CN110777179A - 一种发酵生产硫酸软骨素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产硫酸软骨素的方法,它是将硫酸软骨素生产菌种接种到生产培养基上,经过发酵培养,制得含有硫酸软骨素的发酵液;所述的生产培养基包含如下组分:碳源5‑35g/L,氮源1‑15g/L,玉米浆15‑35g/L,磷酸二氢钾5‑25g/L,磷酸氢二铵5‑25g/L,硫酸铵0.5‑2.5g/L,尿素2‑7g/L,微量元素0.5‑2g/L,氯化镁2‑10g/L,甘氨酸1‑5g/L,消泡剂0.2‑0.8g/L。在硫酸软骨素发酵培养过程中,按梯度策略补料,补料液是甘油、葡萄糖或者果糖溶液。该方法工艺技术稳定、产量高。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域,尤其是一种发酵生产硫酸软骨素的方法。
背景技术
硫酸软骨素,是一种广泛存在于动物组织的细胞外质和细胞表面的糖胺聚糖,作为治疗关节疾病的补充剂,与氨糖配合使用,具有止痛、促进软骨再生的功效,可以从根本上改善关节的问题。
我国是硫酸软骨素出口第一大国,目前主要采用酶解法或者碱提-酶解法从动物骨头中制备硫酸软骨素,污水产生较多,且由于动物骨资源的贫乏,以及特殊人群(素食人群或者宗教问题等)的需求,亟需寻找一种能够替代目前市场上产品的非动物源硫酸软骨素。尽管有多篇报道可以使用微生物发酵生产硫酸软骨素,但由于产量都在1g/L以下,不具备大规模生产的条件。
本发明通过改善发酵配方,优化发酵过程控制,达到高产硫酸软骨素的目的,具备大规模生产的条件。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵生产硫酸软骨素的方法,该方法工艺技术稳定、产量高。
本发明的技术方案是这样实现的:一种发酵生产硫酸软骨素的方法,它是将硫酸软骨素生产菌种接种到生产培养基上,经过发酵培养,制得含有硫酸软骨素的发酵液;其特征在于:所述的生产培养基包含如下组分:碳源5-35g/L,氮源1-15g/L,玉米浆15-35g/L,磷酸二氢钾5-25g/L,磷酸氢二铵5-25g/L,硫酸铵0.5-2.5g/L,尿素2-7g/L,微量元素0.5-2g/L,氯化镁2-10g/L,甘氨酸1-5g/L,消泡剂0.2-0.8g/L。
进一步,所述的生产培养基包含如下组分:碳源15-25g/L,氮源5-10g/L,玉米浆20-30g/L,磷酸二氢钾10-20g/L,磷酸氢二铵10-20g/L,硫酸铵1-2g/L,尿素3-6g/L,微量元素0.7-1.5g/L,氯化镁4-8g/L,甘氨酸2-4g/L,消泡剂0.25-0.6g/L。
进一步,所述的碳源包含甘油、葡萄糖、果糖中的一种或多种。
进一步,所述的氮源包含酵母粉、豆粕粉、大豆蛋白胨中的一种或多种。
进一步,所述的酵母粉优选啤酒酵母粉或者面包酵母粉。
进一步,所述的微量元素包含硫酸亚铁、钼酸钠、硫酸锰、维生素B1、维生素B2。
进一步,所述的微量元素包含硫酸亚铁0.1-0.3g/L、钼酸钠0.1-0.5g/L、硫酸锰0.1-0.3g/L、维生素B10.1-0.3g/L、维生素B20.1-0.5g/L。
进一步,在硫酸软骨素发酵培养过程中,培养温度为34-40℃,pH为6.5-8.5,发酵周期40-60小时。
进一步,上述发酵过程中pH的控制是通过氨水调节的。
进一步,在硫酸软骨素发酵培养过程中,按梯度策略补料,补料液是甘油、葡萄糖或者果糖溶液,浓度为50-75%(w/v);0-5小时,2-5g/L/h;5-15小时,3-6g/L/h;15-35小时,5-9g/L/h;35小时-放罐,6-12g/L/h。
进一步,上述补料策略中,“g/L/h”是指每小时每升发酵液补加料液的克数。
本发明和现有技术相比的优点为:
(1)硫酸软骨素作为多糖类产品,对碳源要求严格,本发明开发多种发酵碳源,为菌体生长提供多种选择。
(2)发酵液中,硫酸软骨素作为菌体结构一部分,需要提高菌体浓度来达到高产,本发明在氮源和微量元素方面的搭配优化,为高密度发酵提供营养条件。
(3)补料策略是影响大肠杆菌高密度发酵的关键因素,本发明在不同碳源的基础上,实现多梯度补料,在保证菌体生长必需的营养条件下,实现发酵液菌体高密度培养,从而达到硫酸软骨素高产的目的。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚,下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1:将硫酸软骨素菌种接种到如下培养基中,甘油5g/L,葡萄糖15g/L,酵母粉4g/L,大豆蛋白胨1.5g/L,玉米浆25g/L,磷酸二氢钾10g/L,磷酸氢二铵15g/L,硫酸铵0.5g/L,尿素5g/L,维生素B1 0.3g/L,钼酸钠0.3g/L,硫酸亚铁0.5g/L,硫酸锰0.1g/L,维生素B2 0.2g/L,氯化镁5g/L,甘氨酸1.5g/L,消泡剂0.4g/L,37℃培养,氨水控制pH在6.5-6.8,使用60%葡萄糖溶液补料,补料速率策略是0-5小时,3.5g/L/h;5-15小时,4.5g/L/h;15-35小时,6.5g/L/h,35小时-放罐,9.5g/L/h。发酵周期50小时,OD600值110,CE(毛细管电泳仪,下同)检测硫酸软骨素含量3.5g/L。
实施例2:将硫酸软骨素菌种接种例1的培养基中,37℃培养,氨水控制pH在7.5-8.0,使用60%甘油溶液补料,补料速率策略是0-5小时,2.5g/L/h;5-15小时,3.0g/L/h;15-35小时,6.8g/L/h,35小时-放罐,7.8g/L/h。发酵周期60小时,OD600值158,CE(毛细管电泳仪,下同)检测硫酸软骨素含量5.5g/L。
实施例3:将硫酸软骨素菌种接种到如下培养基中,甘油15g/L,果糖5g/L,酵母粉10g/L,豆粕粉5g/L,玉米浆10g/L,磷酸二氢钾5g/L,磷酸氢二铵5g/L,硫酸铵0.8g/L,尿素3g/L,维生素B1 0.2g/L,钼酸钠0.2g/L,硫酸亚铁0.2g/L,硫酸锰0.3g/L,维生素B2 0.5g/L,氯化镁3g/L,甘氨酸4g/L,消泡剂0.35g/L,39℃培养,氨水控制pH在7.0-7.5,使用60%甘油溶液补料,补料速率策略是0-5小时,2.5g/L/h;5-15小时,4.8g/L/h;15-35小时,6.8g/L/h,35小时-放罐,8.7g/L/h。发酵周期55小时,OD600值143,CE(毛细管电泳仪,下同)检测硫酸软骨素含量5.2g/L。
实施例4,:将硫酸软骨素菌种接种例3的培养基中,39℃培养,氨水控制pH在7.0-7.5,使用60%果糖溶液补料,补料速率策略是0-5小时,2.0g/L/h;5-15小时,3.0g/L/h;15-35小时,5.0g/L/h,35小时-放罐,6.0g/L/h。发酵周期48小时,OD600值138,CE(毛细管电泳仪,下同)检测硫酸软骨素含量4.8g/L。
实施例5:将硫酸软骨素菌种接种到如下培养基中,甘油35g/L,酵母粉2g/L,豆粕粉10g/L,玉米浆20g/L,磷酸二氢钾14g/L,磷酸氢二铵12g/L,硫酸铵0.8g/L,尿素2.5g/L,维生素B1 0.1g/L,钼酸钠0.15g/L,硫酸亚铁0.15g/L,硫酸锰0.15g/L,维生素B2 0.2g/L,氯化镁8g/L,甘氨酸2g/L,消泡剂0.25g/L,37℃培养,氨水控制pH在6.8-7.0,使用60%甘油溶液补料,补料速率策略是0-5小时,2.8g/L/h;5-15小时,4.3g/L/h;15-35小时,6.2g/L/h,35小时-放罐,11.3g/L/h。发酵周期57小时,OD600值174,CE(毛细管电泳仪,下同)检测硫酸软骨素含量6.4g/L。
实施例6:将硫酸软骨素菌种接种到如下培养基中,葡萄糖35g/L,酵母粉1.0g/L,豆粕粉12.5g/L,玉米浆25g/L,磷酸二氢钾12g/L,磷酸氢二铵6g/L,硫酸铵0.5g/L,尿素2.5g/L,维生素B1 0.1g/L,钼酸钠0.15g/L,硫酸亚铁0.15g/L,硫酸锰0.15g/L,维生素B20.2g/L,氯化镁8g/L,甘氨酸2g/L,消泡剂0.25g/L,37℃培养,氨水控制pH在6.8-7.0,使用60%葡萄糖溶液补料,补料速率策略是0-5小时,3.5g/L/h;5-15小时,5.3g/L/h;15-35小时,7.2g/L/h,35小时-放罐,9.3g/L/h。发酵周期49小时,OD600值152,CE(毛细管电泳仪,下同)检测硫酸软骨素含量5.3g/L。
Claims (10)
1.一种发酵生产硫酸软骨素的方法,它是将硫酸软骨素生产菌种接种到生产培养基上,经过发酵培养,制得含有硫酸软骨素的发酵液;其特征在于:所述的生产培养基包含如下组分:碳源5-35g/L,氮源1-15g/L,玉米浆15-35g/L,磷酸二氢钾5-25g/L,磷酸氢二铵5-25g/L,硫酸铵0.5-2.5g/L,尿素2-7g/L,微量元素0.5-2g/L,氯化镁2-10g/L,甘氨酸1-5g/L,消泡剂0.2-0.8g/L。
2.根据权利要求1所述的发酵生产硫酸软骨素的方法,其特征在于:所述的生产培养基包含如下组分:碳源15-25g/L,氮源5-10g/L,玉米浆20-30g/L,磷酸二氢钾10-20g/L,磷酸氢二铵10-20g/L,硫酸铵1-2g/L,尿素3-6g/L,微量元素0.7-1.5g/L,氯化镁4-8g/L,甘氨酸2-4g/L,消泡剂0.25-0.6g/L。
3.根据权利要求1所述的发酵生产硫酸软骨素的方法,其特征在于:所述的碳源包含甘油、葡萄糖、果糖中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的发酵生产硫酸软骨素的方法,其特征在于:所述的氮源包含酵母粉、豆粕粉、大豆蛋白胨中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的发酵生产硫酸软骨素的方法,其特征在于:所述的酵母粉优选啤酒酵母粉或者面包酵母粉。
6.根据权利要求4所述的发酵生产硫酸软骨素的方法,其特征在于:所述的微量元素包含硫酸亚铁、钼酸钠、硫酸锰、维生素B1、维生素B2。
7.根据权利要求6所述的发酵生产硫酸软骨素的方法,其特征在于:所述的微量元素包含硫酸亚铁0.1-0.3g/L、钼酸钠0.1-0.5g/L、硫酸锰0.1-0.3g/L、维生素B10.1-0.3g/L、维生素B20.1-0.5g/L。
8.根据权利要求7所述的发酵生产硫酸软骨素的方法,其特征在于:在硫酸软骨素发酵培养过程中,培养温度为34-40℃,pH为6.5-8.5,发酵周期40-60小时。
9.根据权利要求8所述的发酵生产硫酸软骨素的方法,其特征在于:上述发酵过程中pH的控制是通过氨水调节的。
10.根据权利要求7所述的发酵生产硫酸软骨素的方法,其特征在于:在硫酸软骨素发酵培养过程中,按梯度策略补料,补料液是甘油、葡萄糖或者果糖溶液,浓度为50-75%(w/v);0-5小时,2-5g/L/h;5-15小时,3-6g/L/h;15-35小时,5-9g/L/h;35小时-放罐,6-12g/L/h。
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