CN110785428A - 用于分析蛋白质-蛋白质界面的方法和试剂 - Google Patents

用于分析蛋白质-蛋白质界面的方法和试剂 Download PDF

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M.金
N.珀尔
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Abstract

本公开提供可用于分析蛋白质‑蛋白质界面诸如呈递蛋白(例如，FKBP家族的成员、亲环蛋白家族的成员或PIN1)与靶蛋白之间的界面的方法和试剂。在一些实施方案中，所述靶蛋白和/或呈递蛋白是细胞内蛋白。在一些实施方案中，所述靶蛋白和/或呈递蛋白是哺乳动物蛋白。

Description

用于分析蛋白质-蛋白质界面的方法和试剂
背景技术
绝大多数小分子药物通过结合靶蛋白上功能上重要的口袋，从而调节所述蛋白的活性来起作用。例如，降胆固醇的药物他汀类结合HMG-CoA还原酶的酶活性位点，从而阻止所述酶与其底物结合。已知许多此类药物/靶相互作用对的事实可能使某些人误认为只要有合理的时间量、精力和资源就可以为大多数(即使不是全部)蛋白质发现小分子调节剂。事实并非如此。目前的估计认为，所有人类蛋白质中只有约10％可以被小分子靶向。目前认为其他90％对小分子药物发现是难以克服或棘手的。此类靶通常被称为“不可成药的(undruggable)”。这些不可成药的靶包括医学上重要的人类蛋白质的大量且在很大程度上未开发的储备库。因此，在发现能够调节此类不可成药的的靶的功能的新分子形态方面存在极大的兴趣。
发明内容
小分子在靶向能力方面受到限制，因为它们与靶的相互作用是由粘附力驱动的，粘附力的强度大致与接触表面积成正比。由于其尺寸小，小分子累积足够的分子间接触表面积以有效地与靶蛋白相互作用的唯一方法是被所述蛋白完全吞噬。实际上，大量的实验和计算数据都支持如下观点：只有那些表面具有疏水性“口袋”的蛋白质才能够结合小分子。在那些情况下，吞噬使结合成为可能。
大自然已经发展出一种策略，允许小分子在疏水性口袋以外的位点与靶蛋白相互作用。所述策略由天然存在的免疫抑制药物环孢霉素A、雷帕霉素和FK506举例说明。这些药物的生物学活性涉及形成小分子与小分子呈递蛋白的高亲和力复合物。小分子和呈递蛋白的复合表面结合靶。因此，例如，在环孢菌素A与亲环蛋白A(cyclophilinA)之间形成的二元复合物以高亲和力和特异性靶向钙调磷酸酶，但是环孢菌素A或亲环蛋白A都不单独地以可测量的亲和力结合钙调磷酸酶。
本发明人已经开发了可用于鉴定呈递蛋白和靶蛋白对并探查它们之间的界面以用于开发能够调节这些相互作用的小分子的化合物和缀合物。
因此，本公开提供可用于分析蛋白质-蛋白质界面诸如呈递蛋白(例如，FKBP家族的成员、亲环蛋白家族的成员或PIN1)与靶蛋白之间的界面的方法和试剂。这种分析可用于帮助设计能够同时结合呈递蛋白和靶蛋白两者的小分子，使得所得小分子-呈递蛋白复合物可以结合靶蛋白并调节靶蛋白的活性。在一些实施方案中，靶蛋白和/或呈递蛋白是细胞内蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白和/或呈递蛋白是哺乳动物蛋白。
在一些方面，本公开提供可以用作交联底物的化合物。这些化合物可以包含能够与蛋白质(例如，靶蛋白或呈递蛋白)共价或非共价结合的蛋白结合部分以及至少一个能够与和结合蛋白结合部分的蛋白质不同的蛋白质的氨基酸化学选择性反应的交联基团。在一些实施方案中，所述化合物包含仅一个交联基团。
因此，一方面，本公开提供一种化合物，其包含蛋白结合部分(例如，呈递蛋白结合部分或靶蛋白结合部分)和交联基团(例如，能够与和结合蛋白结合部分的蛋白质不同的蛋白质的氨基酸化学选择性反应的部分)。蛋白结合部分能够(共价或非共价)结合蛋白质(例如，呈递蛋白或靶蛋白，取决于其是呈递蛋白结合部分还是靶蛋白结合部分)，而交联基团能够与蛋白质(例如，呈递蛋白、靶蛋白或能够结合此类其他蛋白质的另一种化合物)形成共价键。在一些实施方案中，当所述化合物包含呈递蛋白结合部分时，所述化合物不包含靶蛋白结合部分。在一些实施方案中，当所述化合物包含靶蛋白结合部分时，所述化合物不包含呈递蛋白结合部分。
在一些实施方案中，交联基团是巯基反应性交联基团(例如，所述交联基团包括混合的二硫化物、马来酰亚胺、乙烯基砜、乙烯基酮或烷基卤)、氨基反应性交联基团、羧基反应性交联基团、羰基反应性交联基团或形成三唑的交联基团。
在一些实施方案中，交联基团包括混合的二硫化物，例如，交联基团包括式Ia的结构：
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点；并且
a是0、1或2；
RA是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的C2-C9杂芳基。
在一些实施方案中，RA是任选取代的C2-C9杂芳基(例如，吡啶基)。在一些实施方案中，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000032
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，RA是任选取代的C1-C6杂烷基(例如，N,N-二甲基乙基)。在一些实施方案中，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000041
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。在一些实施方案中，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000042
在一些实施方案中，RA是任选取代的C1-C6烷基(例如，甲基)。在一些实施方案中，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000043
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括基于碳的交联基团(例如，在与硫醇反应时形成碳-硫键的交联基团)。
在一些实施方案中，交联基团包括马来酰亚胺，例如，交联基团包括式Ib、Ic、Id或Ie的结构：
Figure BDA0002302535140000044
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点；
XA是–C(O)-或–SO2-；
XB是–C(O)-或CRERF；
RB和RC独立地是氢、卤素、任选取代的羟基、任选取代的氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；
RD是氢、羟基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RE和RF独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
在一些实施方案中，交联基团包括式Ib的结构。在一些实施方案中，XA是–C(O)-。在一些实施方案中，XB是–C(O)-。在一些实施方案中，RB和RC是氢或任选取代的C1-C6烷基(例如，甲基)。
在一些实施方案中，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000051
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000061
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括式If、Ig、Ih或Ii的结构：
Figure BDA0002302535140000062
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点；
XC是–C(O)-或–SO2-；
XD不存在，是NRJRK或ORL；
RG、RH和RI独立地是氢、腈、卤素、任选取代的羟基、任选取代的氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RJ、RK和RL独立地不存在，是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
在一些实施方案中，交联基团包括式If的结构。在一些实施方案中，XD不存在。在一些实施方案中，RG、RH和RI是氢。在一些实施方案中，XC是–C(O)-。在一些实施方案中，XC是–SO2-。
在一些实施方案中，交联基团包括乙烯基砜，例如，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000071
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括乙烯基砜，例如，交联基团包括结构：
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括乙烯基酮，例如，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000073
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括乙烯基酮，例如，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000074
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括乙烯基酮，例如，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000081
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括炔酮，诸如式Ij或Ik的结构：
Figure BDA0002302535140000082
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点；
XE不存在，是NRNRO或ORP；
RM是氢、卤素、任选取代的羟基、任选取代的氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RN、RO和RP独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
在一些实施方案中，交联基团包括乙烯基酮，例如，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000091
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括式Im或In的结构：
Figure BDA0002302535140000092
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点；
XF不存在，是NRSRT或ORU；
XG不存在，或者是–C(O)-；
Y是离去基团；
RQ和RR独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RS、RT和RU独立地不存在，是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Y是卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或三氟甲磺酸酯。在一些实施方案中，Y是腈。在一些实施方案中，XF和XG不存在。在一些实施方案中，RQ和RR是氢。在一些实施方案中，交联基团包括烷基卤，诸如烷基氯，例如，交联基团包括结构：
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。在一些实施方案中，交联基团包括烷基卤，诸如烷基氯或烷基氟，例如，交联基团包括结构：
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括环氧化物，例如，交联基团包括式Io的结构：
Figure BDA0002302535140000103
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点；
RV、RW和RX独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基、任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
在一些实施方案中，交联基团包括式Ip的结构：
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点；
虚线代表为芳族结构所必需包含的任选双键；
b是0、1或2；
Y是离去基团；
RY和RZ独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基、任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；
XH、XI、XJ、XK和XL各自独立地不存在，是NRAA或CRAB，其中XH、XI、XJ、XK和XL中至少五个是NRAA或CRAB；
RAA不存在，或者是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RAB是氢、腈、卤素、任选取代的羟基、任选取代的氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
在一些实施方案中，至少一个RAB是吸电子基团。在一些实施方案中，一至三个RAB是吸电子基团。
在一些实施方案中，Y是腈。在一些实施方案中，Y是卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或三氟甲磺酸酯。
在一些实施方案中，交联基团包括结构：
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000122
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团包括结构：
Figure BDA0002302535140000131
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，交联基团是内部交联基团，例如，交联基团包括式Iq、Ir或Is的结构：
Figure BDA0002302535140000132
其中波浪线示出交联基团与化合物的其余部分的连接点；
XM是–C(O)-或–SO2-；
XN不存在，是NRAE或O；
RAC和RAD独立地是氢、腈、卤素、任选取代的羟基、任选取代的氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RAE是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
在一些实施方案中，XN是NRAE，其中RAE是氢。在一些实施方案中，RAC和RAD是氢。在一些实施方案中，XM是–C(O)-。在一些实施方案中，XM是–SO2-。
在任何前述化合物的一些实施方案中，蛋白结合部分能够与蛋白质非共价相互作用。在任何前述化合物的一些实施方案中，蛋白结合部分能够与蛋白质共价相互作用。
在一些方面，本公开提供一种化合物，其包含呈递蛋白结合部分和交联基团。在一些实施方案中，蛋白结合部分和交联基团通过接头连接。
在一些方面，本公开提供一种具有以下结构的化合物：
Figure BDA0002302535140000141
Figure BDA0002302535140000151
Figure BDA0002302535140000161
在一些方面，本公开提供缀合物、其合成方法及其用途，所述缀合物包含通过接头与靶蛋白缀合的能够与呈递蛋白共价或非共价结合的呈递蛋白结合部分。
因此，另一方面，本公开提供一种缀合物，其包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分。在一些实施方案中，缀合物的呈递蛋白结合部分能够与呈递蛋白非共价相互作用。在一些实施方案中，缀合物的呈递蛋白结合部分能够与呈递蛋白共价相互作用。
在一些方面，本公开提供一种产生缀合物的方法，所述缀合物包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分。所述方法包括使(a)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物与(b)靶蛋白在允许产生所述缀合物的条件下反应。
在一些方面，本公开提供一种产生缀合物的方法，所述缀合物包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分。所述方法包括提供(a)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物；(b)靶蛋白；和(c)呈递蛋白；以及使所述化合物与所述靶蛋白在允许产生所述缀合物的条件下反应。
在一些方面，本公开提供复合物、其产生方法及其用途，所述复合物包含呈递蛋白和包含呈递蛋白结合部分和靶蛋白的缀合物。
因此，另一方面，本公开提供一种复合物，其包含(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白。
在一些方面，本公开提供一种产生复合物的方法，所述复合物包含(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白。所述方法包括在允许产生复合物的条件下将包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物与呈递蛋白组合。
在一些方面，本公开提供一种产生复合物的方法，所述复合物包含(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白。所述方法包括提供(a)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物；(b)靶蛋白；和(c)呈递蛋白；以及使所述化合物与所述靶蛋白在允许产生所述复合物的条件下反应。
在前述方法的一些实施方案中，所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下与所述化合物结合。在前述方法的一些实施方案中，所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下基本上不与所述化合物结合。在前述方法的一些实施方案中，所述化合物与所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下基本上不反应。在前述方法的一些实施方案中，所述化合物和所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下反应。在前述方法的一些实施方案中，所述条件不包括还原剂。在前述方法的一些实施方案中，所述条件包括过量的呈递蛋白。
在一些实施方案中，在不存在所述靶蛋白的情况下观察到所述化合物与所述呈递蛋白之间的可检测的结合。然而，在一些实施方案中，在不存在所述靶蛋白的情况下，未观察到所述化合物与所述呈递蛋白之间的可检测的结合(例如，所述呈递蛋白基本上不与所述化合物结合)。在一些实施方案中，在不存在所述呈递蛋白的情况下未观察到交联基团与靶蛋白之间的显著反应(例如，显著的缀合物形成)。然而，在一些实施方案中，即使在不存在呈递蛋白的情况下，也可以观察到交联基团与靶蛋白之间的显著反应。在一些实施方案中，在存在呈递蛋白的情况下与在不存在呈递蛋白的情况下相比，在给定的测定中，这种反应的速率和/或程度(例如，缀合物形成的速率和/或量)可能不同(例如，在存在呈递蛋白的情况下，缀合物形成的速率和/或量是2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或100倍大)。
在一些实施方案中，如本文所述的缀合物产生在不包括(例如，基本上不含)还原剂的条件下执行。
在一些实施方案中，本发明提供一种复合物，其包含(i)呈递蛋白；(ii)如本文所述的化合物(例如，其结构包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物)；和(iii)靶蛋白。在一些实施方案中，将这种复合物暴露于和/或维持在允许交联部分与靶蛋白反应的条件下，使得在其之间形成交联。在一些实施方案中，所述交联是与靶蛋白的氨基酸中(例如，氨基酸侧链中)的杂原子发生。在一些实施方案中，所述交联是与靶蛋白中半胱氨酸中的-S-原子发生。在一些实施方案中，所述靶蛋白是天然靶蛋白的变体；在一些此类实施方案中，所述变体具有显示高度(例如，80％、81％、82％；83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的天然靶蛋白但差别在于取代或添加至少一种易于参与与交联基团的交联的氨基酸(例如，其氨基酸侧链包含可以参与这种交联的杂原子)的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供缀合物、其合成方法及其用途，所述缀合物包含通过接头与呈递蛋白缀合的能够与靶蛋白共价或非共价结合的靶蛋白结合部分。
因此，另一方面，本公开提供一种缀合物，其包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分。在一些实施方案中，缀合物的靶蛋白结合部分能够与靶蛋白非共价相互作用。在一些实施方案中，缀合物的靶蛋白结合部分能够与靶蛋白非共价相互作用。在一些实施方案中，靶蛋白结合部分和呈递蛋白通过接头缀合。
在一些方面，本公开提供一种产生缀合物的方法，所述缀合物包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分。所述方法包括使(a)包含靶蛋白结合部分和交联基团的化合物与(b)呈递蛋白在允许产生所述缀合物的条件下反应。
在一些方面，本公开提供一种产生缀合物的方法，所述缀合物包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分。所述方法包括提供(a)包含靶蛋白结合部分和交联基团的化合物；(b)呈递蛋白；和(c)靶蛋白；以及使所述化合物与所述呈递蛋白在允许产生所述缀合物的条件下反应。
在一些实施方案中，在不存在所述呈递蛋白的情况下观察到所述化合物与所述靶蛋白之间的可检测的结合。然而，在一些实施方案中，在不存在所述呈递蛋白的情况下，未观察到所述化合物与所述靶蛋白之间的可检测的结合(例如，所述呈递蛋白基本上不与所述化合物结合)。在一些实施方案中，在不存在所述靶蛋白的情况下未观察到交联基团与呈递蛋白之间的显著反应(例如，显著的缀合物形成)。然而，在一些实施方案中，即使在不存在靶蛋白的情况下，也可以观察到交联基团与呈递蛋白之间的显著反应。在一些实施方案中，在存在呈递蛋白的情况下与在不存在呈递蛋白的情况下相比，在给定的测定中，这种反应的速率和/或程度(例如，缀合物形成的速率和/或量)可能不同(例如，在存在呈递蛋白的情况下，缀合物形成的速率和/或量是2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍大)。
在一些实施方案中，所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下与所述化合物结合。在一些实施方案中，所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下基本上不与所述化合物结合。在一些实施方案中，所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下基本上不与所述化合物结合。在一些实施方案中，在不存在所述呈递蛋白的情况下未观察到交联基团与靶蛋白之间的反应(例如，缀合物形成)。然而，在一些实施方案中，即使在不存在呈递蛋白的情况下，也观察到交联基团与靶蛋白之间的反应。在一些实施方案中，如本文所述的缀合物产生在不包括(例如，基本上不含)还原剂的条件下执行。
在一些实施方案中，本发明提供一种复合物，其包含(i)呈递蛋白；(ii)如本文所述的化合物(例如，其结构包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物)；和(iii)靶蛋白。在一些实施方案中，将这种复合物暴露于和/或维持在允许交联部分与靶蛋白反应的条件下，使得在其之间形成交联。在一些实施方案中，所述交联是与靶蛋白的氨基酸中(例如，氨基酸侧链中)的杂原子发生。在一些实施方案中，所述交联是与靶蛋白中半胱氨酸中的-S-原子发生。在一些实施方案中，所述靶蛋白是天然靶蛋白的变体；在一些此类实施方案中，所述变体具有显示高度(例如，80％、81％、82％；83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的天然靶蛋白但差别在于取代或添加至少一种易于参与与交联基团的交联的氨基酸(例如，其氨基酸侧链包含可以参与这种交联的杂原子)的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供复合物、其产生方法及其用途，所述复合物包含靶蛋白和包含通过接头与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物。
在一些方面，本公开提供一种复合物，其包含(i)包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白。在一些实施方案中，将这种复合物暴露于和/或维持在允许交联部分与呈递蛋白反应的条件下，使得在其之间形成交联。在一些实施方案中，所述交联是与呈递蛋白的氨基酸中(例如，氨基酸侧链中)的杂原子发生。在一些实施方案中，所述交联是与呈递蛋白中半胱氨酸中的-S-原子发生。在一些实施方案中，所述呈递蛋白是天然呈递蛋白的变体；在一些此类实施方案中，所述变体具有显示高度(例如80％、81％、82％；83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的天然呈递蛋白但差别在于取代或添加至少一种易于参与与交联基团的交联的氨基酸(例如，其氨基酸侧链包含可以参与这种交联的杂原子)的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供一种产生复合物的方法，所述复合物包含(i)包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物和(ii)靶蛋白。所述方法包括在允许产生复合物的条件下将包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物与靶蛋白组合。
在一些方面，本公开的特征在于一种产生复合物的方法，所述复合物包含(i)如本文所述的缀合物(例如，包含靶蛋白结合部分和呈递蛋白的缀合物)和(ii)靶蛋白。在一些此类实施方案中，所提供的方法包括在允许产生复合物的条件下将缀合物与靶蛋白组合。可替代地或另外，在一些实施方案中，这种方法包括例如(i)彼此组合(a)化合物(例如，其结构包含靶蛋白结合部分和交联基团的化合物)；(b)靶蛋白；和(c)呈递蛋白；以及(ii)将所述组合暴露于和/或维持在允许产生所述复合物的条件下。在一些此类实施方案中，所述条件允许交联基团与呈递蛋白反应，使得产生缀合物。
在一些方面，本公开提供一种产生复合物的方法，所述复合物包含(i)包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物和(ii)靶蛋白。所述方法包括提供(a)包含靶蛋白结合部分和交联基团的化合物；(b)呈递蛋白；和(c)靶蛋白；以及使所述化合物与所述呈递蛋白在允许产生所述复合物的条件下反应。
在一些此类实施方案中，所述条件使得所述化合物、呈递蛋白和/或靶蛋白的特征在于在不存在所述呈递蛋白的情况下观察到所述化合物与所述靶蛋白之间的可检测的结合。然而，在一些实施方案中，在不存在所述呈递蛋白的条件下，未观察到所述化合物与所述靶蛋白之间的可检测的结合(例如，所述靶蛋白基本上不与所述化合物结合)。在一些实施方案中，在所述条件下在不存在靶蛋白的情况下，未观察到交联基团与呈递蛋白之间的显著反应。然而，在一些实施方案中，在所述条件下，即使在不存在靶蛋白的情况下，也可以观察到交联基团与呈递蛋白之间的显著反应。在一些实施方案中，所述条件不包括还原剂。在一些实施方案中，所述条件包括过量的呈递蛋白。
在一些实施方案中，所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下与所述化合物结合。在一些实施方案中，所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下基本上不与所述化合物结合。在一些实施方案中，所述化合物与所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下基本上不反应。在一些实施方案中，所述化合物与所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下反应。在一些实施方案中，所述条件不包括还原剂。在一些实施方案中，所述条件包括过量的靶蛋白。
在一些方面，本公开提供化合物，其包含能够与呈递蛋白非共价相互作用的呈递蛋白结合部分和能够与靶蛋白共价或非共价相互作用的靶蛋白结合部分。在一些实施方案中，呈递蛋白结合部分和靶蛋白结合部分通过接头连接。
因此，在一些方面，本公开提供一种具有式VII的结构的化合物：
A-L-B
式VII
其中A包括式VIIIa或VIIIb的结构：
Figure BDA0002302535140000231
其中b和c独立地是0、1或2；
d是0、1、2、3、4、5、6或7；
X1和X2各自独立地不存在，是CH2、O、S、SO、SO2或NR13；
R1和R2各自独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基)、任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基)，或者R1和R2与它们所结合的碳原子组合形成C＝O，或者R1和R2组合形成任选取代的C3-C10碳环基或任选取代的C2-C9杂环基；
R3各自独立地是羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基)、或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基)，或者两个R8组合形成任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C2-C9杂环基，例如任选取代的C2-C9杂芳基；
R4是任选取代的C1-C6烷基；
L是任选的接头；并且
B是靶蛋白结合部分。
在式VII的化合物的一些实施方案中，靶蛋白结合部分B能够与靶蛋白非共价相互作用。在式VII的化合物的一些实施方案中，靶蛋白结合部分B能够与靶蛋白共价相互作用。在式VII的化合物的一些实施方案中，存在接头L。在式VII的化合物的一些实施方案中，不存在接头L。
在一些方面，本公开提供三元复合物、其产生方法及其用途，所述三元复合物包含呈递蛋白、靶蛋白和包含呈递蛋白结合部分和靶蛋白结合部分的化合物。
因此，另一方面，本公开提供一种复合物，其包含(i)式VII的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白。
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物和复合物可以用于鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的包含呈递蛋白结合部分和靶蛋白的缀合物。
在一些方面，本发明的特征在于一种鉴定和/或表征能够与呈递蛋白形成复合物的如本文所述的缀合物(例如，其中其结构包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物与靶蛋白缀合)的方法。在一些实施方案中，这种方法包括以下步骤：(a)提供(i)这种缀合物(例如，其结构包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物与靶蛋白缀合)和(ii)呈递蛋白；(b)如果所述缀合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则将缀合物与呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定是否形成包含缀合物和呈递蛋白的复合物，其中所述复合物的形成指示所述缀合物是能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物。
因此，在一些方面，本公开提供一种鉴定和/或表征能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；(b)如果所述缀合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则将缀合物与呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定是否形成包含缀合物和呈递蛋白的复合物，其中所述复合物的形成指示所述缀合物是能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物。
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物和复合物可以用于鉴定能够在存在呈递蛋白的情况下与化合物形成共价键的靶蛋白。
因此，另一方面，本公开提供一种鉴定和/或表征能够在存在呈递蛋白的情况下与化合物反应的靶蛋白的方法，其中所述化合物包含呈递蛋白结合部分和交联部分。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含呈递蛋白结合部分和交联部分的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；(b)如果缀合物能够与呈递蛋白形成复合物，则将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定在所述复合物形成期间靶蛋白与化合物是否反应形成缀合物，其中如果靶蛋白与化合物形成缀合物，则将靶蛋白鉴定为能够在存在呈递蛋白的情况下与化合物反应。
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物和复合物可以用于鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白。
因此，另一方面，本公开提供一种鉴定和/或表征与呈递蛋白结合的靶蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；(b)如果所述缀合物能够与呈递蛋白形成复合物，则将所述缀合物与所述呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定靶蛋白是否与复合物中的呈递蛋白结合，其中如果靶蛋白与呈递蛋白结合，则将靶蛋白鉴定为与呈递蛋白结合。
在一些方面，本公开提供一种鉴定和/或表征与呈递蛋白结合的靶蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含呈递蛋白结合部分和交联部分的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；(b)如果缀合物能够与呈递蛋白形成复合物，则将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定靶蛋白是否与复合物中的呈递蛋白结合，其中如果靶蛋白与呈递蛋白结合，则将靶蛋白鉴定为与呈递蛋白结合的靶蛋白。
在一些方面，本公开提供一种鉴定和/或表征能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)式VII的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；(b)如果缀合物能够与呈递蛋白形成复合物，则将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定化合物、靶蛋白和呈递蛋白是否形成复合物，其中如果化合物、靶蛋白和呈递蛋白形成复合物，则将靶蛋白鉴定为能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白。
在一些方面，本公开提供一种鉴定和/或表征与呈递蛋白结合的靶蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)式VII的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；(b)如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定靶蛋白是否与复合物中的呈递蛋白结合，其中如果靶蛋白与呈递蛋白结合，则将靶蛋白鉴定为与呈递蛋白结合的靶蛋白。
在一些方面，本公开提供一种鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白的方法，所述方法通过以下进行：(a)提供(i)一种或多种靶蛋白，(ii)上述化合物中的任一种；和(iii)包含标签(例如，亲和标签)的呈递蛋白；(b)如果所述靶蛋白中的一种或多种能够与所述呈递蛋白形成复合物，则将所述一种或多种靶蛋白、所述化合物和所述呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定一种或多种靶蛋白是否与化合物和呈递蛋白形成复合物，其中将与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白鉴定为能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白。
在一些实施方案中，所述确定步骤包括利用所述呈递蛋白的标签来选择性分离已经与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白(例如，通过在下拉实验中使用)。在一些实施方案中，复合物包含靶蛋白、呈递蛋白和本发明的化合物。在一些实施方案中，复合物包含缀合物，所述缀合物包含靶蛋白和呈递蛋白结合部分(例如，通过本发明化合物的交联基团与靶蛋白的反应性氨基酸之间的反应形成的缀合物)；和呈递蛋白。在一些实施方案中，所述方法还包括(d)鉴定在一种或多种靶蛋白、化合物和呈递蛋白之间形成的复合物中的靶蛋白(例如，确定靶蛋白的结构)。在一些实施方案中，所述鉴定靶蛋白的结构包括对复合物进行质谱法。在一些实施方案中，可以使用下拉实验来进行靶蛋白与呈递蛋白是否形成复合物并且/或者靶蛋白是否与复合物中的呈递蛋白结合的确定，其中对靶蛋白或呈递蛋白进行标记(例如，其中复合物可以在存在复合物中没有的靶蛋白和/或呈递蛋白的情况下被选择性地下拉)。
在一些方面，本公开提供一种鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白的方法，所述方法通过以下进行：(a)提供(i)两种或更多种靶蛋白；(ii)上述化合物中的任一种；和(iii)包含亲和标签的呈递蛋白；(b)如果所述靶蛋白能够与所述呈递蛋白形成复合物，则将所述两种或更多种靶蛋白、所述化合物和所述呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；(c)选择性地分离步骤(b)中形成的靶蛋白、化合物和呈递蛋白的一种或多种复合物；以及(d)通过质谱法鉴定步骤(c)中分离的一种或多种复合物中的靶蛋白(例如，确定靶蛋白的结构)；从而鉴定出能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白。
在一些实施方案中，所述确定步骤包括利用所述呈递蛋白的标签来选择性分离已经与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白(例如，通过在下拉实验中使用)。在一些实施方案中，复合物包含靶蛋白、呈递蛋白和本发明的化合物。在一些实施方案中，复合物包含缀合物，所述缀合物包含靶蛋白和呈递蛋白结合部分(例如，通过本发明化合物的交联基团与靶蛋白的反应性氨基酸之间的反应形成的缀合物)；和呈递蛋白。在一些实施方案中，可以使用下拉实验来进行靶蛋白与呈递蛋白是否形成复合物并且/或者靶蛋白是否与复合物中的呈递蛋白结合的确定，其中对靶蛋白或呈递蛋白进行标记(例如，其中复合物可以在存在复合物中没有的靶蛋白和/或呈递蛋白的情况下被选择性地下拉)。
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物和复合物可以用于鉴定靶蛋白上连接呈递蛋白结合部分而产生缀合物的位置，所述缀合物能够与呈递蛋白形成复合物。
因此，另一方面，本公开提供一种鉴定和/或表征靶蛋白上与呈递蛋白结合部分形成缀合物的位置，所述缀合物能够与呈递蛋白形成复合物。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含在一个位置处与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物；和(ii)呈递蛋白；(b)将所述缀合物与所述呈递蛋白组合；(c)确定缀合物与呈递蛋白是否形成复合物；以及(d)任选地重复步骤(a)至(c)，直至缀合物和呈递蛋白形成复合物，呈递蛋白结合部分在靶蛋白上的不同位置处缀合，其中如果缀合物和呈递蛋白形成复合物，则鉴定靶蛋白上与呈递蛋白结合部分形成缀合物的位置，所述缀合物能够与呈递蛋白形成复合物。在一些实施方案中，呈递蛋白是天然存在的靶蛋白的变体。
在一些方面，本公开提供一种鉴定和/或表征靶蛋白上与呈递蛋白结合部分形成缀合物的位置，所述缀合物能够与呈递蛋白形成复合物。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；(b)将所述化合物与所述靶蛋白在存在所述呈递蛋白的情况下在允许形成包含在一个位置处与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物的条件下组合；(c)确定缀合物与呈递蛋白是否形成复合物；以及(d)任选地重复步骤(a)至(c)，直至缀合物和呈递蛋白形成复合物，其中呈递蛋白结合部分在靶蛋白上的不同位置处缀合；其中如果缀合物和呈递蛋白形成复合物，则鉴定靶蛋白上与呈递蛋白结合部分形成缀合物的位置，所述缀合物能够与呈递蛋白形成复合物，从而鉴定出靶蛋白上形成能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物的位置。在一些实施方案中，靶蛋白是天然存在的靶蛋白的变体。
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物和复合物可以用于鉴定能够在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白形成共价键的化合物。在一些实施方案中，鉴定的化合物在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白选择性地形成共价键。
因此，另一方面，本公开提供一种鉴定和/或表征能够在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白共价结合的化合物的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供样品，其包含(i)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；以及(b)确定所述化合物和所述靶蛋白是否通过所述样品中所述化合物中的交联基团形成共价键，其中如果化合物和靶蛋白在样品中反应，则将化合物鉴定为在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白共价结合。
在一些方面，本公开提供一种鉴定和/或表征能够在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白选择性且共价结合的化合物的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供第一样品，其包含(i)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；和第二样品，其包含(i)与所述第一样品中相同的包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物和(ii)与所述第一样品中相同的靶蛋白；以及(b)确定与第二样品中相比第一样品中化合物与靶蛋白反应的程度，其中如果与在第二样品中相比，第一样品中化合物与靶蛋白更大程度地反应，则将化合物鉴定为在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白选择性地共价结合。
在一些实施方案中，如果第一样品中化合物和靶蛋白的反应程度是第二样品中的至少5倍，则将化合物鉴定为在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白选择性地共价结合。在一些实施方案中，如果第一样品中化合物与靶蛋白反应，但在第二样品中基本上不反应，则将化合物鉴定为在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白选择性地共价结合。
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物和复合物可以用于鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的包含靶蛋白和呈递蛋白结合部分的缀合物。
因此，另一方面，本公开提供一种鉴定和/或表征能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；和(b)将所述缀合物与所述呈递蛋白在适合形成复合物的条件下组合；(c)确定缀合物与呈递蛋白是否形成复合物，其中如果缀合物与呈递蛋白形成复合物，则将所述缀合物鉴定为能够与呈递蛋白形成复合物，从而鉴定出能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物。
在一些实施方案中，缀合物与蛋白质之间的结合可以通过包括三元时间分辨的荧光能量转移测定、三元扩增的发光邻近均质测定、等温滴定量热法、表面等离子体共振或核磁共振的方法来确定。
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物和复合物可以用于确定在呈递蛋白与靶蛋白之间的蛋白质-蛋白质界面的结构。
因此，另一方面，本公开提供一种确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构和/或测定所述界面的一种或多种结构特征的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；(b)使所述缀合物与所述呈递蛋白接触以形成复合物(例如，在小瓶中)；以及(c)确定所述复合物的晶体结构，其中界面的结构至少包括在呈递蛋白与靶蛋白之间的晶体结构的一部分，从而确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构。
在一些方面，本公开提供一种确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构和/或测定所述界面的一种或多种结构特征的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含呈递蛋白结合部分和交联部分的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；(b)在适合在所述化合物与所述靶蛋白之间形成缀合物以及在所述缀合物与所述呈递蛋白之间形成复合物(例如，在小瓶中)的条件下将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白组合；以及(c)确定所述复合物的晶体结构，其中界面的结构至少包括在呈递蛋白与靶蛋白之间的晶体结构的一部分，从而确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构。
在一些方面，本公开提供一种确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构和/或测定所述界面的一种或多种结构特征的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)式VII的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；(b)形成包含所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白的复合物(例如，在小瓶中)；以及(c)确定所述复合物的晶体结构，其中界面的结构至少包括在呈递蛋白与靶蛋白之间的晶体结构的一部分，从而确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构。
在一些方面，本公开提供一种确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中蛋白质-蛋白质界面的结构和/或测定所述界面的一种或多种结构特征的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供前述复合物中的任一种的晶体；以及(b)确定所述晶体的结构，其中界面的结构至少包括在呈递蛋白与靶蛋白之间的晶体结构的一部分，从而确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中蛋白质-蛋白质界面的结构。
在一些方面，本公开提供一种鉴定和/或表征能够调节靶蛋白的生物学活性的化合物的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中蛋白质-蛋白质界面的结构(例如，通过前述方法中的任一种确定的结构)；以及(b)确定能够在所述界面处结合的化合物的结构，从而鉴定出能够调节靶蛋白的生物学活性的化合物。在一些实施方案中，使用计算方法确定能够在界面处结合的化合物的结构。在一些实施方案中，能够在界面处结合的化合物的结构通过筛选用于在存在靶蛋白和呈递蛋白的情况下形成复合物的本文所述的包含呈递蛋白结合部分的化合物来确定。
在一些方面，本公开提供一种获得复合物的X射线晶体坐标的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；(b)如果所述缀合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则将缀合物和呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定所述复合物的晶体结构，从而获得复合物的X射线晶体坐标。
在一些方面，本公开提供一种获得复合物的X射线晶体坐标的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)包含呈递蛋白结合部分和交联部分的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；(b)如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定所述复合物的晶体结构，从而获得复合物的X射线晶体坐标。
在一些方面，本公开提供一种获得复合物的X射线晶体坐标的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供(i)本发明的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；(b)如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白在适合允许复合物形成的条件下组合；以及(c)确定所述复合物的晶体结构，从而获得复合物的X射线晶体坐标。
在一些方面，本公开提供一种确定靶蛋白上参与与呈递蛋白结合的残基。所述方法包括以下步骤：(a)提供通过本发明的方法获得的复合物的X射线晶体坐标；(b)鉴定靶蛋白的残基，所述残基包含在呈递蛋白上的原子的
Figure BDA0002302535140000321
内的原子；从而确定靶蛋白上参与与呈递蛋白结合的残基。在一些方面，本公开提供一种确定本文所述的呈递蛋白/靶蛋白复合物中的任一种的生物化学和/或生物物理特性的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供通过本文所述的方法获得的本文所述的复合物的X射线晶体坐标；(b)计算所述复合物的生物化学和/或生物物理特性；从而确定呈递蛋白/靶蛋白复合物的生物化学和/或生物物理特性。
在一些实施方案中，所述生物化学和/或生物物理特性包括复合物的结合自由能、复合物的Kd、复合物的Ki、复合物的Kinact和/或复合物的Ki/Kinact。在一些实施方案中，生物化学和/或生物物理特性通过等温滴定量热法、表面等离子体共振和/或质谱法确定。
在一些实施方案中，包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中的界面是或包含结合口袋。
在一些方面，本公开提供在溶液中的包含前述化合物中的任一种、靶蛋白和呈递蛋白的组合物。
在一些方面，本公开提供一种药物组合物，其包含本发明的化合物、缀合物或复合物中的任一种和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物呈单位剂型。
在一些方面，本公开提供一种调节靶蛋白(例如，真核靶蛋白，诸如哺乳动物靶蛋白或真菌靶蛋白，或原核靶蛋白，诸如细菌靶蛋白)的方法。在一些实施方案中，这种方法包括使靶蛋白与调节(例如，正或负调节)量的本发明的化合物(例如，在存在呈递蛋白的情况下)、包含靶蛋白结合部分的缀合物或组合物中的任一种接触的步骤。
在一些方面，本公开提供一种调节(例如，正调节或负调节)靶蛋白(例如，真核靶蛋白，诸如哺乳动物靶蛋白或真菌靶蛋白，或原核靶蛋白，诸如细菌靶蛋白)的方法。在一些实施方案中，这种方法包括使表达靶蛋白和呈递蛋白的细胞与有效量的本发明的化合物或组合物在一定条件下接触，从而调节(例如，正或负调节)靶蛋白的步骤，在所述条件下，化合物可以与呈递蛋白形成复合物并且所得复合物可以与靶蛋白结合。
在一些方面，本公开提供一种调节(例如，正调节或负调节)靶蛋白(例如，真核靶蛋白，诸如哺乳动物靶蛋白或真菌靶蛋白，或原核靶蛋白，诸如细菌靶蛋白)的方法。在一些实施方案中，这种方法包括使靶蛋白与本发明的包含靶蛋白结合部分的缀合物接触，从而调节靶蛋白的步骤。
在一些方面，本公开提供一种抑制脯氨酰异构酶活性的方法。在一些实施方案中，这种方法包括使表达脯氨酰异构酶的细胞与本发明的化合物或组合物在允许在所述化合物与所述脯氨酰异构酶之间形成复合物的条件下接触，从而抑制脯氨酰异构酶活性。
在一些方面，本公开提供一种在细胞中形成呈递蛋白/化合物复合物的方法。在一些实施方案中，这种方法包括使表达呈递蛋白的细胞与本发明的化合物或组合物在允许在化合物与呈递蛋白之间形成复合物的条件下接触的步骤。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白结合部分能够结合由表1的基因中的任一种编码的蛋白质。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白结合部分是脯氨酰异构酶结合部分。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白结合部分是FKBP结合部分(例如，呈递蛋白结合部分能够结合FKBP12、FKBP12.6、FKBP13、FKBP25、FKBP51或FKBP52)、亲环蛋白结合部分(例如，呈递蛋白结合部分能够结合PP1A、CYPB、CYPC、CYP40、CYPE、CYPD、NKTR、SRCyp、CYPH、CWC27、CYPL1、CYP60、CYPJ、PPIL4、PPIL6、RANBP2或PPWD1)或PIN1结合部分。在前述方法中的任一种的一些实施方案中，已知呈递蛋白与呈递蛋白结合部分结合。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白结合部分是FKBP结合部分(例如，选择性FKBP结合部分或非选择性FKBP结合部分)。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，FKBP结合部分包括式IIa或IIb的结构：
Figure BDA0002302535140000351
其中Z1和Z2各自独立地是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6杂烷基，或者Z1和Z2与它们所连接的原子组合形成任选取代的10至40元大环；并且其中Z1或Z2中的至少一个包括与交联基团连接的点；
b和c独立地是0、1或2；
d是0、1、2、3、4、5、6或7；
X1和X2各自独立地不存在，是CH2、O、S、SO、SO2或NR4；
R1和R2各自独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基)、任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基)，或者R1和R2与它们所结合的碳原子组合形成C＝O，或者R1和R2组合形成任选取代的C3-C10碳环基或任选取代的C2-C9杂环基；
R3各自独立地是羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基)、或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基)，或者两个R8组合形成任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基，例如任选取代的C2-C9杂芳基；并且
R4各自独立地是氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、C3-C7碳环基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和任选取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白结合部分包括结构：
Figure BDA0002302535140000361
Figure BDA0002302535140000371
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白结合部分是亲环蛋白结合部分(例如，选择性亲环蛋白结合部分或非选择性亲环蛋白结合部分)。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，亲环蛋白结合部分包括式III或IV的结构：
Figure BDA0002302535140000372
其中Z3、Z4、Z5和Z6各自独立地是羟基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6杂烷基，或者Z3和Z4或Z5和Z6与它们所连接的原子组合形成任选取代的10至40元大环；
Z3、Z4、Z5、Z6或R5中的至少一个包括与交联基团连接的点；
e是0、1、2、3或4；
R5和R7独立地是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；
R6是任选取代的C1-C6烷基；并且
R8是氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、C3-C7碳环基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和任选取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，亲环蛋白结合部分包括式IVa的结构：
其中R7’各自独立地是羟基、氰基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基)或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基)。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白结合部分包括结构：
Figure BDA0002302535140000391
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，靶蛋白是GTP酶、GTP酶活化蛋白、鸟嘌呤核苷酸交换因子、热激蛋白、离子通道、卷曲螺旋蛋白、激酶、磷酸酶、泛素连接酶、转录因子、染色质改性剂/重塑剂或具有经典蛋白质-蛋白质相互作用结构域和基序的蛋白质。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，靶蛋白包括不可成药的的表面。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，靶蛋白不具有传统的结合口袋。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，靶蛋白的氨基酸序列已被修饰以用反应性氨基酸(例如，天然氨基酸，诸如半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸，或非天然氨基酸)取代至少一种天然氨基酸。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，靶蛋白的氨基酸序列已被修饰以用非反应性氨基酸(例如，天然氨基酸，诸如丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸，或非天然氨基酸)取代至少一种天然反应性氨基酸(例如，半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸)。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，所述至少一种天然反应性氨基酸是暴露于溶剂的氨基酸。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，修饰靶蛋白的氨基酸序列以用非反应性氨基酸取代所有反应性氨基酸。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，所述取代是保守取代。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，靶蛋白仅包含一种暴露于溶剂的反应性氨基酸。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白是由表1的基因中的任一种编码的蛋白质。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白是脯氨酰异构酶。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，脯氨酰异构酶是FKBP家族的成员(例如，FKBP12、FKBP12.6、FKBP13、FKBP25、FKBP51或FKBP52)、亲环蛋白家族的成员(例如，PP1A、CYPB、CYPC、CYP40、CYPE、CYPD、NKTR、SRCyp、CYPH、CWC27、CYPL1、CYP60、CYPJ、PPIL4、PPIL6、RANBP2或PPWD1)或PIN1。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白的氨基酸序列已被修饰以用反应性氨基酸(例如，天然氨基酸，诸如半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸，或非天然氨基酸)取代至少一种天然氨基酸。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，呈递蛋白的氨基酸序列已被修饰以用非反应性氨基酸(例如，天然氨基酸，诸如丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸，或非天然氨基酸)取代至少一种天然反应性氨基酸(例如，半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸)。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，所述至少一种天然反应性氨基酸是暴露于溶剂的氨基酸。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，修饰呈递蛋白的氨基酸序列以用非反应性氨基酸取代所有反应性氨基酸。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，所述取代是保守取代。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，接头的长度是1至20个原子。在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，接头的长度是1.5至30埃。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，接头具有式V的结构：
A1-(B1)f-(C1)g-(B2)h-(D)-(B3)i-(C2)j-(B4)k-A2
式V
其中A1是接头与蛋白结合部分之间的键；A2是交联基团与接头之间的键；B1、B2、B3和B4各自独立地选自任选取代的C1-C2烷基、任选取代的C1-C3杂烷基、O、S和NRN；RN是氢、任选取代的C1-4烷基、任选取代的C2-4烯基、任选取代的C2-4炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C1-7杂烷基；C1和C2各自独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基或磷酰基；f、g、h、I、j和k各自独立地是0或1；并且D是任选取代的C1-10烷基、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C2-C10聚乙二醇或任选取代的C1-10杂烷基，或连接A1-(B1)f-(C1)g-(B2)h-与-(B3)i-(C2)j-(B4)k-A2的化学键。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，接头包括式VI的结构：
Figure BDA0002302535140000421
其中A1是接头与蛋白结合部分之间的键；
A2是交联基团与接头之间的键；
l是0、1、2或3；
m是0或1；
n是0、1或2；并且
X3、X4和X5各自独立地不存在，是O、S、-C≡C-、CR9R10或NR11；并且
R9、R10和R11各自独立地是氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、C3-C7碳环基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和任选取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。在一些实施方案中，R9、R10和R11各自独立地是氢、未取代的C1-C6烷基、未取代的C2-C6烯基、未取代的C2-C6炔基、未取代的芳基、C3-C7碳环基、未取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和未取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。
在前述化合物、缀合物、复合物、组合物或方法中的任一种的一些实施方案中，接头包括结构：
Figure BDA0002302535140000422
Figure BDA0002302535140000431
化学术语
本领域技术人员将理解，本文所述的某些化合物可以一种或多种不同的异构形式(例如，立体异构体、几何异构体、互变异构体)和/或同位素形式(例如，其中一个或多个原子已被原子的不同同位素取代，诸如氢取代氘)存在。除非另外指明或从上下文中清楚地看出，否则所描绘的结构可以理解为单独或组合地代表任何此类异构或同位素形式。
本文所述的化合物可以是不对称的(例如，具有一个或多个立体中心)。除非另外指明，否则预期所有立体异构体，诸如对映异构体和非对映异构体。可以光学活性形式或消旋形式分离含有不对称取代的碳原子的本公开化合物。关于如何由光学活性起始材料制备光学活性形式的方法在本领域中是已知的，诸如通过消旋混合物的拆分或通过立体选择性合成。烯烃的许多几何异构体、C＝N双键等也可以存在于本文描述的化合物中，并且所有此类稳定的异构体均涵盖在本公开中。描述了本公开化合物的顺式几何异构体和反式几何异构体，并且可以作为异构体混合物或分开的异构形式分离。
在一些实施方案中，本文描绘的一种或多种化合物可以不同的互变异构形式存在。从上下文将清楚地看出，除非明确地排除，否则对此类化合物的提及涵盖所有此类互变异构形式。在一些实施方案中，互变异构形式由单键与相邻双键的交换以及质子的伴随迁移产生。在某些实施方案中，互变异构形式可以是质子互变异构体，其是具有与参考形式相同的经验式和总电荷的异构质子化状态。具有质子互变异构形式的部分的实例是酮-烯醇对、酰胺-亚胺酸对、内酰胺-内酰亚胺对、酰胺-亚胺酸对、烯胺-亚胺对以及其中质子可以占据杂环体系的两个或更多个位置的环状形式，诸如1H-和3H-咪唑，1H-、2H-和4H-1,2,4-三唑，1H-和2H-异吲哚以及1H-和2H-吡唑。在一些实施方案中，互变异构形式可以通过适当的取代而处于平衡或空间锁定到一种形式。在某些实施方案中，互变异构形式由乙缩醛相互转化，例如以下方案中所示的相互转化产生：
Figure BDA0002302535140000441
本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，可以根据本发明制备和/或利用本文所述的化合物的同位素。“同位素”是指由于原子核中的中子数量不同而具有相同原子序数但不同质量数的原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。在一些实施方案中，同位素取代(例如，用氘取代氢)可以改变分子的物理化学特性，诸如手性中心的代谢和/或外消旋速率。
如本领域中已知的，许多化学实体(特别是许多有机分子和/或许多小分子)可以采用多种不同的固体形式，例如像无定形形式和/或结晶形式(例如，多晶型物、水合物、溶剂合物等)。在一些实施方案中，此类实体可以包括任何固体形式的任何形式利用。在一些实施方案中，此类实体以特定的形式，例如以特定的固体形式利用。
在一些实施方案中，本文描述和/或描绘的化合物可以盐形式提供和/或利用。
在某些实施方案中，本文描述和/或描绘的化合物可以水合物或溶剂合物的形式提供和/或利用。
在本说明书中的各个地方，本公开的化合物的取代基以组或以范围公开。具体旨在本公开包括此类组和范围的成员的每种和每个单独子组合。例如，术语“C1-6烷基”具体旨在单独公开甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。此外，在化合物包括多个以组或以范围公开的取代基所处的位置的情况下，除非另外指明，否则本公开旨在涵盖单独的化合物和含有每个位置处的每种和每个单独子组合的化合物组(例如，属和亚属)。
在本文中，形式“任选取代的X”(例如，任选取代的烷基)的短语旨在等于“X，其中X是任选取代的”(例如，“烷基，其中所述烷基是任选取代的”)。并非旨在用以意指特征“X”(例如，烷基)本身是任选的。
如本文所用的术语“烷基”是指含有1至20个(例如，1至10或1至6个)碳的饱和烃基。在一些实施方案中，烷基是非支链的(即，是直链的)；在一些实施方案中，烷基是支链的。烷基由甲基、乙基、正丙基和异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基、新戊基等举例说明，并且可以任选地被一个、两个、三个或(在具有两个或更多个碳的烷基的情况下)四个取代基取代，所述取代基独立地选自由以下组成的组：(1)C1-6烷氧基；(2)C1-6烷基亚磺酰基；(3)氨基，如本文所定义(例如，未取代的氨基(即，-NH2)或取代的氨基(即，-N(RN1)2，其中RN1如对于氨基所定义)；(4)C6-10芳基-C1-6烷氧基；(5)叠氮基；(6)卤基；(7)(C2-9杂环基)氧基；(8)羟基，任选地被O-保护基团取代；(9)硝基；(10)氧代基(例如，羧醛或酰基)；(11)C1-7螺环基；(12)硫代烷氧基；(13)硫醇；(14)-CO2RA’，任选地被O-保护基团取代，并且其中RA'选自由以下组成的组：(a)C1-20烷基(例如，C1-6烷基)，(b)C2-20烯基(例如，C2-6烯基)，(c)C6-10芳基，(d)氢，(e)C1-6烷-C6-10芳基，(f)氨基-C1-20烷基，(g)-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’的聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且R’是H或C1-20烷基，和(h)-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1的氨基-聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且RN1各自独立地是氢或任选取代的C1-6烷基；(15)-C(O)NRB’RC’，其中RB’和RC’各自独立地选自由以下组成的组：(a)氢，(b)C1-6烷基，(c)C6-10芳基，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(16)-SO2RD’，其中RD’选自由以下组成的组：(a)C1-6烷基，(b)C6-10芳基，(c)C1-6烷-C6-10芳基，和(d)羟基；(17)-SO2NRE’RF’，其中RE’和RF’各自独立地选自由以下组成的组：(a)氢，(b)C1-6烷基，(c)C6-10芳基，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)-C(O)RG’，其中RG’选自由以下组成的组：(a)C1-20烷基(例如，C1-6烷基)，(b)C2-20烯基(例如，C2-6烯基)，(c)C6-10芳基，(d)氢，(e)C1-6烷-C6-10芳基，(f)氨基-C1-20烷基，(g)-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’的聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且R’是H或C1-20烷基，和(h)-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1的氨基-聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且RN1各自独立地是氢或任选取代的C1-6烷基；(19)-NRH’C(O)RI’，其中RH’选自由以下组成的组：(a1)氢和(b1)C1-6烷基，并且RI’选自由以下组成的组：(a2)C1-20烷基(例如，C1-6烷基)，(b2)C2-20烯基(例如，C2-6烯基)，(c2)C6-10芳基，(d2)氢，(e2)C1-6烷-C6-10芳基，(f2)氨基-C1-20烷基，(g2)-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’的聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且R’是H或C1-20烷基，和(h2)-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1的氨基-聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且RN1各自独立地是氢或任选取代的C1-6烷基；(20)-NRJ’C(O)ORK’，其中RJ’选自由以下组成的组：(a1)氢和(b1)C1-6烷基，并且RK’选自由以下组成的组：(a2)C1-20烷基(例如，C1-6烷基)，(b2)C2-20烯基(例如，C2-6烯基)，(c2)C6-10芳基，(d2)氢，(e2)C1-6烷-C6-10芳基，(f2)氨基-C1-20烷基，(g2)-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’的聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且R’是氢或C1-20烷基，和(h2)-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1的氨基-聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且RN1各自独立地是氢或任选取代的C1-6烷基；(21)脒；和(22)甲硅烷基，诸如三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和三异丙基甲硅烷基。在一些实施方案中，这些基团各自可以如本文所述进一步被取代。例如，C1-烷芳基的亚烷基可以进一步被氧代基取代以提供相应的芳酰基取代基。
如本文所用的术语“亚烷基”和前缀”烷-”代表通过去除两个氢原子衍生自直链或支链饱和烃的饱和二价烃基，并且其由亚甲基、亚乙基、亚异丙基等举例说明。术语“Cx-y亚烷基”和前缀“Cx-y烷-”代表具有x与y个之间的碳的亚烷基。x的示例性值为1、2、3、4、5和6，且y的示例性值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20(例如，C1-6亚烷基、C1-10亚烷基、C2-20亚烷基、C2-6亚烷基、C2-10亚烷基或C2-20亚烷基)。在一些实施方案中，亚烷基可以进一步被1、2、3或4个如本文对于烷基所定义的取代基取代。
如本文所用的术语“烯基”代表含有一个或多个碳-碳双键的除非另外指明否则具有2至20个碳(例如，2至6个或2至10个碳)的单价直链或支链基团，并且由乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基等举例说明。烯基包括顺式异构体和反式异构体。烯基可以如本文所定义任选地被1、2、3或4个独立地选自氨基、芳基、环烷基或杂环基(例如，杂芳基)的取代基或本文所述的示例性烷基取代基中的任一个取代。
如本文所用的术语“炔基”代表含有碳-碳三键的2至20个碳原子(例如，2至4个、2至6个或2至10个碳)的单价直链或支链基团，并且由乙炔基、1-丙炔基等举例说明。炔基可以如本文所定义任选地被1、2、3或4个独立地选自芳基、环烷基或杂环基(例如，杂芳基)的取代基或本文所述的示例性烷基取代基中的任一个取代。
如本文所用的术语“氨基”代表-N(RN1)2，其中RN1各自独立地是H、OH、NO2、N(RN2)2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、N-保护基团、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、烷芳基、环烷基、烷环烷基、羧基烷基(例如，任选地被O-保护基团取代，诸如任选取代的芳基烷氧基羰基或本文所述的任何基团)、磺烷基、酰基(例如，乙酰基、三氟乙酰基或本文所述的其他基团)、烷氧基羰基烷基(例如，任选地被O-保护基团取代，诸如任选取代的芳基烷氧基羰基或本文所述的任何基团)、杂环基(例如，杂芳基)或烷杂环基(例如，烷杂芳基)，其中这些所述RN1基团中的每一个可以任选地被取代，如本文对每个基团所定义；或两个RN1组合形成杂环基或N-保护基团，并且其中RN2各自独立地是H、烷基或芳基。本发明的氨基可以是未取代的氨基(即，-NH2)或取代的氨基(即，-N(RN1)2)。在一个优选的实施方案中，氨基是-NH2或-NHRN1，其中RN1独立地是OH、NO2、NH2、NRN2 2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、烷基、羧基烷基、磺基烷基、酰基(例如，乙酰基、三氟乙酰基或本文所述的其他基团)、烷氧基羰基烷基(例如，叔丁氧基羰基烷基)或芳基，并且RN2各自可以是H、C1-20烷基(例如，C1-6烷基)或C6-10芳基。
如本文所述，术语“氨基酸”是指具有侧链、氨基和酸基(例如，-CO2H的羧基或-SO3H的磺基)的分子，其中氨基酸通过侧链、氨基或酸基(例如，侧链)连接到母体分子基团。如本文所用的术语“氨基酸”广义上是指可以例如通过形成一个或多个肽键而并入多肽链的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的20种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，不管它是合成制备的还是从天然来源获得的。在一些实施方案中，与上述通用结构相比，氨基酸，包括多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，可以含有结构修饰。例如，在一些实施方案中，与通用结构相比，氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或取代来修饰。在一些实施方案中，与含有其他方面相同的未修饰的氨基酸的多肽相比，这种修饰可以例如改变含有修饰的氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方案中，与含有其他方面相同的未修饰的氨基酸的多肽相比，这种修饰不会显著改变含有修饰的氨基酸的多肽的相关活性。从上下文将清楚地看出，在一些实施方案中，术语“氨基酸”用于指游离氨基酸；在一些实施方案中，其用于指多肽的氨基酸残基。在一些实施方案中，氨基酸通过羰基连接到母体分子基团，其中侧链或氨基连接到羰基。在一些实施方案中，氨基酸是α-氨基酸。在某些实施方案中，氨基酸是β-氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是γ-氨基酸。示例性侧链包括任选取代的烷基、芳基、杂环基、烷芳基、烷基杂环基、氨基烷基、氨基甲酰基烷基和羧基烷基。示例性氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、羟基正缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、吡咯赖氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸基团可以任选地用一个、两个、三个或(在具有两个或更多个碳的氨基酸基团的情况下)四个取代基取代，所述取代基独立地选自由以下组成的组：(1)C1-6烷氧基；(2)C1-6烷基亚磺酰基；(3)如本文所定义的氨基(例如，未取代的氨基(即，-NH2)或取代的氨基(即，-N(RN1)2，其中RN1如对氨基所定义)；(4)C6-10芳基-C1-6烷氧基；(5)叠氮基；(6)卤基；(7)(C2-9杂环基)氧基；(8)羟基；(9)硝基；(10)氧代基(例如，羧醛或酰基)；(11)C1-7螺环基；(12)硫代烷氧基；(13)硫醇；(14)-CO2RA'，其中RA'选自由以下组成的组：(a)C1-20烷基(例如，C1-6烷基)，(b)C2-20烯基(例如，C2-6烯基)，(c)C6-10芳基，(d)氢，(e)C1-6烷-C6-10芳基，(f)氨基-C1-20烷基，(g)-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’的聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且R'是H或C1-20烷基，和(h)-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1的氨基-聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且RN1各自独立地是氢或任选取代的C1-6烷基；(15)-C(O)NRB’RC’，其中RB'和RC'各自独立地选自由以下组成的组：(a)氢，(b)C1-6烷基，(c)C6-10芳基，和(d)C1-6烷基-C6-10芳基；(16)-SO2RD’，其中RD'选自由以下组成的组：(a)C1-6烷基，(b)C6-10芳基，(c)C1-6烷-C6-10芳基，和(d)羟基；(17)-SO2NRE’RF’，其中RE'和RF'各自独立地选自由以下组成的组：(a)氢，(b)C1-6烷基，(c)C6-10芳基，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)-C(O)RG’，其中RG'选自由以下组成的组：(a)C1-20烷基(例如，C1-6烷基)，(b)C2-20烯基(例如，C2-6烯基)，(c)C6-10芳基，(d)氢，(e)C1-6烷-C6-10芳基，(f)氨基-C1-20烷基，(g)-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’的聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且R’是H或C1-20烷基，以及(h)-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1的氨基-聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且RN1各自独立地是氢或任选取代的C1-6烷基；(19)-NRH’C(O)RI’，其中RH’选自由以下组成的组：(a1)氢和(b1)C1-6烷基，并且RI’选自由以下组成的组：(a2)C1-20烷基(例如，C1-6烷基)，(b2)C2-20烯基(例如，C2-6烯基)，(c2)C6-10芳基，(d2)氢，(e2)C1-6烷-C6-10芳基，(f2)氨基-C1-20烷基，(g2)-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’的聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且R'是H或C1-20烷基，和(h2)-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1的氨基-聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，且RN1各自独立地是氢或任选取代的C1-6烷基；(20)-NRJ’C(O)ORK’，其中RJ’选自由以下组成的组：(a1)氢和(b1)C1-6烷基，并且RK’选自由以下组成的组：(a2)C1-20烷基(例如，C1-6烷基)，(b2)C2-20烯基(例如，C2-6烯基)，(c2)C6-10芳基，(d2)氢，(e2)C1-6烷-C6-10芳基，(f2)氨基-C1-20烷基，(g2)-(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’的聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且R'是H或C1-20烷基，和(h2)-NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1的氨基-聚乙二醇，其中s1是1至10(例如，1至6或1至4)的整数，s2和s3各自独立地是0至10(例如，0至4、0至6、1至4、1至6或1至10)的整数，并且RN1各自独立地是氢或任选取代的C1-6烷基；和(21)脒。在一些实施方案中，这些基团各自可以如本文所述进一步被取代。
如本文所用的术语“N-烷基化的氨基酸”是指在形成肽键的氨基酸的氮上含有任选取代的C1-C6烷基的氨基酸。N-烷基化的氨基酸包括但不限于N-甲基氨基酸，诸如N-甲基-丙氨酸、N-甲基-苏氨酸、N-甲基-苯基丙氨酸、N-甲基-天冬氨酸、N-甲基-缬氨酸、N-甲基-亮氨酸、N-甲基-甘氨酸、N-甲基-异亮氨酸、N(α)-甲基-赖氨酸、N(α)-甲基-天冬酰胺和N(α)-甲基-谷氨酰胺。
如本文所用的术语“芳基”代表具有一个或两个芳族环的单环、双环或多环碳环体系并且由苯基、萘基、1,2-二氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基、蒽基、菲基、芴基、茚满基、茚基等举例说明，并且可以任选地用1、2、3、4或5个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：(1)C1-7酰基(例如，羧醛)；(2)C1-20烷基(例如，C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基-C1-6烷基、氨基-C1-6烷基、叠氮基-C1-6烷基、(羧醛)-C1-6烷基、卤代-C1-6烷基(例如，全氟烷基)、羟基-C1-6烷基、硝基-C1-6烷基或C1-6硫代烷氧基-C1-6烷基)；(3)C1-20烷氧基(例如，C1-6烷氧基，诸如全氟烷氧基)；(4)C1-6烷基亚磺酰基；(5)C6-10芳基；(6)氨基；(7)C1-6烷-C6-10芳基；(8)叠氮基；(9)C3-8环烷基；(10)C1-6烷-C3-8环烷基；(11)卤基；(12)C1-12杂环基(例如，C1-12杂芳基)；(13)(C1-12杂环基)氧基；(14)羟基；(15)硝基；(16)C1-20硫代烷氧基(例如，C1-6硫代烷氧基)；(17)-(CH2)qCO2RA'，其中q是0至4的整数，并且RA'选自由以下组成的组：(a)C1-6烷基，(b)C6-10芳基，(c)氢，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)-(CH2)qCONRB’RC’，其中q是0至4的整数，并且其中RB'和RC'独立地选自由以下组成的组：(a)氢，(b)C1-6烷基，(c)C6-10芳基，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(19)-(CH2)qSO2RD’，其中q是0至4的整数，并且其中RD'选自由以下组成的组：(a)烷基，(b)C6-10芳基和(c)烷-C6-10芳基；(20)-(CH2)qSO2NRE’RF’，其中q是0至4的整数，并且其中RE'和RF'各自独立地选自由以下组成的组：(a)氢，(b)C1-6烷基，(c)C6-10芳基，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(21)硫醇；(22)C6-10芳氧基；(23)C3-8环烷氧基；(24)C6-10芳基-C1-6烷氧基；(25)C1-6烷-C1-12杂环基(例如，C1-6烷-C1-12杂芳基)；(26)C2-20烯基；和(27)C2-20炔基。在一些实施方案中，这些基团各自可以如本文所述进一步被取代。例如，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可以进一步被氧代基取代，以提供相应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
如本文所用，“芳基烷基”代表通过如本文所定义的亚烷基连接到母体分子基团的如本文所定义的芳基。示例性的未取代的芳基烷基具有7至30个碳(例如，7至16个或7至20个碳，诸如C1-6烷-C6-10芳基、C1-10烷-C6-10芳基或C1-20烷-C6-10芳基)。在一些实施方案中，亚烷基和芳基各自可以进一步被1、2、3或4个如本文对于相应基团定义的取代基取代。加上前缀“烷-”的其他基团以相同方式定义，其中除非另有说明，否则“烷”是指C1-6亚烷基，并且所连接的化学结构如本文所定义。
术语“叠氮基”代表-N3基团，其也可以表示为-N＝N＝N。
如本文所用的术语“碳环”和“碳环基”是指任选取代的C3-12单环、双环或三环非芳族环结构，其中所述环由碳原子形成。碳环结构包括环烷基、环烯基和环炔基。
如本文所用，“碳环基烷基”代表通过如本文所定义的亚烷基连接到母体分子基团的如本文所定义的碳环基团。示例性的未取代的碳环基烷基具有7至30个碳(例如，7至16个或7至20个碳，诸如C1-6烷-C6-10碳环基、C1-10烷-C6-10碳环基或C1-20烷-C6-10碳环基)。在一些实施方案中，亚烷基和碳环基各自可以进一步被1、2、3或4个如本文对于相应基团定义的取代基取代。加上前缀“烷-”的其他基团以相同方式定义，其中除非另有说明，否则“烷”是指C1-6亚烷基，并且所连接的化学结构如本文所定义。
如本文所用的术语“羰基”代表C(O)基团，其还可以表示为C＝O。
如本文所用的术语“羧基”意指-CO2H。
如本文所用的术语“氰基”代表-CN基团。
除非另有说明，否则如本文所用的术语“环烷基”代表具有3至8个碳的单价饱和或不饱和非芳族环状烃基，并且由环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、双环庚基等举例说明。当环烷基包含一个碳-碳双键时，环烷基可以称为“环烯基”。示例性环烯基包括环戊烯基、环己烯基等。本发明的环烷基可以任选地被以下基团取代：(1)C1-7酰基(例如，羧醛)；(2)C1-20烷基(例如，C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基-C1-6烷基、氨基-C1-6烷基、叠氮基-C1-6烷基、(羧醛)-C1-6烷基、卤代-C1-6烷基(例如，全氟烷基)、羟基-C1-6烷基、硝基-C1-6烷基或C1-6硫代烷氧基-C1-6烷基)；(3)C1-20烷氧基(例如，C1-6烷氧基，诸如全氟烷氧基)；(4)C1-6烷基亚磺酰基；(5)C6-10芳基；(6)氨基；(7)C1-6烷-C6-10芳基；(8)叠氮基；(9)C3-8环烷基；(10)C1-6烷-C3-8环烷基；(11)卤基；(12)C1-12杂环基(例如，C1-12杂芳基)；(13)(C1-12杂环基)氧基；(14)羟基；(15)硝基；(16)C1-20硫代烷氧基(例如，C1-6硫代烷氧基)；(17)-(CH2)qCO2RA’，其中q是0至4的整数，并且RA'选自由以下组成的组：(a)C1-6烷基，(b)C6-10芳基，(c)氢，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)-(CH2)qCONRB’RC’，其中q是0至4的整数，并且其中RB'和RC'独立地选自由以下组成的组：(a)氢，(b)C6-10烷基，(c)C6-10芳基，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(19)-(CH2)qSO2RD’，其中q是0至4的整数，并且其中RD'选自由以下组成的组：(a)C6-10烷基，(b)C6-10芳基和(c)C1-6烷-C6-10芳基；(20)-(CH2)qSO2NRE’RF’，其中q是0至4的整数，并且其中RE'和RF'各自独立地选自由以下组成的组：(a)氢，(b)C6-10烷基，(c)C6-10芳基，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(21)硫醇；(22)C6-10芳氧基；(23)C3-8环烷氧基；(24)C6-10芳基-C1-6烷氧基；(25)C1-6烷-C1-12杂环基(例如，C1-6烷-C1-12杂芳基)；(26)氧代基；(27)C2-20烯基；和(28)C2-20炔基。在一些实施方案中，这些基团各自可以如本文所述进一步被取代。例如，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可以进一步被氧代基取代，以提供相应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
如本文所用，“环烷基烷基”代表通过如本文所定义的亚烷基(例如，具有1至4、1至6、1至10或1至20个碳的亚烷基)连接到母体分子基团的如本文所定义的环烷基。在一些实施方案中，亚烷基和环烷基各自可以进一步被1、2、3或4个如本文对于相应基团所定义的取代基取代。
如本文所用的术语“非对映异构体”意指彼此不是镜像且彼此不可重叠的立体异构体。
如本文所使的术语“对映异构体”意指具有至少80％(即，至少90％的一种对映异构体和至多10％的另一种对映异构体)、优选至少90％且更优选至少98％的光学纯度或对映异构体过量(如由本领域中标准的方法所确定)的本发明化合物的每种单独光学活性形式。
如本文所用的术语“卤基”代表选自溴、氯、碘或氟的卤素。
如本文所用的术语“杂烷基”是指其中一个或两个组成碳原子已各自被氮、氧或硫替代的如本文所定义的烷基。在一些实施方案中，杂烷基可以进一步被1、2、3或4个如本文对于烷基所述的取代基取代。如本文所用的术语“杂烯基”和“杂炔基”分别是指其中一个或两个组成碳原子已各自被氮、氧或硫替代的如本文所定义的烯基和炔基。在一些实施方案中，杂烯基和杂炔基可以进一步被1、2、3或4个如本文对于烷基所述的取代基取代。
如本文所用的术语“杂芳基”代表如本文所定义的杂环基的子集，其是芳族的：即，它们在单环或多环体系中含有4n+2个pi电子。示例性未取代的杂芳基具有1至12(例如，1至11、1至10、1至9、2至12、2至11、2至10或2至9)个碳。在一些实施方案中，杂芳基被1、2、3或4个如对于杂环基所定义的取代基取代。
术语“杂芳基烷基”是指通过如本文所定义的亚烷基连接到母体分子基团的如本文所定义的杂芳基。示例性未取代的杂芳基烷基具有2至32个碳(例如，2至22、2至18、2至17、2至16、3至15、2至14、2至13或2至12个碳，诸如C1-6烷-C1-12杂芳基、C1-10烷-C1-12杂芳基或C1-20烷-C1-12杂芳基)。在一些实施方案中，亚烷基和杂芳基各自可以进一步被1、2、3或4个如本文对于相应基团所定义的取代基取代。杂芳基烷基是杂环基烷基的子集。
除非另有说明，否则如本文所用的术语“杂环基”代表5元、6元或7元环，其含有1、2、3或4个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子。5元环具有0至2个双键，并且6元环和7元环具有0至3个双键。示例性未取代的杂环基具有1至12(例如，1至11、1至10、1至9、2至12、2至11、2至10或2至9)个碳。术语“杂环基”还代表具有桥连的多环结构的杂环化合物，其中一个或多个碳和/或杂原子桥连单环的两个非相邻成员，例如奎宁环基。术语“杂环基”包括双环基团、三环基团和四环基团，其中任何以上杂环稠合到一个、两个或三个碳环，例如芳环、环己烷环、环己烯环、环戊烷环、环戊烯环或另一个单环杂环，诸如吲哚基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基等。稠合杂环的实例包括莨菪烷和1,2,3,5,8,8a-六氢吲嗪。杂环包括吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡啶基、哌啶基、高哌啶基、吡嗪基、哌嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑基、异噁唑烷基、吗啉基、硫代吗啉基、噻唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、二氢喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻二唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑烷基、异噻唑基、三唑基、四唑基、噁二唑基(例如，1,2,3-噁二唑基)、嘌呤基、噻二唑基(例如，1,2,3-噻二唑基)、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、二氢吲哚基、二氢喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、二氢异喹啉基、吡喃基、二氢吡喃基、二噻唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基等，包括其二氢形式和四氢形式，其中一个或多个双键被还原并且用氢替代。其他示例性杂环基包括：2,3,4,5-四氢-2-氧代-噁唑基；2,3-二氢-2-氧代-1H-咪唑基；2,3,4,5-四氢-5-氧代-1H-吡唑基(例如，2,3,4,5-四氢-2-苯基-5-氧代-1H-吡唑基)；2,3,4,5-四氢-2,4-二氧代-1H-咪唑基(例如，2,3,4,5-四氢-2,4-二氧代-5-甲基-5-苯基-1H-咪唑基)；2,3-二氢-2-硫代-1,3,4-噁二唑基(例如，2,3-二氢-2-硫代-5-苯基-1,3,4-噁二唑基)；4,5-二氢-5-氧代-1H-三唑基(例如，4,5-二氢-3-甲基-4-氨基5-氧代-1H-三唑基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代吡啶基(例如，1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3,3-二乙基吡啶基)；2,6-二氧代-哌啶基(例如，2,6-二氧代-3-乙基-3-苯基哌啶基)；1,6-二氢-6-氧代嘧啶基；1,6-二氢-4-氧代嘧啶基(例如，2-(甲硫基)-1,6-二氢-4-氧代-5-甲基嘧啶-1-基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代嘧啶基(例如，1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3-乙基嘧啶基)；1,6-二氢-6-氧代-哒嗪基(例如，1,6-二氢-6-氧代-3-乙基哒嗪基)；1,6-二氢-6-氧代-1,2,4-三嗪基(例如，1,6-二氢-5-异丙基-6-氧代-1,2,4-三嗪基)；2,3-二氢-2-氧代-1H-吲哚基(例如，3,3-二甲基-2,3-二氢-2-氧代-1H-吲哚基和2,3-二氢-2-氧代-3,3'-螺丙烷-1H-吲哚-1-基)；1,3-二氢-1-氧代-2H-异吲哚基；1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚基；1H-苯并吡唑基(例如，1-(乙氧基羰基)-1H-苯并吡唑基)；2,3-二氢-2-氧代-1H-苯并咪唑基(例如，3-乙基-2,3-二氢-2-氧代-1H-苯并咪唑基)；2,3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基(例如，5-氯-2,3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基)；2,3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基；2-氧代-2H-苯并吡喃基；1,4-苯并二噁烷基；1,3-苯并二噁烷基；2,3-二氢-3-氧代,4H-1,3-苯并噻嗪基；3,4-二氢-4-氧代-3H-喹唑啉基(例如，2-甲基-3,4-二氢-4-氧代-3H-喹唑啉基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3H-喹唑啉基(例如，1-乙基-1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3H-喹唑啉基)；1,2,3,6-四氢-2,6-二氧代-7H-嘌呤基(例如，1,2,3,6-四氢-1,3-二甲基-2,6-二氧代-7H-嘌呤基)；1,2,3,6-四氢-2,6-二氧代-1H-嘌呤基(例如，1,2,3,6-四氢-3,7-二甲基-2,6-二氧代-1H-嘌呤基)；2-氧代苯并[c,d]吲哚基；1,1-二氧代-2H-萘并[1,8-c,d]异噻唑基；和1,8-亚萘基二甲酰胺基。另外的杂环包括3,3a,4,5,6,6a-六氢-吡咯并[3,4-b]吡咯-(2H)-基和2,5-二氮杂二环[2.2.1]庚-2-基、高哌嗪基(或二氮杂环庚烷基)、四氢吡喃基、二噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基(oxecanyl)以及硫杂环辛烷基。杂环基团还包括下式的基团
Figure BDA0002302535140000571
其中
E′选自由-N-和-CH-组成的组；F′选自由以下组成的组：-N＝CH-、-NH-CH2-、-NH-C(O)-、-NH-、-CH＝N-、-CH2-NH-、-C(O)-NH-、-CH＝CH-、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2O-、-OCH2-、-O-和-S-；并且G′选自由-CH-和-N-组成的组。本文提到的任何杂环基可以任选地用1、2、3、4或5个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：(1)C1-7酰基(例如，羧醛)；(2)C1-20烷基(例如，C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基-C1-6烷基、氨基-C1-6烷基、叠氮基-C1-6烷基、(羧醛)-C1-6烷基、卤代-C1-6烷基(例如，全氟烷基)、羟基-C1-6烷基、硝基-C1-6烷基或C1-6硫代烷氧基-C1-6烷基)；(3)C1-20烷氧基(例如，C1-6烷氧基，诸如全氟烷氧基)；(4)C1-6烷基亚磺酰基；(5)C6-10芳基；(6)氨基；(7)C1-6烷-C6-10芳基；(8)叠氮基；(9)C3-8环烷基；(10)C1-6烷-C3-8环烷基；(11)卤基；(12)C1-12杂环基(例如，C2-12杂芳基)；(13)(C1-12杂环基)氧基；(14)羟基；(15)硝基；(16)C1-20硫代烷氧基(例如，C1-6硫代烷氧基)；(17)-(CH2)qCO2RA’，其中q是0至4的整数，并且RA'选自由以下组成的组：(a)C1-6烷基，(b)C6-10芳基，(c)氢，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)-(CH2)qCONRB’RC’，其中q是0至4的整数，并且其中RB'和RC'独立地选自由以下组成的组：(a)氢，(b)C1-6烷基，(c)C6-10芳基，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(19)-(CH2)qSO2RD’，其中q是0至4的整数，并且其中RD'选自由以下组成的组：(a)C1-6烷基，(b)C6-10芳基，和(c)C1-6烷-C6-10芳基；(20)-(CH2)qSO2NRE’RF’，其中q是0至4的整数，并且其中RE'和RF’各自独立地选自由以下组成的组：(a)氢，(b)C1-6烷基，(c)C6-10芳基，和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(21)硫醇；(22)C6-10芳氧基；(23)C3-8环烷氧基；(24)芳基烷氧基；(25)C1-6烷-C1-12杂环基(例如，C1-6烷-C1-12杂芳基)；(26)氧代基；(27)(C1-12杂环基)亚氨基；(28)C2-20烯基；和(29)C2-20炔基。在一些实施方案中，这些基团各自可以如本文所述进一步被取代。例如，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可以进一步被氧代基取代，以提供相应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
如本文所用的“杂环基烷基”代表通过如本文所定义的亚烷基连接到母体分子基团的如本文所定义的杂环基。示例性未取代的杂环基烷基具有2至32个碳(例如，2至22、2至18、2至17、2至16、3至15、2至14、2至13或2至12个碳，诸如C1-6烷-C1-12杂环基、C1-10烷-C1-12杂环基或C1-20烷-C1-12杂环基)。在一些实施方案中，亚烷基和杂环基各自可以进一步被1、2、3或4个如本文对于相应基团所定义的取代基取代。
如本文所用的术语“烃”代表仅由碳原子和氢原子组成的基团。
如本文所用的术语“羟基”代表-OH基团。在一些实施方案中，羟基可以被1、2、3或4个如本文对于烷基所定义的取代基(例如，O-保护基团)取代。
如本文所用的术语“异构体”意指本发明的任何化合物的任何互变异构体、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。可认识到本发明的化合物可以具有一个或多个手性中心和/或双键，并且因此呈立体异构体诸如双键异构体(即，几何E/Z异构体)或非对映异构体(例如，对映异构体(即，(+)或(-))或顺式/反式异构体)存在。根据本发明，本文描绘的化学结构并且因此本发明的化合物涵盖所有对应的立体异构体，即立体异构纯形式(例如，几何纯、对映异构纯或非对映异构纯)和对映异构和立体异构混合物，例如消旋体。本发明化合物的对映异构和立体异构混合物通常可以通过熟知的方法，诸如手性相气相色谱法、手性相高效液相色谱法、使化合物结晶为手性盐复合物或在手性溶剂中结晶化合物来拆分成其组分对映异构体或立体异构体。还可以通过熟知的不对称合成方法从立体异构或对映异构纯中间体、试剂和催化剂中获得对映异构体和立体异构体。
如本文所用的术语“N-保护的氨基”是指其上连接一个或两个如本文所定义的N-保护基团的如本文所定义的氨基。
如本文所用的术语“N-保护基团”代表在合成过程期间用于保护氨基抵抗不希望的反应的那些基团。常用的N-保护基团在Greene，“Protective Groups in OrganicSynthesis”，第3版(John Wiley&Sons，纽约，1999)中公开，其通过引用并入本文。N-保护基团包括酰基、芳酰基或氨基甲酰基，诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基，和手性助剂，诸如保护或未保护的D,L或D,L-氨基酸，诸如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等；含磺酰基的基团，诸如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基团，诸如苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、3,5-二甲氧基苄氧基羰基、2,4-二甲氧基苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苄氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊氧基羰基、金刚烷氧基羰基、环己氧基羰基、苯硫羰基等，烷芳基，诸如苄基、三苯甲基、苄氧基甲基等，和甲硅烷基，诸如三甲基甲硅烷基等。优选的N-保护基团是甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、丙氨酰基、苯磺酰基、苄基、叔丁氧基羰基(Boc)以及苄氧基羰基(Cbz)。
如本文所用的术语“硝基”代表-NO2基团。
如本文所用的术语“O-保护基团”代表旨在保护含氧基团(例如，苯酚、羟基或羰基)免于在合成程序期间的不希望的反应。常用的O-保护基团在Greene，“ProtectiveGroups in Organic Synthesis”，第3版(John Wiley&Sons，纽约，1999)中公开，其通过引用并入本文。示例性O-保护基团包括酰基、芳酰基或氨基甲酰基，诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷氧基甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、异丁酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、二甲基甲脒基和4-硝基苯甲酰基；烷基羰基，诸如酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基等；任选取代的芳基羰基，诸如苯甲酰基；甲硅烷基，诸如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)等；与羟基形成醚的基团，诸如甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、苄基、对甲氧基苄基、三苯甲基等；烷氧基羰基，诸如甲氧基羰基、乙氧基羰基、异丙氧基羰基、正异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、异丁氧基羰基、仲丁氧基羰基、叔丁氧基羰基、2-乙基己氧基羰基、环己氧基羰基、甲氧基羰基等；烷氧基烷氧基羰基，诸如甲氧基甲氧基羰基、乙氧基甲氧基羰基、2-甲氧基乙氧基羰基、2-乙氧基乙氧基羰基、2-丁氧基乙氧基羰基、2-甲氧基乙氧基甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、炔丙氧基羰基、2-丁烯氧基羰基、3-甲基-2-丁烯氧基羰基等；卤代烷氧基羰基，诸如2-氯乙氧基羰基、2-氯乙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基等；任选取代的芳基烷氧基羰基，诸如苄氧基羰基、对甲基苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、2,4-二硝基苄氧基羰基、3,5-二甲基苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、芴基甲氧基羰基等；以及任选取代的芳氧基羰基，诸如苯氧基羰基、对硝基苯氧基羰基、邻硝基苯氧基羰基、2,4-二硝基苯氧基羰基、对甲基苯氧基羰基、间甲基苯氧基羰基、邻溴苯氧基羰基、3,5-二甲基苯氧基羰基、对氯苯氧基羰基、2-氯-4-硝基苯氧基-羰基等)；取代的烷基、芳基和烷芳基醚(例如，三苯甲基；甲硫基甲基；甲氧基甲基；苄氧基甲基；甲硅烷氧基甲基；2,2,2-三氯乙氧基甲基；四氢吡喃基；四氢呋喃基；乙氧基乙基；1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]乙基；2-三甲基甲硅烷基乙基；叔丁基醚；对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、苄基、对甲氧基苄基和硝基苄基)；甲硅烷基醚(例如，三甲基甲硅烷基；三乙基甲硅烷基；三异丙基甲硅烷基；二甲基异丙基甲硅烷基；叔丁基二甲基甲硅烷基；叔丁基二苯基甲硅烷基；三苄基甲硅烷基；三苯基甲硅烷基；和二苯基甲基甲硅烷基)；碳酸酯(例如，甲基、甲氧基甲基、9-芴基甲基；乙基；2,2,2-三氯乙基；2-(三甲基甲硅烷基)乙基；乙烯基、烯丙基、硝基苯基；苄基；甲氧基苄基；3,4-二甲氧基苄基；和硝基苄基)；羰基保护基团(例如，缩醛和缩酮基团，诸如二甲基缩醛、1,3-二氧戊环等；缩羰基(acylal group)；以及二噻烷基，诸如1,3-二噻烷、1,3-二硫戊环等)；羧酸保护基团(例如，酯基，诸如甲酯、苄酯、叔丁酯、原酸酯等)；以及噁唑啉基。
如本文所用的术语“氧代基”代表＝O。
如本文所用的前缀“全氟”代表其中每个与烷基结合的氢基被氟基替代的如本文所定义的烷基。例如，全氟烷基由三氟甲基、五氟乙基等举例说明。
如本文所用的术语“受保护的羟基”是指与O-保护基团结合的氧原子。
如本文所用的术语“螺环基”代表C2-7亚烷基二基，其两端均与母体基团的同一碳原子结合以形成螺环基团，并且还具有C1-6杂亚烷基二基，其两端均与同一原子结合。形成螺环基的杂亚烷基可以含有一个、两个、三个或四个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子。在一些实施方案中，螺环基包含一至七个碳，不包括其上连接二基的碳原子。本发明的螺环基可以任选地被1、2、3或4个如本文作为环烷基和/或杂环基的任选取代基提供的取代基取代。
如本文所用的术语“立体异构体”是指化合物可以拥有的所有可能的不同异构体形式以及构象形式(例如，本文所述的任何式的化合物)，具体为基本分子结构的所有可能的立体化学和构象异构体形式、所有非对映异构体、对映异构体和/或构象异构体。本发明的一些化合物可以不同互变异构形式存在，所有互变异构形式都包括在本发明的范围内。
如本文所用的术语“磺酰基”代表-S(O)2-基团。
如本文所用的术语“硫醇”表示-SH基团。
定义
在本申请中，除非上下文另有明确说明，否则(i)术语“一个/种”可以理解为意指“至少一个/种”；(ii)术语“或”可以理解为意指“和/或”；(iii)术语“包含”和“包括”可以理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论它们是单独呈现还是与一个/种或多个/种其他组分或步骤一起呈现；并且(iv)术语“约”和“大约”可以理解为允许如本领域普通技术人员将理解的标准偏差；并且(v)在提供范围的地方包括端点。
如本领域中已知的，“亲和力”是特定配体与其配偶体结合的紧密度的量度。亲和力可以通过不同的方式测量。在一些实施方案中，亲和力通过定量测定法测量。在一些此类实施方案中，结合配偶体浓度可以固定为超过配体浓度，从而模拟生理条件。可替代地或另外，在一些实施方案中，结合配偶体浓度和/或配体浓度可以变化。在一些此类实施方案中，可以在可比较的条件(例如，浓度)下将亲和力与参考进行比较。
如本文所用的术语“大约”和“约”各自旨在涵盖如本领域普通技术人员将理解为适合相关上下文的正常统计变化。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文(例如，所述数字将超过可能值的100％)中明显看出，否则术语“大约”或“约”各自是指在任一方向上(大于或小于)落在所述值的的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。
将理解的是，本文所用的术语“结合”通常是指两个或更多个实体之间或之中的(例如，非共价或共价)缔合。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触；间接结合涉及通过与一种或多种中间实体的物理接触实现的物理相互作用。通常可以在多种情况中的任一种下评估两种或更多种实体之间的结合，包括孤立地或在更复杂系统的情况下(例如，同时与载体实体共价或以其他方式结合和/或在生物系统或细胞中)研究相互作用的实体或部分。
分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域中已知的常用方法(包括本文所述的那些)测量。以下描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。如本文所用的术语“KD”旨在指特定化合物-蛋白质或复合物-蛋白质相互作用的解离平衡常数。通常，例如，当通过表面等离子体共振(SPR)技术使用呈递蛋白作为分析物并且使用化合物作为配体确定时，本发明的化合物以小于约10-6M，诸如小于大约10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的解离平衡常数(KD)结合呈递蛋白。例如，当通过表面等离子体共振(SPR)技术使用靶蛋白作为分析物并且使用复合物作为配体确定时，本发明的呈递蛋白/化合物复合物以小于约10-6M，诸如小于大约10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的解离平衡常数(KD)结合靶蛋白(例如，真核靶蛋白，诸如哺乳动物靶蛋白或真菌靶蛋白，或原核靶蛋白，诸如细菌靶蛋白)。
如本文所用的术语“交联基团”是指包含能够化学连接到蛋白质或其他分子上的特定官能团(例如，伯胺、巯基)的反应性官能团的基团。如本文使用的“能够与氨基酸发生化学选择性反应的部分”是指包含能够化学连接到天然或非天然氨基酸的官能团(例如，伯胺和仲胺、巯基、醇、羧基、羰基或形成三唑的官能团如叠氮化物或炔烃)的反应性官能团的部分。交联基团的实例包括巯基反应性交联基团(例如，包含马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代磺酸盐或乙烯基砜的基团)，胺反应性交联基团(例如，包含酯诸如NHS酯、酰亚胺酯和五氟苯基酯或羟甲基膦的基团)，羧基反应性交联基团(例如，包含伯胺或仲胺、醇或硫醇的基团)，羰基反应性交联基团(例如，包含酰肼或烷氧基胺的基团)，和形成三唑的交联基团(例如，包含叠氮化物或炔烃的基团)。
如本文所用的术语“复合物”是指通过结合相互作用(例如，非共价相互作用，诸如疏水效应相互作用、静电相互作用、范德华相互作用或π效应相互作用)结合在一起的两种或更多种化合物和/或蛋白质的组。复合物的实例是“呈递蛋白/缀合物复合物”和“靶蛋白/缀合物复合物”，其包含与呈递蛋白或靶蛋白结合的本发明的缀合物。
如本文所用的术语“缀合物”是指通过两种或更多种化学化合物(例如，包含交联基团的化合物和蛋白质诸如靶蛋白或呈递蛋白)的连接(例如，通过共价键形成反应)形成的化合物。
如本文所用的术语“吸电子基团”是指从π体系中去除电子密度的官能团。吸电子基团的实例包括但不限于卤化物(例如，氟化物、氯化物、溴化物、碘化物)、醛、酮、羧酸、酰氯、酯、酰胺、三卤化物(例如，三氟甲基、三氯甲基)、腈、磺酸酯和硝基。
如本文所用的术语“离去基团”是指在杂合键裂解中与一对电子分开的分子片段。离去基团的实例包括但不限于卤化物(例如，氟化物、氯化物、溴化物、碘化物)、羧酸酯、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、全氟烷基磺酸酯(例如，三氟甲磺酸酯)、硝酸酯和磷酸酯。
如本文所用的“参与结合”的原子是在它们结合的实体的
Figure BDA0002302535140000641
内或连接到具有它们结合的实体的
Figure BDA0002302535140000642
的原子。
术语“呈递蛋白”是指与小分子结合形成复合物的蛋白质，所述复合物与靶蛋白(例如，真核靶蛋白，诸如哺乳动物靶蛋白或真菌靶蛋白，或原核靶蛋白，诸如细菌靶蛋白)结合并调节所述靶蛋白的活性。在一些实施方案中，呈递蛋白是相对丰富的蛋白质(例如，呈递蛋白足够丰富，因此参与三方复合物基本上不影响呈递蛋白在细胞中的生物学作用和/或细胞的生存力或其他属性)。在某些实施方案中，呈递蛋白是在细胞内具有伴侣蛋白活性的蛋白质。在一些实施方案中，呈递蛋白是在细胞内具有多个天然相互作用配偶体的蛋白质。在某些实施方案中，呈递蛋白是已知结合小分子以形成二元复合物的一种呈递蛋白，已知或怀疑所述二元复合物与靶蛋白结合并调节其生物学活性。
术语“呈递蛋白结合部分”是指一组原子及其所连接的部分(例如，20个原子内的原子，诸如15个原子内的原子、10个原子内的原子、5个原子内的原子)，所述连接部分参与与呈递蛋白的结合，使得所述化合物例如以小于10μM(例如，小于5μM、小于1μM、小于500nM、小于200nM、小于100nM、小于75nM、小于50nM、小于25nM、小于10nM)的KD特异性结合所述呈递蛋白，或者例如以小于1μM(例如，小于0.5μM、小于0.1μM、小于0.05μM、小于0.01μM)的IC50抑制呈递蛋白的肽基-脯氨酰异构酶活性。将理解的是，呈递蛋白结合部分未必涵盖化合物中与呈递蛋白相互作用的全部原子。还应理解，呈递蛋白结合部分的一个或多个原子可以在靶蛋白结合部分(例如，真核靶蛋白结合部分，诸如哺乳动物靶蛋白结合部分或真菌靶蛋白结合部分，或原核靶蛋白结合部分，诸如细菌靶蛋白结合部分)内。
如本文所用的“FKBP结合部分”是指对FKBP蛋白家族中的呈递蛋白(例如，FKBP12、FKBP12.6、FKBPP13、FKBP25、FKBP51或FKBP52)具有选择性的呈递蛋白结合部分。如本文所用的“选择性FKBP结合部分”是指相对于FKBP家族的所有其他成员而言对FKBP家族的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个)成员具有特异性的结合部分。如本文所用的“非选择性FKBP结合部分”是指对FKBP家族的所有成员具有相当的亲和力(在2倍内、3倍内、4倍内、5倍内、10倍内)的结合部分。
术语“蛋白结合部分”是指一组原子及其所连接的部分(例如，20个原子内的原子，诸如15个原子内的原子、10个原子内的原子、5个原子内的原子)，所述连接部分参与与蛋白质(例如，呈递蛋白或靶蛋白)的结合，使得所述化合物例如以小于10μM(例如，小于5μM、小于1μM、小于500nM、小于200nM、小于100nM、小于75nM、小于50nM、小于25nM、小于10nM)的KD特异性结合所述蛋白质，或者例如以小于1μM(例如，小于0.5μM、小于0.1μM、小于0.05μM、小于0.01μM)的IC50抑制呈递蛋白的肽基-脯氨酰异构酶活性。将理解的是，蛋白结合部分未必涵盖化合物中与蛋白相互作用的全部原子。
如本文所用的术语“反应”是指其中相同或不同元素的原子自身重排以形成新物质的过程。例如，在两个原子之间形成共价键，诸如蛋白质上的反应性氨基酸与交联基团之间形成共价键的反应。可以通过本领域已知的任何方法来测量反应，例如，可以通过LC-MS或NMR确定反应产物的形成。
如本文所用的术语“反应性氨基酸”是指包含能够化学连接到特定官能团(例如，交联基团)的官能团(例如，亲核官能团)的天然或非天然氨基酸。反应性氨基酸的实例包括半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸和在侧链上具有叠氮化物的氨基酸。“非反应性氨基酸”是指不含能够化学连接到特定官能团的官能团的天然或非天然氨基酸。非反应性氨基酸的实例包括缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和亮氨酸。
术语“参考”在本文中经常用于描述标准或对照化合物、个体、群体、样品、序列或值，与之进行比较的是感兴趣的化合物、个体、群体、样品、序列或值。在一些实施方案中，与感兴趣的化合物、个体、群体、样品、序列或值的测试或确定基本上同时测试和/或确定参考化合物、个体、群体、样品、序列或值。在一些实施方案中，参考化合物、个体、群体、样品、序列或值是任选地在有形介质中体现的历史参考。通常，如本领域技术人员将理解的，在与用于确定或表征感兴趣的化合物、个体、群体、样品、序列或值的条件相当的条件下确定或表征参考化合物、个体、群体、样品、序列或值。
如本文所用的术语“暴露于溶剂的氨基酸”是指蛋白质周围的溶剂可接近的氨基酸。在一些实施方案中，暴露于溶剂的氨基酸是在被取代时基本上不改变蛋白质的三维结构的氨基酸。
如本文所用的术语“特异性结合”或“对于……特异性”或“对……特异性”是指结合剂与靶实体之间的相互作用。如本领域普通技术人员将理解的，如果在存在替代性相互作用的情况下是有利的，则认为相互作用是“特异性的”，例如，以小于10μM(例如，小于5μM、小于1μM、小于500nM、小于200nM、小于100nM、小于75nM、小于50nM、小于25nM、小于10nM)的KD下的结合。在许多实施方案中，特异性相互作用取决于靶实体的特定结构特征(例如，表位、裂口、结合位点)的存在。应理解，特异性不必是绝对的。在一些实施方案中，可以相对于结合剂对一种或多种其他潜在靶实体(例如，竞争者)的特异性来评价特异性。在一些实施方案中，相对于参考特异性结合剂的特异性来评价特异性。在一些实施方案中，相对于参考非特异性结合剂的特异性来评价特异性。
当参考具有活性的化合物使用时，术语“特异性”被本领域技术人员理解为意指所述化合物区分潜在的靶实体或状态。例如，在一些实施方案中，如果化合物在存在一种或多种竞争性替代靶的情况下优先与它的靶结合，则称所述化合物“特异性地”与所述靶结合。在许多实施方案中，特异性相互作用取决于靶实体的特定结构特征(例如，表位、裂口、结合位点)的存在。应理解，特异性不必是绝对的。在一些实施方案中，可以相对于结合剂对一种或多种其他潜在靶实体(例如，竞争者)的特异性来评价特异性。在一些实施方案中，相对于参考特异性结合剂的特异性来评价特异性。在一些实施方案中，相对于参考非特异性结合剂的特异性来评价特异性。在一些实施方案中，所述试剂或实体在与其靶实体结合的条件下不与竞争性替代靶可检测地结合。在一些实施方案中，与一种或多种竞争性替代靶相比，结合剂以更高的结合速率、更低的解离速率、增加的亲和力、减少的解离和/或增加的稳定性与其靶实体结合。
术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或特性的全部或几乎全部范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解的是，生物现象和化学现象很少(如果曾发生)达到完全和/或进行至完全或者达到或避免绝对的结果。因此，术语“基本上”在本文中用于获得在许多生物现象和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
本文所用的术语与特定蛋白质“基本上不结合”可以例如通过对靶具有10-4M或更大，可替代地10-5M或更大，可替代地10-6M或更大，可替代地10-7M或更大，可替代地10-8M或更大，可替代地10-9M或更大，可替代地10-10M或更大，可替代地10-11M或更大，可替代地10-12M或更大的KD，或在10-4M至10-12M，或10-6M至10-10M，或10-7M至10-9M的范围内的KD的分子或分子部分来表现。
术语“靶蛋白”是指参与与疾病、病症或病状相关联的生物学途径的任何蛋白质。在一些实施方案中，靶蛋白不是mTOR或钙调磷酸酶。在一些实施方案中，靶蛋白能够与呈递蛋白和小分子形成三方复合物。在一些实施方案中，靶蛋白是天然存在的蛋白质；在一些此类实施方案中，靶蛋白天然存在于某些哺乳动物细胞(例如，哺乳动物靶蛋白)、真菌细胞(例如，真菌靶蛋白)、细菌细胞(例如，细菌靶蛋白)或植物细胞(例如，植物靶蛋白)中。在一些实施方案中，靶蛋白的特征在于与一种或多种天然呈递蛋白/天然小分子复合物的天然相互作用。在一些实施方案中，靶蛋白的特征在于与多种不同的天然呈递蛋白/天然小分子复合物的天然相互作用；在一些此类实施方案中，一些或所有复合物利用相同的呈递蛋白(和不同的小分子)。在一些实施方案中，靶蛋白基本上不结合环孢菌素、雷帕霉素或FK506与呈递蛋白(例如，FKBP)的复合物。靶蛋白可以是天然存在的，例如野生型。可替代地，靶蛋白可以不同于野生型蛋白，但仍保留生物学功能，例如作为等位基因变体、剪接突变体或生物学活性片段。示例性哺乳动物靶蛋白是GTP酶、GTP酶活化蛋白、鸟嘌呤核苷酸交换因子、热激蛋白、离子通道、卷曲螺旋蛋白、激酶、磷酸酶、泛素连接酶、转录因子、染色质改性剂/重塑剂、具有经典蛋白-蛋白相互作用结构域和基序的蛋白质，或参与与疾病、病症或病状相关联的生物途径的任何其他蛋白质。
在一些实施方案中，靶蛋白是修饰的靶蛋白。修饰的靶蛋白可以在蛋白质序列中包含保守或非保守的氨基酸插入、缺失或取代(例如，D-氨基酸、去氨基酸)(例如，其中此类变化基本上不改变多肽的生物学活性)。具体地，向本发明的任何多肽的氨基或羧基末端添加一个或多个半胱氨酸残基可以通过例如二硫键促进这些蛋白质的缀合。在一些实施方案中，去除一个或多个反应性氨基酸残基(例如，半胱氨酸)以减少蛋白质上可能缀合位点的数量。氨基酸取代可以是保守的(即，其中一个残基被相同的通用类型或基团中的另一个替代)或非保守的(即，其中一个残基被另一种类型的氨基酸替代)。此外，天然存在的氨基酸可以取代非天然存在的氨基酸(即，非天然存在的保守氨基酸取代或非天然存在的非保守氨基酸取代)。
术语“靶蛋白结合部分”是指一组环原子及其所连接的部分(例如，20个原子内的原子，诸如15个原子内的原子、10个原子内的原子、5个原子内)，其在化合物与呈递蛋白复合时参与与靶蛋白(例如，真核靶蛋白，诸如哺乳动物靶蛋白或真菌靶蛋白，或原核靶蛋白，诸如细菌靶蛋白)的结合。将理解的是，靶蛋白结合部分未必涵盖化合物中与靶蛋白相互作用的全部原子。还将理解的是，呈递蛋白结合部分的一个或多个原子也可以存在于靶蛋白结合部分中。
术语“传统结合口袋”是指蛋白质结构上具有与其活性已被一种或多种小分子调节的蛋白质相当的物理化学和/或几何特性的空腔或口袋。在一些实施方案中，传统结合口袋是体积大于1000A3的轮廓分明的口袋。本领域普通技术人员熟悉传统结合口袋的概念，并且还知道其与“可成药性”的关系。在某些实施方案中，如本文所定义，如果蛋白质是不可成药的，则认为其不具有传统结合口袋。
术语“不可成药的靶”是指不是已知被药物靶向和/或不具备适合于与小分子高亲和力结合的结合位点的蛋白质家族的成员的蛋白质。确定靶蛋白是否是不可成药的方法是本领域已知的。例如，可以使用基于结构的算法，诸如程序(Universitat Hamburg,Hamburg,Germany)所使用的算法来确定靶蛋白是否是不可成药的，所述算法基于针对结合蛋白质上的口袋而计算的参数(包括体积、表面积、亲脂性表面积、深度和/或疏水性比率)来评估可成药性。
附图说明
图1是示出KRASGTP/S39C lite/C2-FK506缀合物的SDS-PAGE分析的图像。泳道1：KRASGTP/S39C lite；泳道2：KRASGTP/S39C lite/C2-FK506反应混合物；泳道3：KRASGTP/S39C lite/C2-FK506反应混合物+100mM DTT。
图2是示出KRASGTP/G12C lite/SFAX9DS缀合物的SDS-PAGE分析的图像。
图3A和图3B是示出KRASGTP/S39C lite/C2Holt/FKBP12复合物形成的SEC和SDS-PAGE分析的图像。图3A)SEC纯化曲线。蓝色虚线指示对应于KRASGTP/S39C lite/C2Holt/FKBP12三元复合物的洗脱的峰；图3B)SEC洗脱峰的SDS-PAGE分析。蓝色虚线对应于对于KRASGTP/S39Clite/C2Holt/FKBP12洗脱峰收集的馏分。
图4是示出洗脱峰的SEC曲线和SDS-PAGE分析的图像，确认KRASGDP/S39C lite/SFAC4DS/CypAC52S复合物的形成。
图5A和图5B是示出游离PTP1BS187C lite和FKBP12蛋白质以及PTP1BS187C lite/C3SLF/FKBP12复合物的SEC曲线和SDS-PAGE分析的图像。
图6是示出通过SDS-PAGE获得的C3和C4SLF的交联效率的图像。
图7A和图7B是示出FKBP12-化合物1-KRASGTP/S39C复合物的晶体结构的图像。图7A)显示FKBP12、KRASGTP/S39C和配体的带状图示。在特写视图中显示配体在3σ处显示的Fo-Fc电子密度。图7B)与红色的配体或配偶体蛋白附近
Figure BDA0002302535140000711
内的原子形成的复合物的表面图示。
图8是示出CypAC52S-SFAC4DS-KRASGDP/S39C的晶体结构的图像。
图9A和图9B是示出FKBP12-C3SLF-PTP1BS187C的晶体结构的图像。图9A示出晶体在不对称单元中含有两个FKBP12-C3SLF-PTP1BS187C复合物分子。图9B示出PTP1BS187C的包埋表面积为
Figure BDA0002302535140000712
并且C3SLF的包埋表面积为
Figure BDA0002302535140000714
图10是示出MCL1S245C/C3SLF/FKBP52的晶体结构的图像。
图11是示出CYPA-W21487-KRASG12C-GTP三元复合物的W21487依赖性复合物形成的结合曲线的图像。
图12是示出CYPA-W21487-KRASG12C-GTP三元复合物的W21487依赖性复合物形成的结合曲线的图像。
图13是示出FKBP12-化合物1和FKBP12-化合物2二元复合物与CEP250的结合的ITC测量的图像。
图14是示出FKBP12/化合物1与CEP25011.4和CEP25029.2的结合的SPR传感图的图像。
图15是示出CYPA/化合物3与KRASG12C-GTP的结合的传感图和稳态拟合曲线的图像。
图16是示出CypA:C3DS:KRAS复合物形成的荧光偏振曲线的图像。
图17A至图17C是示出KRASG12C-GTP的2D 1H-15N TROSY-HSQC谱图(图17A)，添加化学计量的CYPA的2D 1H-15N TROSY-HSQC谱图(图17B)，以及单独的KRAS和CYPA的2D 1H-15NTROSY-HSQC谱图(图17C)的图像。
具体实施方式
小分子在靶向能力方面受到限制，因为它们与靶的相互作用是由粘附力驱动的，粘附力的强度大致与接触表面积成正比。由于其尺寸小，小分子累积足够的分子间接触表面积以有效地与靶蛋白相互作用的唯一方法是被所述蛋白完全吞噬。实际上，大量的实验和计算数据都支持如下观点：只有那些表面具有疏水性“口袋”的蛋白质才能够结合小分子。在那些情况下，吞噬使结合成为可能。
大自然已经发展出一种策略，允许小分子在疏水性口袋以外的位点与靶蛋白相互作用。所述策略由天然存在的免疫抑制药物环孢霉素A、雷帕霉素和FK506举例说明。这些药物的生物学活性涉及形成小分子与小分子呈递蛋白的高亲和力复合物。小分子和呈递蛋白的复合表面接合靶。因此，例如，在环孢菌素A与亲环蛋白A之间形成的二元复合物以高亲和力和特异性靶向钙调磷酸酶，但是环孢菌素A或亲环蛋白A都不单独地以可测量的亲和力结合钙调磷酸酶。
许多重要的治疗靶通过与其他蛋白质复合发挥其功能。在许多这些系统中，蛋白质/蛋白质相互作用表面含有由宽极性残基环包围的疏水性侧链的内核。疏水性残基贡献几乎所有能量上有利的接触，因此所述簇已被指定为参与蛋白质-蛋白质相互作用的“热点”。重要地，在天然存在的小分子与小呈递蛋白的上述复合物中，所述小分子提供类似于热点的疏水官能团簇，并且所述蛋白质提供大部分极性残基的环。换言之，提出的小分子体系模仿天然蛋白质/蛋白质相互作用体系中广泛采用的表面结构。
大自然已经表明通过进化的多样性重新编程所提出的小分子(便携式热点)的靶特异性的能力。在最佳表征的实例中，在FK506结合蛋白(FKBP)与FK506靶钙调磷酸酶之间形成复合物。然而，FKBP也可以与相关分子雷帕霉素形成复合物，并且所述复合物与完全不同的靶TorC1相互作用。迄今为止，尚未开发出重新编程呈递蛋白/配体界面的结合和调节其能力，使得它们可以与先前认为不可成药的其他靶蛋白相互作用并对其进行调节的方法。
此外，已经确定一些药物候选物失败的原因是它们调节预期靶和其他非预期蛋白质两者的活性。当靶蛋白的药物结合位点与非靶蛋白中的结合位点相似时，这个问题尤其令人生畏。一种这种实例是其ATP结合口袋在结构上类似于非靶胰岛素受体(IR)的结合口袋的胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)。设计成靶向IGF-1R的小分子开发候选物通常具有还调节胰岛素受体的不可接受的副作用。然而，在ATP结合口袋周围的区域中，这两种蛋白质之间确实存在结构差异。尽管有这样的知识，但迄今为止尚无方法可利用这些不同并开发出相对于IR而言对IGF-1R具有特异性的药物。
本公开提供可用于分析蛋白质-蛋白质界面诸如呈递蛋白(例如，FKBP家族的成员、亲环蛋白家族的成员或PIN1)与靶蛋白之间的界面的方法和试剂。在一些实施方案中，靶蛋白和/或呈递蛋白是细胞内蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白和/或呈递蛋白是哺乳动物蛋白。在一些实施方案中，这些方法和试剂可以用于通过与呈递蛋白和小分子形成复合物来鉴定适于抑制或活化的靶蛋白。在一些实施方案中，这些方法和试剂可以用于鉴定能够通过与呈递蛋白和靶蛋白形成复合物来抑制或活化靶蛋白的化合物。
化合物和缀合物
本公开提供包含蛋白结合部分(例如，呈递蛋白结合部分或靶蛋白结合部分)和交联基团的化合物。本发明的特征还在于缀合物，其包含与蛋白质缀合的蛋白结合部分，例如与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分或与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分。本发明的特征还在于式VII的化合物：
A-L-B
式VII其中A包括式VIII的结构：
在一些实施方案中，本发明的化合物是：
Figure BDA0002302535140000742
交联基团
在一些实施方案中，本发明的化合物包含交联基团。交联基团是指包含能够化学连接到蛋白质或其他分子上的特定官能团(例如，伯胺、巯基)的反应性官能团的基团。交联基团的实例包括巯基反应性交联基团(例如，包含马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代磺酸盐或乙烯基砜的基团)，胺反应性交联基团(例如，包含酯诸如NHS酯、酰亚胺酯和五氟苯基酯或羟甲基膦的基团)，羧基反应性交联基团(例如，包含伯胺或仲胺、醇或硫醇的基团)，羰基反应性交联基团(例如，包含酰肼或烷氧基胺的基团)，和形成三唑的交联基团(例如，包含叠氮化物或炔烃的基团)。
示例性交联基团包括2'-吡啶基二硫化物、4'-吡啶基二硫化物碘乙酰基、马来酰亚胺、硫代酯、烷基二硫化物、烷基胺二硫化物、硝基苯甲酸二硫化物、酸酐、NHS酯、醛、烷基氯、炔烃、迈克尔受体基团(例如，α,β-未取代的酮或砜)、环氧化物、杂芳基腈和叠氮化物。
呈递蛋白结合部分
在一些实施方案中，本发明的化合物包含呈递蛋白结合部分。在一些实施方案中，呈递蛋白结合部分包含一组原子(例如，5至20个原子、5至10个原子、10至20个原子)并且可以包含其所连接的任何部分(例如，20个原子内的原子、15个原子内的原子、10个原子内的原子、5个原子内的原子)，其参与与呈递蛋白的结合，使得提供的化合物例如以小于10μM(例如，小于5μM、小于1μM、小于500nM、小于200nM、小于100nM、小于75nM、小于50nM、小于25nM、小于10nM)的KD特异性结合所述呈递蛋白，或者例如以小于1μM(例如，小于0.5μM、小于0.1μM、小于0.05μM、小于0.01μM)的IC50抑制呈递蛋白的肽基-脯氨酰异构酶活性。在一些实施方案中，呈递蛋白结合部分不涵盖提供的化合物中与呈递蛋白相互作用的全部原子。在某些实施方案中，呈递蛋白结合部分的一个或多个原子不与呈递蛋白相互作用。
在一些实施方案中，呈递蛋白结合部分包括N-酰基脯氨酸部分、N-酰基-哌啶酸部分、N-酰基3-吗啉代-羧酸部分和/或N-酰基哌嗪酸部分(例如，在任一氮原子上具有酰基化作用。在某些实施方案中，呈递蛋白结合部分包括N-酰基-哌啶酸部分。在一些实施方案中，呈递蛋白结合部分包括N-酰基脯氨酸部分。在某些实施方案中，呈递蛋白结合部分包括N-酰基3-吗啉代-羧酸部分。在一些实施方案中，呈递蛋白结合部分包括N-酰基哌嗪酸部分。
在一些实施方案中，呈递蛋白结合部分的至少一个原子参与与FKBP12的Tyr 27、Phe 37、Asp 38、Arg 41、Phe 47、Gln 54、Glu 55、Val 56、Ile 57、Trp 60、Ala 82、Try 83、His 88、Ile 92和/或Phe 100中的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个)的结合。在一些实施方案中，呈递蛋白结合部分中的至少一个参与与FKBP12的Arg 41、Gln 54、Glu 55和/或Ala 82中的至少一个(例如，两个、三个或四个)的结合。
在一些实施方案中，呈递蛋白结合部分具有根据式II-IV的结构：
在一些实施方案中，呈递蛋白结合部分包括以下结构或由以下结构组成：
Figure BDA0002302535140000782
Figure BDA0002302535140000791
Figure BDA0002302535140000801
或其立体异构体。
呈递蛋白可以与呈递蛋白结合部分中的原子结合。可替代地或另外，呈递蛋白可以与呈递蛋白结合部分中的两个或更多个原子结合。在另一替代方案中，呈递蛋白可以与连接到呈递蛋白结合部分中的一个或多个原子的取代基结合。此外，在一些实施方案中，呈递蛋白可以与呈递蛋白结合部分中的原子结合并且与连接到呈递蛋白结合部分中的一个或多个原子的取代基结合。在一些实施方案中，呈递蛋白与模拟呈递蛋白的天然配体的基团结合，并且其中模拟呈递蛋白的天然配体的基团连接到呈递蛋白结合部分。在一些实施方案中，呈递蛋白与呈递蛋白结合，并且相对于在不存在复合物的情况下呈递蛋白对呈递蛋白的亲和力，二元复合物中呈递蛋白对呈递蛋白的亲和力增加。在此类实例中的结合通常是通过但不限于呈递蛋白与呈递蛋白结合部分的非共价相互作用实现。
靶蛋白结合部分
在一些实施方案中，本发明的化合物包含靶蛋白结合部分(例如，真核靶蛋白结合部分，诸如哺乳动物靶蛋白结合部分或真菌靶蛋白结合部分，或原核靶蛋白结合部分，诸如细菌靶蛋白结合部分)。在一些实施方案中，靶蛋白结合部分包含一组原子(例如，5至20个原子、5至10个原子、10至20个原子)，并且可以包含其所连接的任何部分(例如，20个原子内的原子、15个原子内的原子、10个原子内的原子、5个原子内的原子)，所述连接部分特异性结合靶蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白结合部分包含化合物中与靶蛋白相互作用的多个原子。在某些实施方案中，靶蛋白结合部分的一个或多个原子不与靶蛋白相互作用。
靶蛋白可以与靶蛋白结合部分中的原子结合。可替代地或另外，靶蛋白可以与靶蛋白结合部分中的两个或更多个原子结合。在另一替代方案中，靶蛋白可以与连接到靶蛋白结合部分中的一个或多个原子的取代基结合。在另一替代方案中，靶蛋白可以与靶蛋白结合部分中的原子结合，并且与连接到靶蛋白结合部分中的一个或多个原子的取代基结合。在另一替代方案中，靶蛋白与模拟靶蛋白的天然配体的基团结合，并且其中模拟靶蛋白的天然配体的基团连接到靶蛋白结合部分。在又一替代方案中，靶蛋白与呈递蛋白结合，并且相对于在不存在复合物的情况下靶蛋白对呈递蛋白的亲和力，二元复合物中靶蛋白对呈递蛋白的亲和力增加。在这些实例中的结合通常是通过但不限于靶蛋白与靶蛋白结合部分的非共价相互作用实现。
在一些实施方案中，靶蛋白结合部分包含交联基团(例如，内部交联基团)。
接头
本发明的化合物包含接头(例如，将蛋白结合部分(例如，呈递蛋白结合部分或靶蛋白结合部分)连接至交联基团的部分接头或将蛋白结合部分连接至蛋白质(例如，呈递蛋白或靶蛋白)的接头)。本发明的接头组分最简单地是键，但也可以提供具有共价连接两个部分的侧基的直链、环状或支链分子骨架。
在一些实施方案中，接头的至少一个原子参与与呈递蛋白和/或靶蛋白的结合。在某些实施方案中，接头的至少一个原子不参与与呈递蛋白和/或靶蛋白的结合。
因此，接头在包含在如本文所述的化合物和/或缀合物中时通过共价方式实现两个(或更多个)部分的连接，包括与位于任一部分上的一个或多个官能团形成键。可以用于此目的的化学反应性官能团的实例包括但不限于氨基、羟基、巯基、羧基、羰基、碳水化合物基团、邻二醇、硫醚、2-氨基醇、2-氨基硫醇、胍基、咪唑基和酚基。
在一些实施方案中，两个(或更多个)部分的这种共价连接可以使用含有能够与任一部分中存在的此类官能团反应的反应性部分的接头来实现。例如，部分的胺基可以与接头的羧基或其活化的衍生物反应，导致形成连接两者的酰胺。
能够与巯基反应的部分的实例包括XCH2CO-型的α-卤代乙酰基化合物(其中X＝Br、Cl或I)，其对巯基显示出特别的反应性，但是也可以用于修饰咪唑基、硫醚、苯酚和氨基，如Gurd，Methods Enzymol.11:532(1967)所述。认为N-马来酰亚胺衍生物对巯基也具有选择性，但在某些条件下还可以用于偶联到氨基。如果连接通过二硫桥形成而发生，则通过氨基转化而引入硫醇基的试剂诸如2-亚氨基硫烷(Traut等人Biochemistry 12:3266(1973))可以被认为是巯基试剂。
能够与氨基反应的反应性部分的实例包括，例如，烷基化剂和酰化剂。代表性的烷基化剂包括：
(i)α-卤代乙酰基化合物，其在不存在反应性硫醇基的情况下对氨基显示出特异性并且例如具有XCH2CO-类型(其中X＝Br、Cl或I)，例如由Wong Biochemistry 24:5337(1979)所述；
(ii)N-马来酰亚胺衍生物，其可以通过迈克尔型反应(Michael type reaction)或通过加成到环羰基上的酰化作用而与氨基反应，例如，如Smyth等人,J.Am.Chem.Soc.82:4600(1960)和Biochem.J.91:589(1964)所述；
(iii)芳基卤，诸如反应性硝基卤代芳族化合物；
(iv)烷基卤，如例如McKenzie等人,J.Protein Chem.7:581(1988)所述；
(v)能够与氨基形成席夫碱的醛和酮，形成的加合物通常通过还原来稳定，得到稳定的胺；
(vi)环氧化物衍生物，诸如表氯醇和双环氧乙烷，其可以与氨基、巯基或酚羟基反应；
(vii)s-三嗪的含氯衍生物，其对亲核试剂诸如氨基、巯基和羟基具有很高的反应性；
(viii)基于上面详述的s-三嗪化合物的氮丙啶，例如，如Ross，J.Adv.CancerRes.2:1(1954)所述，其通过开环与亲核试剂诸如氨基反应；
(ix)方酸二乙酯，如Tietze,Chem.Ber.124:1215(1991)所述；以及
(x)α-卤代烷基醚，由于由醚氧原子引起的活化作用，因此与正常烷基卤相比，所述α-卤代烷基醚是更具反应性的烷基化剂，如由Benneche等人,Eur.J.Med.Chem.28:463(1993)所述。
代表性的氨基反应性酰化剂包括：
(i)异氰酸酯和异硫氰酸酯，特别是芳族衍生物，它们分别形成稳定的脲和硫脲衍生物；
(ii)磺酰氯，已由Herzig等人,Biopolymers 2:349(1964)描述；
(iii)酰卤；
(iv)活性酯，诸如硝基苯基酯或N-羟基琥珀酰亚胺酯；
(v)酸酐，诸如混合、对称或N-羧基酸酐；
(vi)其他可用于形成酰胺键的试剂，例如，如M.Bodansky,Principles ofPeptide Synthesis,Springer-Verlag,1984所述；
(vii)酰叠氮，例如，其中叠氮化物基团是使用亚硝酸钠由预先形成的酰肼衍生物生成的，如Wetz等人,Anal.Biochem.58:347(1974)所述；
(viii)酰亚胺酯，其在与氨基反应时形成稳定的脒，例如，如Hunter和Ludwig,J.Am.Chem.Soc.84:3491(1962)所述；以及
(ix)卤代杂芳基，诸如卤代吡啶或卤代嘧啶。
醛和酮可以与胺反应形成席夫碱，其可以有利地通过还原胺化而稳定。烷氧基氨基部分易于与酮和醛反应以产生稳定的烷氧胺，例如，如Webb等人在BioconjugateChem.1:96(1990)中所述。
能够与羧基反应的反应性部分的实例包括重氮化合物，诸如重氮乙酸酯和重氮乙酰胺，它们以高特异性反应以产生酯基，例如，如Herriot,Adv.Protein Chem.3:169(1947)所述。也可以采用通过O-酰基脲形成然后形成酰胺键来反应的羧基改性试剂，诸如碳二亚胺。
应理解，如果需要，可以在反应之前将任一部分中的官能团转化成其他官能团，例如以赋予额外的反应性或选择性。可用于所述目的的方法的实例包括使用诸如二元羧酸酐的试剂将胺转化为羧基；使用诸如N-乙酰基同型半胱氨酸硫代内酯、S-乙酰基巯基琥珀酸酐、2-亚氨基硫烷或含硫醇的琥珀酰亚胺基衍生物的试剂将胺转化为硫醇；使用诸如α-卤代乙酸酯的试剂将硫醇转化为羧基；使用诸如乙撑亚胺或2-溴乙胺的试剂将硫醇转化为胺；使用诸如碳二亚胺的试剂将羧基转化为胺，然后再转化为二胺；以及使用诸如甲苯磺酰氯的试剂将醇转化为硫醇，然后用硫代乙酸酯进行酯交换反应，然后用乙酸钠水解为硫醇。
如果需要的话，根据本发明可以使用所谓的零长度接头，涉及一个部分的反应性化学基团与另一部分的反应性化学基团直接共价连接而不引入另外的连接材料。
然而，更常见地，接头包含如上所述的通过间隔子元件连接的两个或更多个反应性部分。这种间隔子的存在允许双功能接头与任一部分内的特异性官能团反应，从而导致两者之间的共价连接。接头中的反应性部分可以是相同的(同双功能接头)或不同的(异双功能接头，或者，如果存在若干个不同的反应性部分，则是异多功能接头)，从而提供可能导致这两个部分之间共价连接的多种潜在试剂。
接头中的间隔子元件通常由直链或支链组成，并且可以包括C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基、C2-C100聚乙二醇或C1-10杂烷基。
在一些情况下，接头由式V描述。
可用于制备本发明的缀合物的同双功能接头的实例包括但不限于选自乙二胺、丙二胺和六亚甲基二胺的二胺和选自乙二醇、二甘醇、丙二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇、环己二醇和聚己内酯二醇的二醇。
在一些实施方案中，接头是键或至多10个原子的直链，所述原子独立地选自碳、氮、氧、硫或磷原子，其中链中的每个原子任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、氯、碘、溴、氟、羟基、烷氧基、芳氧基、羧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰基氨基、甲酰胺基、氰基、氧代基、硫代基、烷硫基、芳硫基、酰硫基、烷基磺酸酯基、芳基磺酸酯基、磷酰基和磺酰基，并且其中链中的任何两个原子可以与其所结合的取代基一起形成环，其中所述环可以进一步被取代和/或稠合至一个或多个任选取代的碳环、杂环、芳基环或杂芳基环。
在一些实施方案中，接头具有式XIX的结构：
A1-(B1)a-(C1)b-(B2)c-(D)-(B3)d-(C2)e-(B4)f-A2
式XIX
其中A1是接头与呈递蛋白结合部分之间的键；A2是哺乳动物靶相互作用部分与接头之间的键；B1、B2、B3和B4各自独立地选自任选取代的C1-C2烷基、任选取代的C1-C3杂烷基、O、S和NRN；RN是氢、任选取代的C1-4烷基、任选取代的C2-4烯基、任选取代的C2-4炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C1-7杂烷基；C1和C2各自独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基或磷酰基；a、b、c、d、e和f各自独立地是0或1；并且D是任选取代的C1-10烷基、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C2-C10聚乙二醇或任选取代的C1-10杂烷基，或连接A1-(B1)a-(C1)b-(B2)c-与-(B3)d-(C2)e-(B4)f-A2的化学键。
蛋白质
呈递蛋白
呈递蛋白可以与小分子结合形成复合物，所述复合物可以与靶蛋白(例如，真核靶蛋白，诸如哺乳动物靶蛋白或真菌靶蛋白，或原核靶蛋白，诸如细菌靶蛋白)结合并调节所述靶蛋白的活性。在一些实施方案中，呈递蛋白是哺乳动物呈递蛋白(例如，人呈递蛋白)。在一些实施方案中，呈递蛋白是真菌呈递蛋白。在某些实施方案中，呈递蛋白是细菌呈递蛋白。在一些实施方案中，呈递蛋白是植物呈递蛋白。在一些实施方案中，呈递蛋白是相对丰富的蛋白质(例如，呈递蛋白足够丰富，因此参与三方复合物实质上不负面影响呈递蛋白在细胞中的生物学作用和/或细胞的生存力或其他属性)。在一些实施方案中，呈递蛋白比靶蛋白更丰富。在某些实施方案中，呈递蛋白是在细胞内具有伴侣蛋白活性的蛋白质。在一些实施方案中，呈递蛋白在细胞内具有多个天然相互作用配偶体。在某些实施方案中，呈递蛋白是已知结合小分子以形成二元复合物的一种呈递蛋白，已知或怀疑所述二元复合物与靶蛋白结合并调节其生物学活性。亲免蛋白是一类呈递蛋白，已知其具有这些功能并且包括FKBP和亲环蛋白。在一些实施方案中，参考呈递蛋白表现出肽基脯氨酰异构酶活性；在一些实施方案中，呈递蛋白显示出与参考呈递蛋白相当的活性。在某些实施方案中，呈递蛋白是FKBP家族的成员(例如，FKBP12、FKBP12.6、FKBP13、FKBP19、FKBP22、FKBP23、FKBP25、FKBP36、FKBP38、FKBP51、FKBP52、FKBP60、FKBP65和FKBP133)、亲环蛋白家族的成员(例如，PP1A、CYPB、CYPC、CYP40、CYPE、CYPD、NKTR、SRCyp、CYPH、CWC27、CYPL1、CYP60、CYPJ、PPIL4、PPIL6、RANBP2、PPWD1、PPIAL4A、PPIAL4B、PPIAL4C、PPIAL4D或PPIAL4G)或PIN1。“FKBP家族”是具有脯氨酰异构酶活性并充当含有脯氨酸残基的蛋白质的蛋白折叠伴侣蛋白的蛋白质家族。编码所述家族中的蛋白质的基因包括AIP、AIPL1、FKBP1A、FKBP1B、FKBP2、FKBP3、FKBP4、FKBP5、FKBP6、FKBP7、FKBP8、FKBP9、FKBP9L、FKBP10、FKBP11、FKBP14、FKBP15和LOC541473。
“亲环蛋白家族”是与环孢霉素结合的蛋白质家族。编码所述家族中的蛋白质的基因包括PPIA、PPIB、PPIC、PPID、PPIE、PPIF、PPIG、PPIH、SDCCAG-10、PPIL1、PPIL2、PPIL3、PPIL4、P270、PPWD1和COAS-2。示例性亲环蛋白包括PP1A、CYPB、CYPC、CYP40、CYPE、CYPD、NKTR、SRCyp、CYPH、CWC27、CYPL1、CYP60、CYPJ、PPIL4、PPIL6、RANBP2、PPWD1、PPIAL4A、PPIAL4B、PPIAL4C、PPIAL4D和PPIAL4G。
在一些实施方案中，呈递蛋白是伴侣蛋白，诸如GRP78/BiP、GRP94、GRP170、钙连蛋白、钙网蛋白、HSP47、ERp29、蛋白质二硫化物异构酶(PDI)和ERp57。
在一些实施方案中，呈递蛋白是本文公开的FKBP或亲环蛋白的等位基因变体或剪接变体。
在一些实施方案中，呈递蛋白是如下多肽，其氨基酸序列i)与参考呈递蛋白的氨基酸序列显示出显著同一性；ii)包含与参考呈递蛋白的对应部分显示出显著同一性的部分；和/或iii)包含至少一种在呈递蛋白中存在的特征序列。在许多实施方案中，出于定义呈递蛋白的目的，如果同一性高于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高，则同一性被认为是“显著的”。在一些实施方案中，显示出显著同一性的部分具有至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、450、500、550、600个氨基酸或更长的长度。
代表性的呈递蛋白由表1中列出的基因或其同源物编码；在一些实施方案中，参考呈递蛋白由表1中列出的基因编码。另外，参考表1，本领域的普通技术人员可以容易地鉴定通常是呈递蛋白和/或呈递蛋白的特定子集的特征的序列。
表1.编码选定的呈递蛋白的基因
Figure BDA0002302535140000891
Figure BDA0002302535140000901
靶蛋白
靶蛋白(例如，真核靶蛋白，诸如哺乳动物靶蛋白或真菌靶蛋白，或原核靶蛋白，诸如细菌靶蛋白)是调节疾病病状或疾病病状的症状的蛋白质。这样，可以通过调节(抑制或增加)其活性来获得所希望的治疗效果。在本发明的复合物和方法中有用的靶蛋白包括不与呈递蛋白天然缔合的那些靶蛋白，例如在不存在与本发明化合物的二元复合物的情况下对呈递蛋白具有大于1μM，优选地大于5μM，且更优选地大于10μM的亲和力的那些靶蛋白。可替代地，不与呈递蛋白天然缔合的靶蛋白是在不存在二元复合物的情况下对本发明化合物具有大于1μM，优选地大于5μM，且更优选地大于10μM的亲和力的那些靶蛋白。在另一替代方案中，不与呈递蛋白天然缔合的靶蛋白是对环孢霉素、雷帕霉素或FK506与呈递蛋白(例如，FKBP)的二元复合物具有大于1μM，优选地大于5μM，且更优选地大于10μM的亲和力的那些靶蛋白。在又一替代方案中，不与呈递蛋白天然缔合的靶蛋白是不同于钙调磷酸酶或mTOR的那些靶蛋白。用于本发明的复合物和方法的合适靶蛋白的选择可以取决于呈递蛋白。例如，对亲环蛋白具有低亲和力的靶蛋白可以对FKBP具有高亲和力，并且不能与后者一起使用。
靶蛋白可以是天然存在的，例如野生型。可替代地，靶蛋白可以不同于野生型蛋白，但仍保留生物学功能，例如作为等位基因变体、剪接突变体或生物学活性片段。
在一些实施方案中，靶蛋白是跨膜蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白具有卷曲螺旋结构。在某些实施方案中，靶蛋白是二聚复合物的一种蛋白。
在一些实施方案中，本发明的靶蛋白包含一个或多个表面位点(例如，平坦的表面位点)，其特征在于，在不形成呈递蛋白/化合物复合物的情况下，小分子通常表现出与所述一个或多个位点的低或不可检测的结合。在一些实施方案中，靶蛋白包含一个或多个表面位点(例如，平坦的表面位点)，在不形成呈递蛋白/化合物复合物的情况下，特定的小分子(例如，化合物)显示出与所述一个或多个表面位点的低或不可检测的结合(例如，与在包含相同化合物的呈递蛋白/化合物复合物的情况下观察到的结合相比，所述结合为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100倍或更多倍低)。在一些实施方案中，靶蛋白具有以一个或多个位点为特征的表面(并且，在一些实施方案中，整个表面)，所述位点缺乏任何传统的结合口袋，例如，具有与活性已被一种或多种小分子调节的蛋白质相当的物理化学和/或几何特性的蛋白质结构上的空腔或口袋。在某些实施方案中，靶蛋白具有传统的结合口袋和蛋白质-蛋白质相互作用的位点。在一些实施方案中，靶蛋白是不可成药的靶，例如，靶蛋白不是已知被药物靶向和/或不具备预期(例如，根据本领域认可的理解，如本文所讨论)适合与小分子结合的结合位点的蛋白质家族的成员。在一些实施方案中，所述蛋白质包含至少一种反应性半胱氨酸。
在一些实施方案中，靶蛋白是GTP酶，诸如DIRAS1、DIRAS2、DIRAS3、ERAS、GEM、HRAS、KRAS、MRAS、NKIRAS1、NKIRAS2、NRAS、RALA、RALB、RAP1A、RAP1B、RAP2A、RAP2B、RAP2C、RASD1、RASD2、RASL10A、RASL10B、RASL11A、RASL11B、RASL12、REM1、REM2、RERG、RERGL、RRAD、RRAS、RRAS2、RHOA、RHOB、RHOBTB1、RHOBTB2、RHOBTB3、RHOC、RHOD、RHOF、RHOG、RHOH、RHOJ、RHOQ、RHOU、RHOV、RND1、RND2、RND3、RAC1、RAC2、RAC3、CDC42、RAB1A、RAB1B、RAB2、RAB3A、RAB3B、RAB3C、RAB3D、RAB4A、RAB4B、RAB5A、RAB5B、RAB5C、RAB6A、RAB6B、RAB6C、RAB7A、RAB7B、RAB7L1、RAB8A、RAB8B、RAB9、RAB9B、RABL2A、RABL2B、RABL4、RAB10、RAB11A、RAB11B、RAB12、RAB13、RAB14、RAB15、RAB17、RAB18、RAB19、RAB20、RAB21、RAB22A、RAB23、RAB24、RAB25、RAB26、RAB27A、RAB27B、RAB28、RAB2B、RAB30、RAB31、RAB32、RAB33A、RAB33B、RAB34、RAB35、RAB36、RAB37、RAB38、RAB39、RAB39B、RAB40A、RAB40AL、RAB40B、RAB40C、RAB41、RAB42、RAB43、RAP1A、RAP1B、RAP2A、RAP2B、RAP2C、ARF1、ARF3、ARF4、ARF5、ARF6、ARL1、ARL2、ARL3、ARL4、ARL5、ARL5C、ARL6、ARL7、ARL8、ARL9、ARL10A、ARL10B、ARL10C、ARL11、ARL13A、ARL13B、ARL14、ARL15、ARL16、ARL17、TRIM23、ARL4D、ARFRP1、ARL13B、RAN、RHEB、RHEBL1、RRAD、GEM、REM、REM2、RIT1、RIT2、RHOT1或RHOT2。在一些实施方案中，靶蛋白是GTP酶活化蛋白，诸如NF1、IQGAP1、PLEXIN-B1、RASAL1、RASAL2、ARHGAP5、ARHGAP8、ARHGAP12、ARHGAP22、ARHGAP25、BCR、DLC1、DLC2、DLC3、GRAF、RALBP1、RAP1GAP、SIPA1、TSC2、AGAP2、ASAP1或ASAP3。在一些实施方案中，靶蛋白是鸟嘌呤核苷酸交换因子，诸如CNRASGEF、RASGEF1A、RASGRF2、RASGRP1、RASGRP4、SOS1、RALGDS、RGL1、RGL2、RGR、ARHGEF10、ASEF/ARHGEF4、ASEF2、DBS、ECT2、GEF-H1、LARG、NET1、OBSCURIN、P-REX1、P-REX2、PDZ-RHOGEF、TEM4、TIAM1、TRIO、VAV1、VAV2、VAV3、DOCK1、DOCK2、DOCK3、DOCK4、DOCK8、DOCK10、C3G、BIG2/ARFGEF2、EFA6、FBX8或GEP100。在某些实施方案中，靶蛋白是具有蛋白质-蛋白质相互作用结构域的蛋白质，所述结构域诸如为ARM；BAR；BEACH；BH；BIR；BRCT；BROMO；BTB；C1；C2；CARD；CC；CALM；CH；CHROMO；CUE；DEATH；DED；DEP；DH；EF-手；EH；ENTH；EVH1；F-框；FERM；FF；FH2；FHA；FYVE；GAT；GEL；GLUE；GRAM；GRIP；GYF；HEAT；HECT；IQ；LRR；MBT；MH1；MH2；MIU；NZF；PAS；PB1；PDZ；PH；POLO-框；PTB；PUF；PWWP；PX；RGS；RING；SAM；SC；SH2；SH3；SOCS；SPRY；START；SWIRM；TIR；TPR；TRAF；SNARE；TUBBY；TUDOR；UBA；UEV；UIM；VHL；VHS；WD40；WW；SH2；SH3；TRAF；溴区结构域；或TPR。在一些实施方案中，靶蛋白是热休克蛋白，诸如Hsp20、Hsp27、Hsp70、Hsp84、αB结晶、TRAP-1、hsf1或Hsp90。在某些实施方案中，靶蛋白是离子通道，诸如Cav2.2、Cav3.2、IKACh、Kv1.5、TRPA1、NAv1.7、Nav1.8、Nav1.9、P2X3或P2X4。在一些实施方案中，靶蛋白是卷曲螺旋蛋白，诸如联会蛋白、SPAG4、VAV1、MAD1、ROCK1、RNF31、NEDP1、HCCM、EEA1、波形蛋白、ATF4、Nemo、SNAP25、突触融合蛋白1a、FYCO1或CEP250。在某些实施方案中，靶蛋白是激酶，诸如细胞周期蛋白D1、ABL、ALK、AXL、BTK、EGFR、FMS、FAK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4、IGF1R、INSR、JAK1、JAK2、JAK3、KIT、MET、PDGFRA、PDGFRB、RET RON、ROR1、ROR2、ROS、SRC、SYK、TIE1、TIE2、TRKA、TRKB、KDR、AKT1、AKT2、AKT3、PDK1、PKC、RHO、ROCK1、RSK1、RKS2、RKS3、ATM、ATR、CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8、CDK9、CDK10、ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、GSK3A、GSK3B、JNK1、JNK2、JNK3、AurA、AurB、PLK1、PLK2、PLK3、PLK4、IKK、KIN1、cRaf、PKN3、c-Src、Fak、PyK2或AMPK。在一些实施方案中，靶蛋白是磷酸酶，诸如WIP1、SHP2、SHP1、PRL-3、PTP1B或STEP。在某些实施方案中，靶蛋白是泛素或泛素样蛋白(诸如NEDD8、ATG8蛋白、SUMO蛋白、ISG15)、活化酶(E1，诸如UBA1、UBA2、UBA3、UBA5、UBA6、UBA7、ATG7、NAE1、SAE1)、缀合酶(E2，诸如UBE蛋白、ATG3、BIRC6)、连接酶(E3，诸如BMI-1、MDM2、NEDD4-1、β-TRCP、SKP2、E6AP、CBL-B或APC/C)以及泛素或泛素样蛋白蛋白酶。在一些实施方案中，靶蛋白是染色质改性剂/重塑剂，诸如由基因BRG1、BRM、ATRX、PRDM3、ASH1L、CBP、KAT6A、KAT6B、MLL、NSD1、SETD2、EP300、KAT2A或CREBBP编码的染色质改性剂/重塑剂。在一些实施方案中，靶蛋白是转录因子，诸如由以下基因编码的转录因子：EHF、ELF1、ELF3、ELF4、ELF5、ELK1、ELK3、ELK4、ERF、ERG、ETS1、ETV1、ETV2、ETV3、ETV4、ETV5、ETV6、FEV、FLI1、GAVPA、SPDEF、SPI1、SPIC、SPIB、E2F1、E2F2、E2F3、E2F4、E2F7、E2F8、ARNTL、BHLHA15、BHLHB2、BHLBHB3、BHLHE22、BHLHE23、BHLHE41、CLOCK、FIGLA、HAS5、HES7、HEY1、HEY2、ID4、MAX、MESP1、MLX、MLXIPL、MNT、MSC、MYF6、NEUROD2、NEUROG2、NHLH1、OLIG1、OLIG2、OLIG3、SREBF2、TCF3、TCF4、TFAP4、TFE3、TFEB、TFEC、USF1、ARF4、ATF7、BATF3、CEBPB、CEBPD、CEBPG、CREB3、CREB3L1、DBP、HLF、JDP2、MAFF、MAFG、MAFK、NRL、NFE2、NFIL3、TEF、XBP1、PROX1、TEAD1、TEAD3、TEAD4、ONECUT3、ALX3、ALX4、ARX、BARHL2、BARX、BSX、CART1、CDX1、CDX2、DLX1、DLX2、DLX3、DLX4、DLX5、DLX6、DMBX1、DPRX、DRGX、DUXA、EMX1、EMX2、EN1、EN2、ESX1、EVX1、EVX2、GBX1、GBX2、GSC、GSC2、GSX1、GSX2、HESX1、HMX1、HMX2、HMX3、HNF1A、HNF1B、HOMEZ、HOXA1、HOXA10、HOXA13、HOXA2、HOXAB13、HOXB2、HOXB3、HOXB5、HOXC10、HOXC11、HOXC12、HOXC13、HOXD11、HOXD12、HOXD13、HOXD8、IRX2、IRX5、ISL2、ISX、LBX2、LHX2、LHX6、LHX9、LMX1A、LMX1B、MEIS1、MEIS2、MEIS3、MEOX1、MEOX2、MIXL1、MNX1、MSX1、MSX2、NKX2-3、NKX2-8、NKX3-1、NKX3-2、NKX6-1、NKX6-2、NOTO、ONECUT1、ONECUT2、OTX1、OTX2、PDX1、PHOX2A、PHOX2B、PITX1、PITX3、PKNOX1、PROP1、PRRX1、PRRX2、RAX、RAXL1、RHOXF1、SHOX、SHOX2、TGIF1、TGIF2、TGIF2LX、UNCX、VAX1、VAX2、VENTX、VSX1、VSX2、CUX1、CUX2、POU1F1、POU2F1、POU2F2、POU2F3、POU3F1、POU3F2、POU3F3、POU3F4、POU4F1、POU4F2、POU4F3、POU5F1P1、POU6F2、RFX2、RFX3、RFX4、RFX5、TFAP2A、TFAP2B、TFAP2C、GRHL1、TFCP2、NFIA、NFIB、NFIX、GCM1、GCM2、HSF1、HSF2、HSF4、HSFY2、EBF1、IRF3、IRF4、IRF5、IRF7、IRF8、IRF9、MEF2A、MEF2B、MEF2D、SRF、NRF1、CPEB1、GMEB2、MYBL1、MYBL2、SMAD3、CENPB、PAX1、PAX2、PAX9、PAX3、PAX4、PAX5、PAX6、PAX7、BCL6B、EGR1、EGR2、EGR3、EGR4、GLIS1、GLIS2、GLI2、GLIS3、HIC2、HINFP1、KLF13、KLF14、KLF16、MTF1、PRDM1、PRDM4、SCRT1、SCRT2、SNAI2、SP1、SP3、SP4、SP8、YY1、YY2、ZBED1、ZBTB7A、ZBTB7B、ZBTB7C、ZIC1、ZIC3、ZIC4、ZNF143、ZNF232、ZNF238、ZNF282、ZNF306、ZNF410、ZNF435、ZBTB49、ZNF524、ZNF713、ZNF740、ZNF75A、ZNF784、ZSCAN4、CTCF、LEF1、SOX10、SOX14、SOX15、SOX18、SOX2、SOX21、SOX4、SOX7、SOX8、SOX9、SRY、TCF7L1、FOXO3、FOXB1、FOXC1、FOXC2、FOXD2、FOXD3、FOXG1、FOXI1、FOXJ2、FOXJ3、FOXK1、FOXL1、FOXO1、FOXO4、FOXO6、FOXP3、EOMES、MGA、NFAT5、NFATC1、NFKB1、NFKB2、TP63、RUNX2、RUNX3、T、TBR1、TBX1、TBX15、TBX19、TBX2、TBX20、TBX21、TBX4、TBX5、AR、ESR1、ESRRA、ESRRB、ESRRG、HNF4A、NR2C2、NR2E1、NR2F1、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A2、RARA、RARB、RARG、RORA、RXRA、RXRB、RXRG、THRA、THRB、VDR、GATA3、GATA4或GATA5；或C-myc、Max、Stat3、Stat4、Stat6、雄性激素受体、C-Jun、C-Fox、N-Myc、L-Myc、MITF、Hif-1α、Hif-2α、Bcl6、E2F1、NF-κB、Stat5或ER(coact)。在某些实施方案中，靶蛋白是TrkA、P2Y14、mPEGS、ASK1、ALK、Bcl-2、BCL-XL、mSIN1、RORγt、IL17RA、eIF4E、TLR7 R、PCSK9、IgE R、CD40、CD40L、Shn-3、TNFR1、TNFR2、IL31RA、OSMR、IL12β1,2、Tau、FASN、KCTD 6、KCTD 9、Raptor、Rictor、RALGAPA、RALGAPB、膜联蛋白家族成员、BCOR、NCOR、β连环蛋白、AAC 11、PLD1、PLD2、卷曲蛋白7、RaLP、MLL-1、Myb、Ezh2、RhoGD12、EGFR、CTLA4R、GCGC(coact)、脂联素R2、GPR 81、IMPDH2、IL-4R、IL-13R、IL-1R、IL2-R、IL-6R、IL-22R、TNF-R、TLR4、MyD88、Keap1或Nrlp3。
蛋白质变体
如本文所述，蛋白质或多肽变体通常具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列显示出与参考多肽(例如，如本文所述的呈递蛋白或靶蛋白，例如像哺乳动物呈递蛋白或靶蛋白)的显著(例如，80％或更大，即80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性，但包含有限数量的特定氨基酸变化(例如，保守或非保守和/或包括相对于参考多肽的一种或多种氨基酸变体或类似物(例如，D-氨基酸、去氨基酸)的插入、缺失或取代。在某些实施方案中，变体与参考多肽共享相关的生物学活性(例如，与特定的化合物或其部分结合)；在一些此类实施方案中，变体展示出以下水平的活性：不小于参考多肽的约50％和/或不低于参考多肽的小于约0.5倍。
在一些实施方案中，变体多肽具有与参考多肽的氨基酸序列至少(或仅)在以下方面不同的氨基酸序列：所述变体具有较大数量的半胱氨酸残基和/或在对应于参考多肽中的非半胱氨酸残基的位置处具有一个或多个半胱氨酸残基。例如，在一些实施方案中，向如本文所述的多肽(例如，呈递蛋白和/或靶蛋白)中的任一种的氨基或羧基末端添加一个或多个半胱氨酸残基可以促进通过例如二硫键进行的这种多肽的缀合。在一些实施方案中，氨基酸取代可以是保守的(即，其中残基被相同的通用类型或组中的另一个替代)或非保守的(即，其中残基被另一种类型的氨基酸替代)。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸可以取代非天然存在的氨基酸(即，非天然存在的保守氨基酸取代或非天然存在的非保守氨基酸取代)，或反之亦然。
合成制备的多肽可以包括由DNA非天然编码的氨基酸(例如，非天然存在或非天然氨基酸)的取代。非天然存在的氨基酸的实例包括D-氨基酸，具有含叠氮化物的侧链的氨基酸，具有连接至半胱氨酸的硫原子的乙酰氨基甲基的氨基酸，聚乙二醇化氨基酸，式NH2(CH2)nCOOH(其中n是2-6)的ω氨基酸，中性非极性氨基酸，诸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。苯甘氨酸可以取代Trp、Tyr或Phe；瓜氨酸和甲硫氨酸亚砜是中性非极性的，半胱氨酸是酸性的，并且鸟氨酸是碱性的。脯氨酸可以被羟基脯氨酸取代并保留赋予构象的特性。
类似物可以通过取代诱变生成并保留原始蛋白质的结构(例如，局部结构或整体结构)。表2中示出鉴定为“保守取代”的取代的实例。如果此类取代导致不期望的改变，则引入其他类型的取代，在表2中命名为“示例性取代”，或如本文中参考氨基酸类别进一步描述的，并筛选产物。
在功能或免疫学同一性方面的实质性修饰是通过选择其在维持以下的作用方面显著不同的取代完成的：(a)在取代区域中蛋白质主链的结构，例如作为薄片或螺旋构象。(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)大部分的侧链。天然存在的残基基于共同的侧链特性分为以下组：
(1)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)，
(2)中性亲水性：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)
(3)酸性/带负电荷：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)
(4)碱性：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)
(5)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；
(6)芳族：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)，
(7)极性：Ser、Thr、Asn、Gln
(8)碱性带正电荷：Arg、Lys、His，以及；
(9)带电荷的：Asp、Glu、Arg、Lys、His
表2列出其他氨基酸取代。
表2.氨基酸取代
Figure BDA0002302535140000981
Figure BDA0002302535140000991
具有变化的反应性氨基酸谱的蛋白质变体
在一些实施方案中，蛋白质或多肽变体可以包括将一个或多个反应性氨基酸残基(例如，半胱氨酸)添加到蛋白质(例如，在本文所述的任何蛋白质的氨基或羧基末端)可以促进通过例如二硫键进行的这些蛋白质的缀合。在一些实施方案中，可以去除一个或多个反应性氨基酸(例如，半胱氨酸)以减少蛋白质上可能缀合位点的数量。氨基酸取代可以是保守的(即，其中一个残基被相同的通用类型或基团中的另一个替代)或非保守的(即，其中一个残基被另一种类型的氨基酸替代)。此外，天然存在的氨基酸可以取代非天然存在的氨基酸(即，非天然存在的保守氨基酸取代或非天然存在的非保守氨基酸取代)。
如本领域中已知的，例如，如在Chin,J.W.,Expanding and Reprogramming theGenetic Code of Cells and Animals,Annual Review of Biochemistry,第83卷:379-408中所述，可以将非天然氨基酸并入体外制备的蛋白质中。例如，在一个系统中，已经使用UAG琥珀(终止)密码子以通过古细菌tRNA合成酶和tRNA并入吡咯赖氨酸，并且还可以使用这些UAG琥珀(终止)密码子通过进料并入叠氮化物和炔烃。在本领域中已经证明的非天然氨基酸上的其他侧链包括环丙烯、反式环辛烯、双环[6.1.0]壬炔-赖氨酸、香豆素、对叠氮基苯丙氨酸、N6-[(2-丙炔氧基)羰基]-L-赖氨酸、双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)、N-5-降冰片烯-2-基氧羰基-l-赖氨酸、N-叔丁氧羰基-l-赖氨酸、N-2-叠氮基乙氧羰基-l-赖氨酸、N-L-硫代脯氨酰基-L-赖氨酸、N-D-半胱氨酰基-L-赖氨酸、N-L-半胱氨酰基-L-赖氨酸、N6-[(2-丙炔氧基)羰基]-L-赖氨酸、N6-[(2-叠氮基乙氧基)羰基]-L-赖氨酸、二苯甲酮、4-(6-甲基-s-四嗪-3-基)氨基苯丙氨酸和环辛炔。
复合物
在天然存在的蛋白质-蛋白质相互作用中，结合事件通常主要是由相互作用蛋白质的平坦表面位点上的疏水残基驱动的，相比之下，许多小分子-蛋白质相互作用则是由蛋白质上空腔或口袋中的小分子之间的相互作用驱动的。通常，蛋白质平坦表面位点上的疏水性残基形成疏水性热点，其中相互作用的蛋白质之间或之中的大多数结合相互作用都是范德华相互作用。在一些情况下，小分子可以提供“便携式热点”(或其一部分)，因为它参与蛋白质(例如，呈递蛋白)上的这种疏水性相互作用或生成这种疏水性相互作用位点，在小分子不存在的情况下这种疏水性相互作用位点不存在；本公开的各方面特别适用于此类情况。例如，在一些实施方案中，如本文所述的化合物(和/或其标记形式)与蛋白质形成复合物(例如，呈递蛋白/化合物复合物)并参与假蛋白质-蛋白质相互作用(例如，与靶蛋白形成三方复合物)。
许多哺乳动物蛋白能够与多种不同配偶体中的任一种结合；在一些情况下，此类替代性结合相互作用有助于蛋白质的生物学活性。这些蛋白质中的许多都适应热点蛋白质区域的固有可变性，以在不同的结构环境中呈现相同的残基。更具体地，蛋白质-蛋白质相互作用可以通过由一组选择的真菌和细菌物种产生的一类天然产物介导。这些分子既表现出共同的结构组织，又表现出提供调节蛋白质-蛋白质相互作用的能力的所得功能。这些分子含有高度保守的呈递蛋白结合部分和在不同天然产物之中表现出高度可变性的靶蛋白相互作用部分。呈递蛋白结合部分赋予对呈递蛋白的特异性，并允许分子与呈递蛋白结合以形成复合物；哺乳动物靶蛋白结合部分赋予对靶蛋白的特异性，并允许二元复合物与靶蛋白结合，通常调节(例如，正或负调节)其活性。在本发明中，通过将呈递蛋白结合部分与靶蛋白缀合或将靶蛋白结合部分与呈递蛋白缀合来模拟二元复合物(例如，化合物与呈递蛋白之间或化合物与靶蛋白之间)。然后，本发明的所得缀合物可以与呈递蛋白或靶蛋白结合，形成模拟三方复合物的复合物。这些复合物可以用于例如确定呈递蛋白与靶蛋白之间的界面的结构。此外，通过例如通过将呈递蛋白结合部分与靶蛋白缀合而简化复合物的形成，本发明的化合物可以用于例如鉴定能够与呈递蛋白结合的靶蛋白。
用途
靶蛋白的鉴定
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物、复合物、组合物和/或方法可以用于鉴定能够与呈递蛋白形成复合物(例如，在存在小分子的情况下)的靶蛋白。靶蛋白可以通过形成包含与靶部分缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物并确定所述缀合物是否与呈递蛋白形成复合物来鉴定。
在确定小分子的作用机理期间，偶然地鉴定出本领域已知的与呈递蛋白和小分子形成三元复合物的大多数靶蛋白。本发明的方法允许合理鉴定能够通过将呈递蛋白结合部分与靶分子共价缀合来在存在小分子的情况下与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白，从而允许在鉴定出能够同时结合呈递蛋白和靶蛋白两者的化合物之前形成复合物。
然后，可以针对小分子促进在呈递蛋白与鉴定的靶蛋白之间形成复合物的能力对小分子进行筛选，以鉴定能够调节靶蛋白的生物学活性的潜在治疗剂。
在一些实施方案中，本发明的化合物可以用于鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白。例如，可以通过在适合允许形成呈递蛋白/靶蛋白复合物的条件下在存在本发明化合物的情况下将一种或多种靶蛋白与标记的呈递蛋白(例如，用生物素标记)组合来鉴定靶蛋白。然后可以去除(例如，洗去)不与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白，然后可以使用呈递蛋白上的标记下拉并分析形成复合物的靶蛋白。在一些实施方案中，可以通过质谱法下拉的靶蛋白以确定其身份。
化合物设计
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物、复合物、组合物和/或方法可以用于设计能够调节用于治疗疾病的靶蛋白的生物学活性的化合物。
例如，本发明的呈递蛋白和缀合物的复合物的形成可以通过复合物的结晶和晶体结构确定来促进呈递蛋白与靶蛋白之间的蛋白质-蛋白质界面的结构的确定。一旦确定了本发明复合物的晶体结构，就可以使用本领域已知的合理药物设计的方法来开发能够促进呈递蛋白与靶蛋白之间的复合物形成的小分子，诸如从头开始构建结构的计算化学方法和/或使用诸如片段浸泡本发明的复合物的晶体并确定所得结构的方法的基于片段的药物设计。
然后可以对如上所述设计的化合物进行筛选以确定其调节靶蛋白的生物学活性的能力，并根据需要使用药物化学技术对其进行修饰以产生治疗上有用的化合物。
共价小分子治疗剂的鉴定
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物、复合物、组合物和/或方法可以用于鉴定能够通过共价相互作用调节靶蛋白的生物学活性的化合物。
例如，可以在存在和不存在呈递蛋白的情况下针对本发明化合物与靶蛋白共价结合的能力筛选本发明化合物，以鉴定能够仅在存在呈递蛋白的情况下选择性结合靶蛋白的化合物。然后可以针对这些化合物调节靶蛋白的生物学活性的能力来测试这些化合物，并根据需要使用药物化学技术对其进行修饰以产生治疗上有用的化合物。
生物化学和/或生物物理特性的确定
在一些实施方案中，本发明的化合物、缀合物、复合物、组合物和/或方法可以用于确定蛋白质或复合物的生物化学和/或生物物理特性。
例如，可以例如通过等温滴定量热法确定包含呈递蛋白结合部分和靶蛋白的缀合物与呈递蛋白之间的结合自由能。可以例如通过表面等离体共振来确定包含呈递蛋白结合部分和靶蛋白的缀合物对于呈递蛋白的Kd。可以例如通过质谱法确定化合物和呈递蛋白对于靶蛋白的Ki、Kinact和/或Ki/Kinact。
疾病或病症的治疗
本文所述的化合物、缀合物和复合物可以用于治疗与本文所述的靶蛋白相关的疾病或病症的方法中，并且尽管不受理论的束缚，但据信通过其通过与呈递蛋白和靶蛋白的相互作用调节(例如，正或负调节)靶蛋白(例如，真核靶蛋白，诸如哺乳动物靶蛋白或真菌靶蛋白，或原核靶蛋白，诸如细菌靶蛋白)的活性的能力发挥其所希望的作用。
试剂盒
在一些实施方案中，本发明涉及一种用于方便且有效地实施根据本发明的方法的试剂盒。通常，药物包装或试剂盒包括一个或多个装有本发明药物组合物的一种或多种成分的容器。此类试剂盒特别适合于递送固体口服形式，诸如片剂或胶囊。这种试剂盒优选地包括多个单位剂量，并且还可以包括具有按照其预期用途的顺序定向的剂量的卡片。如果需要，例如如果受试者患有阿尔茨海默氏病，则可以例如以数字、字母或其他标记的形式或用指定治疗时间表中可以施用剂量的天数的日历插页提供记忆辅助。可替代地，可以包括以与药物组合物的剂量相似或不同的形式的安慰剂剂量或钙饮食补充剂，以提供其中有每天服用剂量的试剂盒。任选地与此类一种或多种容器相关联的可以是以由管理药物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的报告书，所述报告书反映制造、使用或销售机构对人施用的批准。
药物组合物
为了用于治疗人和动物受试者，可以将本发明的化合物和缀合物配制成药物或兽用组合物。取决于待治疗的受试者、施用方式和所需的治疗类型(例如，预防(prevention)、预防(prophylaxis)或治疗)，以与这些参数相符的方式配制化合物。此类技术的汇总见于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams&Wilkins,(2005)；以及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,编J.Swarbrickand J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York，其各自通过引用并入本文。
本文所述的化合物可以组合物总重量的总计1-95重量％的量存在。可以适合关节内、口服、肠胃外(例如，静脉内、肌肉内)、直肠、皮肤、皮下、局部、透皮、舌下、鼻腔、阴道、膀胱内、尿道内、鞘内、硬膜外、耳内或眼内施用，或通过注射、吸入或与鼻、泌尿生殖、生殖或口腔粘膜直接接触的剂型提供组合物。因此，药物组合物可以是以例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒、混悬液、乳剂、溶液、包括水凝胶的凝胶、糊剂、软膏剂、乳膏剂、膏药、药膏、渗透递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷雾剂、适合离子电渗递送的制剂或气雾剂的形式。可以根据常规医药实践来配制组合物。
通常，为了用于治疗，本文所述的化合物可以单独使用或与一种或多种其他活性剂组合使用。与本文所述的化合物组合的其他药物的实例将包括用于治疗相同适应症的药物。与本文所述的化合物组合的潜在药物的另一实例将包括用于治疗不同但相关或有关的症状或适应症的药物。根据施用模式，将化合物配制成合适的组合物以允许方便的递送。可以本领域已知的多种方式配制组合疗法的每种化合物。例如，组合疗法的第一药剂和第二药剂可以一起或分开配制。希望将第一药剂和第二药剂一起配制成用于药剂的同时或接近同时施用。
可以制备本发明的化合物并将其作为包含有效量的本文所述的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物使用，如本领域熟知的。在一些实施方案中，组合物包含至少两种不同的药学上可接受的赋形剂或载体。
可以适合全身施用或局部(topical)或局部(local)施用的方式制备制剂。全身性制剂包括设计用于注射(例如，肌肉内、静脉内或皮下注射)的那些制剂，或者可以制备成用于经皮、透粘膜或口服施用。制剂通常包含稀释剂，以及在一些情况下，佐剂、缓冲液、防腐剂等。化合物也可以脂质体组合物的形式或作为微乳剂施用。
对于注射，可以常规形式将制剂制备为液体溶液或混悬液，或适合在注射之前在液体中溶解或混悬的固体形式或者乳剂。合适的赋形剂包括例如水、盐水、右旋糖、甘油等。此类组合物还可以包含一定量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如像乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯等。
还设想药物的各种持续释放系统。参见，例如，美国专利号5,624,677，其通过引用并入本文。
全身性施用也可以包括相对无创的方法，诸如使用栓剂、透皮贴剂、透粘膜递送和鼻内施用。口服施用也适用于本发明的化合物。如本领域所理解的，合适的形式包括糖浆、胶囊和片剂。
如本文所述，组合疗法的每种化合物可以本领域已知的多种方式配制。例如，组合疗法的第一药剂和第二药剂可以一起或分开配制。
单独或分开配制的药剂可以作为试剂盒包装在一起。非限制性实例包括但不限于容纳例如两个药丸、药丸和粉剂、小瓶中的栓剂和液体、两种局部乳膏剂等的试剂盒。所述试剂盒可以包括辅助向受试者施用单位剂量的任选组件，诸如用于重构粉剂形式的小瓶、用于注射的注射器、定制的IV递送系统、吸入器等。另外，单位剂量试剂盒可以容纳用于制备和施用组合物的说明书。所述试剂盒可以制造成用于一个受试者的单次使用的单位剂量，或用于特定受试者的多次使用(以恒定剂量或其中单独化合物的功效随治疗进展而变化)；或者试剂盒可以容纳适合向多个受试者施用的多个剂量(“散装包装”)。试剂盒组件可以组装在纸箱、泡罩包装、瓶子、管子等中。
用于口服使用的制剂包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、包括马铃薯淀粉的淀粉、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；制粒剂和崩解剂(例如，包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、海藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸铝镁、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂和抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石粉)。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、矫味剂、增塑剂、湿润剂、缓冲剂等。
两种或更多种化合物可以在片剂、胶囊或其他媒介物中混合在一起，或者可以分配。在一个实例中，第一化合物被包含在片剂的内部，并且第二化合物在片剂的外部，使得大部分的第二化合物在释放第一化合物之前被释放。
用于口服使用的制剂也可以作为以下提供：可咀嚼片剂；或硬质明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合；或软质明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。粉剂、颗粒和丸剂可以使用上文在片剂或胶囊下提到的成分以常规方式使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥设备来制备。
可以通过适当包衣化合物的片剂、胶囊、丸剂或颗粒制剂或将化合物掺入适当的基质中来实现溶解或扩散控制释放。受控释放包衣可以包含一种或多种以上提到的包衣物质和/或例如虫胶、蜂蜡、糖蜡、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸纤维素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羟基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1,3-丁二醇、乙二醇甲基丙烯酸酯和/或聚乙二醇。在受控释放基质制剂中，基质材料还可以包括例如水合的甲基纤维素、巴西棕榈蜡和硬脂醇、卡波姆934(carbopol 934)、硅酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或卤代碳氟化合物。
可以掺入本发明的化合物和组合物以口服施用的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水性或油悬浮液以及具有可食用油诸如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的调味乳液以及酏剂和类似药物媒介物。
通常，当施用给人时，本发明组合的任何化合物的口服剂量取决于化合物的性质，并且可以由本领域的技术人员容易地确定。通常，这种剂量通常为每天约0.001mg至2000mg，理想地为每天约1mg至1000mg，并且更理想地为每天约5mg至500mg。每天可能需要高达200mg的剂量。
如本文所述，在组合疗法中每种药物的施用可以独立地每天进行1至4次，持续1天至1年，并且甚至可能是持续受试者的整个生命期。可能指示慢性长期施用。
实施例
实施例1：某些交联剂的合成
含丙烯酰胺的环孢霉素类似物的合成
Figure BDA0002302535140001081
所有试剂和溶剂均购自Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.。Fmoc-氨基酸、HATU、HOAT、H-Ala-2-Cl-(Trt)树脂(0.36mmol/g)、H-Leu-2-Cl-(Trt)树脂(0.30mmol/g)、H-Phe-2-Cl-(Trt)树脂(0.35mmol/g)和H-Thr(tBu)-2-Cl-(Trt)树脂(0.36mmol/g)购自GLBiochem(Shanghai)Ltd.。
线性肽的偶联是在自动化合成仪上使用标准Fmoc SPSS程序进行的。
通用方法A：通过使用TETRASTM合成仪以0.025mmol树脂的规模合成线性肽。通用协议如下：2x NMP，30s；在NMP中的1x20％(体积/体积)哌啶，15min；5x NMP，30s；将NMP中的氨基酸(3当量)溶液添加到装有树脂的容器中，然后分别添加HATU和DIEA在DMF中的溶液，偶联45min；3x NMP，30s。对所有氨基酸均应用双重偶联策略。
通用方法B：Boc-7mer的连接
通过使用与氨基酸偶联相同的通用协议，在TETRASTM合成仪上实现偶联，不同之处在于Boc-7mer的量是1.5当量。只需要一次偶联。
通用方法C：ivDde保护基团的去除。
在TETRASTM合成仪上实现Dap侧链上ivDde保护基团的去除。通用协议：在装有树脂的容器中添加20％(体积/体积)肼单水合物在NMP中的溶液。将容器摇动30min。排干树脂，并用5x 5mL NMP冲洗(30s)。
通用方法D：在Dap的侧链氨基上连接丙烯酸。
通过使用与氨基酸偶联相同的通用协议，在TETRASTM合成仪上实现偶联。应用双重偶联策略。
通用方法E：侧链保护基团脱保护并最终从树脂上裂解。
通过使TFA混合物在室温下1-2小时实现整体脱保护和从树脂上裂解。裂解混合物(TFA/TIPS/H2O，95/2.5/2.5)或(TFA/DCM/TIPS，40:60:1)可以用于最终裂解。在减压下去除大部分溶剂，并将残留物在真空下浓缩以去除痕量的溶剂。所得残留物无需进一步纯化即可直接用于下一环化。
通用方法F：线性肽的环化
将粗制线性肽溶解在干燥DCM中，使最终浓度为0.1M。然后添加HATU(3当量)、HOAt(3当量)和DIEA(6当量)。将反应混合物搅拌过夜，并且然后通过ESI-LCMS监测。在减压下浓缩溶剂，并将残留物溶解在NMP中，并通过制备型HPLC纯化。通过ESI-LCMS鉴定环肽。
反相HPLC。使用流速为1mL/min的Accucore C18柱(2.6μm，2.1mm x 50mm)进行分析RP-HPLC。使用X选择肽CSH柱(5um，19mm x 150mm)进行制备型RP-HPLC。流动相A：水(0.1％甲酸)，流动相B：ACN；流速：20mL/min；梯度：16分钟内，25％B至95％B。
环[7mer-NMALA-Dap-d-nmala-LEU]的合成：
Figure BDA0002302535140001101
使用上述通用方法，用850mg的H-Leu-2-Cl-(Trt)树脂(0.3mmol/g，0.025mmol规模)执行线性肽链组装。使用通用方法A连接D-N-甲基Ala、Dap和L-N-甲基Ala残基。然后使用通用方法B组装Boc-7mer。通过使用通用方法C实现侧链ivDde保护基团的去除。然后使用通用方法D将丙烯酸连接在Dap侧链上的游离氨基上。在一个步骤中进行整体脱保护并从树脂上裂解(通用方法E)后，将粗制线性肽进行环化(通用方法F)。在最终的制备型HPLC之后，获得17mg的白色固体的最终化合物(56.6％，通过树脂负载计算)。ESI-MS:[M+1]+＝1202,[M+Na]+＝1224,[M/2+1]+＝602。
环[7mer-NMALA-Dap-d-nmala-PHE]的合成：
Figure BDA0002302535140001111
用与环[7mer-NMALA-Dap-d-nmala-LEU]合成类似的方法，获得2.8mg白色固体的最终化合物(9.1％，通过树脂负载计算)。ESI-MS:[M+1]+＝1236,[M+Na]+＝1258,[M/2+1]+＝619。
环[7mer-NMALA-Dap-d-nmala-THR]的合成：
Figure BDA0002302535140001112
用与环[7mer-NMALA-Dap-d-nmala-LEU]合成类似的方法，获得3.4mg白色固体的最终化合物(11.4％，通过树脂负载计算)。ESI-MS:[M+1]+＝1190,[M+Na]+＝1212,[M/2+1]+＝596。
含丙烯酰胺的FKBP12配体的合成
Figure BDA0002302535140001113
Boc-3mer
所有试剂和溶剂均购自Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.。Fmoc-氨基酸、HATU、HOAT、2-Cl-(Trt)-Cl树脂(基于活性位点，0.9mmol/g)和Ala负载的2-Cl-(Trt)-Cl树脂(0.36mmol/g)购自GL Biochem(Shanghai)Ltd.。
将第一氨基酸连接在2-Cl-(Trt)-Cl树脂上。
在用于SPSS的容器中，将5g树脂在50mL干燥NMP中溶胀40min。排干树脂，并且用DCM(5x 30mL)冲洗，然后用NMM 2％/DCM(3x 30mL)冲洗。添加Fmoc-Dap(ivDde)-OH(3.0mmol，1.6g)与NMM(4mmol，400mg)在50mL DCM中的溶液。摇动容器过夜。然后添加2mL的25％NMM/MeOH溶液，并且再摇动容器1小时。排干树脂，并用DCM、NMP、MeOH和EtOH(各3x50mL)冲洗。在室温下真空干燥树脂。
通过Fmoc裂解光度测量(0.32mmol/g)来测量负载。线性肽的偶联是在自动化合成仪上使用标准Fmoc SPSS程序进行的。
通用方法A：通过使用TETRASTM合成仪以0.025mmol树脂的规模合成线性肽。通用协议如下：2x NMP，30s；在NMP中的1x 20％(体积/体积)哌啶，15min；5x NMP，30s；将NMP中的氨基酸(3当量)溶液添加到装有树脂的容器中，然后分别添加HATU和DIEA在DMF中的溶液，偶联45min；3x NMP，30s。对所有氨基酸均应用双重偶联策略。
通用方法B：Boc-3mer的连接
通过使用与氨基酸偶联相同的通用协议，在TETRASTM合成仪上实现偶联，不同之处在于Boc-3mer的量是1.5当量。只需要一次偶联。
通用方法C：ivDde保护基团的去除。
在TETRASTM合成仪上实现Dap侧链上ivDde保护基团的去除。通用协议：在装有树脂的容器中添加20％(体积/体积)肼单水合物在NMP中的溶液。将容器摇动30min。排干树脂，并用5x 5mL NMP冲洗(30s)。
通用方法D：在Dap的侧链氨基上连接丙烯酸。
通过使用与氨基酸偶联相同的通用协议，在TETRASTM合成仪上实现偶联。应用双重偶联策略。
通用方法E：侧链保护基团脱保护并最终从树脂上裂解。
通过使TFA混合物在室温下1-2小时实现整体脱保护和从树脂上裂解。裂解混合物(TFA/TIPS/H2O，95/2.5/2.5)或(TFA/DCM/TIPS，40:60:1)可以用于最终裂解。在减压下去除大部分溶剂，并将残留物在真空下浓缩以去除痕量的溶剂。所得残留物无需进一步纯化即可直接用于下一环化。
通用方法F：线性肽的环化
将粗制线性肽溶解在干燥DCM中，使最终浓度为0.1M。然后添加HATU(3当量)、HOAt(3当量)和DIEA(6当量)。将反应混合物搅拌过夜，并且然后通过ESI-LCMS监测。在减压下浓缩溶剂，并将残留物溶解在NMP中，并通过制备型HPLC纯化。通过ESI-LCMS鉴定环肽。
反相HPLC。使用流速为1mL/min的Accucore C18柱(2.6μm，2.1mm x 50mm)进行分析RP-HPLC。使用X选择肽CSH柱(5um，19mm x 150mm)进行制备型RP-HPLC。流动相A：水(0.1％甲酸)，流动相B：ACN；流速：20mL/min；梯度：16分钟内，25％B至95％B。
环[二胺-Dap-ALA-ALA]的合成：
使用上述通用方法，用700mg的H-Ala-2-Cl-(Trt)树脂(0.025mmol规模)执行线性肽链组装。使用通用方法A连接Ala和Dap残基。然后使用通用方法B组装Boc-3mer。通过使用通用方法C实现侧链ivDde保护基团的去除。然后使用通用方法D将丙烯酸连接在Dap侧链上的游离氨基上。在一个步骤中进行整体脱保护并从树脂上裂解(通用方法E)后，将粗制线性肽进行环化(通用方法F)。在最终的制备型HPLC之后，获得3.1mg的白色固体的最终化合物(14.5％，通过树脂负载计算)。ESI-MS:[M+1]+＝857,[M+Na]+＝879。
环[二胺-ALA-ALA-Dap]的合成
用与环[二胺-Dap-ALA-ALA]合成类似的方法，获得2.2mg白色固体的最终化合物(10.3％，通过树脂负载计算)。ESI-MS:[M+1]+＝857,[M+Na]+＝879。
环[二胺-Dap-ALA]的合成：
Figure BDA0002302535140001152
用与环[二胺-Dap-ALA-ALA]合成类似的方法，获得2.7mg白色固体的最终化合物(12.6％，通过树脂负载计算)。ESI-MS:[M+1]+＝786。
sanglefehrin类似物的合成：
Figure BDA0002302535140001161
可以如下文在方案1中所示使用方法A来制备式IV的化合物。
方案1
Figure BDA0002302535140001162
其中R7、R8、Z5和Z6如先前所定义，PG1是合适的胺保护基团，包括但不限于Boc、Cbz、Alloc和Fmoc，并且X是OH、Cl、F或适合替代或者活化后替代的一些其他基团。
在典型的程序中，使受保护的胺IV与本领域技术人员熟悉的适当试剂反应以去除保护基团PG1。分离的粗产物可以在存在本领域技术人员已知的标准偶联剂(例如，EDC/HOBT、DCC、PyBOP、PyBROP、HATU、HBTU、COMU)的情况下与酰化剂Z5C(O)X反应。在存在碱(包括但不限于DIPEA、三乙胺和NMM)的情况下在室温或略微升高的温度下将酸和胺偶联配偶体与偶联剂在有机溶剂(包括但不限于DMF、二氯甲烷、乙腈和四氢呋喃)中组合。
可替代地，可以在存在碱(包括但不限于吡啶、DIPEA、三乙胺和NMM)的情况下在-78℃至约120℃，优选地在-20℃与50℃的温度范围内使脱保护的胺与酰化剂Z5C(O)X(X为卤素时)在合适的溶剂(包括但不限于DMF、二氯甲烷、DME、乙腈和四氢呋喃)中直接反应。
可以如下文在方案2中所示制备方案1的式IVb的化合物。
方案2
Figure BDA0002302535140001171
其中R7、R8和Z6如先前所定义，并且PG1和PG2各自独立地是合适的胺保护基团，包括但不限于Boc、Cbz、Alloc和Fmoc。
在典型的程序中，使受保护的胺IVc与本领域技术人员熟悉的适当试剂反应，以去除保护基团PG2以产生对应的胺，然后在存在本领域技术人员已知的标准偶联剂(例如，EDC/HOBT、DCC、PyBOP、PyBROP、HATU、HBTU、COMU)的情况下使其与适当的氨基酸反应。在存在碱(包括但不限于DIPEA、三乙胺和NMM)的情况下在室温或略微升高的温度下将酸和胺偶联配偶体与偶联剂在有机溶剂(包括但不限于DMF、二氯甲烷、乙腈和四氢呋喃)中组合以递送式IVb的化合物。
可以如下文在方案3中所示制备方案2的式IVc的化合物。
方案3
Figure BDA0002302535140001172
其中R7和Z6如先前所定义，并且PG2是合适的胺保护基团，包括但不限于Boc、Cbz、Alloc和Fmoc。
在典型的程序中，在存在本领域技术人员已知的标准偶联剂(例如，EDC/HOBT、DCC、PyBOP、PyBROP、HATU、HBTU、COMU)的情况下使受保护的胺IVd与哌嗪酸衍生物IVe反应。在存在碱(包括但不限于DIPEA、三乙胺和NMM)的情况下在室温或略微升高的温度下将酸和胺偶联配偶体与偶联剂在有机溶剂(包括但不限于DMF、二氯甲烷、乙腈和四氢呋喃)中组合。
可替代地，式IVb的化合物可以如方案4中所述由式II-B的化合物合成。
方案4
Figure BDA0002302535140001181
其中R7、R8和Z6如先前所定义，PG1是合适的胺保护基团，包括但不限于Boc、Cbz、Alloc和Fmoc，并且PG3是烷基或芳基，包括但不限于甲基、乙基、苄基、烯丙基、苯基等，其可以通过本领域技术人员已知的方法去除。
在典型的程序中，使化合物IVe在室温下在水解条件下使用碱(例如，氢氧化锂、氢氧化钠、碳酸钠)在包含有机溶剂(例如，甲醇、THF、二噁烷)的溶剂系统中在有水或没有水的情况下反应。本领域技术人员将理解，根据PG3的身份，PG3的去除也可以在氢解条件下使用适当的催化剂，或者在脱烯丙基化条件下使用钯催化剂例如Pd(PPh3)4和碱性清除剂(例如，哌啶、吗啉、哌啶)发生。脱保护以得到所得羧酸后，可以在存在本领域技术人员已知的标准偶联剂(例如，EDC/HOBT、DCC、PyBOP、PyBROP、HATU、HBTU、COMU)的情况下引入Z6。在存在碱(包括但不限于DIPEA、三乙胺和NMM)的情况下在室温或略微升高的温度下将羧酸和偶联配偶体与偶联剂在有机溶剂(包括但不限于DMF、二氯甲烷、乙腈和四氢呋喃)中组合，以得到产物IVb。
可替代地，可以如下文在方案5中所示合成式IVb的化合物。
方案5
其中R7、R8和Z6如先前所定义，并且PG1是合适的胺保护基团，包括但不限于Boc、Cbz、Alloc和Fmoc。
在典型的程序中，在存在本领域技术人员已知的标准偶联剂(例如，EDC/HOBT、DCC、PyBOP、PyBROP、HATU、HBTU、COMU)的情况下，使受保护的胺VI与试剂V反应。在存在碱(包括但不限于DIPEA、三乙胺、NMM)的情况下在室温或略微升高的温度下将酸和胺偶联配偶体与偶联剂在有机溶剂(包括但不限于DMF、二氯甲烷、乙腈和四氢呋喃)中组合。
中间体I-8的合成
Figure BDA0002302535140001192
在25℃下，向中间体I-1(2.00g，7.11mmol)在DMF(13mL)中的室温溶液中添加碳酸铯(4.75g，14.58mmol)和苄基溴(2.49g，14.58mmol，1.73mL)。将反应混合物搅拌2小时，并且然后用乙酸乙酯(100mL)稀释，并用盐水(50mL x 3)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩以得到粗残留物。粗产物通过硅胶柱色谱法(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯→20:1至10:1)纯化，以提供无色油状的中间体I-2(3.20g，96％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.30(m,10H),7.20-7.10(m,1H),6.95-6.85(m,1H),6.74(s,1H),6.70-6.60(m,1H),5.20-5.10(m,2H),4.99(s,2H),4.70-4.60(m,1H),3.15-3.05(m,2H),1.43(s,9H)。ESI-MS m/z＝484.1[M+Na]+；计算的MW：461.55。
在0℃下，向中间体I-2(3.20g，6.93mmol)在四氢呋喃(15mL)的溶液中添加氢氧化锂(在水中1M，10mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。在0℃下，将反应混合物用HCl(在水中1M)调节至pH～6，并用乙酸乙酯(100mL x 3)萃取。将组合的有机层用盐水(20mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩，以得到粗残留物。将粗产物溶解于碳酸氢钠水溶液(7mL)中，并用MTBE(100mL x 3)萃取。将水层用盐酸(在H2O中1M)调节至pH～6，并用乙酸乙酯(50mL x 3)萃取。将组合的有机层用盐水(50mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩，以提供无色油状的中间体I-3(2.27g，88％收率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.30(m,5H),7.25-7.18(m,1H),6.90-6.85(m,1H),6.83-6.75(m,2H),5.05(s,2H),4.94(d,J＝8.00Hz,1H),4.60-4.50(m,1H),3.20-3.12(m,1H),3.10-3.00(m,1H),1.43(s,9H)。ESI-MS m/z＝394.3[M+Na]+；计算的MW：371.43
在0℃下，向中间体I-3(888mg，2.39mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中添加N-甲基吗啉(967mg，9.56mmol)、HOBt(65mg，478umol)、作为TFA盐的(S)-六氢哒嗪-3-羧酸甲酯(890mg，2.39mmol)和EDCI(917mg，4.78mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。将反应混合物用二氯甲烷(50mL)稀释，并用5％柠檬酸水溶液调节至pH～6。用二氯甲烷(20mL x 2)萃取水层。将组合的有机层用盐水(50mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，以得到粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯→10:1、5:1至3:1)纯化，以提供无色油状的中间体I-4(910mg，77％收率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.50-7.35(m,5H),7.20-7.13(m,1H),6.90-6.80(m,3H),5.60-5.50(m,1H),5.30-5.20(m,1H),5.05-5.00(m,2H),4.40-4.30(m,1H),3.65(s,3H),3.55(d,J＝11.20Hz,1H),3.00-2.93(m,1H),2.90-2.80(m,1H),2.75-2.65(m,1H),2.35-2.25(m,1H),1.80-1.72(m,2H),1.42(s,9H)。ESI-MSm/z＝520.1[M+Na]+。计算的MW：497.58。
在0℃下，向中间体I-4(450mg，904umol)在乙酸乙酯(4mL)中的溶液中添加在乙酸乙酯中的盐酸(4M，8.00mL)。将反应混合物在25℃下搅拌1小时。将反应混合物在减压下浓缩，以提供浅黄色固体的中间体I-5的HCl盐(390mg，100％收率)，并且其无需纯化即可用于下一步。ESI-MS m/z＝398.0[M+H]+,420.0[M+Na]+，计算的MW：397.47。
在0℃下，向中间体I-5(195mg，899umol)在二氯甲烷(5.00mL)中的溶液中添加N-甲基吗啉(273mg，2.70mmol)、HOBt(24.29mg，179.75umol)、(S)-1-((S)-2-氨基-3-(3-(苄氧基)苯基)丙酰基)六氢哒嗪-3-羧酸甲酯的HCl盐(390mg，899umol)和EDCI(345mg，1.80mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。将反应混合物用二氯甲烷(20mL)稀释，并用5％柠檬酸水溶液调节至pH～6。用二氯甲烷(20mL x 2)萃取水层。将组合的有机层用盐水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，以得到粗产物。粗产物通过硅胶柱色谱法(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯→5:1、2:1、1:1)纯化，以提供白色固体的中间体I-6(750mg，70％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.50-7.35(m,5H),7.23-7.15(m,1H),6.90-6.80(m,3H),6.13-6.08(m,1H),5.83-5.73(m,1H),5.10-5.00(m,3H),4.30-4.20(m,1H),4.00-3.90(m,1H),3.65(s,3H),3.50(d,J＝11.20Hz,1H),3.05-2.97(m,1H),2.93-2.83(m,1H),2.80-2.70(m,1H),2.35-2.25(m,1H),2.15-2.10(m,1H),1.75-1.65(m,4H),1.45(s,9H),0.94(d,J＝6.80Hz,3H),0.88(d,J＝6.80Hz,3H)。ESI-MS m/z＝597.1[M+H]+。计算的MW：596.71。
在氮气氛下，向中间体I-6(3.00g，6.03mmol)在甲醇(300mL)中的溶液中添加钯/碳(2g，10％负载)。将悬浮液脱气并用氢气吹扫，并将混合物在氢气(1atm)下在20℃下搅拌3小时。将混合物过滤并在减压下浓缩，以得到白色固体的中间体I-7(2.3g，5.64mmol，94％收率)。ESI-MS m/z＝430.1[M+Na]+。计算的MW：407.46
在20℃下，向中间体I-7(2.3g，5.64mmol)在二噁烷(10mL)中的混合物中一次性添加在二噁烷中的盐酸(4M，30mL)。将混合物在20℃下搅拌3小时。将混合物用饱和NaHCO3水溶液调节至pH～7-8，并用乙酸乙酯(100mL x 3)萃取。将组合的有机相用盐水(100mL x 2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩，以得到浅黄色固体的中间体I-8(1.3g，3.63mmol，64％收率，86％纯度)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.15-7.02(m,1H),6.75-6.5(m,3H),4.90-4.77(m,1H),4.50-4.37(m,1H),4.00-3.90(m,1H),3.80-3.70(m,1H),3.68-3.65(m,3H),2.95-2.80(m,1H),2.77-2.62(m,2H),2.50-2.35(m,1H),1.97-1.85(m,1H),1.82-1.70(m,1H),1.60-1.45(m,1H),1.42-1.28(m,1H)。ESI-MSm/z＝308.2[M+Na]+。计算的MW：307.34。
中间体I-11的合成
Figure BDA0002302535140001221
在0℃下，向2-(二甲基氨基)乙硫醇I-9(500mg，3.53mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中添加1,2-二(吡啶-2-基)二硫化物(1.17g，5.3mmol)在甲醇(10mL)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌15小时。真空浓缩反应混合物。残留物通过硅胶柱(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯→3:1、1:1，然后二氯甲烷/乙酸乙酯→2:1，然后二氯甲烷/甲醇→10:1)纯化，将其与先前的批次组合，以提供浅黄色固体的中间体I-10(1.05g，58％收率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.56(d,J＝4.0Hz,1H),7.85-7.75(m,1H),7.69(d,J＝8.0Hz,1H),7.36-7.26(m,1H),3.48-3.40(m,2H),3.28-3.20(m,2H),2.93(s,6H)。ESI-MS m/z＝214.9[M+H]+。计算的MW：214.35。
在25℃下，向4-巯基丁酸(50mg，416umol)在甲醇(1mL)中的溶液中添加中间体I-10(125mg，499umol)在甲醇(1.5mL)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌15小时。在低压下浓缩反应混合物。残留物通过硅胶柱色谱法(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯→2:1、1:1，然后二氯甲烷/甲醇→10:1)纯化，以提供白色胶状的中间体I-11(80mg，86％收率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ3.55-3.45(m,2H),3.08-3.00(m,2H),2.93(s,6H),2.83(t,J＝7.2Hz,2H),2.43(t,J＝7.2Hz,2H),2.05-1.94(m,2H)。
中间体I-15的合成
Figure BDA0002302535140001231
向2-巯基乙酸叔丁酯I-12(800mg，5.4mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中的溶液中添加碳酸钾(1.49g，10.8mmol)和1-溴-2-氯乙烷(2.32g，16.2mmol)。将混合物在25℃下搅拌2小时。将混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释，并用水(50mL x 3)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥并浓缩，以得到无色油状的中间体I-13(1.00g，79％收率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.64-3.71(m,2H),3.14-3.17(m,2H),2.95-3.01(m,2H),1.47(s,9H)。
在0℃下，向中间体I-13(1.00g，4.75mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加m-CPBA(4.61g，21.4mmol，80％纯度)在二氯甲烷(10mL)中的溶液。将混合物温热至室温，搅拌2小时。将混合物用二氯甲烷(80mL)稀释，并用饱和亚硫酸钠水溶液(50mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥并浓缩，以得到粗残留物，将其通过硅胶色谱法(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯→5/1)纯化，以得到无色油状的中间体I-14(700mg，60％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.99(s,2H),3.90-3.95(m,2H),3.69-3.75(m,2H),1.50-1.53(m,9H)。
向中间体I-14(650mg，2.68mmol)在二氯甲烷(12mL)中的溶液中添加三氟乙酸(6.00mL)。将混合物在45℃下搅拌2小时。然后浓缩混合物，以得到白色固体的中间体I-15(360.00mg，72％收率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.34(s,2H),3.89-4.01(m,2H),3.71-3.81(m,2H)。
化合物1的合成
Figure BDA0002302535140001241
向中间体I-8的HCl盐(31mg，119umol)和中间体I-11(44mg，99umol)在二氯甲烷(1.5mL)中的溶液中添加HOBt(1.34mg，9.9umol)、N-甲基吗啉(38.2μL)和EDCI(27mg，139umol)。将混合物在25℃下搅拌1小时。将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，并用水(5mL)洗涤。用二氯甲烷(5mL x 2)萃取水层。将组合的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残留物通过反相HPLC(HCl添加剂)纯化，并使用反相HPLC(HCOOH添加剂)再次纯化，并冻干，以提供浅黄色油状的化合物-1(5.8mg，9％收率)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.53(br.s.,1H),7.12-7.04(m,1H),6.72-6.62(m,3H),5.75-5.65(m,1H),4.20-4.10(m,2H),3.70(s,3H),3.08-3.00(m,2H),2.95-2.76(m,5H),2.76-2.70(m,2H),2.60(s,6H),2.42-2.32(m,3H),2.10-1.98(m,3H),1.85-1.70(m,2H),1.55-1.40(m,2H),1.02-0.85(m,6H)。ESI-MSm/z＝612.1[M+H]+,634.5[M+Na]+。计算的MW：611.82。
化合物-2(SFAC4DS)的合成
Figure BDA0002302535140001251
将中间体I-8(27mg，60umol)在二氯甲烷中的溶液用N,N-二异丙基乙胺(24mg，180umol)、中间体I-16(14mg，60umol)、HOBt(1.6mg，2umol)处理，并且然后最后用EDCI(18mg，90umol)处理。搅拌15小时后，将溶液倒入水和乙酸乙酯中。分离各层且用乙酸乙酯萃取水层。将有机物用硫酸镁干燥，过滤，并真空去除溶剂。通过反相HPLC纯化(在具有0.1％甲酸的水中的乙腈)并冻干，提供白色固体的化合物-2(SFAC4DS)(16mg，42％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)8.47(d,1H),8.16(br s,1H),7.69-7.66(m,1H),7.63-7.60(m,1H),7.13(app t,1H),7.09-7.05(m,1H),5.85-5.79(m,1H),4.72(m,1H),4.31(brs,1H),3.70(s,3H),3.42(d,1H),3.00(dd,1H),2.87-2.78(m,3H),2.52-2.43(m,2H),2.28(br s,1H),2.14-2.04(m,3H),1.83-1.73(m,2H),1.62-143(m,5H),0.95(d,3H),0.90(d,3H)。ESI-MSm/z＝617.9[M+H]+。计算的MW：617.78。
化合物-3的合成
在室温下，向中间体I-15的HCl盐(31.8mg，0.17mmol)、HOBt(2.3mg，0.017mmol)和NMM(54μL，0.54mmol)在DCM(0.75mL)中的溶液中添加I-8的HCl盐(86mg，0.17mmol)和EDCI(76mg，0.34mmol)。在室温下将反应混合物搅拌2小时。将混合物用二氯甲烷(2mL)稀释，用柠檬酸(pH～3，2mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(2mL)和饱和氯化钠水溶液(2mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并在15℃下在减压下浓缩，以得到黄色油状的产物。残留物通过制备型TLC用硅胶(洗脱剂:DCM/MeOH→10:1)，然后通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini C18 250×50 10u；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：26％-56％，11.2min)纯化，以提供白色固体的化合物-3(8.5mg，8％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.02(s,1H),8.80(s,1H),8.42(s,1H),7.01-7.08(m,1H),6.82(dd,J＝16.3,9.9Hz,1H),6.74(d,J＝7.5Hz,1H),6.64-6.70(m,2H),6.36(d,J＝16.5Hz,1H),6.12-6.16(m,2H),4.81-4.85(m,1H),4.40-4.46(m,2H),4.21-4.25(m,1H),4.09-4.13(m,1H),3.57(s,3H),2.81-3.08(m,2H),2.63-2.65(m,1H),2.15-2.19(m,1H),1.21-1.60(m,4H),0.88-0.92(m,6H)。ESI-MS m/z＝539.1[M+H]+。计算的MW：538.61。
化合物-4的合成
Figure BDA0002302535140001262
如化合物-3的制备中所述，通过使用中间体I-8的HCl盐(34mg，77umol)和2-(3-甲基-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸I-17(13mg，77umol)作为起始材料来制备化合物-4。将所得粗产物与先前合成的粗物质组合并纯化，冻干后得到白色固体的化合物-4(29.0mg，51.28umol，45％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.55-8.40(s,1H),8.20-8.07(m,1H),7.10-6.97(m,2H),6.80-6.73(m,1H),6.73-6.63(m,1H),6.63-6.50(m,1H),6.47-6.37(m,1H),5.90-5.75(m,1H),4.80-4.67(m,1H),4.35-4.15(m,3H),3.70-3.57(m,3H),3.45-3.30(d,1H),3.10-3.00(m,1H),3.00-2.70(m,2H),2.20-2.00(m,5H),1.85-1.60(m,2H),1.60-1.45(m,1H),1.45-1.30(m,1H),1.05-0.80(m,6H)。ESI-MS m/z＝558.3[M+H]+；计算的MW：557.60。
化合物-5的合成
如化合物-3的制备中所述，通过使用中间体I-8的HCl盐(34mg，77umol)和2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸I-18(13mg，77umol)作为起始材料以得到化合物-5来制备化合物-5。ESI-MS m/z＝544.0[M+H]+；计算的MW：543.58。
(S)-1-((S)-3-(3-羟基苯基)-2-((S)-3-甲基-2-(3-(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰胺基)丙酰基)六氢哒嗪-3-羧酸甲酯(SFAX6)的合成：
Figure BDA0002302535140001272
将羧酸2(70mg，0.270mmol)和HBTU(204mg，0.540mmol，2.00当量)在3mL乙腈中混合，并将所得悬浮液在室温下搅拌15min。在此时间之后，添加胺1(中间体I-8)(110mg，0.270mmol，1.00当量)，然后添加三乙胺(113μL，0.810mmol，3.00当量)，并将混合物在室温下搅拌18小时。然后将混合物用20mL的饱和碳酸氢钠处理，并用2x30 mL份的乙酸乙酯萃取。将汇集的有机萃取物用2x20 mL份的盐水洗涤，用饱和硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。残留物使用硅胶色谱法，用二氯甲烷:MeOH，100:1至50:1洗脱来纯化，提供70mg(40％)无色油状的产物。Rf＝0.31(二氯甲烷:MeOH，20:1)。MS(ESI)计算值＝648.2(M+H)，观察值＝648.2。
SFAX9DS的合成：
SFAX9DS是根据上文对于SFAX6的合成所述的类似程序合成的。
化合物-6的合成
Figure BDA0002302535140001282
从中间体I-19开始制备化合物-6，以得到化合物-6。ESI-MS m/z＝631.0[M+H]+；计算的MW：630.82。
式IVf的化合物的合成
式IVf的化合物的合成可以如下文在方案6中所示合成。
方案6
Figure BDA0002302535140001291
其中R7、R8和Z6如先前所定义，PG1是合适的胺保护基团，包括但不限于Boc、Cbz、Alloc和Fmoc，并且PG4是烷基或芳基，包括但不限于甲基、乙基、苄基、烯丙基和苯基，其可以通过本领域技术人员已知的方法去除。
在典型的程序中，在存在本领域技术人员熟悉的标准偶联剂(例如，EDC/HOBT、DCC、PyBOP、PyBROP、HATU、HBTU、COMU)的情况下，使化合物IVd与试剂IVg反应。在存在碱(包括但不限于DIPEA、三乙胺和NMM)的情况下在室温或略微升高的温度下将酸和胺偶联配偶体与偶联剂在有机溶剂(包括但不限于DMF、二氯甲烷、乙腈和四氢呋喃)中组合。在酰胺形成后，然后使用对于去除式IVe化合物的PG3(方案4)所述的条件去除保护基团PG4。
Figure BDA0002302535140001292
可以如下文在方案7中所示使用方法B来制备式IIa的化合物。
方案7
Figure BDA0002302535140001301
其中R1、R2、R3、X1、X2、Z1和Z2如先前所定义。
在典型的程序中，在存在本领域技术人员已知的标准偶联剂(例如，EDC/HOBT、DCC、PyBOP、PyBROP、HATU、HBTU、COMU)的情况下，使羧酸IIc与中间体XI反应。在存在碱(包括但不限于DIPEA、三乙胺和NMM)的情况下在室温或略微升高的温度下将酸IIc和偶联配偶体与偶联剂在有机溶剂(包括但不限于DMF、二氯甲烷、DCE、乙腈和四氢呋喃)中组合。
可以如下文在方案8中所示合成式IIc的化合物。
方案8
Figure BDA0002302535140001302
其中R1、R2、R3、X1和Z2如先前所定义，PG5是烷基或芳基，包括但不限于甲基、乙基、苄基、烯丙基和苯基，其可以通过本领域技术人员已知的方法去除，并且LG1是可以被化合物IIe的胺活化并替代的基团，诸如OH。可替代地，LG1可以是可以被亲核试剂替代的适当卤化物(诸如F、Cl和Br)。
在典型的程序中，在存在合适的碱(包括但不限于吡啶、三乙胺、DIPEA和NMM)的情况下在适当的溶剂(包括但不限于THF、DCM和DMF)中在-78℃至120℃，但任选地-20℃至50℃的温度范围内使IIe与IIf(LG1＝卤化物)反应。可替代地，如果LG1是OH，则在存在本领域技术人员已知的标准偶联剂(例如，EDC/HOBT、DCC、PyBOP、PyBROP、HATU、HBTU、COMU)的情况下使XII与试剂IIf反应。在存在碱(包括但不限于DIPEA、三乙胺和NMM)的情况下在室温或略微升高的温度下将酸和胺偶联配偶体与偶联剂在有机溶剂(包括但不限于DMF、二氯甲烷、乙腈和四氢呋喃)中组合。本领域技术人员将理解，可以通过用合适的卤化剂处理由对应的羧酸容易地制备化合物IIf(LG1＝卤化物)。在IIe与IIf之间形成酰胺后，然后使用对于去除式IVe化合物的PG3(方案4)所述的条件去除保护基团PG5，以得到化合物IIc。
可以如下文在方案9中所示使用方法B-2来制备式IIa的化合物。
方案9
其中R1、R2、R3、X1、X2、Z1和Z2如先前所定义。可以在对于化合物IIg与化合物IIf之间的偶联反应(方案8)所述的条件下进行所述反应。
可以如下文在方案11中所示制备式IIg的化合物。
方案11
Figure BDA0002302535140001321
其中R3、X1、X2、Z1如先前所定义，并且PG6是合适的胺保护基团，包括但不限于Boc、Cbz、Alloc和Fmoc。
在典型的程序中，在存在本领域技术人员已知的标准偶联剂(例如，EDC/HOBT、DCC、PyBOP、PyBROP、HATU、HBTU、COMU)的情况下，使羧酸IIg与含有-X2-Z1部分的适当偶联配偶体反应。在存在碱(包括但不限于DIPEA、三乙胺和NMM)的情况下在室温或略微升高的温度下将酸和偶联配偶体与偶联剂在有机溶剂(包括但不限于DMF、二氯甲烷、乙腈和四氢呋喃)中组合。然后通过使所得中间体与本领域技术人员熟悉的适当试剂反应来去除PG6。
化合物-7(C3SLF)的合成
Figure BDA0002302535140001322
向中间体I-24(18mg，0.085mmol)在四氢呋喃(1.2mL)中的溶液中添加N-甲基吗啉(10μL，0.085mmol)。将所述溶液冷却至-20℃，并且然后滴加氯甲酸异丁酯(11μL，0.085mmol)。立即将所述溶液温热至0℃。在0℃下搅拌45分钟后，将中间体I-23的TFA盐(37mg，0.057mmol)与N-甲基吗啉(7μL，0.057mmol)在无水四氢呋喃(0.5mL)中混合，并经5分钟逐滴添加到混合酸酐的0℃溶液中。将所得溶液在0℃下搅拌1.5小时，此时添加甲醇(1mL)，并立即将溶液温热至室温并搅拌5分钟。将所述溶液用二氯甲烷(75mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)稀释。分离各层，并用二氯甲烷(2x 30mL)萃取水层。将有机物组合，用盐水(20mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，并真空去除溶剂。通过硅胶色谱法(在己烷中的0-80％乙酸乙酯)纯化，提供白色泡沫状的化合物7(C3SLF)(20mg，50％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.49(s,1H),8.55(d,1H),7.77(app t,1H),7.71-7.65(m,2H),7.60-7.58(m,1H),7.20-7.17(m,1H),7.01(d,1H),6.78-6.76(m,1H)6.70-6.67(m,2H),5.77(dd,1H),5.33(d,1H),3.86(s,3H),3.85(s,3H),3.35(d,1H),3.25(t,2H),3.15(dt,1H),2.92(t,2H),2.64-2.50(m,2H),2.38(d,1H),2.29-2.15(m,1H),2.10-2.00(m,1H),1.78-1.63(m,3H),1.53-1.37(m,3H),1.22(s,6H),0.89(t,3H,旋转异构体1),0.80(t,3H,旋转异构体2)。ESI-MS m/z＝722.0[M+H]+,744.0[M+Na]+；计算的MW：721.93。
化合物-8的合成
Figure BDA0002302535140001331
向化合物7(22mg，0.031mmol)在二氯甲烷(0.5mL)中的溶液中添加三乙胺(62μL，0.55mmol)，然后添加2-(二甲基氨基)乙硫醇(0.mL，0.0500mmol)(4.8mg，0.046mmol)。在室温下搅拌30分钟后，将溶液倒入二氯甲烷(30mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)中。分离各层，并用二氯甲烷(2x 20mL)萃取水层。将有机物用硫酸镁干燥，过滤，并真空去除溶剂。通过硅胶色谱法纯化(在二氯甲烷中的0-10％甲醇)提供不纯的物质，其通过反相HPLC(在具有0.1％甲酸的水中的乙腈)再次纯化，以得到白色固体的化合物-8的甲酸盐(7.1mg，21％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.53(br s,1H),9.50(s,1H),8.00(s,1H),7.75(d,1H),7.68(s,1H),7.29(t,1H),7.02(d,1H),6.79-6.77(m,1H),6.70-6.67(m,2H),5.76(dd,1H),5.29(d,1H),3.86(s,3H),3.85(s,3H),3.36-3.27(m,2H),3.23-3.11(m,4H),2.90(t,2H),2.79-2.71(m,8H),2.62-2.50(m,2H),2.55(d,1H),2.28-2.17(m,1H),2.12-2.03(m,1H),1.72-1.61(m,3H),1.49-1.36(m,3H),1.22(s,3H),1.21(s,3H),0.88(t,3H,旋转异构体1),0.79(t,3H,旋转异构体2)。ESI-MS m/z＝716.1[M+H]+；计算的MW：715.97。
化合物-9的合成
Figure BDA0002302535140001341
向中间体I-23(15mg，0.029mmol)、3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酸(5.8mg，0.034mmol)和DMAP(0.4mg，0.003mmol)在二氯甲烷中的室温溶液中添加N,N'-二环己基碳二亚胺(9.4mg，0.046mmol)。在室温下搅拌15小时后，所得固体通过注射器式过滤器过滤，并用二氯甲烷洗涤。真空去除溶剂，并将所得残留物溶于乙酸乙酯中。冷却至-20℃后，悬浮液通过注射器式过滤器过滤，并用冷乙酸乙酯洗涤。将滤液用乙酸乙酯(30mL)和水(30mL)稀释。分离各层，并用乙酸乙酯(2x 20mL)萃取水层。将有机物用硫酸镁干燥，过滤，并真空去除溶剂。通过硅胶色谱法纯化(在己烷中的0-90％乙酸乙酯)，提供油状的化合物-9(11mg，60％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25(br s,1H),7.79(d,1H),7.38(s,1H),7.29(t,1H),6.98(d,1H),6.82(s,2H),6.78-6.76(m,1H),6.70-6.66(m,2H),5.83(dd,1H),5.37(d,1H),4.43(d,1H),4.37(d,1H),3.86(s,3H),3.85(s,3H),3.32(d,1H),2.96(t,1H),2.55(t,2H),2.35(d,1H),2.29-2.15(m,1H),2.11-2.01(m,1H),1.81-1.60(m,4H),1.49-1.42(m,3H),1.27(s,3H),1.25(s,3H),0.93(t,3H,旋转异构体1),0.82(t,3H,旋转异构体2)。ESI-MS m/z＝662.0[M+H]+；计算的MW：661.75。
(R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(3-(4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酰胺基)苯基)(S)-1-(3,3-二甲基-2-氧代戊烷酰基)哌啶-2-羧酸丙酯(C4-SLF)的合成：
Figure BDA0002302535140001351
向苯胺1(90mg，172μmol，1当量)、二硫化物2(79mg，343μmol，2当量)和二异丙基乙胺(149μL，111mg，858μmol，5当量)在DMF(3mL)中的溶液中添加HATU(130mg，343μmol，2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌24小时。将反应混合物用水稀释，并用乙酸乙酯萃取(3x)。将有机萃取物用水、饱和氯化钠洗涤，用硫酸镁干燥并蒸发。残留物在硅胶梯度洗脱(20％乙酸乙酯:80％庚烷→100％乙酸乙酯)上纯化，以提供标题化合物C4-SLF(98mg，77％)。MS(ESI)计算值＝736.3(M+H)，观察值＝736.3。
实施例2：某些缀合物的合成
通用协议：所述协议描述了一种用于形成靶蛋白-化合物缀合物的方法。
试剂：100％DMSO中的化合物(内部)和哺乳动物靶蛋白(内部)
设备：微型PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad)
实验协议：将摩尔比为1:2的靶蛋白和化合物在含有2％DMSO的12.5mM HEPES pH7.4、75mM NaCl缓冲液中混合在一起。将反应物在37℃下孵育30min，然后在室温下孵育过夜。通过SDS-PAGE凝胶评估交联效率。与非交联的靶蛋白相比，缀合物的迁移更慢。对于硫醇反应性化合物，在向反应混合物中添加100mM DTT后，可以通过SDS-PAGE进一步确认化合物与靶蛋白的Cys特异性连接，这减少缀合物回到其各组分中。
A.KRASGTP/S39C lite/C2-FK506缀合物的形成
试剂：100％DMSO中的C2-FK506(内部)、KRASGTP/S39C lite(内部；残基1-169含有G12V/S39C/C51S/C80L/C118S)。
Figure BDA0002302535140001361
C2-FK506
设备：微型PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad)
实验协议：将摩尔比为1:2的KRASGTP/S39C lite和C2-FK506在含有2％DMSO的12.5mMHEPES pH 7.4、75mM NaCl缓冲液中混合在一起。将反应物在37℃下孵育30min，然后在室温下孵育过夜。通过SDS-PAGE凝胶评估交联效率。还通过用100mM DTT孵育反应混合物来评估C2-FK506与KRASGTP/S39C lite上的半胱氨酸39的连接。
结果：C2-FK506与KRASGTP/S39C lite高效地交联，并且对半胱氨酸39具有特异性(图1)。
B.KRASGTP/G12C lite/SFAX9DS缀合物的形成
试剂：100％DMSO中的SFAX9DS(内部)、KRASGTP/G12C lite(内部；残基1-169含有G12C/C51S/C80L/C118S)。
设备：微型PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad)
实验协议：将摩尔比为1:2的KRASGTP/G12C lite和SFAX9DS在含有2％DMSO的12.5mMHEPES pH 7.4、75mM NaCl缓冲液中混合在一起。将反应物在37℃下孵育30min，然后在室温下孵育过夜。通过SDS-PAGE凝胶评估交联效率。野生型CypA也与化合物交联。半胱氨酸52作为CypA上的反应性半胱甘酸并使其突变成丝氨酸，从而废除呈递蛋白交联。
结果：SFAX9DS与KRASGTP/G12C lite蛋白高效地交联，并且CypAC52S不与SFAX9DS交联(图2)。
实施例3：某些复合物的形成
通用协议：所述协议描述了两种用于形成和分离包含呈递蛋白、化合物和哺乳动物靶蛋白的复合物的方法。
试剂：100％DMSO中的化合物(内部)、呈递蛋白(内部)和哺乳动物靶蛋白(内部)
设备：微型PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad)、Superdex 75(GE Healthcare，CV 120mL)
实验协议A：预缀合的化合物和蛋白质
将摩尔比为1:2的缀合物和呈递蛋白在含有2％DMSO的12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl缓冲液中混合在一起。将反应物在37℃下孵育30min，然后在室温下孵育过夜。通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化分离纯的复合物。将反应混合物直接注射在用含12.5mMHEPES pH 7.4、75mM NaCl的缓冲液预平衡的Superdex 75柱(CV 120mL)上。洗脱出分子量比未反应的靶蛋白和呈递蛋白高的复合物。为了确认洗脱峰中存在复合物，通过SDS-PAGE评估样品。
实验协议B：交联剂、呈递蛋白和靶蛋白
将摩尔比为1:2:2的化合物、呈递蛋白和靶蛋白在含有2％DMSO的12.5mM HEPESpH 7.4、75mM NaCl缓冲液中混合在一起。将反应物在37℃下孵育30min，然后在室温下孵育过夜。通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化分离纯的复合物。将反应混合物直接注射在用含12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl的缓冲液预平衡的Superdex 75柱(CV 120mL)上。洗脱出分子量比未反应的靶蛋白和呈递蛋白高的复合物。为了确认洗脱峰中存在复合物，通过SDS-PAGE评估样品。
A.KRASGTP/S39C lite/C2Holt/FKBP12三元复合物的形成
试剂：100％DMSO中的C2Holt(内部)、KRASGTP/S39C lite(内部；残基1-169含有G12V/S39C/C51S/C80L/C118S)和FKBP12(内部)。
Figure BDA0002302535140001381
C2Holt
设备：微型PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad)、Superdex 75(GE Healthcare，CV 120mL)
实验协议：将摩尔比为1:2:2的C2-Holt、FKBP12和KRASGTP/S39C lite在含有2％DMSO的12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl缓冲液中混合在一起。将反应物在37℃下孵育30min，然后在室温下孵育过夜。通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化分离纯的复合物。将反应混合物直接注射在用含12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl的缓冲液预平衡的Superdex 75柱(CV120mL)上。在注射后约69mL下洗脱出复合物，并且分别在注射后约75mL和87mL下洗脱出未反应的KRASGTP/S39C lite和FKBP12。为了确认洗脱峰中存在KRASGTP/S39C lite和FKBP12，还通过SDS-PAGE评估样品。
结果：洗脱峰的SEC曲线和SDS-PAGE分析确认KRASGTP/S39C lite/C2Holt/FKBP12复合物的形成(图3A和图3B)。
B.KRASGDP/S39C lite/SFAC4DS/CypAC52S三元复合物的形成
试剂：100％DMSO中的SFAC4DS(内部)、KRASGDP/S39C lite(内部；残基1-169含有G12V/S39C/C51S/C80L/C118S)和CypAC52S(内部)。
设备：微型PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad)、Superdex 75(GE Healthcare，CV 120mL)
实验协议：将摩尔比为1:2:2的SFAC4DS、CypAC52S和KRASGDP/S39C lite在含有2％DMSO的12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl缓冲液中混合在一起。将反应物在37℃下孵育30min，然后在室温下孵育过夜。通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化分离纯的复合物。将反应混合物直接注射在用含12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl的缓冲液预平衡的Superdex 75柱(CV 120mL)上。在注射后约69mL下洗脱出复合物，并且分别在注射后约75mL和80mL下洗脱出未反应的KRASGDP/S39C lite和CypAC52S。为了确认洗脱峰中存在KRASGDP/S39C lite和CypAC52S，还通过SDS-PAGE评估样品。
结果：洗脱峰的SEC曲线和SDS-PAGE分析确认KRASGDP/S39Clite/SFAC4DS/CypAC52S复合物的形成(图4)。
C.PTP1BS187C lite/C3SLF/FKBP12三元复合物的形成
试剂：100％DMSO中的C3SLF(内部)、PTP1BE186C lite(内部；残基1-293含有C32S/C92V/C121S/S187C)和FKBP12(内部)。
设备：微型PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad)、Superdex 75(GE Healthcare，CV 120mL)
实验协议：将摩尔比为1:3:3的C3SLF、FKBP12和PTP1BS187Clite在含有4％DMSO的12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl缓冲液中混合在一起。将反应物在37℃下孵育30min，然后在室温下孵育过夜。通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化分离纯的复合物。将反应混合物直接注射在用含12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl的缓冲液预平衡的Superdex 75柱(CV120mL)上。在注射后约62mL下洗脱出复合物，并且分别在注射后约75mL(二聚体)和90mL(单体)下洗脱出未反应的FKBP12。为了确认洗脱峰中存在PTP1BS187C lite和FKBP12，还通过SDS-PAGE评估样品。在相同条件下使游离PTP1BS187C lite和FKBP12混合物经历Superdex 75柱以确定其洗脱时间。
结果：游离PTP1BS187C lite和FKBP12蛋白的SEC曲线和SDS-PAGE分析(图5A)确认游离PTP1BS187C lite在约64-65ml下洗脱出来。洗脱峰的SEC曲线和SDS-PAGE分析确认PTP1BS187Clite/C3SLF/FKBP12复合物的形成，其在约61ml下洗脱出来(图5B)。
实施例4：存在呈递蛋白时缀合物形成，但在呈递蛋白不存在时缀合物不形成
所述协议描述了使用质谱法和凝胶位移测定分析交联效率的方法，旨在评估缀合物形成的呈递蛋白依赖性。
试剂：100％DMSO中的化合物(内部)、FKBP12(内部)、KRASGTP/G12C(内部，残基1-169)。
实验协议：为了跟踪二硫键交联反应的动力学，使用了采用AdvanceBio RP-mAbC4柱(2.1x 100mm，3.5μm)并配有自动进样器的Agilent 6230TOF-LC/MS和Agilent1260HPLC仪器。将HPLC级乙腈和水(各自含有1.0mM甲酸铵和1体积％甲酸)用作流动相，具有以下匀变：流速：0.6ml/min，0.0分钟至13.0分钟，水:乙腈＝95:5，13.0分钟至17.0分钟，逐渐匀变到水:乙腈＝5:95，。总时间＝17.0min。
所有交联反应均在配有0.5mL玻璃插入物的1.5mL琥珀色玻璃小瓶中执行。将水溶性肽(SEQ ID NO:1:YQNLLVGRNRGEEILD)用作内标。尽管内标的实际序列无关紧要，但氨基酸残基的选择对于避免干扰交联测定是至关重要的。因此，排除了脯氨酸残基(干扰FKBP12)和半胱氨酸残基(干扰二硫键形成)。所有反应和标准溶液均在HEPES(pH 7.4，1.0mM MgCl2)缓冲液中制备。
在每个反应之前，使用一系列标准溶液获得单个组分的标准曲线(以下表3中示出FKBP12的标准曲线分析的实例)。使用来自标准曲线的数据，将蛋白质样品的μmol相对于面积比(样品:标准品)作图，并采用线性拟合(y＝mx+c)获得斜率和截距。这些标准曲线中涉及的斜率和截距值是在评价反应过程之前和期间的底物和产物浓度期间考虑的。对于每种底物/产物，在初始注射后进行空白注射，以验证是否存在任何残留的蛋白质/试剂。基于此分析，可以调整自动进样器的顺序，使其包含适当数量的空白注射，以去除残留的组分(如果有的话)。MS光谱使用Agilent MassHunter v B.07.0软件分析。
表3.FKBP12的标准曲线。斜率＝6.53，截距＝-0.64，R2＝0.999
Figure BDA0002302535140001411
在评估靶蛋白上配体交联的呈递蛋白依赖性的代表性实验中，在存在或不存在FKBP12的情况下，将KRASGTP/G12C和C3或C4SLF配体以2μM KRAS、10μM FKBP12、10μM C3或C4SLF的浓度在室温下在12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl、1mM MgCl2、3％DMSO中孵育4小时。使用上述方法分析与配体进行二硫键交联的KRAS的量。如表4所示，在存在呈递蛋白的情况下，观察到交联效率增加了5至10倍：
表4.C3-和C4SLF分析的MS的交联效率
与质谱分析并行，在存在或不存在FKBP12的条件下，在上述相同的实验条件下，使用12％SDS-PAGE对与C3或C4SLF的交联反应进行凝胶位移测定，不同之处在于交联反应在更高的浓度(60μM KRAS、180μM FKBP12和180μM C3或C4SLF)下进行，并且其通过MMTS猝灭以终止反应。与MS数据相似，在存在FKBP12的情况下，配体交联效率显著提高，这对于C4SLF更为明显(图6)。
实施例5：通过X射线分析确定呈递蛋白/靶蛋白界面结构
所述协议描述了FKBP12-C2Holt-KRASGTP/S39C三元复合物的晶体结构的结晶和结构确定方法。
A.FKBP12-C2Holt-KRASGTP/S39C三元复合物的晶体结构确定
试剂：100％DMSO中的配体(C2Holt)(内部)、FKBP12(内部)、KRASGTP/S39C lite(内部，残基1-169含有G12V/S39C/C51S/C80L/C1 18S)。
设备：Superdex 75(GE Healthcare)
实验协议：将C Holt和FKBP12以3:1和1.5:1摩尔过量添加到在12.5mM HEPES pH7.4、75mM NaCl缓冲液、1mM MgCl2、2％DMSO中的KRASGTP/S39C lite中，并且在20℃下孵育过夜或者在4℃下孵育36-72小时。通过尺寸排阻色谱法在Superdex 75柱上在12.5mM HEPESpH 7.4、75mM NaCl和1mM MgCl2中分离纯复合物。使用坐滴式蒸汽扩散法在20℃下对纯化的复合物(15-20mg/ml)进行结晶筛选。晶体在含有0.1M MES pH 6.5、20-22％PEG 20,000的孔溶液中生长。为了收集数据，将晶体转移到含有补充有15％甘油的母液的溶液中，并且然后将其在液氮中冷冻。在高级光子源(APS)上收集衍射数据集，并使用HKL程序进行处理。使用CCP4套件中的程序PHASER，使用FKBP12(PDB-ID 1FKD)和KRAS(PDB-ID 3GFT)的已公开结构作为搜索模型，获得分子替代溶液。根据标准协议用软件包CCP4和COOT执行后续的模型构建和细化。
结果：FKBP12-C2Holt-KRASGTP/S39C的整体结构：晶体在不对称单元中含有一种FKBP12和KRASGTP/S39C的异二聚体(图7)。所述模型包含FKBP12的残基Met1至Glu108和KRASGTP/S39C的残基Met1至Lys169。所得的电子密度显示出明确的结合模式，包括配体的取向和构象。观察到由蛋白质的半胱氨酸生成的二硫键和来自配体的硫的连续电子密度。
参与结合C2Holt(
Figure BDA0002302535140001431
距离截止)的KRASGTP/S39C残基是Glu37、Cys39、Leu56和Met67。参与结合FKBP12的KRASGTP/S39C残基是Glu3、Lys5、Ile36、Cys39、Tyr40、Arg41、Asp54、Glu63、Tyr64、Met67和Arg73。参与结合KRASGTP/S39C的FKBP12残基是Arg43、Lys53、Gln54、Glu55、Thr86、Pro89、Gly90和Ile92。参与结合C2Holt的FKBP12残基是Tyr27、Phe37、Asp38、Phe47、Glu55、Val56、Ile57、Trp60、Tyr83、His88、Ile91、Ile92和Phe100。
所述复合物的总包埋表面积是
Figure BDA0002302535140001432
KRASGTP/S39C的包埋表面积为
Figure BDA0002302535140001433
其中
Figure BDA0002302535140001434
由FKBP12贡献(83％)，而
Figure BDA0002302535140001435
由C2Holt贡献(17％)。FKBP12的包埋表面积为
Figure BDA0002302535140001436
其中
Figure BDA0002302535140001437
由KRASGTP/S39C贡献(66％)，而
Figure BDA0002302535140001438
由C2Holt贡献(34％)。C2Holt的包埋表面积为
Figure BDA0002302535140001439
其中由KRASGTP/S39C贡献(23％)，而
Figure BDA00023025351400014312
由FKBP12贡献(77％)。KRASGTP/S39C与FKBP12之间的蛋白质-蛋白质界面是通过疏水性和极性相互作用(包括三个分子间H-键)形成的。C2 Holt与FKBP12之间的结合界面主要是由疏水性相互作用贡献的，但还由配体的三个羰基与FKBP12的Tyr27、Ile57和Tyr83之间的三个H-键贡献。通过设计，C2 Holt与KRASGTP/S39C的接触最少
Figure BDA00023025351400014313
但与KRASGTP/S39C的Glu37形成一个H-键。以下表5中列出了最终结构的数据收集和细化统计。
B.KRASGDP/S39C/SFAC4DS/CypAC52S三元复合物的晶体结构确定
试剂：100％DMSO中的配体(SFAC4DS)(内部)、CypAC52S(内部)、KRASGDP/S39C lite(内部，残基1-169含有G12V/S39C/C51S/C80L/C118S)。
设备：Superdex 75(GE Healthcare)
实验协议：将SFAC4DS和CypAC52S以2:1和2:1摩尔过量添加到在12.5mM HEPES pH7.4、75mM NaCl缓冲液、1mM MgCl2、2％DMSO中的KRASGDP/S39C lite中，并且在20℃下孵育过夜。通过尺寸排阻色谱法在Superdex 75柱上在12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl和1mMMgCl2中分离纯复合物。使用坐滴式蒸汽扩散法在20℃下对纯化的复合物(15mg/ml)进行结晶筛选。晶体在含有0.1M Bis-Tris pH 6.5、25％PEG 3350的孔溶液中生长。为了收集数据，将晶体转移到含有补充有额外PEG 3350的母液的溶液中，使其具有40％的PEG，并且然后将其在液氮中冷冻。在高级光源(ALS)上收集衍射数据集，并使用HKL程序进行处理。使用CCP4套件中的程序PHASER，使用CypA(PDB-ID 1CWA)和KRAS(PDB-ID 3GFT)的已公开结构作为搜索模型，获得分子替代溶液。根据标准协议用软件包CCP4和COOT执行后续的模型构建和细化。
结果：CypAC52S-SFAC4DS-KRASGDP/S39C的整体结构：晶体在不对称单元中含有一种CypAC52S和KRASGDP/S39C的异二聚体(图8)。所述模型包含CypA的残基Met1至Glu165和KRASGDP/S39C的残基Met1至Lys169。所得的电子密度显示出明确的结合模式，包括配体的取向和构象。观察到由蛋白质的半胱氨酸生成的二硫键和来自配体的硫的连续电子密度。
参与结合SFAC4DS(
Figure BDA0002302535140001451
距离截止)的KRASGDP/S39C残基是Glu3、Lys5、Cys39、Arg41、Leu52、Asp54、Ile55和Leu56。参与结合CypAC52S的KRASGDP/S39C残基是Glu37、Asp38、Cys39、Arg41、Gln43、Leu56、Ala66、Met67、Gln70和Thr74。参与结合KRASGDP/S39C的CypAC52S残基是Arg55、Ile57、Arg69、Asn71、Thr73、Ala81、Ala103、Arg148和Asn149。参与结合SFAC4DS的CypAC52S残基是Arg55、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Ala101、Asn102、Gln111、Phe113和His126。
由于蛋白质-蛋白质界面的部分结构无序，无法计算出所述复合物的总包埋表面积。除用于计算的无序区域外，蛋白质-蛋白质界面处的包埋表面积大于
Figure BDA0002302535140001452
其中超过30％是由SFAC4DS贡献的
Figure BDA0002302535140001453
KRASGDP/S39C与CypAC52S之间的蛋白质-蛋白质界面是通过疏水性和极性相互作用(包括两个分子间H-键)形成的。SFAC4DS与CypA之间的结合界面由疏水性和极性相互作用共同贡献。在配体的羰基和N-H基团之间与CypAC52S的残基Arg55、Gln63、Asn102和His126之间有六个H-键。SFAC4DS与KRASGDP/S39C形成最少的直接接触，但与KRASGDP/S39C的Arg41形成一个H-键。以下表5中列出了最终结构的数据收集和细化统计。
C.PTP1BS187C/C3SLF/FKBP12三元复合物的晶体结构确定
试剂：100％DMSO中的配体(C3SLF)(内部)、FKBP12(内部)、PTP1BS187C lite(内部，残基1-169含有C32S/C92V/C121S/S187C)。
设备：Superdex 75(GE Healthcare)、Gryphon(Art Robbins Instruments)
实验协议：将C3SLF和FKBP12以3:1摩尔过量添加到在12.5mM HEPES pH 7.4、75mMNaCl缓冲液、4％DMSO中的PTP1BS187Clite中，并且在4℃下孵育36-72小时。通过尺寸排阻色谱法在Superdex 75柱上在12.5mM HEPES pH 7.4和75mM NaCl中分离纯复合物。使用坐滴式蒸汽扩散法在20℃下对纯化的复合物(15mg/ml)进行结晶筛选。晶体在含有0.2M乙酸镁、20％w/v PEG 3350的孔溶液中生长。为了收集数据，将晶体转移到含有补充有25％PEG400的母液的溶液中，然后将其在液氮中冷冻。在高级光子源(APS)上收集衍射数据集，并使用XDS程序进行处理。使用CCP4套件中的程序PHASER，使用FKBP12(PDB-ID 2PPN)和PTP1B(PDB-ID 2NT7)的已公开结构作为搜索模型，获得分子替代溶液。根据标准协议用软件包CCP4和COOT执行后续的模型构建和细化。
结果：FKBP12-C3SLF-PTP1BS187的整体结构：晶体在不对称单元中含有两个FKBP12-C3SLF-PTP1BS187C复合物分子(图9A)。所述模型包含FKBP12的残基Gly2至Glu108和PTP1BS187C的残基Glu6至Phe280。所得的电子密度显示出明确的结合模式，包括配体的取向和构象。观察到由蛋白质的半胱氨酸生成的二硫键和来自配体的硫的连续电子密度。
所述复合物的总包埋表面积是
Figure BDA0002302535140001461
PTP1BS187C的包埋表面积为
Figure BDA0002302535140001462
C3SLF的包埋表面积为
Figure BDA0002302535140001463
(图9B)。PTP1BS187C与FKBP12之间的蛋白质-蛋白质界面是通过疏水性和极性相互作用形成的。
D.MCL1S245C/C3SLF/FKBP52三元复合物的晶体结构确定
试剂：100％DMSO中的配体(C3SLF)(内部)、FKBP52(内部，残基1-140)、MCL1S245Clite(内部，残基172-327含有S245C/C286S)。
设备：Superdex 75(GE Healthcare)、Gryphon(Art Robbins Instruments)
实验协议：将C3SLF和FKBP52以3:1摩尔过量在12.5mM HEPES pH 7.4、75mM NaCl缓冲液、2％DMSO中与MCL1S245C lite混合，并且在4℃下孵育24-48小时。通过尺寸排阻色谱法在Superdex 75柱上在12.5mM HEPES pH 7.4和75mM NaCl中分离纯复合物。使用坐滴式蒸汽扩散法在20℃下对纯化的复合物(15mg/ml)进行结晶筛选。晶体在含有2.1M苹果酸的孔溶液中生长。为了收集数据，将晶体转移到含有补充有20％甘油的母液的溶液中，并且然后将其在液氮中速冻。在高级光子源(APS)上测量
Figure BDA0002302535140001471
分辨率衍射数据集，并使用XDS程序进行处理。使用CCP4套件中的程序PHASER，使用FKBP52(PDB-ID 1N1A)和PTP1B(PDB-ID3MK8)的已公开结构作为搜索模型，获得分子替代溶液。根据标准协议用软件包CCP4和COOT执行后续的模型构建和细化。
结果：晶体在不对称单元中含有一个MCL1S245C/C3SLF/FKBP52复合物分子(图10)。所得的电子密度揭示在两种蛋白质之间的明确结合，包括配体的取向和构象。观察到由蛋白质的半胱氨酸生成的二硫键和来自配体的硫的连续电子密度。所述复合物的总包埋表面积为
Figure BDA0002302535140001472
其中大约60％由FKBP52贡献
Figure BDA0002302535140001473
并且大约40％由C3SLF贡献
Figure BDA0002302535140001474
由于分辨率有限，所以无法进行蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体相互作用的详细分析。
表5.数据收集和细化统计
Figure BDA0002302535140001475
1测试设置包括5％的测量反射
2与几何目标值的均方根偏差
3用RAMPAGE计算
实施例6：通过TR-FRET确定复合物形成
TR-FRET技术(LANCE,Perkin Elmer)是检测两种融合标记蛋白例如蛋白1/标签A和蛋白2/标签B的二元缔合的标准方法，其中A和B可以是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、六组氨酸(His6)、FLAG、生物素-avi、Myc和血凝素(HA)中的任一种。在所述实施例中，使用所述技术来测量呈递蛋白与靶蛋白的化合物促进的缔合。将呈递蛋白/标签A和靶蛋白/标签B的混合物添加到含有本发明化合物的384孔测定板中，并孵育15分钟。添加抗融合标签A或B铕螯合物供体和抗融合标签A或B别藻蓝蛋白受体或Ulight受体试剂的混合物，并将反应物孵育240分钟。在Envision微板读数器(Perkin Elmer)上使用激发＝320nm，发射＝665/615nm读取TR-FRET信号。促进三元复合物形成的化合物被鉴定为相对于DMSO对照孔引起TR-FRET比增加的那些化合物。
通过TR-FRET确定CYPA-化合物3-KRASG12C-GTP复合物形成
将Avi标记的亲环蛋白A和His标记的KRASG12C-GTP与增加浓度的配体(化合物3)混合，并在室温下孵育15分钟，以允许形成三元复合物。然后添加抗His Eu-W1024和链霉亲和素APC的预混合物，并孵育60分钟。在EnVision微板读数器(Perkin Elmer，Ex 320nm，Em665/615nm)上读取TR-FRET信号。还进行没有呈递蛋白和靶蛋白的计数器筛选以排除单独化合物的贡献。
试剂和仪器
■His6-KRASG12C-GTP(内部；残基1-169)；1.2mM，在PBS缓冲液中，pH 7.4
■Avi-CYPA(内部；残基1-165)；556μM，在PBS缓冲液中，pH7.4
■抗His Eu-W1024(Perkin Elmer)
■链霉亲和素APC(Perkin Elmer)
■配体(W21487)，10mM，在100％DMSO中
■EnVision(Perkin Elmer)
■具有8通道小容量盒的Combi Mutidrop液体分配器
■384孔ProxiPlate板(黑色)
实验协议
1.使用Mosquito将100nL/孔的化合物(在DMSO中的浓度不同)分配到384孔黑色ProxiPlate板中，制成测定就绪板(ARP)。
2.制备2x含有40mM Hepes pH 8.0、200mM NaCl、2mM MgCl2、0.1％BSA和0.004％Tween-20的测定缓冲液。
3.制备2x预混合物A：在1X测定缓冲液中的100nM His6-KRas G12C-GTP(1-169)和1000nM Avi-CypA(1-165)。
4.使用MutiDrop Combi将2x预混合物A分配到ARP中，5μl/孔。在室温下孵育15min。
5.制备2X预混合物B：10nM抗His Eu-W1024和40nM SA APC。
6.使用MutiDrop Combi将2x预混合物B分配到ARP中，5μl/孔。在Combi上短暂摇动，且在室温下孵育60min。
7.在EnVision(Ex：320nm；Em1：615nm；Em2：665nm)上读数。
8.使用Dotmatics处理数据。使用4参数非线性拟合来拟合曲线，以确定用于形成三元复合物的EC50值。
结果：结合曲线(图11)证明CYPA-化合物3-KRASG12C-GTP三元复合物的化合物3依赖性复合物形成，计算的EC50值为2.1μM
实施例7：通过放大发光临近均相测定确定复合物形成
AlphaScreen技术(Perkin Elmer)是检测两种融合标记蛋白例如蛋白1/标签A和蛋白2/标签B的二元缔合的标准方法，其中A和B可以是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、六组氨酸(His6)、FLAG、生物素-avi、Myc和血凝素(HA)中的任一种。在所述实施例中，使用所述技术来测量呈递蛋白与靶蛋白的化合物促进的缔合。将呈递蛋白/标签A和靶蛋白/标签B的混合物添加到含有本发明化合物的384孔测定板中，并孵育15分钟。添加抗融合标签A或BAlphaScreen供体珠粒和抗融合标签A或B AlphaScreen受体珠粒的混合物，并将反应物孵育240分钟。在Envision微板读数器(Perkin Elmer)上使用激发＝680nm，发射＝585nm读取AlphaScreen信号。促进三元复合物形成的化合物被鉴定为相对于DMSO对照孔引起AlphaScreen信号增加的那些化合物。
通过αLISA确定CYPA-化合物3-KRASG12C-GTP复合物形成
将Avi标记的亲环蛋白A和His标记的KRASG12C-GTP与增加浓度的配体(化合物3)混合，并在室温下孵育60分钟，以允许形成三元复合物。然后添加镍螯合物配体珠粒和链霉亲和素受体珠粒的预混合物，并孵育60分钟。在Envision微板读数器(Perkin Elmer，Ex680nm，Em 615nm)上读取αLISA信号。还进行没有呈递蛋白和靶蛋白的计数器筛选以排除单独化合物的贡献。
试剂和仪器：
■His6-KRASG12C-GTP(内部；残基1-169)；1.2mM，在PBS缓冲液中，pH 7.4
■Avi-CYPA(内部；残基1-165)；556uM，在PBS缓冲液中，pH7.4
■镍螯合物供体珠粒(Perkin Elmer)
■链霉亲和素受体珠粒(Perkin Elmer)
■配体(W21487)，10mM，在100％DMSO中
■EnVision(Perkin Elmer)
■具有8通道小容量盒的Combi Mutidrop液体分配器
■alphaPlate-384板(白色)
实验协议：
1.使用Mosquito将100nL/孔的化合物(在DMSO中的浓度不同)分配到384孔黑色ProxiPlate板中，制成测定就绪板(ARP)。
2.制备2X含有40mM Hepes pH 8.0、200mM NaCl、2mM MgCl2和0.004％Tween-20的测定缓冲液。
3.制备2x预混合物A：在1X测定缓冲液中的300nM His6-KRas G12C-GTP(1-169)和300nM Avi-CypA(1-165)。
4.使用MutiDrop Combi将2x预混合物A分配到ARP中，5μl/孔。在室温下孵育60min。
5.制备2X预混合物B：30μg/ml的链霉亲和素受体珠粒和30μg/ml的镍螯合物供体珠粒。
6.使用MutiDrop Combi将2x预混合物B分配到ARP中，5μl/孔。在Combi上短暂摇动，且在室温下孵育60min。
7.在EnVision(Ex：680nm；Em1：615nm)上读数。
8.使用Dotmatics处理数据。使用4参数非线性拟合来拟合曲线，以确定用于形成三元复合物的EC50值。
结果：结合曲线(图12)证明CYPA-化合物3-KRASG12C-GTP三元复合物的化合物3依赖性复合物形成，计算的EC50值为0.99μM。
实施例8：通过等温滴定量热法确定复合物形成
等温滴定量热法(ITC)是一种用于直接测量与两种蛋白质或一种蛋白质与配体的二元相互作用相关的热变化的已确立的生物物理技术。热变化的测量允许准确地确定缔合常数(Ka)、反应化学计量(N)和结合焓的变化(ΔH)。吉布斯能量变化(ΔG)和熵变化(ΔS)也可以使用以下关系式确定：ΔG＝-RTlnKa＝ΔH-TΔS(其中R是气体常数，并且T是绝对温度)。在所述实施例中，所述方法用于测量本发明的化合物或缀合物与呈递蛋白的结合(例如，非共价或共价结合)。
通过ITC确定FKBP12-化合物1与CEP250之间结合的动力学和热力学
试剂：100％DMSO中的化合物1和化合物2(内部)、蛋白质缓冲液(10mM HEPES，pH7.5、75mM NaCl、0.5mM TCEP)、测定缓冲液(蛋白质缓冲液+1％DMSO)、FKBP12(内部)、CEP25029.4(内部，残基1982-2231)和CEP25011.4(内部，残基2134-2231)。
设备：MicroCalTM ITC200(GE Healthcare)。仪器参数示于表6中。
表6.等温滴定量热仪参数
实验协议：将FKBP12储备溶液在测定缓冲液中稀释至10μM(最终1％DMSO)。将化合物添加到FKBP12中至20μM(最终1％DMSO)，并在5-10min的预孵育时间后将二元复合物填充到ITC装置的反应池中。将CEP250蛋白储备物在测定缓冲液中稀释至50μM，并补充20μM化合物(最终1％DMSO)，然后将其填充到注射器中。还在不存在化合物的情况下进行对照实验，以确定与操作伪像相关联的热量以及滴定剂从注射器注入反应池时的稀释度。更详细的实验参数示于表7中。
表7.最终蛋白质和配体浓度
Figure BDA0002302535140001532
Figure BDA0002302535140001541
数据拟合：根据以下程序，将数据用Origin ITC200软件拟合：
1)读取原始数据
2)在“mRawITC”中：调整积分峰和基线，对所有峰进行积分
3)在“ΔH”-数据控制中：删除不良数据(注入#1和其他伪像)，减去直线(背景减法)
4)在“ΔH”-模型拟合中：选择一组位点模型，使用列文伯格-马夸尔特(Levenberg-Marquardt)算法执行拟合，直到卡方(Chi Square)不再进一步减小，以“完成(done)”结束(基于拟合计算参数N、Ka和ΔH)
结果：表8和图13汇总了FKBP12-化合物1和FKBP12-化合物2二元复合物与CEP250的结合的ITC测量值。总体而言，FKBP12-化合物1和FKBP12-化合物2二元复合物与CEP25011.4和CEP25029.4结合的数据显示出相似的相互作用参数。所有组合的Kd值均相似。所有相互作用均显示出几乎相同的热力学曲线，其中结合的特征在于纯焓结合模式(-T*ΔS项为正并且对吉布斯自由能没有贡献)。CEP25011.4/化合物1/FKBP12的晶体结构证明，所有相互作用的结合化学计量比均为N＝0.5-0.6，并支持1个CEP250同源二聚体与2个FKBP12分子结合的结合比为1:2。
表8.通过ITC确定FKBP12-化合物1-CEP250三元复合物形成
Figure BDA0002302535140001542
Figure BDA0002302535140001551
*Kd(由Ka＝1/Kd计算
**ΔH
***T*ΔS(由-TΔS＝ΔG-ΔH计算)
****ΔG＝-RT In Ka＝RT In Kd
实施例9：通过表面等离子体共振确定缀合物与蛋白质之间结合的动力学
表面等离子体共振(SPR)是一种用于测量与两种蛋白质或一种蛋白质与配体的二元相互作用相关的动力学的生物物理技术。通常，二元相互作用对的一种组分通过融合标签固定在激活的传感器芯片的流动池上。然后将增加浓度的第二组分(分析物)注射在活性表面上，持续固定的时间。在缔合阶段期间SPR信号(以共振单位RU表示)增加并且在解离阶段期间SPR信号降低指示相互作用，并且可以拟合成结合模型以确定相关联的KD、Ka、Kd值。在所述实施例中，所述方法用于测量本发明的缀合物与呈递蛋白结合的动力学，其中(i)缀合物通过融合标签固定在芯片上，并将呈递蛋白注射在表面上，或(ii)呈递蛋白通过融合标签固定在芯片上，并将缀合物注射在表面上。
通过SPR确定FKBP12-化合物1与CEP250之间结合的动力学
所述协议利用表面等离子体共振(SPR)作为确定CEP250(分析物)与固定的FKBP12-化合物1二元复合物(配体)结合的动力学(KD、Ka、Kd)的方法。
试剂：100％DMSO中的化合物1(内部)、10X HBS-P+缓冲液(GE Healthcare BR-1006-71)、测定缓冲液(1X HBS-P+缓冲液、1％DMSO、1μM化合物1)、12x HIS标记的FKBP12(内部)、CEP25029.2(残基1982-2231)和CEP25011.4(残基2134-2231)(内部)。
设备：BIACORETM X100(GE Healthcare)
供应商：NTA传感器芯片(GE Healthcare BR-1000-34)
实验协议：实验在25℃下执行。将12XHIS标记的FKBP12的储备溶液在含有1μM化合物1的测定缓冲液中稀释至100nM(最终1％DMSO)。将大约200-400RU的FKBP12固定在激活的NTA芯片的两个流动池之一上。第二流动池未激活，以作为分析物与传感器芯片的非特异性相互作用的参考。将在含有1μM化合物1的相同测定缓冲液中系列稀释(最终1％DMSO)的各种浓度的CEP250(1nM-1μM范围)以10μl/min的流速注射到FKBP12表面和参考表面上。表面在分析物注射液与350mM EDTA之间再生。
数据拟合：使用BiaEvaluation软件程序进行数据拟合。对于参考流动池和缓冲液注射液均参考减去所有数据。对于动力学分析，数据局部地拟合为1:1相互作用模型。
结果：SPR传感图且示于图14中。确定FKBP12/化合物1与CEP25011.4和CEP25029.2的结合的解离常数(KD)分别为5.4nM和0.29nM。
实施例10：通过生物层干涉法确定缀合物与蛋白质之间结合的动力学
生物层干涉法(BLI)是一种用于测量两种蛋白质或一种蛋白质与配体的二元相互作用相关的动力学的生物物理技术。通常，二元相互作用对的一种组分通过融合标签固定在生物传感器尖端上。然后将增加浓度的第二组分(分析物)注射在生物传感器尖端上，持续固定的时间。在缔合阶段期间BLI信号(以光学厚度nm表示)增加并且在解离阶段期间BLI信号降低指示相互作用，并且可以拟合成结合模型以确定相关联的KD、Ka、Kd值。在所述实施例中，所述方法用于测量本发明的缀合物与呈递蛋白结合的动力学，其中(i)缀合物通过融合标签固定在尖端上，并将呈递蛋白注射在表面上，或(ii)呈递蛋白通过融合标签固定在尖端上，并将缀合物注射在表面上。
通过BLI确定CYPA-化合物3与KRASG12C-GTP之间结合的动力学
所述协议利用生物层干涉法(BLI)作为确定KRASG12C-GTP(分析物)与固定的CYPA-化合物3二元复合物(配体)结合的解离常数(KD)的方法。
试剂：100％DMSO中的化合物3(内部)、ForteBio动力学缓冲液(FortéBio Inc.,Menlo Park,CA)、测定缓冲液(动力学缓冲液、1％DMSO、2μM化合物3)、Avi标记的CYPA(内部)、KRASG12C-GTP(残基1-169)(内部)。
设备：Octet Red 96仪器(FortéBio Inc.,Menlo Park,CA)
供应商：链霉亲和素(SA)生物传感器(FortéBio)
实验协议：将链霉亲和素(SA)生物传感器在25℃下在含有10μMAvi-CYPA蛋白的溶液中涂覆至加载信号为0.6nm。蛋白质的加载量显示随时间的稳定性以及没有基线漂移。在剂量反应实验中，以1:2稀释系列用从200μM开始的KRASG12C-GTP蛋白浓度评价三元复合物的形成。对于阴性对照，将涂有Avi-CYPA蛋白的传感器浸入仅含有筛选缓冲液(补充有2μM化合物3)的孔中。记录并分析校正的结合反应传感图。
数据拟合：使用FortéBio软件在FortéBio Octet RED仪器上执行分析。所述分析考虑了非特异性结合、背景和信号漂移，并使良好基础和传感器可变性最小化。观察到三元复合物的剂量依赖性形成，并确定了对应的平衡解离常数(KD)。
结果：传感图和稳态拟合曲线示于图15中。确定CYPA/化合物3与KRASG12C-GTP结合的解离常数(KD)为44μM。
实施例11：对于交联剂，FKBP12结合的靶蛋白的蛋白质组学鉴定
试剂：100％DMSO中的化合物(内部)、N-末端生物素-FKBP12(内部)、HEK293T细胞裂解液(内部)。
实验协议：使用由40mM HEPES,pH 7.3、120mM NaCl、2mM MgCl2、2mM CaCl2、0.5％辛基-b-葡萄糖苷和无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)组成的裂解缓冲液使用超声处理(以20％功率脉冲4、10秒)在冰上制备HEK293T细胞裂解液。首先通过离心清除裂解液，并使所得上清液通过冰上的0.2mm注射器式过滤器。将N-末端生物素标记的FKBP12添加到500ml的裂解液中，最终浓度为4mM，通过移液混合，并且然后添加化合物到最终浓度为10mM，反应物通过移液混合。添加60mL的50％浆液琼脂糖-链霉亲和素树脂(在裂解缓冲液中预平衡)，并使反应在4℃下轻轻摇动进行1小时。孵育后，将树脂轻轻地粒化，通过添加、离心和抽吸用1mL冰上裂解缓冲液洗涤4次，并且然后以相同的物理方式用1mL不含洗涤剂的裂解缓冲液再洗涤4次。使用HEPES缓冲液中的8M尿素,pH 8.0从树脂上洗脱保留的蛋白质，用100mM HEPES,pH 8.0稀释至7M尿素，并添加内切蛋白酶Lys-C，在37℃下蛋白消化2小时。接着，使用100mM HEPES,pH 8.0将样品稀释至0.8M尿素，添加胰蛋白酶，并将样品在37℃下再消化16小时。消化完成后，使用C18 SPE过滤器制备样品进行LC-MS/MS分析，将样品装载到C18 SPE过滤器上，将其洗涤，洗脱，在真空离心蒸发浓缩器中干燥，并且最后悬浮于10ml的5％乙腈、5％甲酸缓冲液中用于LC-MS/MS分析。LC-MS/MS分析在Thermo-FisherLTQ-Velos-Pro OrbiTrap质谱仪上使用前20数据依赖性采集方法和用于HPLC的8-35％乙腈梯度执行。使用Sequest算法分配肽序列，并将鉴定的蛋白质与对照样品(仅DMSO)进行比较，以鉴定候选靶蛋白。
结果：使用上述协议，已鉴定>100种能够在存在交联化合物的情况下结合呈递蛋白的靶蛋白。鉴定的靶蛋白包括激酶、磷酸酶、泛素连接酶、DNA结合蛋白、热激蛋白、DNA解旋酶、GTP酶活化蛋白、核苷酸结合蛋白和其他蛋白质结合蛋白。
实施例12：通过荧光偏振法确定缀合物与蛋白质之间的结合
荧光偏振(FP)技术基于以下观察结果：当荧光标记的分子被偏振光激发时，其发出偏振度与分子旋转速率成反比的光。小分子在激发态期间快速旋转，并且在发射时具有低极化值。通过标记分子与第二分子的结合形成的大复合物在激发态期间略微旋转，并且因此具有很高的极化值。荧光的这种特性可以用于测量标记的配体与较大蛋白质的相互作用，并为直接和竞争结合测定提供基础。在所述实施例中，所述方法用于测量本发明的化合物或缀合物与呈递蛋白的结合，并建立与靶蛋白的三元复合物形成。
通过FP确定CypA:C3DS:KRAS复合物形成
试剂：100％DMSO中的C3DS(内部)、蛋白质缓冲液(12.5mM HEPES pH＝7.4、1mMMgCl2)、测定缓冲液(25mM HEPES，pH 7.3、0.002％Tween 20、0.1％BSA、10mM NaCl、1mMMgCl2)、CYPA(内部)、负载Mant-GMP-PNP的KRAS(1-169个残基)。
Figure BDA0002302535140001591
设备：SpectraMax
实验协议：将KRAS储备溶液加载在测定缓冲液中，最终浓度为0.8μM(最终1％DMSO)。添加化合物(C3DS)至最终浓度为10μM，并且将反应混合物分配到384孔Costar黑色板上。将CYPA连续稀释到板的孔中，并允许在室温下孵育15min。还在不存在化合物的情况下进行了对照实验，以确定在不存在化合物的情况下CYPA与KRAS的缔合。反应混合物在355nm处激发，并记录455nm下的发射信号。在垂直平面和平行平面上测量信号，并使用以下公式记录极化。
FP(极化单位x 10^-3)＝信号(平行)-信号(垂直)/[信号(平行)+信号(垂直)]
结果：代表性曲线且示于图16中，并且下文列出了列出EC50(增强KRAS的FP信号50％所需的浓度)的表。曲线拟合成四参数方程，并且获得的EC50指示配体C3DS对增强CYPA与KRAS之间的结合的作用。
CypA:Kras CypA:C3DS:Kras
EC50 30μM 2.3μM
实施例13：通过核磁共振法确定缀合物与蛋白质之间的结合
核磁共振(NMR)光谱法是一种用于解析三维结构并研究蛋白质和蛋白质-配体复合物的动力学的技术。此外，其可以用于鉴定蛋白质-配体相互作用中的配体结合位点。在若干种可用的NMR方法之中，基于蛋白质结构的配体筛选(高灵敏度的2D 1H-15N TROSY-HSQC光谱)和鉴定参与配体(药物)结合的关键残基是此类研究中最敏感的方法。向蛋白质的NMR样品中添加浓度按顺序增加的配体并收集2D 1H-15N TROSY-HSQC，提供原子级高度解析的残基扰动信息，称为化学位移扰动(CSP)，这直接提供关于鉴定配体结合位点的更准确信息，所述信息无法通过任何其他生物物理技术得到。通过这种方法，可以研究配体与蛋白质或二元蛋白质复合物结合的弱、中等和强亲和力，并且所述信息可以直接与现有的结构、动态和动力学信息关联。在所述实施例中，所述方法用于证明本发明的化合物(药物)或缀合物与呈递蛋白的结合(例如，非共价或共价)。
通过溶液NMR光谱法确定三元复合物中KRAS(G12C)-亲环蛋白-化合物3结合
试剂：100％DMSO中的化合物3(内部)、蛋白质缓冲液(50mM TRIS-d11、50mM NaCl，pH 7.0、1mM TCEP-d16、1mM MgCl2)、KRAS的NMR样品中的添加剂(100μM DSS，在93％H2O和7％D2O中)、测定缓冲液(蛋白质缓冲液+DMSO中增加当量的药物(≤5％))、GMP-15N-KRAS(G12C)-16(N-His，残基1-169，内部)、未标记的(UL)亲环蛋白(CYPA；残基1-165)(内部)。
设备：配备5mm CPTCI 1H-13C/15N/D Z-GRD Z44909/0026冷冻探针的BrukerAvance 800MHz光谱仪(Bruker)。在这些实验中使用高精度5mm NMR管。
NMR数据处理和分析：运行Topspin v3.1和NMRPipe/NMRDraw进行处理，以及运行CCPNMR“分析”程序进行数据分析的Linux计算机。
实验协议：使用蛋白缓冲液中0.72mM的GMP-15N-KRAS(G12C)-16储备溶液制备600μl的0.18mM NMR样品(包含NMR添加剂)。DSS用作内标(0.0ppm处有1H峰)用于化学位移参考。收集15N KRAS的2D 1H-15N TROSY-HSQC光谱(数据大小2048x128)。将蛋白质缓冲液中的1当量(0.18mM)的CYPA(来自0.4mM的储备溶液)添加到NMR样品中，并搅拌10分钟。最终NMR样品体积保持为600μl。收集二元复合物(15N-KRAS+UL-CYPA)的2D 1H-15N TROSY-HSQC光谱(数据大小2048x128)，其他采集参数保持不变(光谱中仅KRAS 1H-15N相关交叉峰可见)。将20mM化合物3在100％DMSO中的储备溶液用于NMR滴定。将化合物3依次添加到NMR样品中以使其在二元复合物(15N-KRAS+UL-CYPA)的NMR样品中的当量(相当于15N-KRAS浓度)为0.5、1.0、2.5和5.0。在每个阶段，保持样品体积为600μl，同时保持采集参数不变。在添加化合物3的每个阶段，获取2D 1H-15N TROSY-HSQC光谱以研究KRAS残基的化学位移扰动(CSP)。所有光谱相互叠加。使用三元复合物(KRAS+CYPA+化合物3)相对于二元复合物(KRAS+CYPA)中KRAS的每个残基的化学位移之差确定每个化合物3滴定点处的有效CSP。随后，使用以下公式确定每个KRAS残基的加权平均化学位移(Δδ加权)：
Δδ加权＝[(Δ1H)2+(Δ15N/5)2]1/2
认为引发比总体平均值大一个标准偏差的Δδ加权的残基被显著扰动并将其用于结合位点作图。在单独的滴定实验中，通过依次添加DMSO当量(以满足上述实验中的等效溶剂浓度)以减去DMSO添加的贡献，收集二元复合物(KRAS+CYPA)的2D 1H-15N TROSY-HSQC光谱。在第二对照实验中，收集用不同当量的化合物3滴定(在没有CYPA的情况下)的15N-KRAS的2D 1H-15N TROSY-HSQC光谱系列。
将有效的CSP制成表格并进行分析。将KRAS的药物结合残基(在存在CYPA的情况下)分布到蛋白质表面上。确定解离常数KD。
实验和处理参数：
光谱数据大小：2048(1H维度)x128(15N-维度)
扫描次数：4
温度：298K
正交检测模式：DQD(1H)和Echo-AntiEcho(15N)
通过在间接维度内应用前后线性预测来扩展数据大小。在进行傅立叶变换之前，在每个维度上通过零填充一次来推断数据集。
结果：KRASG12C-GTP的2D 1H-15N TROSY-HSQC光谱示于图17A中。添加化学计量的量的CYPA对KRAS酰胺主链交叉峰没有影响(图17B)，指示KRAS和CYPA不直接相互作用。将W21487滴定到CYPA:KRAS的1:1样品中引发不同的化学位移(图17C)，指示与KRAS直接相互作用。
实施例14：通过微量热泳法确定缀合物与蛋白质之间的结合
微量热泳法(MST)是一种通过将分子的分子特性的任何变化诸如大小、构象与其在定向温度梯度中的迁移率相关联来表征生物分子相互作用的技术。梯度的产生是由红外激光引起的。生物分子的运动通常通过使用共价连接的荧光团或甚至固有荧光标记分子来表征。在所述实施例中，所述方法用于测量本发明的化合物或缀合物与呈递蛋白的结合，并建立与靶蛋白的三元复合物形成，其中(i)用荧光团标记缀合物并滴定呈递蛋白，或者(ii)用荧光团标记呈递蛋白并滴定缀合物。
实施例15：通过二次谐波生成技术确定缀合物与蛋白质之间的结合
二次谐波生成(SHG)是一种可以用来实时测量水溶液中的构象变化的光学现象。SHG信号强度对标记到系链到表面的蛋白质上的染料的平均角取向敏感，并且信号变化的幅度与角度变化量直接相关。可以通过结合时信号变化的幅度、相对于基线而言的信号(相对于表面的更多垂直取向产生正信号变化，并且反之亦然)和动力学来对不同的构象进行分类。在所述实施例中，所述方法用于测量本发明的化合物或缀合物与呈递蛋白的结合，并建立与靶蛋白的三元复合物形成，其中(i)染料标记的缀合物通过融合标签固定在表面上并将呈递蛋白注射在表面上，或者(ii)染料标记的呈递蛋白通过融合标签固定在表面上，并将缀合物注射在表面上。
实施例16：通过差示扫描荧光测定法确定缀合物与蛋白质之间的结合
差示扫描荧光测定法(DSF)是一种用于测量蛋白质的熔融温度(Tm)的基于溶液的生物物理技术。在典型的实验中，在存在荧光染料(例如，SYPRO橙)的情况下，使感兴趣的蛋白经受逐渐增加的热量(通常4℃-95℃)。绘制作为温度的函数的荧光强度，并由荧光信号的负导数最小值计算Tm。对于靶蛋白，可以测量在存在小分子的情况下的热位移(ΔTm)，以评估小分子是否结合蛋白质并使蛋白质稳定。在所述实施例中，所述方法用于测量本发明的化合物或缀合物与呈递蛋白的热位移(例如，非共价或共价结合)，其中(i)用荧光染料标记缀合物并滴定呈递蛋白，或者(ii)用荧光染料标记呈递蛋白并滴定缀合物。
实施例17：通过NanoDSF确定缀合物与蛋白质之间的结合
NanoDSF是一种用于使用固有色氨酸或酪氨酸荧光来测量蛋白质的Tm的先进DSF方法。在一个典型的实验中，使感兴趣的蛋白质经受逐渐增加的热量(通常4℃-95℃)，并且作为温度的函数监测固有色氨酸或酪氨酸残基的荧光强度。可以由色氨酸荧光强度的变化或330nm和350nm处色氨酸发射的比率来计算Tm，所述比率描述展开时色氨酸发射的位移。对于靶蛋白，可以测量在存在小分子的情况下的ΔTm，以评估小分子是否结合蛋白质并使蛋白质稳定。在所述实施例中，所述方法用于测量本发明的化合物或缀合物与呈递蛋白的热位移(例如，非共价或共价结合)，其中(i)测量缀合物的荧光并滴定呈递蛋白，或者(ii)监测呈递蛋白的荧光并滴定缀合物。
实施例18：通过差示光散射确定复合物形成
动态光散射(DLS)是一种用于测量由于粒子经历随机布朗运动而引起的散射强度的时间依赖性波动的已建立的生物物理学方法。可以从这些波动的分析中获得扩散系数和粒度信息。更具体地，所述方法提供测量包括水溶液中蛋白质的半径和分子量的尺寸特征的能力。在所述实施例中，所述方法用于测量以下的半径或分子量的变化：(i)结合本发明的缀合物时的呈递蛋白，或(ii)结合呈递蛋白时的本发明的缀合物。
实施例19：通过声波声学技术确定缀合物与蛋白质之间的结合
表面声波(SAW)技术是一种用于通过监视沿生物传感器行进的表面声波的相位位移来实时检测结合诱导的构象变化的生物物理方法。其可以用于测量两种蛋白质或一种蛋白质与配体的二元相互作用相关的动力学。通常，二元相互作用对的一种组分通过融合标签固定在生物传感器上。然后将增加浓度的第二组分(分析物)注射在生物传感器上，持续固定的时间。在缔合阶段期间信号(通过波相位或振幅的变化测量)增加并且在解离阶段期间信号降低指示相互作用，并且可以拟合成结合模型以确定相关联的KD、Ka、Kd值。在所述实施例中，所述方法用于测量本发明的缀合物与呈递蛋白结合的动力学，其中(i)缀合物通过融合标签固定在生物传感器芯片上，并将呈递蛋白注射到表面上，或(ii)呈递蛋白。
实施例20：通过小角度X射线散射确定复合物形成
小角度X射线散射(SAXS)是一种用于根据平均粒度和形状确定蛋白质的结构的基于溶液的方法。其能够递送分辨率在1nm与25nm之间的结构信息，并且能够在部分有序系统中重复尺寸高达150nm的距离。超小角度散射(USAS)可以解析甚至更大的尺寸。在典型的散射实验中，将蛋白质或蛋白质复合物的溶液暴露于X射线(波长λ通常为约0.15nm)。记录作为动量传递s的函数(s＝4πsinθ/λ，其中2θ是入射辐射与散射辐射之间的角度)的散射强度I(s)。从溶液的强度中减去仅来自溶剂的散射。然后使用X射线散射曲线(强度相对于散射角)产生蛋白质或蛋白质复合物的低分辨率模型。在所述实例中，所述方法用于鉴定本发明的化合物或缀合物与呈递蛋白的三元复合物(例如，非共价或共价结合)的存在。
其他实施方案
应理解，虽然已经结合本公开的详述描述了本公开，但是前述描述旨在说明而不是限制本公开的范围，本公开的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和变更在所附权利要求的范围内。
本领域的技术人员将认识到，或仅使用常规实验就能够确定本文描述的根据本发明的具体实施方案的许多等效物。本发明的范围并非旨在限于以上描述，而是如所附权利要求所阐述。
在权利要求中，除非指明相反情况或另外从上下文明显看出，否则冠词诸如“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the)”可以意指一个/种或多于一个/种。除非指明相反情况或另外从上下文明显看出，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、被用于给定产品或方法中或以其他方式与给定产品或方法相关，则认为在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述是满足的。本发明包括其中所述组中只有一个成员存在于、被用于给定产品或方法中或以其他方式与给定产品或方法相关的实施方案。本发明包括其中多于一个或所有的组成员存在于、被用于或以其他方式与给定的产品或方法相关的实施方案。
还应注意术语“包含”旨在为开放的并且容许但并非要求包括另外的要素或步骤。当本文中使用术语“包含”时，因此还涵盖并且公开术语“由……组成”。
在给出范围时，端点被包括在内。此外，应了解的是，除非另外指明或另外根据上下文和本领域的普通技术人员的理解明显看出，否则被表示为范围的值可以在本发明的不同实施方案中呈现所述范围内的任何具体值或子范围，除非上下文另外明确规定，否则直到所述范围的下限的单位的十分之一为止。
另外，应理解，在现有技术内的本发明的任何具体实施方案可以从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为认为此类实施方案为本领域普通技术人员所已知的，即使本文没有明确阐述排除，也可以排除它们。本发明的组合物的任何特定实施方案(例如，由其编码的任何多核苷酸或蛋白质；任何生产方法；任何使用方法)都可以出于任何原因而从任何一项或多项权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在有关。

Claims (277)

1.一种化合物，其包含蛋白结合部分和交联基团。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述交联基团是能够与氨基酸进行化学选择性反应的部分。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述交联基团是巯基反应性交联基团、氨基反应性交联基团、羧基反应性交联基团、羰基反应性交联基团或形成三唑的交联基团。
4.如权利要求3所述的化合物，其中所述交联基团是巯基反应性交联基团。
5.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述交联基团包括混合的二硫化物。
6.如权利要求5所述的化合物，其中所述交联基团包括式I的结构：
Figure FDA0002302535130000011
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点；并且
a是0、1或2；
RA是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的C2-C9杂芳基。
7.如权利要求6所述的化合物，其中RA是任选取代的C2-C9杂芳基。
8.如权利要求7所述的化合物，其中所述任选取代的C2-C9杂芳基是吡啶基。
9.如权利要求6所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000021
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
10.如权利要求6所述的化合物，其中RA是任选取代的C1-C6杂烷基。
11.如权利要求10所述的化合物，其中所述任选取代的C1-C6杂烷基是N.N-二甲基-乙烯。
12.如权利要求6所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000022
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
13.如权利要求12所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000023
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
14.如权利要求6所述的化合物，其中RA是任选取代的C1-C6烷基。
15.如权利要求10所述的化合物，其中所述任选取代的C1-C6烷基是甲基。
16.如权利要求14或15所述的化合物，其中a是2。
17.如权利要求6所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000031
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
18.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述交联基团包括马来酰亚胺。
19.如权利要求18所述的化合物，其中所述交联基团包括式Ib、Ic、Id或Ie的结构：
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点；
XA是–C(O)-或–SO2-；
XB是–C(O)-或CRERF；
RB和RC独立地是氢、卤素、任选取代的羟基、任选取代的氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；
RD是氢、羟基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RE和RF独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
20.如权利要求19所述的化合物，其中所述交联基团包括式Ib的结构。
21.如权利要求20所述的化合物，其中XA是–C(O)-。
22.如权利要求20或21所述的化合物，其中XB是–C(O)-。
23.如权利要求20至22中任一项所述的化合物，其中RB和RC是氢或任选取代的C1-C6烷基。
24.如权利要求23所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
25.如权利要求24所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000051
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
26.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述交联基团包括式If、Ig、Ih或Ii的结构：
Figure FDA0002302535130000052
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点；
XC是–C(O)-或–SO2-；
XD不存在，是NRJRK或ORL；
RG、RH和RI独立地是氢、腈、卤素、任选取代的羟基、任选取代的氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RJ、RK和RL独立地不存在，是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
27.如权利要求26所述的化合物，其中所述交联基团包括式If的结构。
28.如权利要求26或27所述的化合物，其中XD不存在。
29.如权利要求26至28中任一项所述的化合物，其中RG、RH和RI是氢。
30.如权利要求26至29中任一项所述的化合物，其中XC是–SO2-。
31.如权利要求26至30中任一项所述的化合物，其中所述交联基团包括乙烯基砜
32.如权利要求26所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000061
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
33.如权利要求32所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000062
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
34.如权利要求26至29中任一项所述的化合物，其中XC是–C(O)-。
35.如权利要求26至29中任一项所述的化合物，其中所述交联基团包括乙烯基酮。
36.如权利要求35所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000071
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
37.如权利要求36所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000072
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
38.如权利要求36所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000073
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
39.如权利要求26至29中任一项所述的化合物，其中所述交联基团包括炔酮。
40.如权利要求39所述的化合物，其中所述交联基团包括式Ij或Ik的结构：
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点；
XE不存在，是NRNRO或ORP；
RM是氢、卤素、任选取代的羟基、任选取代的氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RN、RO和RP独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
41.如权利要求40所述的化合物，其中所述交联基团包括式Ij的结构。
42.如权利要求40或41所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
43.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述交联基团包括式Im或In的结构：
Figure FDA0002302535130000092
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点；
XF不存在，是NRSRT或ORU；
XG不存在，或者是–C(O)-；
Y是离去基团；
RQ和RR独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RS、RT和RU独立地不存在，是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
44.如权利要求43所述的化合物，其中Y是卤素。
45.如权利要求44所述的化合物，其中所述卤素是氯或氟。
46.如权利要求43所述的化合物，其中Y是腈。
47.如权利要求43至46中任一项所述的化合物，其中XF和XG不存在。
48.如权利要求43至47中任一项所述的化合物，其中RQ和RR是氢。
49.如权利要求43所述的化合物，其中所述交联基团包括烷基卤。
50.如权利要求49所述的化合物，其中所述烷基卤是烷基氯或烷基氟。
51.如权利要求50所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000101
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
52.如权利要求51所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000102
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
53.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述交联基团包括环氧化物。
54.如权利要求53所述的化合物，其中所述交联基团包括式Io的结构：
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点；
RV、RW和RX独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基、任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
55.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述交联基团包括式Ip的结构：
Figure FDA0002302535130000112
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点；
虚线代表为芳族结构所必需包含的任选双键；
b是0、1或2；
Y是离去基团；
RY和RZ独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基、任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；
XH、XI、XJ、XK和XL各自独立地不存在，是NRAA或CRAB，其中XH、XI、XJ、XK和XL中至少五个是NRAA或CRAB；
RAA不存在，或者是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RAB是氢、腈、卤素、任选取代的羟基、任选取代的氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
56.如权利要求55所述的化合物，其中至少一个RAB是吸电子基团。
57.如权利要求56所述的化合物，其中一至三个RAB是吸电子基团。
58.如权利要求55至57中任一项所述的化合物，其中Y是腈、卤素、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或三氟甲磺酸酯。
59.如权利要求55至58中任一项所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000131
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
60.如权利要求59所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000132
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
61.如权利要求60所述的化合物，其中所述交联基团包括结构：
Figure FDA0002302535130000133
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点。
62.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述交联基团是内部交联基团。
63.如权利要求62所述的化合物，其中所述交联基团包括式Iq、Ir或Is的结构：
Figure FDA0002302535130000141
其中波浪线示出所述交联基团与所述化合物的其余部分的连接点；
XM是–C(O)-或–SO2-；
XN不存在，是NRAE或O；
RAC和RAD独立地是氢、腈、卤素、任选取代的羟基、任选取代的氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
RAE是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂芳基、任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基。
64.如权利要求63所述的化合物，其中XN是NRAE，其中RAE是氢。
65.如权利要求63或64所述的化合物，其中RAC和RAD是氢。
66.如权利要求63至65中任一项所述的化合物，其中XM是–C(O)-。
67.如权利要求63至65中任一项所述的化合物，其中XM是–SO2-。
68.如权利要求1至67中任一项所述的化合物，其中所述蛋白结合部分与蛋白质之间的相互作用是非共价的。
69.如权利要求1至67中任一项所述的化合物，其中所述蛋白结合部分与蛋白质之间的相互作用是共价的。
70.一种化合物，其包含呈递蛋白结合部分和交联基团。
71.如权利要求70所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分能够结合由表1的基因中的任一种编码的蛋白质。
72.如权利要求70所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分是脯氨酰异构酶结合部分。
73.如权利要求70至72中任一项所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分是FKBP结合部分、亲环蛋白结合部分或PIN1结合部分。
74.如权利要求73所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分是FKBP结合部分。
75.如权利要求74所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分能够结合FKBP12、FKBP12.6、FKBP13、FKBP25、FKBP51或FKBP52。
76.如权利要求74或75所述的化合物，其中所述FKBP结合部分是选择性FKBP结合部分。
77.如权利要求74或75所述的化合物，其中所述FKBP结合部分是非选择性FKBP结合部分。
78.如权利要求74至77中任一项所述的化合物，其中所述FKBP结合部分包括式IIa或IIb的结构：
Figure FDA0002302535130000161
其中Z1和Z2各自独立地是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6杂烷基，或者Z1和Z2与它们所连接的原子组合形成任选取代的10至40元大环；并且其中Z1或Z2中的至少一个包括与所述交联基团连接的点；
b和c独立地是0、1或2；
d是0、1、2、3、4、5、6或7；
X1和X2各自独立地不存在，是CH2、O、S、SO、SO2或NR4；
R1和R2各自独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基、任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基，或者R1和R2与它们所结合的碳原子组合形成C＝O，或者R1和R2组合形成任选取代的C3-C10碳环基或任选取代的C2-C9杂环基；
R3各自独立地是羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基，或者两个R8组合形成任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的C2-C9杂芳基；并且
R4各自独立地是氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、C3-C7碳环基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和任选取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。
79.如权利要求78所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分包括结构：
80.如权利要求73所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分是亲环蛋白结合部分。
81.如权利要求80所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分能够结合PP1A、CYPB、CYPC、CYP40、CYPE、CYPD、NKTR、SRCyp、CYPH、CWC27、CYPL1、CYP60、CYPJ、PPIL4、PPIL6、RANBP2或PPWD1。
82.如权利要求80或81所述的化合物，其中所述亲环蛋白结合部分是选择性亲环蛋白结合部分。
83.如权利要求80或81所述的化合物，其中所述亲环蛋白结合部分是非选择性亲环蛋白结合部分。
84.如权利要求80至83中任一项所述的化合物，其中所述亲环蛋白结合部分包括式III或IV的结构：
Figure FDA0002302535130000181
其中Z3、Z4、Z5和Z6各自独立地是羟基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6杂烷基，或者Z3和Z4或Z5和Z6与它们所连接的原子组合形成任选取代的10至40元大环；
Z3、Z4、Z5、Z6或R5中的至少一个包括与所述交联基团连接的点；
e是0、1、2、3或4；
R5是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；
R6是任选取代的C1-C6烷基；
R7各自独立地是羟基、氰基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
R8是氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、C3-C7碳环基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和任选取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。
85.如权利要求84所述的化合物，其中所述亲环蛋白结合部分包括式IVa的结构：
Figure FDA0002302535130000191
其中R7’各自独立地是羟基、氰基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基)或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基(例如，任选取代的C2-C9杂芳基C1-C6烷基)。
86.如权利要求84或85所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分包括结构：
Figure FDA0002302535130000201
87.一种化合物，其包含靶蛋白结合部分和交联基团。
88.如权利要求87所述的化合物，其中所述靶蛋白是GTP酶、GTP酶活化蛋白、鸟嘌呤核苷酸交换因子、热激蛋白、离子通道、卷曲螺旋蛋白、激酶、磷酸酶、泛素连接酶、转录因子、染色质改性剂/重塑剂或具有经典蛋白质-蛋白质相互作用结构域和基序的蛋白质。
89.如权利要求87或88所述的化合物，其中所述靶蛋白包括不可成药的表面。
90.如权利要求87至89中任一项所述的化合物，其中所述靶蛋白不具有传统的结合口袋。
91.如权利要求1至90中任一项所述的化合物，其中所述蛋白结合部分和所述交联基团通过接头连接。
92.如权利要求91所述的化合物，其中所述接头的长度为1至20个原子。
93.如权利要求91或92所述的化合物，其中所述接头具有式V的结构：
A1-(B1)f-(C1)g-(B2)h-(D)-(B3)i-(C2)j-(B4)k-A2
式V
其中A1是所述接头与蛋白结合部分之间的键；A2是所述交联基团与所述接头之间的键；B1、B2、B3和B4各自独立地选自任选取代的C1-C2烷基、任选取代的C1-C3杂烷基、O、S和NRN；RN是氢、任选取代的C1-4烷基、任选取代的C2-4烯基、任选取代的C2-4炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C1-7杂烷基；C1和C2各自独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基或磷酰基；f、g、h、I、j和k各自独立地是0或1；并且D是任选取代的C1-10烷基、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C2-C10聚乙二醇或任选取代的C1-10杂烷基，或连接A1-(B1)f-(C1)g-(B2)h-与-(B3)i-(C2)j-(B4)k-A2的化学键
94.如权利要求91至93中任一项所述的化合物，其中所述接头包括式VI的结构：
Figure FDA0002302535130000211
Figure FDA0002302535130000221
其中A1是所述接头与蛋白结合部分之间的键；
A2是所述交联基团与所述接头之间的键；
l是0、1、2或3；
m是0或1；
n是0、1或2；并且
X3、X4和X5各自独立地不存在，是O、S、-C≡C-、CR9R10或NR11；并且
R9、R10和R11各自独立地是氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、C3-C7碳环基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和任选取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。
95.如权利要求94所述的化合物，其中所述接头包括结构：
Figure FDA0002302535130000222
96.一种化合物，其具有结构：
Figure FDA0002302535130000231
Figure FDA0002302535130000241
Figure FDA0002302535130000251
97.一种缀合物，其包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分。
98.如权利要求97所述的缀合物，其中所述缀合物的所述呈递蛋白结合部分能够与呈递蛋白非共价相互作用。
99.如权利要求97所述的缀合物，其中所述缀合物的所述呈递蛋白结合部分能够与呈递蛋白共价相互作用。
100.如权利要求97至99中任一项所述的缀合物，其中所述呈递蛋白结合部分能够结合由表1的基因中的任一种编码的蛋白质。
101.如权利要求97至99中任一项所述的缀合物，其中所述呈递蛋白结合部分是脯氨酰异构酶结合部分。
102.如权利要求97至101中任一项所述的缀合物，其中所述呈递蛋白结合部分是FKBP结合部分、亲环蛋白结合部分或PIN1结合部分。
103.如权利要求102所述的缀合物，其中所述呈递蛋白结合部分是FKBP结合部分。
104.如权利要求103所述的缀合物，其中所述呈递蛋白结合部分能够结合FKBP12、FKBP12.6、FKBP13、FKBP25、FKBP51或FKBP52。
105.如权利要求103或104所述的缀合物，其中所述FKBP结合部分是选择性FKBP结合部分。
106.如权利要求103或104所述的缀合物，其中所述FKBP结合部分是非选择性FKBP结合部分。
107.如权利要求103至106中任一项所述的缀合物，其中所述FKBP结合部分包括式IIa或IIb的结构：
Figure FDA0002302535130000261
其中Z1和Z2各自独立地是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6杂烷基，或者Z1和Z2与它们所连接的原子组合形成任选取代的10至30元大环；并且其中Z1或Z2中的至少一个包括与所述靶蛋白连接的点；
b和c独立地是0、1或2；
d是0、1、2、3、4、5、6或7；
X1和X2各自独立地不存在，是CH2、O、S、SO、SO2或NR13；
R1和R2各自独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基、任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基，或者R1和R2与它们所结合的碳原子组合形成C＝O，或者R1和R2组合形成任选取代的C3-C10碳环基或任选取代的C2-C9杂环基；并且
R3各自独立地是羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基，或者两个R8组合形成任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的C2-C9杂芳基。
108.如权利要求107所述的缀合物，其中所述呈递蛋白结合部分包括结构：
Figure FDA0002302535130000271
109.如权利要求102所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分是亲环蛋白结合部分。
110.如权利要求109所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分能够结合PP1A、CYPB、CYPC、CYP40、CYPE、CYPD、NKTR、SRCyp、CYPH、CWC27、CYPL1、CYP60、CYPJ、PPIL4、PPIL6、RANBP2或PPWD1。
111.如权利要求109或110所述的化合物，其中所述亲环蛋白结合部分是选择性亲环蛋白结合部分。
112.如权利要求109或110所述的化合物，其中所述亲环蛋白结合部分是非选择性亲环蛋白结合部分。
113.如权利要求109至112中任一项所述的化合物，其中所述亲环蛋白结合部分包括式III或IV的结构：
Figure FDA0002302535130000281
其中Z3、Z4、Z5和Z6各自独立地是羟基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6杂烷基，或者Z3和Z4或Z5和Z6与它们所连接的原子组合形成任选取代的10至40元大环；
Z3、Z4、Z5、Z6或R5中的至少一个包括与所述交联基团连接的点；
d是0、1、2、3或4；
R5是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；
R6是任选取代的C1-C6烷基；
R7各自独立地是羟基、氰基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基；并且
R8是氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、C3-C7碳环基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和任选取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。
114.如权利要求113所述的化合物，其中所述呈递蛋白结合部分包括结构：
Figure FDA0002302535130000291
115.如权利要求97至114中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白是GTP酶、GTP酶活化蛋白、鸟嘌呤核苷酸交换因子、热激蛋白、离子通道、卷曲螺旋蛋白、激酶、磷酸酶、泛素连接酶、转录因子、染色质改性剂/重塑剂或具有经典蛋白质-蛋白质相互作用结构域和基序的蛋白质。
116.如权利要求97至115中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白包括不可成药的表面。
117.如权利要求97至116中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白不具有传统的结合口袋。
118.如权利要求97至117中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白的氨基酸序列已被修饰以用反应性氨基酸取代至少一种天然氨基酸。
119.如权利要求118所述的缀合物，其中所述反应性氨基酸是天然氨基酸。
120.如权利要求119所述的缀合物，其中所述反应性氨基酸是半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。
121.如权利要求118所述的缀合物，其中所述反应性氨基酸是非天然氨基酸。
122.如权利要求97至121中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白的氨基酸序列已被修饰以用非反应性氨基酸取代至少一种天然反应性氨基酸。
123.如权利要求122所述的缀合物，其中所述至少一种天然反应性氨基酸是半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。
124.如权利要求122或123所述的缀合物，其中所述至少一种天然反应性氨基酸是暴露于溶剂的氨基酸。
125.如权利要求122至124中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白的氨基酸序列被修饰以用非反应性氨基酸取代所有反应性氨基酸。
126.如权利要求122至125中任一项所述的缀合物，其中所述非反应性氨基酸是天然氨基酸。
127.如权利要求118至126中任一项所述的缀合物，其中所述取代是保守取代。
128.如权利要求121至127中任一项所述的缀合物，其中所述反应性氨基酸被丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸取代。
129.如权利要求121至124中任一项所述的缀合物，其中所述非反应性氨基酸是非天然氨基酸。
130.如权利要求97至129中任一项所述的缀合物，其中所述呈递蛋白结合部分和所述靶蛋白通过接头缀合。
131.如权利要求130所述的缀合物，其中所述接头的长度为1至20个原子。
132.如权利要求130或131所述的缀合物，其中所述接头具有式III的结构：
A1-(B1)f-(C1)g-(B2)h-(D)-(B3)i-(C2)j-(B4)k-A2
式V
其中A1是所述接头与蛋白结合部分之间的键；A2是所述交联基团与所述接头之间的键；B1、B2、B3和B4各自独立地选自任选取代的C1-C2烷基、任选取代的C1-C3杂烷基、O、S和NRN；RN是氢、任选取代的C1-4烷基、任选取代的C2-4烯基、任选取代的C2-4炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C1-7杂烷基；C1和C2各自独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基或磷酰基；f、g、h、I、j和k各自独立地是0或1；并且D是任选取代的C1-10烷基、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C2-C10聚乙二醇或任选取代的C1-10杂烷基，或连接A1-(B1)f-(C1)g-(B2)h-与-(B3)i-(C2)j-(B4)k-A2的化学键。
133.如权利要求130至132中任一项所述的缀合物，其中所述接头包括式IV的结构：
其中A1是所述接头与蛋白结合部分之间的键；
A2是所述交联基团与所述接头之间的键；
l是0、1、2或3；
m是0或1；
n是0、1或2；并且
X3、X4和X5各自独立地不存在，是O、S、-C≡C-、CR9R10或NR11；并且R9、R10和R11各自独立地是氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、C3-C7碳环基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和任选取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。
134.如权利要求133所述的缀合物，其中所述接头包括结构：
Figure FDA0002302535130000322
135.一种产生包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物的方法，所述方法包括在允许产生所述缀合物的条件下使(a)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物与(b)靶蛋白反应。
136.一种产生包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物的方法，所述方法包括
提供(a)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物；(b)靶蛋白；和(c)呈递蛋白；以及
使所述化合物与所述靶蛋白在允许产生所述缀合物的条件下反应。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下与所述化合物结合。
138.如权利要求136所述的方法，其中所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下基本上不与所述化合物结合。
139.如权利要求136至138中任一项所述的方法，其中所述化合物与所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下基本上不反应。
140.如权利要求136至138中任一项所述的方法，其中所述化合物与所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下反应。
141.如权利要求135至140中任一项所述的方法，其中所述条件不包括还原剂。
142.一种复合物，其包含(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白。
143.如权利要求142所述的复合物，其中所述呈递蛋白是由表1的基因中的任一种编码的蛋白质。
144.如权利要求142所述的复合物，其中所述呈递蛋白是脯氨酰异构酶。
145.如权利要求142至144中任一项所述的复合物，其中所述脯氨酰异构酶是FKBP家族的成员、亲环蛋白家族的成员或PIN1。
146.如权利要求145所述的复合物，其中所述FKBP家族的所述成员是FKBP12、FKBP12.6、FKBP13、FKBP25、FKBP51或FKBP52。
147.如权利要求145所述的复合物，其中所述亲环蛋白家族的所述成员是PP1A、CYPB、CYPC、CYP40、CYPE、CYPD、NKTR、SRCyp、CYPH、CWC27、CYPL1、CYP60、CYPJ、PPIL4、PPIL6、RANBP2或PPWD1。
148.一种产生复合物的方法，所述复合物包含(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白，所述方法包括在允许产生所述复合物的条件下将包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物与呈递蛋白组合。
149.一种产生复合物的方法，所述复合物包含(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白，所述方法包括
提供(a)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物；(b)靶蛋白；和(c)呈递蛋白；以及
使所述化合物与所述靶蛋白在允许产生所述复合物的条件下反应。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下与所述化合物结合。
151.如权利要求149所述的方法，其中所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下基本上不与所述化合物结合。
152.如权利要求149至151中任一项所述的方法，其中所述化合物与所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下基本上不反应。
153.如权利要求149至151中任一项所述的方法，其中所述化合物与所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下反应。
154.如权利要求148至153中任一项所述的方法，其中所述条件不包括还原剂。
155.如权利要求148至154中任一项所述的方法，其中所述条件包括过量的呈递蛋白。
156.一种缀合物，其包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分。
157.如权利要求156所述的缀合物，其中所述缀合物的所述靶蛋白结合部分能够与靶蛋白非共价相互作用。
158.如权利要求156所述的缀合物，其中所述缀合物的所述靶蛋白结合部分能够与靶蛋白共价相互作用。
159.如权利要求156至158中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白是GTP酶、GTP酶活化蛋白、鸟嘌呤核苷酸交换因子、热激蛋白、离子通道、卷曲螺旋蛋白、激酶、磷酸酶、泛素连接酶、转录因子、染色质改性剂/重塑剂或具有经典蛋白质-蛋白质相互作用结构域和基序的蛋白质。
160.如权利要求156至159中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白包括不可成药的表面。
161.如权利要求156至160中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白不具有传统的结合口袋。
162.如权利要求156至161中任一项所述的缀合物，其中所述呈递蛋白是由表1的基因中的任一种编码的蛋白质。
163.如权利要求156至161中任一项所述的缀合物，其中所述呈递蛋白是脯氨酰异构酶。
164.如权利要求156至163中任一项所述的缀合物，其中所述呈递蛋白是FKBP家族的成员、亲环蛋白家族的成员或PIN1。
165.如权利要求164所述的缀合物，其中所述FKBP家族的所述成员是FKBP12、FKBP12.6、FKBP13、FKBP25、FKBP51或FKBP52。
166.如权利要求164所述的缀合物，其中所述亲环蛋白家族的所述成员是PP1A、CYPB、CYPC、CYP40、CYPE、CYPD、NKTR、SRCyp、CYPH、CWC27、CYPL1、CYP60、CYPJ、PPIL4、PPIL6、RANBP2或PPWD1。
167.如权利要求156至166中任一项所述的缀合物，其中所述呈递蛋白的氨基酸序列已被修饰以用反应性氨基酸取代至少一种氨基酸。
168.如权利要求167所述的缀合物，其中所述反应性氨基酸是天然氨基酸。
169.如权利要求168所述的缀合物，其中所述反应性氨基酸是半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。
170.如权利要求167所述的缀合物，其中所述反应性氨基酸是非天然氨基酸。
171.如权利要求156至170中任一项所述的缀合物，其中所述呈递蛋白的氨基酸序列已被修饰以用非反应性氨基酸取代至少一种天然反应性氨基酸。
172.如权利要求171所述的缀合物，其中所述至少一种天然反应性氨基酸是半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。
173.如权利要求171或172所述的缀合物，其中所述至少一种天然反应性氨基酸是暴露于溶剂的氨基酸。
174.如权利要求171至173中任一项所述的缀合物，其中所述呈递蛋白的氨基酸序列被修饰以用非反应性氨基酸取代所有反应性氨基酸。
175.如权利要求171至174中任一项所述的缀合物，其中所述非反应性氨基酸是天然氨基酸。
176.如权利要求167至175中任一项所述的缀合物，其中所述取代是保守取代。
177.如权利要求171至176中任一项所述的缀合物，其中所述反应性氨基酸被丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸取代。
178.如权利要求171至174中任一项所述的缀合物，其中所述非反应性氨基酸是非天然氨基酸。
179.如权利要求156至178中任一项所述的缀合物，其中所述靶蛋白结合部分和所述呈递蛋白通过接头连接。
180.如权利要求179所述的缀合物，其中所述接头的长度为1至20个原子。
181.如权利要求179或180所述的缀合物，其中所述接头具有式V的结构：
A1-(B1)f-(C1)g-(B2)h-(D)-(B3)i-(C2)j-(B4)k-A2
式V
其中A1是所述接头与蛋白结合部分之间的键；A2是所述交联基团与所述接头之间的键；B1、B2、B3和B4各自独立地选自任选取代的C1-C2烷基、任选取代的C1-C3杂烷基、O、S和NRN；RN是氢、任选取代的C1-4烷基、任选取代的C2-4烯基、任选取代的C2-4炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C1-7杂烷基；C1和C2各自独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基或磷酰基；f、g、h、I、j和k各自独立地是0或1；并且D是任选取代的C1-10烷基、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C2-C10聚乙二醇或任选取代的C1-10杂烷基，或连接A1-(B1)f-(C1)g-(B2)h-与-(B3)i-(C2)j-(B4)k-A2的化学键。
182.如权利要求179至181中任一项所述的缀合物，其中所述接头包括式IV的结构：
Figure FDA0002302535130000381
其中A1是所述接头与蛋白结合部分之间的键；
A2是所述交联基团与所述接头之间的键；
l是0、1、2或3；
m是0或1；
n是0、1或2；并且
X3、X4和X5各自独立地不存在，是O、S、-C≡C-、CR9R10或NR11；并且
R9、R10和R11各自独立地是氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、C3-C7碳环基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和任选取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。
183.如权利要求182所述的缀合物，其中所述接头包括结构：
184.一种产生包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物的方法，所述方法包括在允许产生所述缀合物的条件下使(a)包含靶蛋白结合部分和交联基团的化合物与(b)呈递蛋白反应。
185.一种产生包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物的方法，所述方法包括
提供(a)包含靶蛋白结合部分和交联基团的化合物；(b)呈递蛋白；和(c)靶蛋白；以及
使所述化合物与所述呈递蛋白在允许产生所述缀合物的条件下反应。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下与所述化合物结合。
187.如权利要求185所述的方法，其中所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下基本上不与所述化合物结合。
188.如权利要求185至187中任一项所述的方法，其中所述化合物与所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下基本上不反应。
189.如权利要求185至187中任一项所述的方法，其中所述化合物与所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下反应。
190.如权利要求184至189中任一项所述的方法，其中所述条件不包括还原剂。
191.一种复合物，其包含(i)包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物和(ii)靶蛋白。
192.如权利要求191所述的复合物，其中所述靶蛋白是GTP酶、GTP酶活化蛋白、鸟嘌呤核苷酸交换因子、热激蛋白、离子通道、卷曲螺旋蛋白、激酶、磷酸酶、泛素连接酶、转录因子、染色质改性剂/重塑剂或具有经典蛋白质-蛋白质相互作用结构域和基序的蛋白质。
193.如权利要求191或192所述的复合物，其中所述靶蛋白包括不可成药的表面。
194.如权利要求191至193中任一项所述的复合物，其中所述靶蛋白不具有传统的结合口袋。
195.一种产生复合物的方法，所述复合物包含(i)包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物和(ii)靶蛋白，所述方法包括在允许产生所述复合物的条件下将包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物与靶蛋白组合。
196.一种产生复合物的方法，所述复合物包含(i)包含与呈递蛋白缀合的靶蛋白结合部分的缀合物和(ii)靶蛋白，所述方法包括
提供(a)包含靶蛋白结合部分和交联基团的化合物；(b)呈递蛋白；和(c)靶蛋白；以及
使所述化合物与所述呈递蛋白在允许产生所述复合物的条件下反应。
197.如权利要求196所述的方法，其中所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下与所述化合物结合。
198.如权利要求196所述的方法，其中所述靶蛋白在不存在所述呈递蛋白的情况下基本上不与所述化合物结合。
199.如权利要求196至198中任一项所述的方法，其中所述化合物与所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下基本上不反应。
200.如权利要求196至198中任一项所述的方法，其中所述化合物与所述呈递蛋白在不存在所述靶蛋白的情况下反应。
201.如权利要求195至200中任一项所述的方法，其中所述条件不包括还原剂。
202.如权利要求196至201中任一项所述的方法，其中所述条件包括过量的靶蛋白。
203.一种化合物，其具有式VII的结构：
A-L-B
式VII
其中A包括式VIIIa或VIIIb的结构：
Figure FDA0002302535130000411
其中b和c独立地是0、1或2；
d是0、1、2、3、4、5、6或7；
X1和X2各自独立地不存在，是CH2、O、S、SO、SO2或NR13；
R1和R2各自独立地是氢、羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基、任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基，或者R1和R2与它们所结合的碳原子组合形成C＝O，或者R1和R2组合形成任选取代的C3-C10碳环基或任选取代的C2-C9杂环基；并且
R3各自独立地是羟基、任选取代的氨基、卤素、硫醇、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C2-C6杂烯基、任选取代的C2-C6杂炔基、任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂环基C1-C6烷基，或者两个R8组合形成任选取代的C3-C10碳环基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂芳基；并且
R4是任选取代的C1-C6烷基；
L是任选的接头；并且
B是靶蛋白结合部分。
204.如权利要求203所述的化合物，其中所述靶蛋白结合部分与靶蛋白之间的相互作用是非共价的。
205.如权利要求203所述的化合物，其中所述靶蛋白结合部分与靶蛋白之间的相互作用是共价的。
206.如权利要求203至205中任一项所述的化合物，其中所述靶蛋白是GTP酶、GTP酶活化蛋白、鸟嘌呤核苷酸交换因子、热激蛋白、离子通道、卷曲螺旋蛋白、激酶、磷酸酶、泛素连接酶、转录因子、染色质改性剂/重塑剂或具有经典蛋白质-蛋白质相互作用结构域和基序的蛋白质。
207.如权利要求203至206中任一项所述的化合物，其中所述靶蛋白包括不可成药的表面。
208.如权利要求203至207中任一项所述的化合物，其中所述靶蛋白不具有传统的结合口袋。
209.如权利要求203至208中任一项所述的化合物，其中A包括结构：
Figure FDA0002302535130000431
210.如权利要求203至209中任一项所述的化合物，其中所述靶蛋白结合部分与所述呈递蛋白通过接头缀合。
211.如权利要求210所述的化合物，其中所述接头的长度为1至20个原子。
212.如权利要求210或211所述的化合物，其中所述接头具有式V的结构：
A1-(B1)f-(C1)g-(B2)h-(D)-(B3)i-(C2)j-(B4)k-A2
式V
其中A1是所述接头与蛋白结合部分之间的键；A2是所述交联基团与所述接头之间的键；B1、B2、B3和B4各自独立地选自任选取代的C1-C2烷基、任选取代的C1-C3杂烷基、O、S和NRN；RN是氢、任选取代的C1-4烷基、任选取代的C2-4烯基、任选取代的C2-4炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基或任选取代的C1-7杂烷基；C1和C2各自独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基或磷酰基；f、g、h、I、j和k各自独立地是0或1；并且D是任选取代的C1-10烷基、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的C2-6杂环基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的C2-C10聚乙二醇或任选取代的C1-10杂烷基，或连接A1-(B1)f-(C1)g-(B2)h-与-(B3)i-(C2)j-(B4)k-A2的化学键。
213.如权利要求210至212中任一项所述的化合物，其中所述接头包括式IV的结构：
其中A1是所述接头与蛋白结合部分之间的键；
A2是所述交联基团与所述接头之间的键；
l是0、1、2或3；
m是0或1；
n是0、1或2；并且
X3、X4和X5各自独立地不存在，是O、S、-C≡C-、CR9R10或NR11；并且
R9、R10和R11各自独立地是氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、C3-C7碳环基、任选取代的C6-C10芳基C1-C6烷基和任选取代的C3-C7碳环基C1-C6烷基。
214.如权利要求213所述的化合物，其中所述接头包括结构：
Figure FDA0002302535130000451
215.一种复合物，其包含(i)如权利要求203所述的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白。
216.如权利要求215所述的复合物，其中所述靶蛋白是GTP酶、GTP酶活化蛋白、鸟嘌呤核苷酸交换因子、热激蛋白、离子通道、卷曲螺旋蛋白、激酶、磷酸酶、泛素连接酶、转录因子、染色质改性剂/重塑剂或具有经典蛋白质-蛋白质相互作用结构域和基序的蛋白质。
217.如权利要求215或216所述的复合物，其中所述靶蛋白包括不可成药的表面。
218.如权利要求215至217中任一项所述的复合物，其中所述靶蛋白不具有传统的结合口袋。
219.如权利要求215至218中任一项所述的复合物，其中所述呈递蛋白是由表1的基因中的任一种编码的蛋白。
220.如权利要求215至218中任一项所述的复合物，其中所述呈递蛋白是脯氨酰异构酶。
221.如权利要求215至220中任一项所述的化合物，其中所述呈递蛋白是FKBP家族的成员、亲环蛋白家族的成员或PIN1。
222.如权利要求221所述的化合物，其中所述FKBP家族的所述成员是FKBP12、FKBP12.6、FKBP13、FKBP25、FKBP51或FKBP52。
223.如权利要求221所述的复合物，其中所述亲环蛋白家族的所述成员是PP1A、CYPB、CYPC、CYP40、CYPE、CYPD、NKTR、SRCyp、CYPH、CWC27、CYPL1、CYP60、CYPJ、PPIL4、PPIL6、RANBP2或PPWD1。
224.一种鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物的方法，所述缀合物包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分，所述方法包括：
(a)提供(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；
(b)如果所述缀合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述缀合物与所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述缀合物与所述呈递蛋白是否形成复合物，
其中如果所述缀合物与所述呈递蛋白形成复合物，则将所述缀合物鉴定为能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物，
从而鉴定出能够与呈递蛋白形成复合物的包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物。
225.一种鉴定与呈递蛋白结合的靶蛋白的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；
(b)如果所述缀合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述缀合物与所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述靶蛋白是否与所述复合物中的所述呈递蛋白结合，
其中如果所述靶蛋白与所述呈递蛋白结合，则将所述靶蛋白鉴定为与所述呈递蛋白结合，
从而鉴定出与呈递蛋白结合的靶蛋白。
226.一种鉴定能够在存在呈递蛋白的情况下与化合物反应的靶蛋白的方法，其中所述化合物包含呈递蛋白结合部分和交联部分，所述方法包括：
(a)提供(i)包含呈递蛋白结合部分和交联部分的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；
(b)如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述靶蛋白与所述化合物在形成所述复合物期间是否反应形成缀合物，
其中如果所述靶蛋白与所述化合物在形成所述复合物期间反应形成缀合物，则将所述靶蛋白鉴定为能够在存在呈递蛋白的情况下与所述化合物反应的靶蛋白，
从而鉴定出能够在存在呈递蛋白的情况下与包含呈递蛋白结合部分和交联部分的化合物反应的靶蛋白。
227.一种鉴定与呈递蛋白结合的靶蛋白的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)包含呈递蛋白结合部分和交联部分的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；
(b如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述靶蛋白是否与所述复合物中的所述呈递蛋白结合，
其中如果所述靶蛋白与所述呈递蛋白结合，则将所述靶蛋白鉴定为与呈递蛋白结合的靶蛋白，
从而鉴定出与呈递蛋白结合的靶蛋白。
228.一种鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)如权利要求181所述的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；
(b)如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白是否形成复合物，
其中如果所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白形成复合物，则将所述靶蛋白鉴定为能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白，
从而鉴定出能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白。
229.一种鉴定与呈递蛋白结合的靶蛋白的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)如权利要求181所述的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；
(b)如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述靶蛋白是否与所述复合物中的所述呈递蛋白结合，
其中如果所述靶蛋白与所述呈递蛋白结合，则将所述靶蛋白鉴定为与呈递蛋白结合的靶蛋白
从而鉴定出与呈递蛋白结合的靶蛋白。
230.一种鉴定靶蛋白上与呈递蛋白结合部分形成缀合物的位置的方法，所述缀合物能够与呈递蛋白形成复合物，所述方法包括：
(a)提供(i)包含在一个位置处与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；
(b)如果所述缀合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述缀合物与所述呈递蛋白组合；
(c)确定所述缀合物与所述呈递蛋白是否形成复合物；以及
(d)重复步骤(a)至(c)，直至缀合物与所述呈递蛋白形成复合物，所述呈递蛋白结合部分在所述靶蛋白上的不同位置处缀合，
其中如果所述缀合物与所述呈递蛋白形成复合物，则鉴定出靶蛋白上与呈递蛋白结合部分形成缀合物的位置，所述缀合物能够与呈递蛋白形成复合物，
从而鉴定出靶蛋白上形成能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物的位置。
231.一种鉴定靶蛋白上与呈递蛋白结合部分形成缀合物的位置的方法，所述缀合物能够与呈递蛋白形成复合物，所述方法包括：
(a)提供(i)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；
(b)在允许形成包含在一个位置处与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物的条件下在存在所述呈递蛋白的情况下将所述化合物与所述靶蛋白组合；
(c)确定所述缀合物与所述呈递蛋白是否形成复合物；以及
(d)重复步骤(a)至(c)，直至缀合物与所述呈递蛋白形成复合物，其中所述呈递蛋白结合部分在所述靶蛋白上的不同位置处缀合；
其中如果所述缀合物与所述呈递蛋白形成复合物，则鉴定出靶蛋白上形成能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物的位置，
从而鉴定出靶蛋白上与呈递蛋白结合部分形成缀合物的位置，所述缀合物能够与呈递蛋白形成复合物。
232.如权利要求230或231所述的方法，其中所述靶蛋白的氨基酸序列已被修饰以用反应性氨基酸取代至少一种氨基酸。
233.如权利要求232所述的方法，其中所述反应性氨基酸是天然氨基酸。
234.如权利要求233所述的方法，其中所述反应性氨基酸是半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。
235.如权利要求232所述的方法，其中所述反应性氨基酸是非天然氨基酸。
236.如权利要求230至235中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白的氨基酸序列已被修饰以用非反应性氨基酸取代至少一种天然反应性氨基酸。
237.如权利要求236所述的方法，其中所述至少一种天然反应性氨基酸是半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。
238.如权利要求236或237所述的方法，其中所述至少一种天然反应性氨基酸是暴露于溶剂的氨基酸。
239.如权利要求236至238中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白的氨基酸序列被修饰以用非反应性氨基酸取代所有反应性氨基酸。
240.如权利要求236至239中任一项所述的方法，其中所述非反应性氨基酸是天然氨基酸。
241.如权利要求230至240中任一项所述的方法，其中所述取代是保守取代。
242.如权利要求232至241中任一项所述的方法，其中所述反应性氨基酸被丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸取代。
243.如权利要求232至242中任一项所述的方法，其中所述非反应性氨基酸是非天然氨基酸。
244.一种鉴定能够在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白共价结合的化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含(i)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白的样品；以及
(b)确定所述化合物与所述靶蛋白是否通过所述样品中所述化合物的所述交联基团形成共价键，
其中如果所述化合物与所述靶蛋白在所述样品中反应，则将化合物鉴定为在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白共价结合。
245.一种鉴定能够在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白选择性且共价结合的化合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含(i)包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白的第一样品和包含(i)与所述第一样品中相同的包含呈递蛋白结合部分和交联基团的化合物和(ii)与所述第一样品中相同的靶蛋白的第二样品；以及
(b)确定与所述第二样品相比，所述第一样品中所述化合物与所述靶蛋白的反应程度，
其中如果所述第一样品中所述化合物与所述靶蛋白的反应程度比所述第二样品中高，则将化合物鉴定为在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白选择性地共价结合。
246.如权利要求245所述的方法，其中如果所述第一样品中所述化合物与所述靶蛋白的反应程度是所述第二样品中的至少5倍，则将化合物鉴定为在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白选择性地共价结合。
247.如权利要求245或246所述的方法，其中如果所述第一样品中所述化合物与所述靶蛋白反应，但在所述第二样品中它们基本上没有反应，则将化合物鉴定为在存在呈递蛋白的情况下与靶蛋白选择性地共价结合。
248.一种鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；以及
(b)如果所述缀合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述缀合物与所述呈递蛋白组合；
(c)确定所述缀合物与所述呈递蛋白是否形成复合物，
其中如果所述缀合物与所述呈递蛋白形成复合物，则将缀合物鉴定为能够与呈递蛋白形成复合物，
从而鉴定出能够与呈递蛋白形成复合物的缀合物。
249.一种确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；
(b)如果所述缀合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述缀合物与所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述复合物的晶体结构，
其中所述界面的结构至少包括在所述呈递蛋白与所述靶蛋白之间的晶体结构的一部分，
从而确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构。
250.一种确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)包含呈递蛋白结合部分和交联部分的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；
(b)如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述复合物的晶体结构，
其中所述界面的结构至少包括在所述呈递蛋白与所述靶蛋白之间的晶体结构的一部分，
从而确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构。
251.一种确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)如权利要求203所述的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；
(b)如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述复合物的晶体结构，
其中所述界面的结构至少包括在所述呈递蛋白与所述靶蛋白之间的晶体结构的一部分；
从而确定包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中界面的结构。
252.如权利要求249至251中任一项所述的方法，其中包含呈递蛋白和靶蛋白的复合物中的所述界面是结合口袋。
253.一种获得复合物的X射线晶体坐标的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)包含与靶蛋白缀合的呈递蛋白结合部分的缀合物和(ii)呈递蛋白；
(b)如果所述缀合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述缀合物与所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述复合物的晶体结构，
从而获得所述复合物的X射线晶体坐标。
254.一种获得复合物的X射线晶体坐标的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)包含呈递蛋白结合部分和交联部分的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；
(b)如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述复合物的晶体结构，
从而获得所述复合物的X射线晶体坐标。
255.一种获得复合物的X射线晶体坐标的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)如权利要求203所述的化合物；(ii)靶蛋白；和(iii)呈递蛋白；
(b)如果所述化合物能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述化合物、所述靶蛋白和所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定所述复合物的晶体结构，
从而获得所述复合物的X射线晶体坐标。
256.一种确定靶蛋白上参与与呈递蛋白结合的残基的方法，所述方法包括：
(a)提供通过如权利要求253至255中任一项所述的方法获得的复合物的X射线晶体坐标；
(b)鉴定所述靶蛋白的残基，所述残基包含在所述呈递蛋白上的原子的
Figure FDA0002302535130000551
内的原子；
从而确定靶蛋白上参与与呈递蛋白结合的残基。
257.一种确定如权利要求142至147、191至194或215至223中任一项所述的复合物的生物化学和/或生物物理特性的方法，所述方法包括：
(a)提供通过如权利要求253至255中任一项所述的方法获得的如权利要求142至147、191至194或215至223中任一项所述的复合物的X射线晶体坐标；
(b)计算所述复合物的生物化学和/或生物物理特性；
从而确定呈递蛋白/靶蛋白复合物的生物化学和/或生物物理特性。
258.如权利要求257所述的方法，其中所述生物化学和/或生物物理特性包括所述复合物的结合自由能、所述复合物的Kd、所述复合物的Ki、所述复合物的Kinact和/或所述复合物的Ki/Kinact。
259.如权利要求258所述的方法，其中所述生物化学和/或生物物理特性包括所述复合物的结合自由能。
260.如权利要求259所述的方法，其中所述复合物的所述结合自由能通过等温滴定量热法确定。
261.如权利要求258所述的方法，其中所述生物化学和/或生物物理特性包括所述复合物的Kd。
262.如权利要求261所述的方法，其中所述复合物的所述Kd通过表面等离子体共振确定。
263.如权利要求258所述的方法，其中所述生物化学和/或生物物理特性包括所述复合物的Ki、所述复合物的Kinact和/或所述复合物的Ki/Kinact。
264.如权利要求263所述的方法，其中所述复合物的所述Ki、所述复合物的所述Kinact和/或所述复合物的所述Ki/Kinact通过质谱法确定。
265.一种组合物，其包含如权利要求1至98或203至214中任一项所述的化合物和合适的载体。
266.一种药物组合物，其包含如权利要求1至98或203至214中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
267.一种调节靶蛋白的方法，所述方法包括使所述靶蛋白与调节量的如权利要求1至98或203至214中任一项所述的化合物或如权利要求265或266所述的组合物接触。
268.一种调节靶蛋白的方法，所述方法包括通过使细胞与有效量的如权利要求1至98或203至214中任一项或如权利要求265或266所述的组合物接触在所述细胞中形成如权利要求142至147、191至194或215至223中任一项所述的复合物。
269.一种调节靶蛋白的方法，所述方法包括使所述靶蛋白与如权利要求155至183中任一项所述的缀合物接触。
270.一种抑制脯氨酰异构酶活性的方法，所述方法包括在允许在所述化合物与所述脯氨酰异构酶之间形成复合物的条件下使表达所述脯氨酰异构酶的细胞与如权利要求1至98或203至214中任一项所述的化合物或如权利要求265或266所述的组合物接触，从而抑制脯氨酰异构酶活性。
271.一种在细胞中形成如权利要求142至147、191至194或215至223中任一项所述的复合物的方法，所述方法包括使表达呈递蛋白的细胞与如权利要求1至98或203至214中任一项所述的化合物或如权利要求265或266所述的组合物在允许所述化合物与所述呈递蛋白之间形成复合物的条件下接触。
272.一种鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)一种或多种靶蛋白，(ii)如权利要求1至98中任一项所述的化合物；和(iii)包含标签的呈递蛋白；
(b)如果所述靶蛋白能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述一种或多种靶蛋白、所述化合物和所述呈递蛋白组合；以及
(c)确定一种或多种靶蛋白是否与所述化合物和所述呈递蛋白形成复合物；
其中与所述化合物和所述呈递蛋白形成复合物的靶蛋白被鉴定为能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白。
273.如权利要求272所述的方法，其中所述呈递蛋白包含亲和标签。
274.如权利要求272或273所述的方法，其中所述确定步骤包括利用所述呈递蛋白的所述标签选择性地分离已经与所述呈递蛋白形成复合物的靶蛋白。
275.如权利要求272至274中任一项所述的方法，其中所述方法还包括(d)鉴定在一种或多种靶蛋白与所述呈递蛋白之间形成的复合物中的所述靶蛋白。
276.如权利要求275所述的方法，其中所述鉴定所述靶蛋白的结构包括对所述复合物进行质谱法。
277.一种鉴定能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白的方法，所述方法包括：
(a)提供(i)两种或更多种靶蛋白；(ii)如权利要求1-98中任一项所述的化合物；和(iii)包含亲和标签的呈递蛋白；
(b)如果所述靶蛋白能够与所述呈递蛋白形成复合物，则在适合允许复合物形成的条件下将所述两种或更多种靶蛋白、所述化合物和所述呈递蛋白组合；
(c)选择性地分离步骤(b)中形成的靶蛋白、所述化合物和所述呈递蛋白的一种或多种复合物；以及
(d)通过质谱法确定步骤(c)中分离的所述一种或多种复合物中的所述靶蛋白的结构；
从而鉴定出能够与呈递蛋白形成复合物的靶蛋白。
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