CN110806486A - Mafg/as1/pcbp2/fpn1调控轴作为靶位点检测试剂的应用 - Google Patents

Mafg/as1/pcbp2/fpn1调控轴作为靶位点检测试剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了“MAFG‑AS1/PCBP2/FPN1”调控轴作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。本发明研究证实，在膀胱癌细胞中，表达升高的MAFG‑AS1结合PCBP2后能通过招募去泛素化酶UCHL5稳定PCBP2的表达，进而通过PCBP2的运输作用，将铁离子传递给细胞膜上的FPN1，促进铁转运出胞外，导致铁死亡抵抗。首次证实膀胱癌中“MAFG‑AS1/PCBP2/FPN1”调控轴的存在，是膀胱癌治疗领域的一种非常有价值的潜在治疗药物。因此，PCBP2可在制备治疗膀胱癌药物中作为靶位点，也是临床上预测膀胱癌癌患者的分子标志物。

Description

MAFG/AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及“MAFG/AS1/PCBP2/FPN1”调控轴及PCBP2作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
背景技术
顺铂（DDP）是治疗膀胱癌的一线化疗药物，DDP主要作用于细胞DNA的嘌呤和嘧啶碱基，与DNA形成顺铂-DNA加合物，导致DNA损伤，抑制DNA的复制和转录进而杀伤肿瘤细胞。近年来，膀胱癌细胞对顺铂耐药性的产生严重影响了顺铂的疗效。目前多认为顺铂耐药的机制主要存在两方面：肿瘤细胞DNA被破坏减少基于顺铂于DNA结合减少；损伤的DNA被DNA修复系统修复及细胞死亡逃逸机制启动，使得已经遭到顺铂破坏的细胞依旧存活。目前多种方式（包括促进凋亡、调控自噬等）尝试增加膀胱癌对顺铂的敏感性，但相当一部分膀胱癌患者对顺铂仍然耐药，严重影响膀胱癌患者的愈合。因此探索逆转膀胱癌细胞对顺铂耐药的方法是提高疗效的关键。
铁死亡是一种铁依赖性的，以细胞内活性氧堆积为特征的非细胞凋亡形式的细胞死亡。形态上发生铁死亡的细胞会出现比正常细胞小的线粒体，且线粒体膜皱缩，同时线粒体嵴减少、消失，外膜破碎。细胞外三价铁离子（Fe3+）与transferrin（TF）结合后形成TF-Fe3+，在膜蛋白transferrin receptor protein 1（TFR1）的介导下进入细胞内，并被还原成Fe2+。在divlent metal transporter （DMT1）、ZRT/IRT-like proteins 8/14( ZIP8/14)的协助下存储到细胞内的labile iron pool（LIP）中。另外，胞内Fe2+在PCBP2等铁伴侣蛋白的协助下经过膜蛋白运铁蛋白1 (FPN1)泵出铁离子，维持胞内铁平衡。铁过载与细胞膜脂质过氧化有关, 导致大量活性氧簇（ROS），促使细胞发生铁死亡。多项研究证实促进铁死亡能增加顺铂对肿瘤细胞的杀伤性。因此深入研究铁死亡在膀胱癌顺铂耐药中的作用及分子机制，对膀胱癌的治疗具有重要意义。
Long non-coding RNA (lncRNA)是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。LncRNAs能通过转录调控、组蛋白修饰、结合蛋白、ceRNA等机制参与多种生物学行为的调控。目前有少数文献报道LINC00336、P53RRA等lncRNAs参与肿瘤细胞铁死亡的调控。MAFBZIP Transcription Factor G Antisense RNA 1 （MAFG-AS1）是最新被报道的能促进肿瘤增殖及转移的lncRNA，但MAFG-AS1在膀胱癌中的作用尚不清楚。
发明内容
本发明旨在提供一种可以用于制备膀胱癌顺铂增敏药物的新靶点。在本研究中，抑制MAFG-AS1表达能诱导铁死亡进而增加顺铂对膀胱癌细胞的杀伤力。在本研究中，我们首次发现在膀胱癌细胞中高表达的MAFG-AS1与PCBP2结合后能促进胞内铁离子的泵出，进而诱导铁死亡抵抗。首次证实膀胱癌中“MAFG-AS1/PCBP2/FPN1”调控轴的存在，是膀胱癌治疗领域的一种非常有价值的潜在治疗药物；并提供了抑制膀胱癌顺铂耐药性的潜在治疗新靶点。
本发明首次证实MAFG-AS1在膀胱癌中也发挥癌基因作用，能促进膀胱癌细胞的增殖能力。本发明还首次揭示膀胱癌中表达升高的MAFG-AS1能抑制膀胱癌细胞的铁死亡，且细胞及动物层面均证实MAFG-AS1能通过抑制铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。本发明从铁离子水平改变角度探索的MAFG-AS1诱导膀胱癌铁死亡抵抗的新机制。
通过ChIRP-MS高通量测序方法发现与MAFG-AS1探针结合差异表达的蛋白有26个，其中包括PCBP2等蛋白。我们通过PRM-MS 法验证了MAFG-AS1与PCBP2蛋白直接结合，证实MAFG-AS1与PCBP2相结合。通过分析相关去泛素化酶在膀胱癌中的表达水平、预后及与PCBP2相关性，最终筛选出在膀胱癌中高表达或预后相关或与PCBP2表达呈正相关性的5个去泛素化酶UCHL5、USP5、COPS6、PSMD14、OTUB1。通过GSE83586、GSE87304、GSE13507、GSE31684等芯片分析发现在膀胱癌中UCHL5与PCBP2呈正相关；并WB及COIP方法检测证实MAFG-AS1通过招募去泛素化酶UCHL5从而上调PCBP2蛋白表达水平。
蛋白结合预测发现PCBP2与FPN1相结合。WB及COIP方法检测证实PCBP2结合FPN1之后能够将携带的铁离子经由FPN1向胞外输出铁离子进而抑制铁死亡。
总之，本发明首次发现在膀胱癌细胞中，表达升高的MAFG-AS1结合PCBP2后能通过招募去泛素化酶UCHL5稳定PCBP2的表达，进而通过PCBP2的运输作用，将铁离子传递给细胞膜上的FPN1，促进铁转运出胞外，导致铁死亡抵抗。首次证实膀胱癌中“MAFG-AS1/PCBP2/FPN1”调控轴的存在，是膀胱癌治疗领域的一种非常有价值的潜在治疗药物；并提供了抑制膀胱癌顺铂耐药性的潜在治疗新靶点。靶向MAFG-AS1/PCBP2/FPN1途径可能成为改善膀胱癌或其他癌症患者的治疗和存活的新的治疗策略。
附图说明
图1：MAFG-AS1抑制膀胱癌细胞铁死亡。A-B：MTT法检测MAFG-AS1敲除后T24/RT4细胞的增殖情况，联合应用凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK，自噬抑制剂3-MA，铁死亡抑制剂DFO或铁死亡诱导剂Erastin。C，D，E，F：用相应的试剂盒检测Iron和Lipid-ROS水平。G，H：PCR检测干扰MAFG-AS1后T24/RT4细胞中MAFG-AS1的表达。I，G：克隆形成实验检测改变MAFG-AS1后的细胞增殖。K，L：检测改变MAFG-AS1后T24/RT4细胞MDA、Iron和Lipid-ROS水平。p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图2：MAFG-AS1通过铁死亡途径调节膀胱癌细胞对顺铂的化疗敏感性。A-D：MTT和克隆形成试验检测经顺铂(DDP，IC50)处理的T24/RT4细胞在敲除MAFG-AS1和/或DFO处理后的细胞增殖。E-G：用相应的试剂盒检测MDA、Iron和Lipid-ROS的表达水平。H-K：MTT和克隆形成实验检测经顺铂(DDP，IC50)处理的T24/RT4细胞在过表达MAFG-AS1和/或Erastin后的细胞增殖。L-N：用相应的试剂盒检测MDA、Iron和Lipid-ROS的表达水平。ns p>0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图3：体内实验证实敲除MAFG-AS1可通过促进铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂化疗的敏感性。A，G：在T24/RT4细胞中敲除MAFG-AS1和/或DDP处理后，用PCR检测MAFG-AS1的表达。B，H：处死后从指定小鼠分离的肿瘤组织。C，I：处死后指定小鼠的肿瘤体积。D，J：采用免疫组化检测肿瘤组织中Ki67的表达。E，F，K，L：测定动物血清中MDA和Iron的含量。ns p>0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图4：MAFG-AS1通过募集去泛素酶UCHL5来稳定PCBP2蛋白的表达水平。A：Chirp-MS用于鉴定与MAFG-AS1结合的蛋白质。B：PRM-MS实验证实MAFG-AS1与PCBP2结合。C：图中显示了MAFG-AS1与PCBP2蛋白之间的结合模式。D，E：敲除去泛素酶(UCHL5，USP5，COPS6，PSMD14和OTUB1)后，用WB法检测PCBP2的表达。F-G：CO-IP法以PCBP2为沉淀抗体，检测MAFG-AS1在T24/RT4细胞中过表达后的UCHL5水平。H-L：GSE31189，GSE83586，GSE87304，GSE13507和GSE31684芯片揭示了UCHL5和PCBP2之间的正相关。M-N：CO-IP与PCBP2沉淀抗体共同检测过表达MAFG-AS1和/或在T24/RT4细胞中敲除UCHL5后PCBP2的泛素水平。ns p>0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图5：PCBP2与FPN1结合，加速铁泵出并抑制膀胱癌细胞中的铁死亡。A，B：MTT法检测PCBP2表达改变后T24/RT4细胞的增殖能力。C-D：检测改变PCBP2后的Iron和Lipid-ROS水平。E，G：GSE31189，GSE87304和GSE83586芯片揭示了PCBP2和FPN1之间的正相关。H：图中显示了PCBP2和FPN1之间的结合模式。I，J：以PCBP2为沉淀抗体的CO-IP法检测干扰PCBP2在T24/RT4细胞中表达后的FPN1水平。ns p>0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图6：A-B：PCR法在T24/RT4两株细胞中分别过表达MAFG与MAFG-AS1及敲除PCBP2后检测MAFG-AS1表达。C、F：MTT法检测MAFG-AS1/MAFG/PCBP2轴对细胞增值能力的影响。D-E、G-H：使用Iron Colorimetric assay、Lipid ROS assay using flow cytometer检测MAFG-AS1/MAFG/PCBP2轴对细胞铁死亡相关指标Iron、Lipid-ROS水平的影响。I、M：裸鼠皮下成瘤模型。 J、N: 各组瘤体体积大小。K-L、O-P：使用Malondialdehyde (MDA) assay、IronColorimetric assay检测动物血液（血清）中的MDA、Iron水平。Q：免疫组织化学检测各组中ki67的表达量。Bars表示标准差，ns p>0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图7：3-MA、Z-DEVD-FMK对自噬及凋亡水平的影响。A，B：WB用于检测LC3B表达。C，D：使用Annexin V-Fict/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。
图8：MAFG-AS1上调PCBP2水平。A：通过GSE31189芯片分析膀胱癌中MAFG-AS1与PCBP2的相关性。B：MAFG-AS1过表达后用PCR检测MAFG-AS1的表达，并结合UCHL5敲除与否。C：用WB法检测新鲜临床膀胱癌及癌旁组织中MAFG和PCBP2的表达。D：用免疫组化方法检测MAFG和PCBP2在石蜡包埋BUC组织和癌旁组织中的表达。
图9：MAFG和PCBP2在异种移植小鼠模型肿瘤中的表达。A：MAFG下调表达和/或DDP干预后，WB检测肿瘤组织中MAFG和PCBP2的表达。B：上调MAFG-AS1和MAFG表达后，结合PCBP2下调与否，用WB检测肿瘤组织中MAFG和PCBP2的表达。
具体实施方式
下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明
1、材料及方法
细胞培养及转染，qRT-PCR分析，RNA纯化分离染色质（CHIRP）、平行反应监测(PRM)、蛋白质印迹分析，免疫组化测定，MTT测定，流式细胞术，免疫沉淀，染色质免疫共沉淀，免疫荧光，双荧光素酶实验，铁比色法，丙二醛（MDA）测定，流式细胞仪测定Lipid-ROS，克隆形成测定，以上方法均是现有方法，在此不再累述。
、结果
2.1 MAFG-AS1能抑制膀胱癌细胞的铁死亡
我们在T24/RT4两株细胞中分别对MAFG-AS1敲除及过表达干预（图1G,H），在T24/RT4两株细胞敲除MAFG-AS1后MTT实验进一步证实细胞增殖能力明显受抑制，并且Iron、Lipid-ROS水平显著上升（图1A-F）。加入铁死亡抑制剂DFO能够抑制Iron、Lipid-ROS水平并拮抗敲除MAFG-AS1诱导的细胞死亡，而加入铁死亡诱导剂Erastin后能增加Iron、Lipid-ROS水平，并进一步促进敲除MAFG-AS1诱导的细胞死亡在T24/RT4两株细胞中分别对MAFG-AS1敲除及过表达干预（图1C-F）。但加入凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK和自噬抑制剂3-MA对Iron、Lipid-ROS水平及敲除MAFG-AS1诱导的细胞死亡影响轻微（图1C-F）。3-MA、Z-DEVD-FMK对自噬及凋亡水平的影响见补充材料（图6A-D）。克隆形成实验发现敲除MAFG-AS1显著抑制细胞克隆能力以及上调MDA、Iron、Lipid-ROS水平，而过表达MAFG-AS1结果相反（图1I-L）。以上结果提示MAFG-AS1能抑制膀胱癌细胞的铁死亡。
通过铁死亡途径调节膀胱癌细胞对顺铂的化疗敏感性
有研究表明在肿瘤细胞内铁死亡抵抗是顺铂耐药的新机制之一，那么MAFG-AS1能否通过铁死亡来调节膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性呢，在顺铂（DDP）IC50处理下，在T24/RT4两株细胞中干扰MAFG-AS1表达，MTT实验及克隆形成实验证实敲除MAFG-AS1后促进DDP对细胞的杀伤能力及铁死亡相关指标的表达，加入DFO能抑制铁死亡相关指标及DDP的杀伤能力（图2A-G）。过表达MAFG-AS1后抑制DDP对细胞的杀伤能力及铁死亡相关指标的表达，而加入Erastin能促进铁死亡相关指标及DDP的杀伤能力（图2H-L）。上述结果证实MAFG-AS1通过铁死亡途径来调节膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性。
动物实验证实敲除MAFG-AS1能通过促进铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂化疗敏感性
为从体内实验进一步验证我们上述的结论。我们构建了裸鼠皮下成瘤模型，结果发现相对于对照组，DDP与敲除MAFG-AS1均能抑制对肿瘤的生长，而在DDP干预的同时，敲除MAFG-AS1（图3A、G）能进一步增强DDP对肿瘤组织的杀伤作用（图3B-C、H-I）。免疫组化检测肿瘤增殖相关指标Ki67，发现DDP干预及敲除MAFG-AS1后肿瘤组织中的Ki67阳性率下降，而DDP+MAFG-AS1敲除组瘤组织的Ki67阳性率下降更为明显（图3D、J）。以上表明敲除MAFG-AS1增加膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性。我们收集动物血液检测铁死亡相关指标，发现相对于对照组，敲除MAFG-AS1及DDP干预组中的MDA、Iron水平上升（图E-F，K-L）。以上结果证明MAFG-AS1在体内能通过铁死亡途径来调节膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性。
通过招募去泛素化酶UCHL5激活PCBP2/FPN1/铁离子轴进而抑制膀胱癌细胞的铁死亡
我们为进一步研究MAFG-AS1调控铁死亡途径的具体分子机制，通过ChIRP-MS高通量测序方法发现与MAFG-AS1探针结合差异表达的蛋白有26个，间接结合有15个蛋白，总共有141个蛋白（图4A），其中包括PCBP2等蛋白。我们收集了14对膀胱癌与癌旁蜡块组织及6对临床膀胱癌与癌旁新鲜组织，WB及免疫组化检测结果显示相对于癌旁组织，PCBP2在癌组织表达相对增高（图8H-I）。GSE31189芯片分析发现在膀胱癌中MAFG-AS1与PCBP2成正相关（图8A）。catRAPID 证实MAFG-AS1与PCBP2相结合，其中MAFG-AS1片段上黄色碱基为MAFG-AS1与PCBP2蛋白（红色为氨基酸识别结合位点）结合区域（图4C）。为此我们通过分析相关去泛素化酶在膀胱癌中的表达水平、预后及与PCBP2相关性，最终筛选出在膀胱癌中高表达或预后相关或与PCBP2表达呈正相关性的5个去泛素化酶UCHL5、USP5、COPS6、PSMD14、OTUB1（图9A-E）。在T24和RT4两株细胞中分别敲除上述去泛素化酶后，WB结果发现抑制UCHL5后PCBP2表达下降最为明显（图4D-E）。通过GSE83586、GSE87304、GSE13507、GSE31684等芯片分析发现在膀胱癌中UCHL5与PCBP2呈正相关（图4H-L）。以PCBP2为沉淀抗体，用COIP方法检测UCHL5表达，结果表明PCBP2能与UCHL5结合（图4F-G）。PCBP2蛋白表达水平明显上升，而过表达MAFG-AS1同时敲除UCHL5后PCBP2泛素化水平显著上调，但PCBP2蛋白表达水平明显下降（图4M-N）。综上表明MAFG-AS1通过招募去泛素化酶UCHL5从而上调PCBP2蛋白表达水平。
有研究报道PCBP2作为铁伴侣参与吸附和转运铁离子从而影响铁死亡途径。在T24/RT4两株细胞中敲除PCBP2后膀胱癌细胞增殖能力显著下降，Iron、Lipid-ROS水平显著上升，过表达PCBP2其结果完全相反（图5A-D）。提示PCBP2能够影响膀胱癌细胞的铁死亡。运铁蛋白1 (FPN1)是哺乳动物存在的一种出口铁蛋白，其主要功能就是铁离子转运出细胞，有文献报道表明FPN1输出胞外的铁来自铁伴侣PCBP2。我们通过GEO（GSE31189、GSE87304、GSE83586）芯片分析发现在膀胱癌中PCBP2与FPN1呈正相关（图5E-G），而蛋白结合预测发现PCBP2与FPN1相结合（图5H）。为了证实PCBP2与FPN1之间的关系，在T24/RT4两株细胞中分别干扰PCBP2后，WB发现敲除PCBP2后FPN1表达水平无明显改变，以PCBP2为沉淀抗体，行COIP检测FPN1发现FPN1表达水平下调，而过表达PCBP2则结果完全相反（图5I-J）。上述表明PCBP2能与FPN1结合，但不影响FPN1表达。提示PCBP2结合FPN1之后能够将携带的铁离子经由FPN1向胞外输出铁离子进而抑制铁死亡。综上表明MAFG-AS1结合PCBP2能招募去泛素化酶UCHL5稳定PCBP2蛋白的表达，PCBP2结合FPN1能加速铁离子泵出进而抑制膀胱癌细胞的铁死亡。
通过上调PCBP2表达从而抑制膀胱癌细胞的铁死亡
已证实MAFG-AS1/MAFG正反馈环存在情况下。为了证实MAFG-AS1/MAFG正反馈环通过PCBP2介导的铁死亡。我们在T24/RT4两株细胞中分别过表达MAFG、MAFG-AS1及敲除PCBP2并行PCR检测MAFG-AS1表达（图6A-B），结果表明PCBP2不影响MAFG-AS1表达。但过表达MAFG-AS1或MAFG后同时敲除PCBP2后细胞增殖能力明显受到抑制，且铁死亡相关指标显著上升（图6C-H）。上述结果表明MAFG-AS1/MAFG正反馈环通过PCBP2调控膀胱癌细胞的铁死亡。为了从体内实验进一步证实我们的结论，我们构建了裸鼠皮下成瘤模型，结果发现相对于对照组，过表达MAFG-AS1和过表达MAFG均能促进肿瘤的生长，而在过表达MAFG-AS1和过表达MAFG同时敲除PCBP2能抑制肿瘤组织的生长（图6I-J、M-N）。免疫组化检测肿瘤增殖相关指标Ki67，发现过表达MAFG-AS1和过表达MAFG后肿瘤组织中的Ki67阳性率上升，而过表达MAFG-AS1和过表达MAFG同时敲除PCBP2组中瘤组织的Ki67阳性率明显下降（图6Q）。动物瘤体行WB检测PCBP2与MAFG表达，结果显示相对于对照组，过表达MAFG-AS1和过表达MAFG同时敲除PCBP2后PCBP2表达明显下降，而MAFG表达无明显变化（图10B）。在顺铂化疗敏感性体内实验中，瘤体行WB检测PCBP2与MAFG表达，结果显示相对于对照组，敲除MAFG-AS1后PCBP2与MAFG的表达均下降（图10A）。我们收集动物血液检测铁死亡相关指标，发现相对于对照组，过表达MAFG-AS1和过表达MAFG后MDA、Iron水平下降；而过表达MAFG-AS1和过表达MAFG同时敲除PCBP2后MDA、Iron水平上升（图6K-L、O-P）。以上结果证实MAFG-AS1通过上调PCBP2表达从而抑制膀胱癌细胞的铁死亡。
综上所述，本发明首次发现在膀胱癌细胞中，表达升高的MAFG-AS1结合PCBP2后能通过招募去泛素化酶UCHL5稳定PCBP2的表达，进而通过PCBP2的运输作用，将铁离子传递给细胞膜上的FPN1，促进铁转运出胞外，导致铁死亡抵抗。首次证实膀胱癌中“MAFG-AS1/PCBP2/FPN1”调控轴的存在，是膀胱癌治疗领域的一种非常有价值的潜在治疗药物；并提供了抑制膀胱癌顺铂耐药性的潜在治疗新靶点。靶向MAFG/AS1/PCBP2/ FPN1途径可能成为改善膀胱癌或其他癌症患者的治疗和存活的新的治疗策略。

Claims (5)

1.MAFG-AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂的应用,其特征是，MAFG-AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述膀胱癌是指BUC。
3.PCBP2作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，PCBP2作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌分子标志物中的应用。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述膀胱癌是指BUC。
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