CN110806452A - 一种检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，具体步骤包括：(1)取样品加入提取溶液涡旋振荡，旋涡震荡后放入微波反应器中微波加热，然后超声处理后离心，移取上清液A另存；(2)向移取上清液A后剩余残渣中再次加入提取溶液涡旋振荡，旋涡震荡后微波加热，然后超声处理后离心，移取上清液B另存，(3)将上清液A与上清液B合并，然后吹干，得到样品提取液干粉；(4)将提取液干粉进行复溶液涡旋振荡，然后加入C18、PAS和中性氧化铝基质固相萃取剂，超声处理后离心，将上清液经滤膜过滤，得待测样；(5)检测待测样中抗病毒药物残留的含量。所述检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法具有快速、回收率高的优点。
Description
技术领域
本公开涉及食品安全领域，具体涉及一种检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法。
背景技术
随着社会快速进步人民生活水平得到了极大到的提高，水产品例如：鱼、虾也逐渐成为日常生活的刚需。人们对水产品的市场需求，带动了水产品养殖量的扩增。规模化程度低下的养殖量盲目扩增导致了水产品疾病复杂化加上兽药市场监管的混乱，在利益的驱使下从业者将人用抗病毒药物金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚或吗啉胍等拿来给水产动物食用，但这些药物并没有被批准用作兽用。
2005年，美国食品药物管理局(FDA)已经下令禁止把人类抗病毒药物滥用于畜禽中，与此同时我国农业部第560号公告也曾明令禁止抗病毒药物作为兽药使用。虽然抗病毒药属兽用禁用药物，但其在实际畜禽养殖中依然使用广泛，若饲养者不科学、不合理地使用该药物，易导致药物在畜禽机体内残留，不仅会对畜禽本身带来中毒，也会引起病毒耐药毒株的出现使抗病毒药物有效性降低，其耐药性也有转移扩散到人体的风险，对消费者的健康存在很大的隐患。保障畜禽产品安全，不仅有利于公众健康，而且可以大力促进我国进出口贸易快速健康发展。而抗病毒药物残留检测技术，将会成为最大程度上解决因使用抗病毒药物而产生的食品安全问题的重要研究内容。
现有的水产品肉中抗毒药残留检测方法主要采用酶联免疫法、气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱法等检测动物组织中的金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚和吗啉胍，检测项目与基质都比较单一，每一种抗病毒药检测方法都不尽相同，所使用的仪器，试剂均存在不同程度的差异，而且每一种方法的可检测范围及精密度也存在较大的差异，甚至一些抗病毒药至今还缺少检测方法，这样就造成了检测成本高，周期长，难度大等问题。因此如何提出一种简便快捷，成本节约，环境友好，结果可靠，且能适应多种基质中的多种抗病毒药物同时检测的高通量方法势在必行。
发明内容
本公开的目的是提供一种检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，以快速检测水产品肉中残留的抗病毒药物残留含量。
为实现上述目的，技术方案如下：
一种检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，所述方法的具体步骤包括：
(1)取样品加入提取溶液进行涡旋振荡，旋涡震荡后在进行微波加热，然后经超声处理后离心，移取上清液A另存；
(2)向移取上清液A后剩余残渣中再次加入提取溶液进行涡旋振荡，旋涡震荡后再进行微波加热，然后超声处理后离心，移取上清液B另存；
(3)分别将上清液A与上清液B合并，然后吹干，得到样品提取液干粉；
(4)将提取液干粉进行复溶液涡旋振荡，然后加入C18、PAS和中性氧化铝基质固相萃取剂，超声处理后离心，将其上清液经滤膜过滤，得到待测样；
(5)利用超高效液相色谱串联质谱仪对待测样中抗病毒药物残留的含量进行检测。
所述提取溶液为1％三氯乙酸和1％乙酸乙腈的混合物，所述1％三氯乙酸和1％乙酸乙腈之间添加的比例为1：9，优选的所述样品与提取溶液添加比例为1g：5mL。
所述微波加热的温度为50-65℃，所述微波加热的时间为5-9min。
所述旋涡震荡的转速为2500r/min，所述旋涡振荡时间为1-10min。
所述超声处理的频率为30-40kHZ，所述超声处理的时间为14-17min。
所述离心的转速为6000-10000r/min，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为4-6min。
所述吹干的方法为水浴氮吹，所述水浴氮吹的温度为45℃。
所述复溶液为0.1％甲酸水和甲醇的混合物，所述0.1％甲酸水和甲醇添加的比例为1：9，复溶液的添加量为1ml。
所述基质固相萃取剂C18、PSA和中性氧化铝的添加量分别为30mg、30mg和50mg。
所述滤膜的滤孔直径为0.22μm。
本公开的有益效果是：提供了一种检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，所述方法中利用微波加热处理，可以在较短的时间内破坏细胞膜，形成微小的空洞和裂纹，这样可以使得提取液更易的进入细胞内，可更充分更快的将细胞内残留的抗病毒药物提取出来，其中超声处理也可破坏细胞膜结构，以提高残留的抗病毒药物提取率，且C18可有效去除脂类、糖类等亲脂性杂质，PSA粉可去除基质中的脂肪酸和甾醇类干扰物，中性氧化铝通过路易斯酸碱作用、极性相互作用、和离子交换作用能有效的吸附基质中脂肪类杂质，所以本公开所述检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法具有快速、回收率高的优点。
附图说明
图1为金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、吗啉胍标准溶液MRM色谱图。
图2为金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、吗啉胍在南美对白虾肉中的MRM色谱图。
图3为金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、吗啉胍在鲤鱼肉中的MRM色谱图。
图4为金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、吗啉胍在草鱼肉中的MRM色谱图。
具体实施方式
以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。
实施例1一种检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法
1.材料、仪器及溶液配制
1.1材料与仪器
API4000超高效液相色谱串联质谱仪(美国WHATERS公司)；HSC-24B氮吹浓缩仪(天津市恒奥科技发展公司)；JW-3021HK低温超高速离心机(安徽嘉文)；BT25S电子天平(感量0.00001g，梅特勒-托利多仪器有限公司)；JJ500电子天平(感量0.001g，双杰测试公司)；MTV-100涡旋混合器(杭州奥盛仪器有限公司)。
甲醇(色谱纯，德国SccBayer公司)；乙腈(色谱纯，德国SccBayer公司)；甲酸(分析纯，天津科密欧化学试剂厂)；三氯乙酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；C18(粒径40μm，青云实验耗材有限公司)；PSA(美国Agilent公司)；中性氧化铝(国药集团化学试剂有限公司)；美金刚(纯度99.2％，美国Sigma公司)；金刚乙胺(纯度99％，美国Sigma公司)；金刚烷胺(纯度98％,中国食品药品检定研究所)；吗啉胍(纯度98.3％，日本TCI公司)。
1.2抗病毒药物标准溶液的配制
准确称取金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、吗啉胍10mg(按实际含量折算，精确至0.0001)，分别置100ml容量瓶中使用甲醇溶解并稀释，配成0.1mg/ml外标储备溶液，-18℃下保存。
2.仪器的条件
2.1色谱条件
色谱柱：Shim-pack GIST C18-AQ HP(3μm，2.1×100mm)；流动相:A(0.1％甲酸水)，B(甲醇)；柱温：35℃；进样量：10μL，梯度洗脱程序如表1。
表1梯度洗脱程序
2.2质谱条件
离子源:电喷雾离子源(ESI+)；扫描方式：正离子扫描；气帘气压力(CurtainGas)：25psi；离子源喷雾电压(Ionspray Voltage)：5500V；碰撞气压力(Collision Gas)：5psi；离子源温(temperature)：550℃；喷雾气(GS1)压力：60psi；加热辅助雾化气(GS2)压力：55psi；检测方式：多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)；监测离子对、锥孔电压和碰撞能量参数如表2。
表2目标化合物的多反应监测质谱参数
注：a为定量离子。
3.实验方法
其中用空白鲤鱼肉、草鱼和南美对白虾肉试样进行加标回收和精密度试验，添加水平均为1、10、50μg/kg的金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚和吗啉胍，混匀后静置使标准溶液被样品充分吸收(每个添加水平测定6次)，然后将鱼肉和虾肉分别切成小块后绞肉机绞碎，分别称取2g上述处理好的样品，精确至0.01g，于50mL聚丙烯具塞离心管中为待测样品，添加与检测样品同样水平量的金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚和吗啉胍外标标准液分别为阳性对照，分别在待测样品和阳性对照中加入1％三氯乙酸和1％乙酸乙腈(1:9)提取液10mL，2500r/min涡旋震荡5min，然后放入微波反应器中60℃微波加热6min，超声15min后用冷冻高速离心机8000r/min，4℃离心5min取上清液于另一支50mL离心管中，在残渣中加入5ml提取液重复上述操作，合并上清液；
利用分散固相萃取的方法，分散固相萃取剂主要有PSA、C18、中性氧化铝，将上述空白鲤鱼待测样品、草鱼待测样品、虾肉待测样品和4种标准工作液阳性对照合并的上清液于45℃水浴氮吹至干，在吹干的离心管中加入1mL0.1％甲酸水和甲醇(1:9，V:V)的复溶液，2500r/min涡旋振荡3min进行复溶，复溶液的添加量为1mL，将复溶后的液体全部转移到加有30mgPSA、30mgC18、50mg中性氧化铝的2mL的离心管中，然后将上清液过0.22μm滤膜；
最后利用超高效液相色谱串联质谱仪对待测样进行检测待测样品和阳性对照滤液中的金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚和吗啉胍，以保留时间和特征离子对定性，峰面积的内标曲线法定量。
4.结果分析
4.1方法线性范围及检出限
将上述4种抗病毒药物的质量浓度设置为1-100μg/L，采用内标法，以待测物的质量浓度作为横坐标，以待测物定量离子的峰面积与内标定量离子的峰面积之比作为纵坐标，绘制标准曲线；此外，利用上述方法在空白鲤鱼、草鱼、南美对白虾样品中加入4种抗病毒类药物的标准溶液，经过提取和净化后，进行仪器检测，以3倍信噪比为检出限，以10倍信噪比为定量限。4种抗病毒药物的的线性方程、相关系数及检出限、定量限如表3所示。目前，我国行业标准SN/T4253—2015《出口动物组织中抗病毒类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》中对抗病毒类药物的检测低限为1.0μg/kg，《食药监食监三便函[2014]73号动物源性食品中金刚烷胺的检测》中对金刚烷胺的检测低限为5.0μg/kg，因此，本公开建立的4种抗病毒药物方法能够符合国内检测的要求。
表3线性方程与检出限
4.2方法的回收率和精密度结果
以空白鲤鱼、草鱼、南美对白虾作为样品基质，在1、10、50μg/kg含量水平上添加4种抗病毒药混合标准溶液，按上述方法测定并计算回收率，每个添加水平测定6个平行样品，利用上述实验方法进行回收率实验。结果如表4，显示在空白鲤鱼、草鱼、南美对白虾样品中4种抗病毒药物的回收率在86％-98.5％之间，相对标准偏差(relative standarddeviation，RSD)小于8％，其精密度和回收率均符合残留分析方法。其中金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚和吗啉胍的MRM色谱图分别见图1、图2、图3和图4，其中图1(A是金刚烷胺、B是金刚乙胺、C是美金刚、D是吗啉胍)为标准溶液MRM色谱图，图2(A是金刚烷胺、B是金刚乙胺、C是美金刚、D是吗啉胍)为金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚和吗啉胍在南美对白虾肉中的MRM色谱图，图3(A是金刚烷胺、B是金刚乙胺、C是美金刚、D是吗啉胍)为金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚和吗啉胍在鲤鱼肉中的MRM色谱图，图4(A是金刚烷胺、B是金刚乙胺、C是美金刚、D是吗啉胍)为金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚和吗啉胍在草鱼肉中的MRM色谱图，根据可以看出本公开所述的检测方法所检测出的鲤鱼、草鱼和南美对白虾中金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚和吗啉胍的回收率高，且实验结果更加准确可靠,特别适用于实际样品的批量检测。
表4南美对白虾、鲤鱼和草鱼肉中4种抗病毒药物的添加回收率和精密度(n＝6)
Claims (10)
1.一种检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：
(1)取样品加入提取溶液进行涡旋振荡，旋涡震荡后放入微波反应器中进行微波加热，然后经超声处理后离心，移取上清液A另存；
(2)向移取上清液A后剩余残渣中再次加入提取溶液进行涡旋振荡，旋涡震荡后再进行微波加热，然后超声处理后离心，移取上清液B另存；
(3)分别将上清液A与上清液B合并，然后吹干，得到样品提取液干粉；
(4)将提取液干粉进行复溶液涡旋振荡，然后加入C18、PAS和中性氧化铝基质固相萃取剂，超声处理后离心，将其上清液经滤膜过滤，得到待测样；
(5)利用超高效液相色谱串联质谱仪对待测样中抗病毒药物残留的含量进行检测。
2.根据权利要求书1中所述的检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，其特征在于，所述提取溶液为1％三氯乙酸和1％乙酸乙腈的混合物，所述1％三氯乙酸和1％乙酸乙腈之间添加的比例为1：9，优选的所述样品与提取溶液添加比例为1g：5mL。
3.根据权利要求书1中所述的检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，其特征在于，所述微波加热的温度为50-65℃，所述微波加热的时间为5-9min。
4.根据权利要求书1中所述的检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，其特征在于，所述旋涡震荡的转速为2500r/min，所述旋涡振荡时间为1-10min。
5.根据权利要求书1中所述的检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，其特征在于，所述超声处理的频率为30-40kHZ，所述超声处理的时间为14-17min。
6.根据权利要求书1中所述的检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，其特征在于，所述离心的转速为6000-10000r/min，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为4-6min。
7.根据权利要求书1中所述的检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，其特征在于，所述吹干的方法为水浴氮吹，所述水浴氮吹的温度为45℃。
8.根据权利要求书1中所述的检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，其特征在于，所述复溶液为0.1％甲酸水和甲醇的混合物，所述0.1％甲酸水和甲醇添加的比例为1：9，复溶液的添加量为1ml。
9.根据权利要求书1中所述的检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，其特征在于，所述基质固相萃取剂C18、PSA和中性氧化铝的添加量分别为30mg、30mg和50mg。
10.根据权利要求书1中所述的检测水产品肉中抗病毒药物残留含量的方法，其特征在于，所述滤膜的滤孔直径为0.22μm。
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