CN110759966A - caspase-3抑制剂及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了caspase‑3抑制剂及用途，包括两种分子形式：其核心功能区域分别为DMPD(天冬氨酸‑蛋氨酸‑脯氨酸‑天冬氨酸)和DMLD(天冬氨酸‑蛋氨酸‑亮氨酸‑天冬氨酸)多肽片段，两端分别进行化学修饰用以改善多肽的生物特性、活性及成药性。该抑制剂可直接与活性caspase‑3结合抑制其酶活性，有效抑制caspase‑3/PARP介导的细胞凋亡及凋亡性坏死、caspase‑3/GSDME介导的细胞焦亡。可用于制备抗细胞死亡相关工具分子或试剂、抗细胞死亡或组织器官坏死相关疾病的强效药物。

Description

caspase-3抑制剂及用途
技术领域
本发明涉及caspase-3抑制剂及用途。
背景技术
细胞死亡作为肝组织器官衰竭中的核心事件贯穿于整个肝组织衰竭发生发展的过程中，同时也是心肌梗死(Acute myocardial infarction and heart failure：Role ofapoptosis.Int J Biochem Cell B，2006.38，1834-1840)，慢性肾衰竭(Apoptosis inglomerular sclerosis.Kidney Int，1993.49，103-111)等多种疾病的共同病因。长期以来，由肝功能损伤后引起的凝血机制障碍、黄疸、肝性脑病和腹水等并发症导致的高病死率居高不下。目前，临床上针对肝衰竭的治疗手段包括抗病毒治疗(乙肝肝衰竭)(Antiviraltherapy for hepatitis B virus associated hepatic failure.Hepatob Pancreat Dis8，2009.17-24)，激素治疗(糖皮质激素)(Importance of adequate immunosuppressivetherapy for the recovery of patients with″life-threatening″severeexacerbation of chronic hepatitis B.World J Gastroenterol，2005.11，1109-1114)和干细胞移植(Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyteproliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli.Blood，2002.99，3838-3843)三大类，虽然以上治疗手段为肝衰竭治疗带来了希望，但是各型肝衰竭有其相对的病理学特征，而且缺少针对广泛肝细胞死亡这一共性特征的治疗方案。因此，针对肝细胞死亡的新型药物对于肝衰竭的预防和治疗意义重大。
最新的研究表明，caspase-3是凋亡、凋亡性坏死以及焦亡过程中一个非常关键的因素(Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of agasdermin.Nature 547，2017.99-103)，抑制其活性可显著抑制体内外细胞凋亡和焦亡。Caspase-3可通过剪切下游底物蛋白PARP和GSDME发挥诱导细胞凋亡和焦亡性坏死的作用。现有的Caspase-3抑制剂根据设计原理可分为肽类抑制剂和非肽类抑制剂。肽类抑制剂以Z-DEVD-FMK为代表，由caspase-3酶切PARP蛋白识别位点的特异性氨基酸序列设计而来，对烧伤、脓血症和脊髓伤害的治疗有一定效果(Discovery of novel aspartyl ketonedipeptides as potent and selective caspase-3 inhibitors.Bioorg Med Chem Lett，2004.14，805-808；J Clin Neurosci，2008.15，672-678)，缺点是具有抑制不可逆性同时会非特异性抑制其他半胱氨酸蛋白酶，而且膜通透性差，对细胞的效果不理想，从而限制了其在临床中的应用。近年来，非肽类caspase-3抑制剂的研究得到长足的发展，以喹啉类化合物为代表，该类抑制剂虽然抑制caspase-3的酶活性能力不如肽类抑制剂，但是具有更好的药代动力学参数，并且膜通透性好(Design and synthesis of new nonpeptide caspase-3 inhibitors.Pharmaceutical Chemistry Journal，2006.40，127-131)。从目前研究来看，虽然各类caspase-3抑制剂因为自身缺陷进入临床应用的比较少，但是随着细胞死亡途径的进一步清晰，药物设计手段的不断完善，对发现的先导化合物进行修饰，增加膜渗透性和代谢稳定性，减小细胞毒性，将会开发更多高效、低毒、体内外药代动力学和药效学参数更完美的新型caspase-3抑制剂用于治疗诸如肝衰竭、纤维化等疾病，以及用于研究与细胞凋亡和坏死有关疾病的机理。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供caspase-3抑制剂。
本发明另一目的是提供所述caspase-3抑制剂的用途。
技术方案：本发明提供一种caspase-3抑制剂，其核心功能区域为DMPD(天冬氨酸-蛋氨酸-脯氨酸-天冬氨酸)或者DMLD(天冬氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-天冬氨酸)多肽片段，两端分别进行修饰，化学结构如下：
Figure BDA0002284438870000021
其中，用于修饰的R1、R2相同或不同，R1、R2是用于修饰的基团等。
进一步地，所述两端分别进行乙酰化修饰(Ac)和CMK修饰(引入卤素C1)修饰，化学结构如下：
Figure BDA0002284438870000022
进一步地，所述caspase-3抑制剂与活性caspase-3片段在分子水平产生特异性、直接相互作用，抑制caspase-3的酶活性。
进一步地，其能够特异性抑制活性caspase-3的下游生物学效应，进而抑制细胞凋亡、凋亡性坏死以及焦亡。
进一步地，能够同时抑制caspase-3下游底物蛋白PARP以及GSDME的活化。
进一步地，对抗肿瘤药物诱发的细胞凋亡或坏死的抑制作用。
进一步地，对抗肿瘤药物诱发的HepG2细胞凋亡或坏死的抑制作用。
所述的caspase-3抑制剂在制备抗细胞死亡相关工具分子或试剂、抗细胞死亡或组织器官坏死相关疾病药物中的用途。
进一步地，所述细胞死亡或组织器官坏死相关疾病包括与细胞死亡相关的各类急性、慢性组织器官损伤或衰竭病症。
所述的caspase-3抑制剂在制备caspase-3抑制剂相关试剂及试剂盒中的用途。
本发明caspase-3抑制剂设计思路是：通过诱导细胞焦亡的效应蛋白GSDME的活化位点设计合成得到Ac-DMPD-CMK/Ac-DMLD-CMK等以DMPD(天冬氨酸-蛋氨酸-脯氨酸-天冬氨酸)或者DMLD(天冬氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-天冬氨酸)多肽片段为核心功能区域的、两端修饰的抑制剂，通过分子互作、底物酶活性检测、细胞水平抗肿瘤药物IC50计算、下游蛋白活化抑制率等手段发现新型caspase-3抑制剂表现出高效、特异、多靶点等优点，该新型抑制剂与经典的Z-DEVD-FMK相比较IC50效应强弱基本一致，同时为以焦亡效应蛋白为基础研究预防和治疗急性肝衰、纤维化疾病创新药物研究提供一定的理论依据和借鉴参考。
为此，本发明通过以下几方面进行研究：
所述caspase-3抑制剂与细胞内外活性caspase-3片段的相互作用/亲和力研究；caspase-3抑制剂对重组活性caspase-3蛋白IC50数值的确证；caspase-3抑制剂对重组活性caspase-3蛋白剪切下游PARP/GSDME的影响；caspase-3抑制剂对抗肿瘤药物诱发的HepG2细胞凋亡/坏死的抑制作用；caspase-3抑制剂对抗肿瘤药物诱发的HepG2细胞内PARP/GSDME蛋白活化的影响。
具体研究方法如下：
所述caspase-3抑制剂与细胞内外活性caspase-3片段的相互作用/亲和力研究分别采用物理学方法MST微热泳动法和生物素-亲和磁珠系统pull-down相结合确证二者之间的相互作用以及亲和力常数Kd值。
所述caspase-3抑制剂对重组活性caspase-3蛋白IC50数值的确证采用浓度梯度抑制剂与重组活性caspase-3蛋白预孵育2小时后再加入荧光底物Ac-DMPD/DMLD-AMC温敷后在Ex 365nm，Em 450nm激发波长下检测荧光数值，以相对活性为纵坐标(％)，log(底物浓度)为横坐标做出抑制曲线并计算IC50值(Graphpad prism 6.0)。
所述caspase-3抑制剂对重组活性caspase-3蛋白剪切下游PARP/GSDME的影响采用抑制剂与重组活性caspase-3蛋白预孵育2小时后再加入等蛋白量HepG2细胞裂解液温敷1小时后煮沸变性，使用western blot分析PARP/GSDME蛋白的活化情况。
所述caspase-3抑制剂对抗肿瘤药物诱发的HepG2细胞凋亡/坏死的抑制作用采用抑制剂预给细胞2小时再给予抗肿瘤药物ActD/TNFα和CHX/TNFα造细胞凋亡/坏死模型，利用培养上清中乳酸脱氢酶释放量为检测指标计算IC50值。
所述caspase-3抑制剂对抗肿瘤药物诱发的HepG2细胞凋亡/坏死的抑制作用采用抑制剂预给细胞2小时再给予抗肿瘤药物ActD/TNFα和CHX/TNFα造细胞凋亡/坏死模型，利用BD Annexin V-FITC/PI双染试剂盒配合BD Accuri C6 plus小型个人流式细胞仪检测细胞凋亡/坏死率。
所述caspase-3抑制剂对抗肿瘤药物诱发的HepG2细胞内PARP/GSDME蛋白活化的影响采用用抑制剂预给细胞2小时再给予抗肿瘤药物ActD/TNFα和CHX/TNFα造细胞凋亡/坏死模型，利用western blot分析细胞内PARP/GSDME蛋白的活化情况。
有益效果：本发明公开了特异性抑制caspase-3的新型化合物，并首次公开了基于GSDME蛋白与caspase-3结合活化的多肽序列通过两端修饰后合成得Ac-DMPD/DMLD-CMK抑制剂，该抑制剂通过与caspase-3活性结构域竞争性结合进而抑制下游PARP/GSDME蛋白的活化，最终对抗由这两个效应蛋白所引起的细胞凋亡/焦亡，从而能够为MSOF引起的疾病如肝损伤/纤维化等创新药物研发提供分子理论基础与实际指导。特别地，其应用价值在于，基于细胞凋亡/坏死/焦亡在肝损伤纤维化中的重要作用，能够对抗由这一大类细胞死亡所诱发的急性肝衰/肝纤维化等疾病恶化进程，从而能够为临床上这类难治性肝损伤疾病提供新的治疗选择和分子理论基础，也为新型针对细胞焦亡所进行的药物研发提供指导。
附图说明
图1：利用微热泳动法(MST)研究三种抑制剂与重组活性caspase-3/4蛋白的相互作用的结果图；
图2：生物素化DMPD/DMLD与细胞内活性caspase-3/4pull-down实验结果图；
图3：由AMC修饰的DMPD/DMLD底物分子与重组人活性caspase-3蛋白温敷实验结果图；
图4：Ac-DMPD-CMK对重组人活性caspase-3蛋白抑制作用(IC50)实验结果图；
图5：Ac-DMLD-CMK对重组人活性caspase-3蛋白抑制作用(IC50)实验结果图；
图6：Ac-DMPD-CMK对重组人活性caspase-4蛋白抑制作用实验结果图；
图7：Ac-DMLD-CMK对重组人活性caspase-4蛋白抑制作用实验结果图；
图8：三种抑制剂抑制重组人活性caspase-3蛋白剪切HepG2细胞裂解液中下游PARP和GSDME蛋白实验结果图；
图9：Ac-DMPD-CMK对TNFα/ActD诱导的HepG2细胞死亡率抑制作用(IC50)实验结果图；
图10：Ac-DMLD-CMK对TNFα/ActD诱导的HepG2细胞死亡率抑制作用(IC50)实验结果图；
图11：Ac-DMPD-CMK对TNFα/CHX诱导的HepG2细胞死亡率抑制作用(IC50)实验结果图；
图12：Ac-DMLD-CMK对TNFα/CHX诱导的HepG2细胞死亡率抑制作用(IC50)实验结果图；
图13：三种抑制剂对TNFα/CHX或TNFα/ActD所诱导的HepG2细胞中下游PARP和GSDME蛋白活化抑制作用实验结果图；
图14：三种抑制剂对TNFα/CHX或TNFα/ActD所诱导的HepG2细胞死亡率的影响实验结果图。
具体实施方式
实施例1
Ac-DMPD/DMLD-CMK分子结构式(982478/982479，中肽生化有限公司)。MST仪器(NanoTemper，Germany)检测具体步骤为：抑制剂浓度梯度设为：0.8，1.6，3.2，6.25，12.5，25，50，100，200μM，使用PBS稀释至以上浓度梯度后备用。稀释融合GFP的caspase-3(南京晶麦生物科技有限公司)活性蛋白至合适的浓度，以微热泳动仪检测信号为200-600峰强度为宜，稀释备用，以caspase-4/11-GFP重组蛋白(南京德泰生物科技有限公司)作为对照，观察抑制剂与caspase-3的相互作用是否特异。各浓度抑制剂与蛋白按1∶1比例(4+4μl)混匀10min后上机检测，选择蓝光为激发条件，设置好激发参数(20％-50％)，输入浓度梯度数值与稀释后蛋白浓度值，检测结束后绘制拟合曲线测定解离常数Kd值。根据拟合曲线确定是否需要调整小分子的浓度，以绘制出完整平滑的相互作用力曲线为宜。根据仪器处理软件所示Kd值判断Ac-DMPD/DMLD-CMK与活性caspase-3蛋白有很强的相互作用力，解离常数分别为1.62 x 10-6和6.48 x 10-6 M-1而与caspase-4并无明显相互作用(图1)
生物素-亲和磁珠验证核心多肽与caspase-3之间的相互作用。Biotin-DMPD/DMLD分子结构式(982482/982483，中肽生化有限公司)，
Figure BDA0002284438870000061
具体步骤为：NP-40裂解处理后的HepG2细胞使蛋白总量为1mg，浓度调为1mg/ml。组别设定：biotin(200μM)，Biotin-C6-DMPD/DMLD(200μM)，caspase-3激活处理组包含三个组别：Vehicle，ActD(HY17559，MCE)/TNFα(300-01A，Peprotech)和CHX(24839，MCE)/TNFα，caspase-4激活组包含两个组别：Vehicle，Fugene HD(E231A，Promega)/LPS(E.coli(o111：B4)，Sigma)，每组与1mg蛋白液混合，在轻旋的情况下室温孵育8h。
亲和磁珠(65001，Invitrogen)准备：
(1)涡旋管中beads＞30s；
(2)吸取一定量的beads至新的EP管中(根据容量计算吸取100μl)；
(3)向管中加入等量的washing buffer(PBST)并重悬；
(4)将EP管放入磁力架中1min后去除上清；
(5)取出EP管并向管中加入与初始取用量等量的washing buffer，重复步骤4、5，总计洗3次；
(6)使用适量细胞裂解液重悬beads备用。
亲和磁珠捕捉蛋白：
(1)加入已准备好的亲和磁珠，在轻旋的情况下室温孵育6h；
(2)利用磁力架以及细胞裂解液反复洗3次；
(3)最终向磁珠加入50-100μl NP40(预混1 x loading buffer)，沸水浴10min；
(4)SDS-PAGE胶，跑caspase-3与caspase-4蛋白，比较核心多肽与两种caspase亲和力的差异。
SDS-PAGE具体方案为：
制胶(10％)，上样；
电泳(两阶段：一.75V，45min；二.110V，1h 15min；可根据电泳实际情况调整参数)；
半干转印：海绵垫先置于转膜液中浸泡5min。电泳完毕后，根据分子量切胶，一般内参GAPDH为36kDa，而GSDME为50和30，PARP为116和89kDa。PVDF膜先甲醇后超纯水活化之后置于bottom海绵上，将胶转至膜上，赶气泡。将top海绵盖在胶上，锁上盒子，置于半干转机器中，一般恒压25V，30min。转膜完毕后，取下膜，看是否转上，转好的膜置于5％的牛奶或BSA中37℃封闭一小时(牛奶预先配好，并且开口超声15min)。
敷一抗：所使用抗体信息如下，包含蛋白名称，货号，稀释比以及生产厂家：GAPDH(ab181602，1/10000，Abcam)，caspase-3(9662S，1/1000，Cell Signal Techology)，caspase-4(sc-56056，1/200，Santa Cruz)，敷好后，4℃摇床过夜。
敷二抗：根据相应一抗种属选择二抗种类，一般使用3％BSA配制。二抗敷上37℃摇一小时后洗膜，最后一遍用超纯水洗。
曝光：机器一般要预热30min，显影液按1∶1进行配制，量以覆盖整条膜为宜，注意避光。
图2结果显示，抗肿瘤药物刺激后，DMPD/DMLD核心片段借助生物素-亲和磁珠系统能够将活性caspase-3片段从胞浆中pull-down出来，而利用Fugene HD转染试剂转染LPS进入胞浆以激活caspase-4蛋白后并不能pull-down出活性caspase-4片段，从而显示出该母核结合caspase-3活化区域的特异性。
以DMPD/DMLD为基础而成的荧光底物Ac-DMPD/DMLD-AMC(982480/982481，中肽生化有限公司)，分子式如下：
Figure BDA0002284438870000071
底物浓度梯度设为0，1.6，3.2，6.25，12.5，25，50，100，200μM，活性caspase-3(ab52101，Abcam)用量为1 unit，温敷体系构成为：50mM HEPES(pH7.5)，150mM NaCl，3mMEDTA and 0.005％(v/v)Tween-20and 10mM DTT.100μl反应体系中加入1 unit caspase-3蛋白，摇匀再分别加入浓度梯度的底物，37℃反应30min后，利用荧光酶标仪在Ex 365nm，Em450nm处检测荧光值，以相对活性倍数为纵坐标，底物浓度为横坐标，结果如图3所示，二者呈现出线性相关性，符合酶促反应一级反应速率特征，由此也可以看出DMPD/DMLD母核是与caspase-3活性片段结合的关键分子。
实施例2
抑制剂浓度梯度设为1.5，3.125，6.25，12.5，25，50，100μM，活性caspase-3用量为1unit，温敷体系构成为：50mM HEPES(pH7.5)，150mM NaCl，3mM EDTA and 0.005％(v/v)Tween-20 and 10mM DTT.100μl反应体系中加入1unit caspase-3/4蛋白，摇匀再分别加入浓度梯度的抑制剂室温孵育2h后再加入200μM相应的底物，其中caspase-3蛋白使用Ac-DMPD/DMLD-AMC为底物，而caspase-4(1084，Biovision)使用Ac-LEVD-pNA(1110，Biovision)为显色底物，37℃反应30min后，利用荧光酶标仪在Ex 365nm，Em 450nm处检测caspase-3活性荧光值，在吸收光405nm波长处检测caspase-4的活性。利用Graphpad prism6.0软件中非线性拟合模式下log(抑制剂浓度)vs酶活比例(％)求得IC50值与相应的抑制曲线。图4与图5结果显示Ac-DMPD/DMLD-CMK抑制caspase-3蛋白活性的IC50分别为4.306μM和7.977μM，呈现出强抑制作用。图6与图7结果显示浓度梯度抑制剂对caspase-4的活性并无显著性影响，即使是在高浓度也没有明显抑制作用。以上结果表明Ac-DMPD/DMLD-CMK对caspase-3的抑制作用具有高效性和特异性。
为了研究抑制剂对caspase-3剪切活化下游PARP/GSDME蛋白的影响，抑制剂浓度选择20μM，以Z-DEVD-FMK(HY-12466，MCE)为对照，活性caspase-3用量为1 unit，温敷体系构成为：50mM HEPES(pH7.5)，150mM NaCl，3mM EDTA and 0.005％(v/v)Tween-20 and10mM DTT.50μl反应体系中加入1 unit caspase-3蛋白，摇匀后再加入20μM抑制剂室温孵育2h后，与50μl含200μg总蛋白量的HepG2细胞裂解液混匀，37℃反应1h后，煮沸变性，利用SDS-PAGE检测PARP和GSDME的活化情况，GSDME抗体(ab215191，Abcam)，PARP抗体(9532S，Cell Signal Techology)。图8结果显示，Ac-DMPD/DMLD-CMK以及Z-DEVD-FMK都具有抑制PARP/GSDME蛋白活化的作用，而且三者的抑制效能相近，表明三种抑制剂的作用区域可能十分接近，从而产生了相类似的抑制效果。
实施例3
HepG2(ATCC，HB-8065)细胞水平验证抑制剂效能
首先确定抗肿瘤药物的剂量与作用时间，发现在70-80％细胞汇合度的情况下，预给10μg/ml放线菌酮CHX或者400nM放线菌素D ActD半小时后，再协同给予20ng/ml TNFα持续16h后细胞出现大量坏死，8h后caspase-3，PARP和GSDME蛋白明显活化。以此为基础，设定抑制剂浓度梯度为3.125，6.25，12.5，25，50，100，200μM，预给HepG2细胞浓度梯度抑制剂2h后，协同预给10μg/ml CHX或者400nM ActD0.5h，最终再协同给予20ng/ml TNFα持续16h，使用乳酸脱氢酶检测试剂盒(C0017，碧云天生物科技有限公司)检测细胞培养上清中的乳酸脱氢酶释放量，具体操作步骤为：
(1)到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。
(2)到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。
(3)LDH检测工作液的配置：根据待测定的样品数(含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。注意：LDH检测工作液必须现配现用，配制和使用过程中均要注意适当避光。单孔工作液配制需20μl乳酸溶液，20μl 1xINT溶液，20μl酶溶液，总体积60μl，根据所需孔数计算单一试剂所需用量并提前混匀备用。
(4)样品测定：a.各孔分别加入60μl LDH检测工作液；b.混匀，室温(约25℃)避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定；c.计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)；d.细胞毒性或死亡率(％)＝(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100；e.可绘制细胞毒性IC50曲线：利用Graphpad prism 6.0软件中非线性拟合模式下log(抑制剂浓度)vs乳酸脱氢酶LDH释放百分比(％)求得IC50值与相应的抑制曲线。图9-12结果显示Ac-DMPD/DMLD-CMK均对两种抗肿瘤药物所诱发的HepG2细胞死亡有浓度依赖性的抑制作用，IC50值如图所示，在细胞水平呈现强抑制作用。
为了研究抑制剂对抗肿瘤药物所诱发的HepG2细胞内caspase-3剪切活化下游PARP/GSDME蛋白的影响，抑制剂浓度选择40μM，以Z-DEVD-FMK为对照，预给HepG2细胞抑制剂2h后，协同预给10μg/ml CHX或者400nM ActD 0.5h，最终再协同给予20ng/ml TNFα持续8h，收集细胞后，使用RIPA裂解液裂解细胞0.5h后超声破碎细胞，13000g离心10min后转移上清至新的EP管中，BCA法确定蛋白浓度后，蛋白裂解液稀释4 x loading buffer至1 x，煮沸变性后准备做SDS-PAGE电泳。图13电泳结果表明，Ac-DMPD/DMLD-CMK以及Z-DEVD-FMK都具有抑制ActD/CHX协同TNFα刺激下HepG2细胞内PARP/GSDME蛋白活化的作用，而且三者的抑制效能相近。
为了研究抑制剂对抗肿瘤药物所诱发的细胞凋亡/坏死的抑制率，抑制剂浓度选择40μM，以Z-DEVD-FMK为对照，预给HepG2细胞抑制剂2h后，协同预给10μg/ml CHX或者400nM ActD 0.5h，最终再协同给予20ng/ml TNF α持续16h。使用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(BD Biosciences)处理细胞，具体步骤为：
(1)弃去含药培养基，每孔加800μl无EDTA的0.25％胰酶消化细胞5分钟，适当轻轻吹打，显微镜下观察细胞悬浮后用300μl/孔10％DMEM终止消化；
(2)离心，1000rpm，5min，弃上清，用1ml无菌PBS润洗，1000rpm，5min收集细胞；
(3)弃上清，每孔加200μl含2.5μl Annexin V-FITC和2.5μl PI染液的1x的binding buffer重悬细胞，避光冰上放置15min待上机检测。
图14结果表明，Ac-DMPD/DMLD-CMK以及Z-DEVD-FMK都具有抑制ActD/CHX协同TNFα诱导HepG2细胞死亡的作用，包括细胞凋亡率和坏死率都显著下降，且三种抑制剂效能基本一致，从而表明抑制剂对细胞坏死模式的抑制作用十分显著。
以上实验结果表明，Ac-DMPD/DMLD-CMK通过核心片段DMPD/DMLD竞争性结合caspase-3活性区域，而与其他caspase如caspase-4并无相互作用。一旦占据活性位点后，会抑制caspase-3活化自身下游底物包括Ac-DMPD/DMLD-AMC以及凋亡执行蛋白PARP和焦亡/坏死执行蛋白GSDME。执行蛋白活化受到抑制后，抗肿瘤药物所诱发的HepG2细胞凋亡和坏死率也受到影响，细胞死亡率大幅降低。对比研究已有的caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK发现新型抑制剂的效能与之相比基本一致，三者同时表现出强抑制性。

Claims (10)

1.一种caspase-3抑制剂，其特征在于：其核心功能区域为DMPD(天冬氨酸-蛋氨酸-脯氨酸-天冬氨酸)或者DMLD(天冬氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-天冬氨酸)多肽片段，两端分别进行修饰，化学结构如下：
Figure FDA0002284438860000011
其中，用于修饰的R1、R2相同或不同。
2.根据权利要求1所述的caspase-3抑制剂，其特征在于：所述两端分别进行乙酰化修饰(Ac)和CMK修饰(引入卤素Cl)修饰，化学结构如下：
Figure FDA0002284438860000012
3.根据权利要求1或2所述的caspase-3抑制剂，其特征在于：所述caspase-3抑制剂与活性caspase-3片段在分子水平产生特异性、直接相互作用，抑制caspase-3的酶活性。
4.根据权利要求1或2所述的caspase-3抑制剂，其特征在于：其能够特异性抑制活性caspase-3的下游生物学效应，进而抑制细胞凋亡、凋亡性坏死以及焦亡。
5.根据权利要求4所述的caspase-3抑制剂，其特征在于：能够同时抑制caspase-3下游底物蛋白PARP以及GSDME的活化。
6.根据权利要求1所述的caspase-3抑制剂，其特征在于：对抗肿瘤药物诱发的细胞凋亡或坏死的抑制作用。
7.根据权利要求6所述的caspase-3抑制剂，其特征在于：对抗肿瘤药物诱发的HepG2细胞凋亡或坏死的抑制作用。
8.权利要求1所述的caspase-3抑制剂在制备抗细胞死亡相关工具分子或试剂、抗细胞死亡或组织器官坏死相关疾病药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，所述细胞死亡或组织器官坏死相关疾病包括与细胞死亡相关的各类急性、慢性组织器官损伤或衰竭病症。
10.权利要求1所述的caspase-3抑制剂在制备caspase-3抑制剂相关试剂及试剂盒中的用途。
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