉衰弱相关疾病是选自肌肉减少症、肌肉萎缩、肌营养不良症、恶病质和心肌萎缩中的任何一种或多种。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，用于测量蛋白质表达水平的试剂是对基因编码的蛋白质具有特异性的抗体。
9.根据权利要求5至7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，测量蛋白质表达水平使用选自酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选(FACS)、质谱分析、MRM(多重反应监测)测定、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定(iTRAQ，同位素标记相对和绝对定量)和蛋白质芯片测定中的任何一种来进行。
10.一种用于提供诊断肌肉衰弱相关疾病的信息的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)测量获自对象的生物样品中四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平；和
(b)当四连接素和凝溶胶蛋白的表达水平高于正常组时，确定该对象患有肌肉衰弱相关疾病。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的生物样品是选自血液、血清和血浆的任何一种。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(a)中测量蛋白质表达水平使用选自酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选(FACS)、质谱分析、MRM(多重反应监测)测定、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定(iTRAQ，同位素标记相对和绝对定量)和蛋白质芯片测定中的任何一种来进行。
13.一种用于提供诊断肌肉衰弱相关疾病的信息的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)测量从对象获得的生物样品中的四连接素、凝溶胶蛋白、以及选自巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白介素6(IL-6)、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)中的任何一种或多种蛋白的表达水平；
(b)根据步骤(a)中测得的表达水平计算风险评分；和
(c)将计算出的风险评分与参考水平进行比较，当风险评分等于或高于参考水平时，确定对象患有肌肉衰弱相关疾病。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的生物样品是选自血液、血清和血浆中的任何一种。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(a)中测量蛋白质表达水平使用选自酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心分析、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、荧光免疫测定、酶底物显色、抗原抗体聚集、荧光激活细胞分选(FACS)、质谱分析、MRM(多重反应监测)测定、采用一组多重胺特异性稳定同位素试剂的测定(iTRAQ，同位素标记相对和绝对定量)和蛋白质芯片测定中的任何一种来进行。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的测量蛋白质表达水平是测量四连接素、凝溶胶蛋白、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白介素6(IL-6)、SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的表达水平。
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