CN108410984B - Rbms3作为肿瘤耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了RBMS3作为肿瘤耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用，本发明发现RBMS3缺失可促进肿瘤顺铂耐药性及肿瘤复发。目前大部分肿瘤的治疗方案都是手术切除辅助化疗，化疗耐药性现已成为影响肿瘤患者预后的重要因素。本发明寻找到一个特异性的分子标志物，可作为预测肿瘤耐药的重要分子标志物。本发明的目的基因可以在DNA水平检测，DNA比RNA或蛋白具有更强的稳定性，可提高诊断的准确性和局限性。本发明为肿瘤患者的治疗提供了有针对性的治疗方案，对于RBMS3‑非缺失的肿瘤患者，单独使用顺铂即可获得较好治疗效果；但对于RBMS3‑缺失的肿瘤患者，需联合顺铂和PRI‑724，才能使患者获得较好治疗效果。

Description

RBMS3作为肿瘤耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用
技术领域
本发明涉及RBMS3作为肿瘤耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用。
背景技术
卵巢癌是妇科肿瘤中死亡率最高的肿瘤之一，其中上皮性卵巢癌(EpithelialOvarian Cancer,EOC)是最常见的肿瘤类型。目前针对EOC的治疗方案是手术切除(细胞减压术) 联合铂类药物为主的化学治疗。虽然超过80％的EOC患者在接受铂类药物的化疗后具有较好的缓解反应，但是超过75％的患者会由于对铂类药物产生耐药而导致肿瘤复发，从而造成EOC 患者的5年生存率只有30％。因此，探索肿瘤耐药的分子调控机制并寻找其中的靶向调控分子是非常重要的研究方向和开发领域。
导致肿瘤细胞抵抗铂类药物的分子机制主要包括抗凋亡、增加药物泵出及增强DNA修复能力等。已有文献报导，细胞内各种信号通路的异常激活可促进肿瘤细胞的耐药性，其中 Wnt/β-catenin信号通路在多种肿瘤中的异常激活已被证实与顺铂、卡铂及奥沙拉铂等铂类耐药密切相关。乙酰基转移酶CREB结合蛋白(CBP)与β-catenin的结合可特异性地上调一系列与细胞泵药、抗凋亡及DNA修复的靶基因，包括ABCB1,ABCG2,Survivin，MMP-7，MRE11 及MRE11等，因此Wnt/β-catenin/CBP信号通路的激活可显著促进肿瘤细胞的化疗抵抗性。由此，抑制CBP与β-catenin结合的小分子抑制剂PRI-724(ICG-001多用于体外实验研究中) 目前正被运用于多种肿瘤的临床试验中，然而，由于缺乏特异性的分子靶向指标，PRI-724 的临床运用效果受到极大的限制。
基因变异是诱发肿瘤及促进肿瘤恶性发展的的重要因素之一，而染色体缺失则是其中最常见的类型。已有大量文献证明，染色体缺失可作为预测肿瘤患者的生存预后的标志物，并与肿瘤的化疗抵抗性相关。
发明内容
本发明的目的在于提供RBMS3作为卵巢癌耐药检测靶点、卵巢癌预后检测靶点、预测卵巢癌肿瘤复发检测靶点的应用。
本发明的另一目的在于提供一种卵巢癌耐药、卵巢癌预后、或/和预测卵巢癌肿瘤复发的检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种提高卵巢癌对顺铂类药物敏感性的药剂。
本发明所采取的技术方案是：
RBMS3作为肿瘤耐药检测靶点、肿瘤预后检测靶点、预测肿瘤复发检测靶点的应用，所述肿瘤耐药中的药物指顺铂类药物。
进一步的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
检测RBMS3的试剂在制备肿瘤耐药检测试剂盒、或肿瘤预后检测试剂盒、或预测肿瘤复发检测试剂盒中的应用，所述肿瘤耐药中的药物指顺铂类药物。
进一步的，所述定量检测RBMS3的试剂选自检测RBMS3基因水平拷贝数的试剂、定量检测RBMS3的RNA转录水平的试剂、定量检测RBMS3的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
进一步的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
RBMS3蛋白或/和提高RBMS3蛋白表达的物质在制备提高肿瘤对顺铂类药物敏感性的药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
蛋白DKK3、AXIN1、BACH1和/或NFAT5在制备提高肿瘤对顺铂类药物敏感性的药物中的应用。
提高DKK3、AXIN1、BACH1和/或NFAT5蛋白表达的物质在制备提高肿瘤对顺铂类药物敏感性的药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
一种肿瘤耐药、肿瘤预后、或/和预测肿瘤复发的检测试剂盒，该试剂盒中含有检测 RBMS3的试剂，所述肿瘤耐药中的药物指顺铂类药物。
进一步的，所述定量检测RBMS3的试剂选自检测RBMS3基因水平拷贝数的试剂、定量检测RBMS3的RNA转录水平的试剂、定量检测RBMS3的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
进一步的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
一种提高肿瘤对顺铂类药物敏感性的药剂，该药剂中含有RBMS3蛋白、提高RBMS3蛋白表达的物质、蛋白DKK3、AXIN1、BACH1和/或NFAT5、提高DKK3、AXIN1、BACH1 和/或NFAT5蛋白表达的物质中的至少一种。
进一步的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
本发明的有益效果是：
(1)本发明发现RBMS3缺失可作为顺铂耐药的重要分子标志物。由于目前大部分肿瘤的治疗方案都是手术切除辅助化疗，化疗耐药性现已成为影响肿瘤患者预后的重要因素。本发明寻找到一个特异性的分子标志物，可作为预测肿瘤耐药的重要分子标志物。
(2)以往的检测结果易受取样环境、实验条件影响。以往的肿瘤分子标志物大多通过检测目的基因的RNA及蛋白表达水平，由于RNA及蛋白在取样及提取过程中容易降解，所以实验结果可信度不高。本发明的目的基因可以在DNA水平检测，DNA比RNA或蛋白具有更强的稳定性，可以提高诊断的准确性和局限性。
(3)本发明为肿瘤患者的治疗提供了有针对性的治疗方案，对于RBMS3-非缺失的肿瘤患者，单独使用顺铂即可以获得较好的治疗效果；但对于RBMS3-缺失的肿瘤患者，需要联合使用顺铂+PRI-724，才能使患者获得较好的肿瘤治疗效果。
(4)现有的分子标志物具有肿瘤类型局限性。大部分分子标志物都局限于某一种或某一类肿瘤的运用，本发明RBMS3的缺失是从多种肿瘤中筛选出来的结果，提示本发明的应用具有多种肿瘤的广泛应用行，可以消除应用上的肿瘤类型局限性。
附图说明
图1为RBMS3在多种肿瘤中的缺失情况以及与肿瘤耐药的相关性；A～D为在TCGA公共数据库中，RBMS3在包括卵巢癌在内的13种肿瘤中存在缺失并与患者的复发呈正相关；E为A2780和SKOV3细胞的MTT结果均显示低表达RBMS3对顺铂的作用具有最显著的抑制效应；E～H为在临床样品中，RBMS3也被证实在卵巢癌中缺失，并与患者的肿瘤耐药及生存预后呈正相关；G中“+/+”代表RBMS3是野生型，“+/-”代表RBMS3杂合性缺失；I 中RBMS3-低表达组的患者具有更高的复发率及更短的无复发生存时间；
图2为在体内实验中RBMS3缺失对上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药的影响；结果显示在PDX 模型及腹腔种植肿瘤模型中，RBMS3缺失均增强上皮性卵巢癌细胞的顺铂耐药性，并提示小鼠较短的生存时间；图中Sc-DOPC、si#1-DOPC或si#2-DOPC分别表示Scramble-DOPC、RBMS3-si#1-DOPC或RBMS3-si#2-DOPC；
图3为在体外实验中RBMS3缺失对上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药的影响；显示为RBMS3 缺失在多种体外顺铂处理实验中均抑制上皮性卵巢癌细胞的凋亡从而促进上皮性卵巢癌细胞的顺铂耐药性；
图4为RBMS3调控上皮性卵巢癌顺铂耐药的调控途径探索；显示为RBMS3缺失可显著促进Wnt/β-Catenin信号通路的激活，并上调其下游一系列基因的RNA和蛋白表达；
图5为RBMS3调控Wnt/β-Catenin信号通路的具体调控分子机制；显示为RBMS3可作为一个RNA结合蛋白，稳定多个Wnt/β-Catenin信号通路的负调控因子 (DKK3,AXIN1,BACH1,NFAT5)的RNA，从而抑制Wnt/β-Catenin信号通路的激活；
图6为体内外实验验证小分子抑制剂ICG-001/PRI-724对顺铂敏感性的影响；显示为在多个体内外实验中，在RBMS3缺失/低表达的上皮性卵巢癌细胞中联合使用ICG-001/PRI-724 可增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性，并延长EOC实验小鼠的生存时间；
图7为RBMS3在除卵巢癌外的其它肿瘤类型中的表达、临床特征及调控途径探索；A为RBMS3在乳腺癌、头颈鳞癌及肝细胞肝癌中表达降低；B为RBMS3低表达提示着乳腺癌、头颈鳞癌及肝细胞肝癌患者较短的无复发生存时间；C为GSEA相关性分析显示在乳腺癌、头颈鳞癌及肝细胞肝癌中，RBMS3与肿瘤耐药呈负相关；D为RBMS3低、高表达分别促进、抑制Wnt/β-Catenin信号通路的激活；E为RBMS3低表达促进小鼠皮下肿瘤在顺铂处理后的肿瘤大小。
具体实施方式
RBMS3作为肿瘤耐药检测靶点、肿瘤预后检测靶点、预测肿瘤复发检测靶点的应用。
优选的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
优选的，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。
优选的，所述肿瘤耐药中的药物指顺铂类药物。
检测RBMS3的试剂在制备肿瘤耐药检测试剂盒、或肿瘤预后检测试剂盒、或预测肿瘤复发检测试剂盒中的应用。
优选的，所述定量检测RBMS3的试剂选自检测RBMS3基因水平拷贝数的试剂、定量检测RBMS3的RNA转录水平的试剂、定量检测RBMS3的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
更优选的，所述定量检测RBMS3的试剂为检测RBMS3基因水平拷贝数的试剂。
优选的，所述检测RBMS3基因水平拷贝数的试剂含有SEQ ID NO:1～2所述的引物或检测RBMS3基因的探针(由生物公司设计和合成)。
优选的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
优选的，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。
优选的，所述肿瘤耐药中的药物指顺铂类药物。
RBMS3蛋白或/和提高RBMS3蛋白表达的物质在制备提高肿瘤对顺铂类药物敏感性的药物中的应用。
优选的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
蛋白DKK3、AXIN1、BACH1和/或NFAT5在制备提高肿瘤对顺铂类药物敏感性的药物中的应用。
提高DKK3、AXIN1、BACH1和/或NFAT5蛋白表达的物质在制备提高肿瘤对顺铂类药物敏感性的药物中的应用。
优选的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
一种肿瘤耐药、肿瘤预后、或/和预测肿瘤复发的检测试剂盒，该试剂盒中含有检测RBMS3的试剂。
优选的，所述定量检测RBMS3的试剂选自检测RBMS3基因水平拷贝数的试剂、定量检测RBMS3的RNA转录水平的试剂、定量检测RBMS3的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
优选的，所述定量检测RBMS3的试剂为检测RBMS3基因水平拷贝数的试剂。
优选的，所述检测RBMS3基因水平拷贝数的试剂为SEQ ID NO:1～2所述的引物。
优选的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
优选的，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。
优选的，所述肿瘤耐药中的药物指顺铂类药物。
一种提高肿瘤对顺铂类药物敏感性的药剂，该药剂中含有RBMS3蛋白、提高RBMS3蛋白表达的物质、蛋白DKK3、AXIN1、BACH1和/或NFAT5、提高DKK3、AXIN1、BACH1 和/或NFAT5蛋白表达的物质中的至少一种。
优选的，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、头颈鳞癌、肝癌。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面结合具体实例，进一步阐述本发明内容。下列实施例中未标明具体条件的实验方法，通常按照标准条件实施，如《分子克隆实验指南》(第三版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。其中检测RBMS3基因水平拷贝数的引物序列为 5’-CATCCAGTTCCCTGCCTCGGAGATA-3’(SEQ ID NO:1)和5’-CAAGTGCAGAACGATACC ACGCTGA-3’(SEQ ID NO:2)。
实施例1.RBMS3在多种肿瘤中缺失并导致肿瘤耐药
(1)TCGA数据库分析及MTT实验筛选目的基因
方法：通过分析TCGA公共数据库中33种肿瘤中基于单核苷酸多态性(SNP)的拷贝数高通量测序数据，筛选出在3号染色体短臂(Chr3p)显著缺失的肿瘤类型，并通过生存预后分析，分析3p缺失与肿瘤患者的总体生存率及复发的相关性。通过单因素、COX回归多因素分析筛选与患者复发相关的染色体区域。在EOC细胞系A2780和SKOV3中用相应的siRNA分别抑制Chr3p所编码的368个基因，检测单独抑制相应基因后顺铂的杀细胞作用。
结果：分析结果显示在TCGA中包括卵巢癌在内的13种肿瘤存在显著的Chr3p缺失(如图1-A所示)。Chr3p在13种肿瘤中的缺失提示患者较高的复发率(如图1-B所示)。单因素分析发现Chr3p中三个主要区域Chr3p14.3-21.33、Chr3p22及Chr3p23-24.1的缺失是影响患者复发预后的危险因子(如图1-C所示)，但是COX回归多因素分析显示只有Chr23-24.1区域的缺失可以作为独立预测患者复发的因素(如图1-D所示)。A2780和SKOV3细胞的MTT结果均显示低表达RBMS3对顺铂的作用具有最显著的抑制效应(如图1-E所示)。
结论：①Chr3p缺失可提高多种肿瘤的复发率。
②Chr3p23-24.1区域的缺失可作为多种肿瘤的独立预后检测因子。
③Chr3p中所编码的RBMS3基因缺失促进卵巢癌耐药。
(2)检测RBMS3在临床样品中的基因水平、RNA水平及蛋白水平表达
方法：在150例EOC临床样品中，通过荧光原位杂交技术(FISH)和免疫组化实验检测RBMS3在DNA水平及蛋白水平的表达值。将收集的15例新鲜EOC组织提取RNA及蛋白，并切片进行FISH实验，检测RBMS3在新鲜组织中的DNA表达、RNA表达及蛋白表达的相关性。
结果：FISH实验结果证明，RBMS3在34％(51/150)的EOC患者中存在缺失(如图1-F所示)。免疫组化实验显示RBMS3发生缺失的EOC组织具有较低的RBMS3蛋白表达水平(如图1-F所示)。将FISH实验和免疫组化实验的结果进行统计学分析，发现在临床样品中RBMS3的缺失与蛋白低表达呈正相关(如图1-F所示)。在收集的新鲜EOC组织中，在RBMS3缺失的组织相应具有较低的RNA及蛋白表达水平(如图1-G所示)。
结论：①RBMS3在临床EOC样品中具有34％的缺失比例。
②RBMS3缺失可导致蛋白水平的降低。
(3)分析RBMS3缺失及低表达对上皮性卵巢癌患者生存预后的影响
方法：在150例EOC临床样品中，根据上述(2)中FISH的实验结果将样品分为RBMS3-缺失(RBMS3del)及RBMS3-非缺失(RBMS3Non-del)两组，并分析两组样品与化疗抵抗性(Chemoresistancce)的相关性。分析RBMS3-缺失和RBMS3-非缺失两组患者的肿瘤复发情况。根据(2)中免疫组化结果将150例样品分为RBMS3-低表达(Low RBMS3)及RBMS3- 高表达(High RBMS3)两组(如图1-F所示)，并分析两组的肿瘤复发情况。
结果：RBMS3-缺失与患者的化疗抵抗性呈正相关性(如图1-F所示)。相较于RBMS3-非缺失组的EOC患者，RBMS3-缺失组患者具有更高的复发率及更短的无复发生存时间(如图1-H所示)。相较于RBMS3-高表达组的EOC患者，RBMS3-低表达组的患者具有更高的复发率及更短的无复发生存时间(如图1-I所示)。
结论：①在临床样品中，RBMS3缺失导致EOC发生化疗抵抗性。
②在临床样品中，RBMS3缺失或低表达均可导致肿瘤复发。
实施例2.在体内实验中，RBMS3缺失/低表达可增强上皮性卵巢癌的顺铂耐药性
(1)Patient-derived xenografts model(PDX模型)构建
方法：将实施例1中所收集的15例新鲜EOC组织分别种植到NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NOG)小鼠背侧皮下，分别命名为OV#1、OV#2……OV#15，当皮下肿瘤可被触摸时，将各组NOG小组分为两组，分别腹腔注射PBS或者顺铂(CDDP，5mg/kg)，每周记录肿瘤大小并绘制成相应肿瘤生长曲线。在RBMS3-缺失组及RBMS3-非缺失组分别挑选OV#2及OV#11 两个样品，将其所形成的皮下肿瘤取出后分离原代细胞，命名为OV-2及OV-11。用FISH及免疫印迹(Western blot)实验验证OV-2及OV-11中RBMS3的基因组及蛋白表达水平。
结果：皮下成瘤实验证明，RBMS3-缺失组中OV#11、OV#13及OV#15可在NOG小鼠皮下形成肿瘤，而RBMS3-非缺失组中则是OV#2、OV#3、OV#4、OV#6及OV#9可形成皮下瘤(如图2-A所示)。RBMS3-缺失组组织所形成的皮下瘤对顺铂的反应不明显，相反 RBMS3-非缺失组对顺铂具有较强的敏感性。FISH证实RBMS3在OV-2原代细胞中不存在缺失，而在OV-11原代细胞中则明显缺失(如图2-B所示)。Western blot显示RBMS3在OV-11 中表达低于OV-2(如图2-B所示)。
结论：在PDX模型中RBMS3缺失的组织对顺铂具有较强的化疗抵抗性。
(2)肿瘤细胞腹腔种植小鼠模型
方法：①在上述(1)的OV-2及OV-11细胞中构建稳定表达荧光素酶(luci)的细胞系后，将OV-2-luci和OV-11-luci细胞种植到NOD SCID小鼠腹腔内(1*106细胞/只)。利用活体成像系统(IVIS)拍摄腹腔肿瘤的荧光值，当小鼠肿瘤荧光值达到2*107p/sec/cm2/sr时，将OV-2-luci组小鼠分为三组，分别在腹腔注射Scramble-DOPC、RBMS3-si#1-DOPC或 RBMS3-si#2-DOPC(其中，RBMS3-si#1、RBMS3-si#2均为RBMS3的RNA干涉序列，Scramble 为对照序列，DOPC为dioleoyl phosphatidylcholine，即二油酰磷脂酰胆碱，为siRNA的体内递送载体，RBMS3siRNA联合DOPC，腹腔注射后可靶向进入肿瘤细胞内)，并同时腹腔注射Vehicle或顺铂(5mg/kg)，每周拍摄并记录各组的荧光值后绘制成曲线，分析各组小鼠的生存水平。
②在EOC细胞系SKOV3中首先构建稳定表达荧光素酶的细胞系后，利用CRISPR/Cas9 系统敲除RBMS3以得到SKOV3RBMS3gRNA#1及SKOV3RBMS3gRNA#2细胞系后,将对照组细胞SKOV3CRISPR control、SKOV3RBMS3gRNA#1及SKOV3RBMS3gRNA#2细胞系分别种植到小鼠腹腔内，当小鼠肿瘤荧光值达到2*107p/sec/cm2/sr时，腹腔注射Vehicle或顺铂(5mg/kg)，每周拍摄并记录各组的荧光值后绘制成曲线，分析各组小鼠的生存水平。
结果：在原代细胞OV-2中，低表达RBMS3可显著降低顺铂对肿瘤的抑制作用(如图2-C及2-E所示)。低表达RBMS3还可缩短小鼠的生存时间(如图2-F所示)。在EOC细胞系SKOV3中，敲除RBMS3可降低顺铂对肿瘤的抑制作用(如图2-G、H所示)，并显著缩短小鼠的生存时间(如图2-I所示)。
结论：在体内实验中，RBMS3缺失/低表达增强EOC对顺铂的化疗抵抗性。
(3)检测小鼠体内肿瘤增殖、凋亡等指标的表达情况
方法：将上述(2)中各组的小鼠腹腔内肿瘤组织取出后，包埋切片，并进行HE染色(H&E)、TUNEL免疫荧光染色(DNA损伤指示实验)、Ki67免疫组化染色(细胞增殖分子指标)及RBMS3免疫组化染色，对各组切片实验结果定量并进行统计学分析。
结果：RBMS3在OV-2RBMS3si#1-DOPC及OV-2RBMS3si#2-DOPC中确实比OV-2Scramble-DOPC组织中表达降低(如图2-D所示)。在OV-2原代细胞中，低表达RBMS3可显著抑制顺铂作用下的细胞凋亡及促进肿瘤细胞的增殖(如图2-D所示)。RBMS3在SKOV3RBMS3gRNA#1及OV-2RBMS3gRNA#2中确实比OV-2CRISPR control组织中表达降低(如图2-J所示)。在SKOV3细胞中，敲除RBMS3可显著抑制顺铂作用下的细胞凋亡及促进肿瘤细胞的增殖(如图2-J所示)。
结论：在顺铂处理后，RBMS3缺失/低表达可减少EOC细胞的凋亡及促进其增殖。
实施例3.在体外实验中，RBMS3缺失/低表达可增强上皮性卵巢癌对顺铂的化疗抵抗性。
(1)体外耐药实验验证RBMS3缺失/低表达对上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响
方法：在OV-2原代细胞中构建RBMS3低表达的细胞系OV-2RBMS3si#1及OV-2RBMS3si#2，并在SKOV3细胞中构建敲除RBMS3的细胞系SKOV3RBMS3gRNA#1及OV-2RBMS3gRNA#2，Western blot验证RBMS3的表达。利用Annexin V流式细胞实验检测RBMS3 缺失/低表达在Vehicle对照或顺铂(5μM)处理后的凋亡比例。利用平板克隆形成实验检测RBMS3缺失/低表达在Vehicle对照或顺铂(5μM)处理后的生长情况。检测各组细胞的半数抑制浓度(IC50)以体现RBMS3表达水平对顺铂耐药的影响。
结果：RBMS3蛋白水平在低表达或敲除后确实低于相应对照组(如图3-A所示)。在Vehicle对照处理组，RBMS3缺失/低表达并不影响肿瘤细胞的凋亡及生长，但在顺铂处理组， RBMS3缺失/低表达显著抑制肿瘤细胞的凋亡及促进其生长(如图3-B及3-C所示)。RBMS3 缺失/低表达显著提高肿瘤细胞对于顺铂的IC50浓度(图3-D)。
结论：在体外实验中，RBMS3缺失/低表达可增强上皮性卵巢癌对顺铂的化疗抵抗性。
(2)检测肿瘤组织及肿瘤细胞中顺铂的残余量及泵出效率
方法：收集实施例2中的各组小鼠肿瘤组织，提取DNA后通过火焰原子吸收光谱法检测组织中顺铂的含量。收集上述(1)中的各组肿瘤细胞，用顺铂(5μM)处理细胞后提取DNA后通过火焰原子吸收光谱法检测组织中顺铂的含量。收集上述(1)中的各组肿瘤细胞，分别顺铂(5μM)处理10分钟后，换正常培养基培养10分钟、20分钟及30分钟，提取DNA 后通过火焰原子吸收光谱法检测组织中顺铂在相应时间点的含量。
结果：在肿瘤组织中，RBMS3缺失/低表达的肿瘤组织中顺铂含量较低(如图3-E所示)。在体外细胞中，RBMS3缺失/低表达的肿瘤组织中顺铂含量较低(如图3-F所示)。RBMS3缺失/低表达的肿瘤细胞具有更强的顺铂泵出能力(如图3-G所示)。
结论：RBMS3缺失/低表达可降低顺铂在肿瘤细胞内的聚集。
(3)RBMS3缺失/低表达抑制顺铂介导的DNA损伤及增强其修复能力
方法：在顺铂处理的情况下，通过检测γ-H2AX斑点实验(DNA损伤的指示实验)探讨 RBMS3表达水平对DNA损伤水平的影响。在顺铂处理后，通过彗星实验检测不同表达量的RBMS3对DNA损伤水平的影响。
结果：RBMS3缺失/低表达组在顺铂处理后所形成的γ-H2AX斑点显著少于对照组(如图3-H所示)。RBMS3缺失/低表达组在顺铂处理后的DNA拖尾现象显著短于对照组(如图3-I所示)。
结论：RBMS3缺失/低表达抑制顺铂所介导的DNA损伤。
实施例4.RBMS3可调控Wnt/β-Catenin信号通路
(1)在公共数据库、高通量测序及芯片表达数据中分析RBMS3调控的分子途径
方法：在公共数据库中分析RBMS3低表达所调控的基因集，通过DAVID网站将基因集聚合成相应的类别。统计SKOV3/RBMS3HITS-CLIP高通量测序数据及RBMS3敲除的细胞表达谱芯片数据，筛选出差异基因后用DAVID网站进行聚类。利用Gene Set EnrichmentAnalysis(GSEA)分析分析RBMS3表达与Wnt信号通路的相关性。
结果：公共数据库中的分析结果提示RBMS3低表达显著促进Wnt/β-Catenin信号通路(如图4-A所示)。测序及芯片数据提示RBMS3通过结合和调控Wnt信号通路的调控因子，从而促进Wnt/β-Catenin信号通路(如图4-B所示)。GSEA分析提示RBMS3低表达与Wnt/β-Catenin 信号通路激活相关的基因显著相关(如图4-C所示)。
结论：RBMS3可调控Wnt/β-Catenin信号通路。
(2)在细胞水平验证RBMS3对Wnt/β-Catenin信号通路的调控作用
方法：利用双荧光素酶报告基因系统检测RBMS3缺失/低表达对Wnt/β-Catenin信号通路的报告质粒调控。通过凝胶迁移实验(EMSA)检测RBMS3表达水平对β-Catenin信号的激活调控。聚合酶链式反应(PCR)及Western blot检测RBMS3表达水平对Wnt/β-Catenin信号通路下游基因的RNA及蛋白表达水平调控。在RBMS3不同表达水平下，通过免疫荧光实验检测β-Catenin的入核情况。
结果：RBMS3缺失/低表达可显著促进Wnt/β-Catenin信号通路的荧光素酶报告质粒的表达，反之RBMS3高表达可抑制其表达水平(如图4-D所示)。EMSA实验证实RBMS3缺失可促进β-Catenin信号的激活，而高表达RBMS3可抑制其激活(如图4-E所示)。PCR及Westernblot实验显示RBMS3缺失可促进Wnt/β-Catenin信号通路下游基因的激活(如图4-F、G所示)。免疫荧光实验也验证了RBMS3缺失可促进β-Catenin的入核，而高表达RBMS3可抑制β-Catenin的入核(如图4-H、I所示)。
结论：RBMS3缺失/低表达可促进Wnt/β-Catenin信号通路的激活。
(3)在临床样品中验证RBMS3对Wnt/β-Catenin信号通路的调控作用
方法：在实施例1中的150例EOC临床样品中进行β-Catenin蛋白的免疫组化实验，结合实施例1中的RBMS3免疫组化染色结果和β-Catenin蛋白的细胞核定位进行统计学分析。
结果：RBMS3低表达的EOC临床样品中，β-Catenin具有较高的细胞核定位比例(如图 4-H、I所示)。
结论：RBMS3低表达与Wnt/β-Catenin信号通路的激活具有临床相关性。
实施例5.RBMS3调控Wnt/β-Catenin信号通路的具体分子机制
(1)通过高通量测序数据分析RBMS3结合并调控的分子
方法：通过分析SKOV3/RBMS3HITS-CLIP测序数据，筛选出可与RBMS3结合的 Wnt/β-Catenin信号通路调控因子。在OV-2/RBMS3及SKOV3/RBMS3中通过RNA-免疫共沉淀(RIP)实验验证测序结果，筛选出两株细胞系中与RBMS3结合能力最强的基因。PCR和 Westernblot实验验证RBMS3对结合靶基因的RNA及蛋白水平调控作用。
结果：测序数据中筛选出可与RBMS3结合的22个Wnt/β-Catenin信号通路的负调控因子(如图5-A所示)。RIP实验证实DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个基因与RBMS3 结合能力最强(如图5-B所示)。RBMS3缺失抑制DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的RNA及蛋白表达水平(如图5-C、D所示)。
结论：RBMS3可结合并调控多个Wnt/β-Catenin信号通路的负调控因子。
(2)RBMS3对靶基因的具体调控分子机制
方法：根据已有文章报导，RBMS3是一个RNA结合蛋白，可结合靶基因的mRNA3’-UTR并稳定其表达，从而提高靶基因的表达水平。因此，在RBMS3低表达或高表达时，我们对DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的mRNA半衰期时间(Actinomycin D，10μg/mL， 0，2，4，6，8小时后分别检测mRNA表达水平)进行检测。已有文章报导RBMS3的结合碱基序列，于是我们在DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的mRNA3’-UTR寻找相应的碱基序列。将DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的mRNA 3’-UTR上相应的RBMS3结合序列敲除后，检测各自的mRNA 3’-UTR荧光素酶表达情况。
结果：DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的mRNA半衰期时间随着RBMS3 的缺失而缩短，同时随着RBMS3的高表达而延长(如图5-E所示)。敲除DKK3、AXIN1、 BACH1及NFAT5四个靶基因的mRNA 3’-UTR上相应的RBMS3结合序列后，RBMS3缺失对靶基因的mRNA表达无明显影响(如图5-F所示)。
结论：RBMS3可通过结合靶基因mRNA 3’-UTR上特异的碱基序列，从而稳定其mRNA的表达。
(3)RBMS3所调控靶基因的临床特征
方法：在实施例1中的150例EOC临床样品中，通过免疫组化实验检测DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的蛋白表达水平，并与实施例1中的RBMS3免疫组化结合进行相关行分析。通过DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的免疫组化实验结果将临床样品分为高、低表达两组，并分析两组患者的复发预后。
结果：免疫组化结果显示，在RBMS3低表达的样品中，DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的蛋白表达水平也随着降低，并且RBMS3的表达与DKK3、AXIN1、BACH1及 NFAT5四个靶基因的表达分别成显著正相关(如图5-G所示)。生存预后分析结果显示DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的低表达提示患者较高的复发率及较短的无病生存时间(如图5-H)。
结论：RBMS3与DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的表达具有临床相关性。
(4)验证RBMS3是否通过调控(1)中所述的分子而影响Wnt/β-Catenin信号通路和肿瘤耐药
方法：在OV-2RBMS3si#1及SKOV3RBMS3gRNA#1细胞中分别降低DKK3、AXIN1、 BACH1及NFAT5四个靶基因的表达，检测Wnt/β-Catenin信号通路的荧光素酶报告质粒的表达情况、Annexin V流式细胞凋亡比例及IC50浓度。
结果：在OV-2RBMS3si#1及SKOV3RBMS3gRNA#1细胞中分别降低DKK3、AXIN1、 BACH1及NFAT5四个靶基因的表达后，Wnt/β-Catenin信号通路的荧光素酶报告质粒的表达及IC50浓度均有不同程度的降低情况，而细胞凋亡比例则有一定程度的提高(如图5-I、5-J 及5-K所示)。
结论：RBMS3通过调控DKK3、AXIN1、BACH1及NFAT5四个靶基因的表达从而影响Wnt/β-Catenin信号通路和肿瘤耐药。
实施例6.Wnt/β-Catenin/CBP信号通路的小分子抑制剂是否可增强上皮性卵巢癌对顺铂的敏感性
(1)探讨在体外实验中ICG-001对顺铂敏感性的调控
方法：已有文章报导，ICG-001可抑制CBP与β-Catenin的结合，从而抑制Wnt/β-Catenin/CBP信号通路的激活。由于实施例5中所提到的RBMS3靶基因BACH1及 NFAT5是抑制CBP与β-Catenin结合的重要分子，因此RBMS3所调控的Wnt/β-Catenin信号通路很大程度上是集中于Wnt/β-Catenin/CBP信号通路上。因此，我们通过平板克隆实验检测 OV-2、OV-11原代细胞及SKOV3CRISPR control、SKOV3RBMS3gRNA#1细胞系分别在 Vehicle对照处理、顺铂单独处理、ICG-001单独处理及顺铂+ICG-001联合处理之后的生长情况以及Annexin V凋亡细胞比例。另外，在上述不同组细胞中，我们检测并计算了顺铂与 ICG-001的联合指数(Combination index,CI50)。
结果：在RBMS3未发生低表达的细胞系OV-2及SKOV3CRISPR control中，顺铂可显著促进肿瘤细胞的凋亡及抑制其增殖；然而在RBMS3缺失的细胞系OV-11及SKOV3RBMS3gRNA#1细胞系中，顺铂对肿瘤细胞的增殖及凋亡无明显的影响，但是联合运用顺铂+ICG-001 可促进肿瘤细胞的凋亡及抑制其增殖(如图6-A及6-B所示)。在OV-2及SKOV3CRISPRcontrol中,顺铂与ICG-001无明显协同作用(CI50≈1)，即Log(CI)的值约为0，但是在OV-11及SKOV3RBMS3gRNA#1细胞系中，顺铂与ICG-001具有较强的协同作用(CI50＜1)，即 Log(CI)的值小于为0(如图6-C所示)。
结论：RBMS3缺失的细胞中，ICG-001可增强肿瘤细胞的顺铂敏感性。
(2)探讨在体内实验中PRI-724对顺铂敏感性的调控
方法：利用OV-2、OV-11原代细胞及SKOV3CRISPR control、SKOV3RBMS3gRNA#1 细胞系分别构建小鼠腹腔肿瘤模型，待小鼠腹腔荧光值达到2*107p/sec/cm2/sr后，处理组分为Vehicle对照处理、顺铂单独处理、PRI-724单独处理及顺铂+PRI-724联合处理四组，记录小鼠的荧光值并分析各组小鼠的总体生存水平。
结果：在RBMS3未发生低表达的细胞系OV-2及SKOV3CRISPR control中，顺铂可显著抑制肿瘤的荧光值；然而在RBMS3缺失的细胞系OV-11及SKOV3RBMS3gRNA#1细胞系中，顺铂对肿瘤细胞的生长无明显影响，但是联合运用顺铂+PRI-724可抑制肿瘤的生长(如图6-D及6-F所示)。同样地，联合运用顺铂+PRI-724可显著延长OV-11及SKOV3RBMS3 gRNA#1组小鼠的生存时间(如图6-E及6-G所示)。
结论：RBMS3缺失的细胞中，PRI-724可增强肿瘤细胞的顺铂敏感性。
实施例7.RBMS3在多种肿瘤中表达降低并调控肿瘤耐药。
(1)分析RBMS3在除卵巢癌外的其它肿瘤类型中的表达及临床特征。
方法：通过分析TCGA中多种肿瘤类型中RBMS3的表达，筛选RBMS3表达降低的肿瘤类型。通过生存预后分析，分析RBMS3降低的肿瘤类型中RBMS3的低表达与临床预后的相关性。通过GSEA分析分析RBMS3低表达与肿瘤耐药的相关性。
结果：在TCGA公共数据中，RBMS3在乳腺癌、头颈鳞癌及肝细胞肝癌中表达降低(如图7-A所示)。此外，RBMS3低表达还提示着乳腺癌、头颈鳞癌及肝细胞肝癌患者较短的无复发生存时间(如图7-B所示)。GSEA相关性分析进一步证明：在乳腺癌、头颈鳞癌及肝细胞肝癌中，RBMS3与肿瘤耐药呈负相关(如图7-C所示)。
结论：RBMS3在多种肿瘤中表达降低，并与肿瘤患者的预后及耐药性相关。
(2)RBMS3在多种肿瘤中激活Wnt/β-Catenin信号通路，抑制RBMS3可增强小鼠对顺铂的敏感性。
方法：检测乳腺癌、头颈鳞癌及肝细胞肝癌细胞中RBMS3的不同表达水平对 Wnt/β-Catenin信号通路激活的影响。在小鼠体内抑制RBMS3表达，检测头颈鳞癌及肝细胞肝癌对顺铂的敏感性。将小鼠皮下肿瘤组织取出后，组织包埋后切片进行TUNEL免疫荧光染色。
结果：在乳腺癌、头颈鳞癌及肝细胞肝癌细胞中，RBMS3低表达可促进Wnt/β-Catenin 信号通路的激活，而RBMS3高表达可抑制Wnt/β-Catenin信号通路的激活(如图7-D所示)。在体内实验中，RBMS3低表达可促进小鼠皮下肿瘤在顺铂处理后的肿瘤大小(如图7-E所示)。小鼠皮下肿瘤组织的TUNEL染色显示：RBMS3低表达可抑制肿瘤细胞的TUNEL阳性细胞率，表明RBMS3低表达可抑制顺铂处理后的细胞凋亡。
结论：RBMS3在多种肿瘤中均可调控Wnt/β-Catenin信号通路及肿瘤耐药。
总结：本发明在包括卵巢癌在内的多种肿瘤中发现了Chr3p的缺失，并且与肿瘤的复发相关，这就提示Chr3p缺失可作为上皮性卵巢癌(EOC)患者的生存预后诊断分子标志物。进一步的分析结果显示，Chr3p上的Chr3p23-24.1区域缺失可作为EOC患者复发预后的独立影响因子，这提示Chr3p23-24.1区域缺失也可作为预测EOC患者复发的独立影响因子。通过 siRNA敲除实验，我们证明Chr3p23-24.1区域中的RBMS3基因是影响顺铂耐药最重要的基因，并在临床样品中验证RBMS3在EOC患者中存在缺失以及蛋白低表达。通过一系列体内外实验，RBMS3缺失被证实在EOC细胞中通过促进Wnt/β-Catenin信号通路，从而促进肿瘤细胞的顺铂耐药性并导致肿瘤复发，这就提示RBMS3缺失也可作为评估EOC患者肿瘤耐药及肿瘤复发的诊断分子标志物。从分子调控机制研究中，我们发现RBMS3可作为RNA结合蛋白结合并稳定表达Wnt/β-Catenin信号通路多个负调控因子的mRNA(DKK3、AXIN1、 BACH1及NFAT5)，由此RBMS3缺失才可促进Wnt/β-Catenin信号通路的激活。由于BACH1 及NFAT5是Wnt/β-Cateni/CBP信号通路的主要抑制分子，因此RBMS3缺失可显著激活 Wnt/β-Cateni/CBP信号通路从而影响顺铂耐药。通过大量体内外实验，我们证实在RBMS3 缺失的EOC细胞中，联合使用Wnt/β-Cateni/CBP信号通路的小分子抑制剂ICG-001/PRI-724 可显著增强肿瘤细胞的顺铂敏感性，并可提高实验小鼠的生存时间。由此，本发明为EOC患者的治疗提供了两种治疗方案，对于RBMS3-非缺失的EOC患者，单独使用顺铂即可以获得较好的治疗效果；但对于RBMS3-缺失的EOC患者，需要联合使用顺铂+PRI-724，才能使患者获得较好的肿瘤治疗效果。
综上所述，基因RBMS3能够作为肿瘤耐药检测靶点、肿瘤预后检测靶点、预测肿瘤复发检测靶点。据此可制备相应肿瘤耐药检测试剂盒、肿瘤预后检测试剂盒、预测肿瘤复发检测试剂盒，该些试剂盒中含有检测RBMS3基因水平拷贝数的试剂、定量检测RBMS3的RNA转录水平的试剂、定量检测RBMS3的蛋白表达水平的试剂等。通过检测患者肿瘤组织中RBMS3的基因拷贝数、RNA和蛋白表达水平以确定RBMS3是否缺失，从而判断该患者是否对顺铂治疗具有化疗抵抗性。通过检测患者肿瘤组织中RBMS3的基因拷贝数以确定 RBMS3是否缺失，从而判断该患者是否具有较高的复发倾向。通过检测患者肿瘤组织中 RBMS3的基因拷贝数以确定RBMS3是否缺失，从而对RBMS3缺失的病人制定顺铂联合 PRI-724(Wnt/β-catenin信号通路抑制剂)的治疗方案，以增强顺铂的治疗效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
广州杰尔克生物技术有限公司
<120> RBMS3作为肿瘤耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
catccagttc cctgcctcgg agata 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
caagtgcaga acgataccac gctg 24

Claims (3)

1.检测RBMS3的试剂在制备肿瘤耐药检测试剂盒、或肿瘤预后检测试剂盒、或预测肿瘤复发检测试剂盒中的应用，
所述肿瘤耐药中的药物指顺铂类药物；
所述肿瘤为卵巢癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测RBMS3的试剂选自检测RBMS3基因水平拷贝数的试剂、定量检测RBMS3的RNA转录水平的试剂、定量检测RBMS3的蛋白表达水平的试剂中的至少一种。
3.RBMS3蛋白或/和提高RBMS3蛋白表达的物质在制备提高肿瘤对顺铂类药物敏感性的药物中的应用；
所述肿瘤为卵巢癌。
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