CN113640518A - 去泛素化酶usp37作为药物靶点在筛选治疗耐药乳腺癌的药物中的用途 - Google Patents

去泛素化酶usp37作为药物靶点在筛选治疗耐药乳腺癌的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了去泛素化酶USP37作为药物靶点在筛选治疗耐药乳腺癌的药物中的用途。本发明还提供了去泛素化酶USP37在制备作为诊断耐药乳腺癌的试剂中的用途。本发明还提供了去泛素化酶USP37在制备治疗乳腺癌的药物中的用途，所述的治疗为通过靶向USP37并联合顺铂用药抑制乳腺癌细胞的增殖。本发明和Cisplatin相比，对乳腺癌的杀伤效果更明显。比起BLM抑制剂ML216更有特异性，以及不会产生脱靶效果。本发明在于明确去泛素化酶USP37在乳腺癌的发生发展中起关键性作用，证实靶向USP37并且联合化学药物或者联合辐射治疗可以更加有效治疗乳腺癌疾病，有效克服乳腺癌治疗中的耐药问题提供理论依据。

Description

去泛素化酶USP37作为药物靶点在筛选治疗耐药乳腺癌的药 物中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种去泛素化酶USP37，具体来说是去泛素化酶USP37作为药物靶点在筛选治疗耐药乳腺癌的药物中的用途。
背景技术
乳腺癌是全世界女性癌症发病率和死亡率的主要原因之一。相关研究数据显示，我国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一。目前正以每年3％的速度递增，并且有着患者年轻化的趋势。尤其是居住在大城市的女性，乳腺癌发病率逐年上升。乳腺癌现在已经成为中国女性恶性肿瘤中死亡率最高的。尽管他莫西芬(Tamoxifen)和顺铂(Cisplatin)等药物治疗可以显著降低其复发几率，但仍有约三分之一的患者会耐药而复发转移。乳腺癌耐药，即在早期治疗过程中，乳腺癌细胞对某些化疗药物敏感，药物在乳腺癌细胞内大量蓄积并进入细胞核，作用于DNA，导致细胞死亡。然而化疗进程中乳腺癌细胞产生变异，发生结构与功能进化，对药物不敏感，即乳腺癌耐药，最终导致化疗失败。因此，乳腺癌耐药是乳腺癌病人治疗的一个重要瓶颈。
乳腺癌产生耐药性的原因有很多，DNA损伤信号通路异常是其主要分子机制之一。即乳腺癌化疗药物通过引起乳腺癌细胞的DNA双链断裂损伤来诱导细胞凋亡杀伤乳腺癌。然而乳腺癌细胞为了抵抗药物杀伤，在压力应激下，一部分细胞会进化，显著提高自身DNA损伤修复效率，促进乳腺癌细胞的生存，这是乳腺癌耐药的主要分子机制之一。以往研究表明DNA损伤修复通路关键蛋白的突变与乳腺癌的耐药密切相关，如BRCA1，ATM，RECQL和XRCC1。
布鲁姆综合症(Bloom’s syndrome)是一种表现为基因组不稳定性的类似于范可尼贫血症的遗传性综合症，是属于一种较罕见的常染色体隐性遗传性疾病。这类病人通常在年幼时发病，在检查染色体时常见断裂和重新排列，还常伴有多发性的先天畸形。BLM基因的突变是导致布鲁姆综合症发病的主要原因，它是高度保守的RecQ DNA解螺旋酶家族重要成员之一。RecQ DNA解螺旋酶广泛存在于原核、真核生物和病毒体内，其在DNA复制、重组、修复及维护端粒的稳定等方面均发挥了关键的作用。当DNA发生双链断裂时，BLM解旋酶复合物能够被迅速的招募到DNA损伤诱导位点(DNA damage-induced foci)，进而能够促进同源重组的重要修复中间产物dHJ(double Holliday Junction)结构的解开生成没有发生遗传物质交换的精确同源重组修复产物(Non-crossover product)。过去的研究表明，对于MRN复合物和BRCA1基因招募至停滞复制叉处，BLM基因是必不可少的。BLM可促使Holliday中间体中DNA链移动，在由于DNA的复制过程的停止所引起的DNA双链断裂的HR中起关键作用。另外，当BLM发生功能缺陷突变时，DNA损伤信号的传导及同源重组修复不能正常进行，这将引起基因组不稳定进而可能诱发肿瘤。另一方面，BLM基因在某些肿瘤中存在超量表达的情况。例如，BLM在乳腺癌中的高表达与乳腺癌增殖与耐药密切相关。综上所述，BLM基因的严密调控在DNA同源重组修复中具有重要作用，进而对维持基因组稳定性及肿瘤干预至关重要。一方面，BLM基因发生突变促进肿瘤发生；另一方面，BLM在肿瘤中过量表达，导致肿瘤细胞DNA损伤修复能力提高，抵抗化疗药物的细胞杀伤作用。已有研究发现BLM解旋酶抑制剂ML216抑制人类细胞中染色体稳定性从而杀伤肿瘤细胞，但是此抑制剂缺乏特异性，并且还能靶向或者抑制其他解旋酶活性从而产生脱靶效应。因此，需要发现与BLM相关的新的癌症生物标记物。
泛素化修饰(ubiquitination)是细胞内重要的蛋白翻译后修饰途径，通过介导蛋白质降解及信号传导调控一系列生物学过程，包括：基因转录、免疫反应、肿瘤生长、细胞周期调节等。而这一过程也是一个可逆过程，其可逆过程主要通过去泛素化酶进行调节。目前研究发现，哺乳动物中发现约100种去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)，根据它们不同的催化区域结构，可分为5类：泛素羧基末端水解酶家族(UCH)、泛素特异性加工酶家族(USP)、MJD(Machado-Joseph Disease Protease)、OTU(ovarian tumour)和JAMM(JAB1/MPN/Mov34 Metallo-enzyme)，其中研究较多较为广泛的主要以前面两类为主。这些不同类型的去泛素化酶均能水解底物蛋白上泛素链之间的链接，起到去泛素化的作用，对蛋白泛素化进行反向调节，从而影响蛋白质的功能。近些年来，研究发现DUBs可以选择性地降解或稳定抑癌基因、癌基因以及与细胞增殖、分化、凋亡等细胞生物学相关的蛋白(如括转录因子、信号传导分子以及酶)，与肿瘤的发生发展密切相关。已有研究发现，USP12去泛素化并且稳定PHLPP和PHLPPL蛋白从而调控AKT信号通路进而参与肿瘤发生。另外，我们发现去泛素化酶UCHL3在同源重组修复中，去泛素化DNA损伤蛋白RAD51的信号级联调控机制研究，去泛素化酶USP13去泛素化修饰Receptor-associated protein 80(RAP80)信号轴依赖的DNA损伤应答机制。此外，我们发现去泛素化酶USP9X通过稳定YAP的表达而促进乳腺癌细胞的生长和抗药性机制研究，CDK4/6依赖的去泛素化酶DUB3通过稳定肿瘤基因Snail1而调控乳腺癌的转移机制研究及去泛素化酶USP20通过正向调控β-catenin的稳定性而促进肿瘤的生长、迁移、侵袭及耐药性的机制研究。综上所述，去泛素化酶通过逆向调控泛素化，参与泛素介导的多种生物学过程，通过调控多种基因参与不同信号通路调控肿瘤的生长、迁移和耐药等。
USP37(Ubiquitin-specific protease 37)属于去泛素化酶家族的半胱氨酸水解酶家族成员之一，在人体组织内分布广泛。USP37位于2号染色体长臂区，全长8022bp，包含27个外显子。USP37蛋白由979个氨基酸组成，在细胞核和细胞质中都有分布。近年来研究发现USP37参与许多生物学过程，包括细胞生长、有丝分裂、DNA复制、迁移和EMT(上皮间质转换)，肿瘤干性和化疗抵抗等，在疾病的发生发展中起重要作用。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了去泛素化酶USP37作为药物靶点在筛选治疗耐药乳腺癌的药物中的用途，所述的这种去泛素化酶USP37作为药物靶点在筛选治疗耐药乳腺癌的药物中的用途要解决现有技术中的药物对于乳腺癌的治疗效果不佳的技术问题。
本发明提供了去泛素化酶USP37作为药物靶点在筛选治疗耐药乳腺癌的药物中的用途。
本发明还提供了去泛素化酶USP37作为诊断耐药乳腺癌的生物标记物中的用途。
本发明还提供了去泛素化酶USP37在制备作为诊断耐药乳腺癌的试剂中的用途。
本发明还提供了去泛素化酶USP37在制备治疗乳腺癌的药物中的用途，所述的治疗为通过靶向USP37并联合顺铂用药抑制乳腺癌细胞的增殖。
本发明利用乳腺癌细胞实验和小鼠动物模型实验，探究USP37在乳腺癌耐药中的作用机制。第一，我们发现USP37与DNA损伤修复通路中的关键蛋白DNA解旋酶BLM发生相互作用，并且在HEK293T细胞敲低USP37，抑制了BLM蛋白的表达。另外过表达USP37，促进BLM蛋白的表达，另外chx实验同样证明USP37稳定BLM蛋白水平。第二，在细胞内外实验证明了USP37抑制BLM的泛素化水平。第三，细胞受DNA损伤药物顺铂Cisplatin刺激后，BLM的蛋白水平增加，但是mRNA水平不变。进一步的实验发现虽然Cisplatin诱导的BLM蛋白水平上升，但在去泛素化酶USP37敲低的细胞中并没有出现，这提示Cisplatin调控BLM蛋白水平受USP37调控。另外进一步实验我们发现Cisplatin诱导的DNA损伤促进了USP37与BLM之间的相互作用以及BLM的泛素化水平降低。第四，我们发现USP37受DNA损伤应答调控。Cisplatin激活ATM，ATM磷酸化USP37的第114位丝氨酸，此位点激活后促进USP37与BLM的互作并激活USP37的去泛素化酶活性。第五，在人骨肉瘤细胞U-2OS中敲低USP37并加入DNA损伤药物Cisplatin刺激，发现DNA损伤更严重(γ-H2AX为DNA损伤标记物，其Foci越多，说明DNA损伤越严重)。第六，在乳腺癌细胞中发现敲低USP37后，肿瘤细胞对顺铂(Cisplatin)和离子辐射(IR)更敏感，肿瘤细胞死亡更多。另外在小鼠动物实验中同样发现，过表达USP37并且加入Cisplatin刺激，促进了肿瘤生长。第七，通过TCGA数据库我们发现USP37在乳腺癌中高表达，以及GEO数据库发现USP37高表达的乳腺癌病人生存率更差。另外，在乳腺癌病人标本中利用免疫组化实验同样发现USP37呈高表达，并且和BLM的表达呈正相关。
综上所述，我们认为USP37通过促进DNA损伤修复蛋白BLM的表达，从而在乳腺癌中抑制了DNA损伤，最终促进乳腺癌耐药。因此，靶向USP37并联合顺铂Cisplatin用药，可缓解乳腺癌耐药成为可能。因此，这有助于帮助我们深入理解DNA损伤修复异常与乳腺癌耐药的内在联系，并且阐明USP37成为乳腺癌治疗靶点，为开发USP37的小分子抑制剂治疗乳腺癌提供依据，为临床开发治疗乳腺癌新型药物提供依据。
本发明和已有乳腺癌治疗药物Cisplatin相比，其进步是显著的，对乳腺癌的杀伤效果更明显。另外，比起BLM抑制剂ML216更有特异性，以及不会产生脱靶效果。本发明的创新点以及有益效果在于明确去泛素化酶USP37在乳腺癌的发生发展中起关键性作用，证实靶向USP37并且联合化学药物或者联合辐射治疗可以更加有效治疗乳腺癌疾病，为有效克服乳腺癌治疗中的耐药问题提供理论依据。
附图说明
图1显示去泛素化酶USP37与BLM互作，并促进BLM蛋白表达水平。
图2显示去泛素化酶USP37在体内外去泛素化BLM。
图3显示DNA损伤促进了去泛素化酶USP37对BLM蛋白的稳定作用。
图4显示去泛素化酶USP37受DNA损伤应答调控。
图5显示去泛素化酶USP37通过BLM抑制DNA损伤。
图6显示去泛素化酶USP37通过BLM促进乳腺癌细胞对化疗药物Cisplatin和放疗不敏感。
图7显示乳腺癌组织中USP37表达与BLM水平呈正相关。
具体实施方式
下述实验未提供出处的试剂均为市售试剂，未详细描述的方法均为常规的公知实验方法。
实施例1去泛素化酶USP37与BLM发生互作，并促进BLM蛋白表达
材料和方法：
1)试剂耗材
HEK293T细胞来源于美国ATCC。所用抗体来自于：USP37抗体订购于Proteintech，BLM抗体订购于Abcam，Myc抗体订购于Covance，HA和β-actin订购于Sigma。
2)具体实施过程：我们在HEK293T细胞瞬转MYC-BLM cDNA，CO-IP实验发现USP37与BLM互作(图1A)，进一步的全内源co-IP实验证实了USP37与BLM发生互作(图1B，C)。另外在HEK293T细胞瞬转HA-USP37浓度梯度质粒，Western blot实验发现USP37促进BLM蛋白水平的表达(图1D)，反之，稳定干扰USP37促进BLM蛋白表达下降。另外定量PCR说明USP37调控BLM蛋白水平但是mRNA水平不变(图1E).最后cycloheximide(CHX)刺激细胞，发现敲低USP37，BLM的蛋白水平稳定性下降，反之，过表达USP37促进BLM的蛋白稳定(图1G-J)。
实施例2去泛素化酶USP37在细胞体内外去泛素化BLM
材料和方法：
1)试剂耗材
Ub抗体和His抗体购置于Santa Cruz Biotechnology，HA，Flag抗体购置于Sigma公司。
2)具体实施过程：我们在HEK293T细胞用2条特异针对USP37的shRNA稳定干扰内源的USP37，ub assays实验发现干扰USP37后，BLM蛋白的泛素化水平增加(图2A-B)，反之，过表达野生型的USP37(WT-USP37)，而不是酶活性失活型的USP37(CA-USP37)，促进BLM的泛素化水平下降(图2C)。另外，细胞外实验同样验证了USP37能够去泛素化BLM(图2D)。进一步实验证明USP37切割BLM上的泛素链是以K63方式的，而不是K48方式切割(图2E-F)。
实施例3DNA损伤促进了去泛素化酶USP37对BLM蛋白的稳定作用。
材料和方法：
1)试剂耗材
Chk2抗体和p-Chk2抗体购置于Cell Signaling Technology公司。
2)具体实施过程：我们用DNA损伤药物Cispltin(3μmol/L)时间梯度刺激HEK293T细胞，Western blot实验发现BLM蛋白水平随着时间而逐渐增加，但是BLM的mRNA水平不变(图3A-B)。进一步实验发现，Cisplatin诱导的BLM蛋白水平在USP37稳定敲低的细胞里面并未增加(图3C)，这个结果说明在DNA损伤应激下，USP37调控BLM蛋白水平。此外在HEK293T细胞和乳腺癌细胞MCF7中都证实了在DNA损伤药物Cisplatin刺激下，USP37和BLM的互作水平增加(图3D-E)，这说明DNA损伤刺激促进了USP37和BLM的互作。进一步ub assays实验证明在DNA损伤下，BLM的泛素化水平下降(图3F)。总之，这些结果说明DNA损伤能增强USP37与BLM的互作，进而稳定BLM蛋白水平。
实施例4去泛素化酶USP37受DNA损伤应答调控
材料和方法：
1)试剂耗材
ATM抗体购置于Abcam公司，pS/TQ抗体购置于Cell Signaling Technology公司。
2)具体实施过程：前面实验证实了在DNA损伤情况下USP37抑制了BLM的泛素化水平。为了进一步探究USP37是否受DNA损伤调控，我们在HEK293T细胞里分别用DNA损伤药物Cisplatin和离子辐射(IR)处理细胞，并加入ATM抑制剂Ku55933和磷酸酶，Western blot实验发现ATM能够激活USP37的磷酸化，在加入ATM抑制剂或者磷酸酶后磷酸化作用消失了(图4A-B)。进一步的实验证明USP37在ATM+/+的MEF细胞里被磷酸化，而在ATM-/-的MEF细胞里没这个现象(图4C)。另外，通过以往文献推测，以及结合我们的实验，证明ATM磷酸化USP37的第114位丝氨酸，将114位丝氨酸突变成不能被磷酸化的丙氨酸时，这种磷酸化被阻断了(图4D)。进一步实验发现，将USP37的第114位丝氨酸突变成不能被磷酸化的丙氨酸时(S114A)，减弱了USP37与BLM的互作(图4E)。最后，在泛素化的细胞内外实验中，同样证实了将USP37稳定敲低后，在稳定转入USP37的磷酸化持续激活型突变质粒(S114E)和磷酸化失活型质粒(S114A)，发现只有S114E能够降低BLM的多聚泛素化水平(图4F-G)。总之，这些结果说明S114磷酸化增强UPS37和BLM之间的相互作用以及ATM对USP37的S114磷酸化从而激活USP37的去泛素化酶活性进而降低BLM的泛素化水平。
实施例5去泛素化酶USP37通过BLM抑制DNA损伤
材料和方法：
1)试剂耗材
Histone H3抗体购置于Abcam公司，cyclin A抗体购置于Santa CruzBiotechnology公司，γ-H2AX抗体分别购置于Cell Signaling Technology公司和Millipore公司。荧光二抗购置于Jackson Lab
2)具体实施过程：以往的文章发现BLM缺失或者突变损害了DNA末端切除，并且诱导了DNA损伤(通过γ-H2AX染色可以检测到)。因此为了进一步探索USP37-BLM信号轴在DNA损伤发生中的作用，在骨肉瘤U-2OS细胞中稳定敲低USP37，BLM，同时敲低USP37和BLM，加以Cisplatin时间梯度刺激，免疫荧光实验发现USP37通过BLM抑制了DNA损伤(γ-H2AX的Foci点更少)，并且是时间依赖的方式(图5A-C)。另外，在USP37稳定敲低的U-2OS细胞中，稳定转入USP37野生型质粒(USP37-WT)和USP37磷酸化突变型(S114A)后，加入Cisplatin刺激后，免疫荧光实验发现只有野生型的USP37减弱了DNA损伤发生(γ-H2AX的Foci点更少)，这些实验说明USP37抑制DNA损伤发生(图5D-F)。此外在细胞药敏实验中发现USP37抑制了细胞对化疗药物Cisplatin和放疗(离子辐射IR)的敏感性(图5G-I)。
实施例6去泛素化酶USP37通过BLM促进乳腺癌细胞对化疗药物Cisplatin和放疗不敏感。
众所周知，DNA损伤应答通路的状态直接影响着癌细胞对化疗药物或放疗的反应，因此DNA损伤应答通路中的关键元件的缺失会促进癌细胞对DNA损伤剂的敏感性，因此我们进一步研究USP37-BLM信号轴在人类癌细胞化疗或放疗反应中的作用。
2)具体实施过程：首先我们通过Western blot实验检测人类正常乳腺上皮细胞和多种乳腺癌细胞中USP37和BLM蛋白的表达水平，我们发现USP37和BLM蛋白水平在多种乳腺癌细胞中都高表达(图6A).其次在USP37高表达的乳腺癌细胞株MCF7细胞中敲低USP37，敲低BLM，同时敲低USP37和BLM，分别用Cisplatin或者IR处理，细胞药敏实验发现敲低USP37，癌细胞对DNA损伤药物和IR更敏感(图6B-D)。进一步实验发现，在USP37低表达的乳腺癌T-47D细胞中过表达USP37，敲低BLM，敲低BLM后稳定过表达USP37，分别用Cisplatin或者IR处理，细胞药敏实验发现过表达USP37后，癌细胞对DNA损伤药物Cisplatin和IR更不敏感，而且在BLM敲低的细胞中过表达USP37，癌细胞同样对药物和IR更敏感(图6E-G)，这些实验说明USP37通过BLM抑制了乳腺细胞对DNA损伤药物和IR的敏感性。此外，我们发现USP37调控乳腺耐药是通过其酶活性的(图6H-J)。最后在小鼠模型中，我们在高表达USP37的MDA-MB-231乳腺癌细胞株上敲低USP37，然后外源替换稳定导入USP37野生型质粒(USP37-WT)或者USP37磷酸化失活型突变质粒(USP37-S114A)，打入裸鼠皮下，等到肿瘤长到100mm3左右，打入DNA损伤药物Cisplatin，时间梯度测量肿瘤大小，我们发现只有USP37-WT的裸鼠皮下肿瘤明显长的更快更重(图6K-M)，这些结果说明USP37抑制乳腺癌细胞对DNA损伤药物的敏感性。
实施例7乳腺癌组织中USP37表达与BLM水平呈正相关
为了进一步确定USP37-BLM信号轴与乳腺癌之间在临床上的相关性，在临床公共数据库中我们发现USP37在乳腺癌标本中是高表达的(图7A-B)以及GEO公共数据库发现USP37表达的增加与乳腺癌患者的低生存率显著相关(图7C)。另外在乳腺癌病人的临床样本中通过免疫组化实验发现USP37在乳腺癌组织中是高表达的，而且与BLM的表达呈正相关(图7D-F)。

Claims (4)

1.去泛素化酶USP37作为药物靶点在筛选治疗耐药乳腺癌的药物中的用途。
2.去泛素化酶USP37作为诊断耐药乳腺癌的生物标记物中的用途。
3.去泛素化酶USP37在制备作为诊断耐药乳腺癌的试剂中的用途。
4.去泛素化酶USP37在制备治疗乳腺癌的药物中的用途，所述的治疗为通过靶向USP37并联合顺铂用药抑制乳腺癌细胞的增殖。
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