CN110742818A

CN110742818A - 一种抗紫外线损伤的辅酶q10脂质体的制备方法

Info

Publication number: CN110742818A
Application number: CN201910876853.4A
Authority: CN
Inventors: 吴铁; 唐林志; 吴海游; 吕思敏; 于琼
Original assignee: GUANGDONG RUNHE BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Guangdong Medical University
Current assignee: GUANGDONG RUNHE BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Guangdong Medical University
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2020-02-04

Abstract

本发明公开了一种抗紫外线损伤的辅酶Q10脂质体的制备方法，属于辅酶Q10脂质体制备技术领域。本发明的制备方法为将辅酶Q10、硫辛酸、大豆卵磷脂、胆固醇、无水乙醇和吐温80混合后加热溶解得油相；将三乙醇胺加蒸馏水溶解后加热保温得水相；将水相于恒温磁力搅拌器上加热搅拌，快速注入油相，即得辅酶Q10脂质体颗粒。本发明制备得到的辅酶Q10脂质体包封率高，大小均匀，成球状；动物实验结果显示辅酶Q10脂质体具有抗小鼠皮肤紫外线损伤的作用；辅酶Q10脂质体可以作为供外用的护肤膏霜，如润肤霜，晚霜，防晒霜。

Description

一种抗紫外线损伤的辅酶Q10脂质体的制备方法

技术领域

本发明涉及辅酶Q10脂质体制备技术领域，更具体的说是涉及一种抗紫外线损伤的辅酶Q10脂质体的制备方法。

背景技术

辅酶Q10是一种脂溶性抗氧化剂，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能。辅酶Q10在体内主要有两个作用，一是营养物质在线粒体内转化为能量的过程中起重要的作用，二是有明显的抗脂质过氧化作用。它是细胞线粒体中的能量转换剂，它通过转移和传递电子参与“三羧酸循环”产生ATP(三磷酸腺苷)，即能量因子供细胞代谢使用。

皱纹的增加、皮肤的老化与辅酶Q10含量有关，辅酶Q10含量越低，皮肤越易老化，面部的皱纹也越多。辅酶Q10可以通过口服来摄取，也可以涂擦含有辅酶Q10的护肤品，增加细胞对辅酶Q10的吸收，从而减少皱纹的形成。由于细胞中含足够辅酶Q10，即能量代谢会有所增强，清除自由基，缓解皱纹加重。

随着年龄的增加，皮肤胶原蛋白抵御紫外线等氧化刺激物损伤的能力下降，而长期使用辅酶Q10能够有效防止皮肤光衰老，减少眼部周围的皱纹，由于辅酶Q10渗透进入皮肤生长层可以减弱光子的氧化反应，在生育醇的协助下可以启动特异性的磷酸化酪氨酸激酶，防止DNA的氧化损伤，抑制紫外光照射下人皮肤成纤维母细胞胶原蛋白酶的表达，保护皮肤免于损伤。广泛的研究认为辅酶Q10抑制脂质过氧化反应，减少自由基的生成，保护SOD活性中心及其结构免受自由基氧化损伤，提高体内SOD等酶活性，抑制氧化应激反应诱导的细胞凋亡，具有显著的抗氧化、延缓衰老的作用。

辅酶Q10是一种泛醌，其分子量达到863.36，单独穿透皮肤表皮层的难度较大；且脂质体的制备受到多种因素的干扰，其中包括：投药量百分比、水相pH值、卵磷脂百分比、温度等。

因此，如何将辅酶Q10“运输”进皮肤，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种抗紫外线损伤的辅酶Q10脂质体的制备方法，辅酶Q10脂质体是一种油相包裹辅酶Q10的制剂，从而将辅酶Q10“运输”进皮肤，进而使辅酶Q10透过皮肤发挥抗紫外线损伤作用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗紫外线损伤的辅酶Q10脂质体的制备方法，具体步骤如下：

(1)制备油相：将辅酶Q100.5-1.5％、硫辛酸0.45％、大豆卵磷脂1.3-1.9％、胆固醇0.33％、无水乙醇7％和吐温801.5％，混合加热溶解，制备得到油相；所述百分比为占辅酶Q10脂质体的质量百分比；

(2)制备水相：将三乙醇胺加蒸馏水溶解，使pH达到7.7-8.1，得水相；

(3)制备辅酶Q10脂质体：将步骤(2)制备得到的水相加热搅拌，快速注入步骤(1)制备的油相，获得辅酶Q10脂质体颗粒，所述水相占辅酶Q10脂质体的质量百分比为87.32-88.92％。

进一步，步骤(1)制备油相：将辅酶Q100.9％、硫辛酸0.45％、大豆卵磷脂1.3％、胆固醇0.33％、无水乙醇7％和吐温801.5％，混合加热溶解，制备得到油相；所述百分比为占辅酶Q10脂质体的质量百分比。

进一步，步骤(1)制备油相所述混合加热溶解的条件为在50-60℃水浴条件下搅拌20min，使油相物质充分溶解。

进一步，步骤(3)制备辅酶Q10脂质体的具体步骤如下：将步骤(2)制备得到的水相在恒温磁力搅拌器上加热搅拌30min，转速为1000r/min，温度为50-60℃，作为水相，用注射器将步骤(1)制备的油相快速注入搅拌中的水相，油相被大量的水相稀释，油相在水相中不溶从而迅速形成小的脂质体颗粒，继续搅拌30min，获得辅酶Q10脂质体颗粒，40℃保存。

脂质体的生物学定义:当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，称为脂质体。药剂学定义为脂质体系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。脂质体是一种人工膜，在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。

脂质体是由卵磷脂和神经酰胺等制得的空心体，具有的双分子层结构与皮肤细胞膜结构相同，是一种很好的穿透皮肤运输载体。本发明采用脂质体作为运输载体，辅酶Q10脂质体是一种油相包裹辅酶Q10的制剂，可以快速地将辅酶Q10“运输”进皮肤。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种抗紫外线损伤的辅酶Q10脂质体的制备方法，辅酶Q10脂质体包封率高，大小均匀，成球状；动物实验结果显示辅酶Q10脂质体具有抗小鼠皮肤紫外线损伤的作用。本发明制备的辅酶Q10脂质体可以作为供外用的护肤膏霜，如润肤霜，晚霜，防晒霜等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明辅酶Q10脂质体在电镜下拍摄的图片；

其中，A为在30000倍电镜下拍摄(比例尺为1μm)；B为在80000倍电镜下拍摄(比例尺为500nm)；C为在200000倍电镜下拍摄(比例尺为200nm)；

图2附图为本发明实验期间各组小鼠体重变化；

图3附图为本发明各组小鼠皮肤组织病理切片染色；

图4附图为本发明各组小鼠皮肤组织基质金属蛋白酶相对表达量；与MOL组比较，*：P<0.05；

图2-图4中，CON，正常组；MOL，模型组；COQ，辅酶Q10脂质体组；TiO₂：二氧化钛组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试剂：辅酶Q10由广东润和生物科技有限公司提供，60％大豆卵磷脂(PC60)购于海爱康精细化工，胆固醇、聚山梨酯80、无水乙醇、盐酸、PBS购于国药试剂，丙二醛测试盒、超氧化物歧化酶测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶测试盒、伊红-苏木素染色试剂盒购于南京建成公司，RT-qPCR反逆转录试剂盒与SYBR荧光染料购于TaKaRa公司。

仪器：PCR扩增仪(Thermo公司)，UVB紫外灯及ST-513型紫外线辐照计(台湾先驰光电公司)，电子天平(上海民桥)，雷磁实验室pH计(上海精密仪器公司)，200KV场发射透射电子显微镜(Tecani G2 F20 S-TWIN型)、酶标仪(中国普朗公司)、微量移液器(美国Thermo公司)、冷冻离心机(德国eppendorf公司)。

实施例1辅酶Q10脂质体的制备方法

称取辅酶Q10(0.9％)、硫辛酸(0.45％)、大豆卵磷脂(1.3％)、胆固醇(0.33％)、无水乙醇(7％)和吐温80(1.5％)(百分比为各物质占辅酶Q10脂质体的质量百分比)，在55℃水浴条件下搅拌20min至完全溶解，得到油相；再用三乙醇胺配制pH值为7.9的水溶液，作为水相，并于55℃恒温磁力低速搅拌；用注射器将油相快速注射入水相中，并将水相搅拌速度提升至1000r/min、温度不变搅拌20min，即可制成辅酶Q10脂质体，将得到的脂质体溶液自然冷却到室温，分装保存即可。

实施例2辅酶Q10脂质体的制备方法

称取辅酶Q10(0.6％)、硫辛酸(0.45％)、大豆卵磷脂(1.6％)、胆固醇(0.33％)、无水乙醇(7％)和吐温80(1.5％)(百分比为各物质占辅酶Q10脂质体的质量百分比)，在50℃水浴条件下搅拌20min至完全溶解，得到油相；再用三乙醇胺配制pH值为7.7的水溶液，作为水相，并于50℃恒温磁力低速搅拌30min；用注射器将油相快速注射入水相中，并将水相搅拌速度提升至1000r/min、温度不变搅拌20min，即可制成辅酶Q10脂质体，将得到的脂质体溶液自然冷却到室温，分装保存即可。

实施例3辅酶Q10脂质体的制备方法

称取辅酶Q10(1.5％)、硫辛酸(0.45％)、大豆卵磷脂(1.9％)、胆固醇(0.33％)、无水乙醇(7％)和吐温80(1.5％)(百分比为各物质占辅酶Q10脂质体的质量百分比)，在60℃水浴条件下搅拌20min至完全溶解，得到油相；再用三乙醇胺配制pH值为8.1的水溶液，作为水相，并于60℃恒温磁力低速搅拌；用注射器将油相快速注射入水相中，并将水相搅拌速度提升至1000r/min、温度不变搅拌20min，即可制成辅酶Q10脂质体，将得到的脂质体溶液自然冷却到室温，分装保存即可。

实施例4脂质体电镜观察

将辅酶Q10脂质体在电镜下拍摄图片，见图1。从图1中可以看出，在不同倍数下对本发明实施例1制得的辅酶Q10脂质体进行观察，辅酶Q10脂质体清晰可见，成球状，大小分布均匀。

实施例5辅酶Q10脂质体抗小鼠皮肤紫外线损伤的动物实验

数据处理：参数值用x±s表示，采用SPSS 17.0软件对数据进行方差分析，计算F值，查阅F界值表，并以P<0.05为表示有统计学意义。

(1)实验动物造模

28只SPF级3月龄雌性KM小鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，体重(27.41±0.57)g，动物合格证：SCXK(粤)2011-0015。

实验开始前，将小鼠背部皮肤进行物理脱毛，面积约为2×3cm²，再随机分成4组，(1)正常组(CON)，小鼠脱毛后不作任何处理；(2)模型组(MOL)，小鼠脱毛后涂抹空白霜剂(成分为羟苯乙酯，三乙醇胺、羊毛脂、硬脂酸、鲸蜡、鲸蜡醇，橄榄油、矿物油)30min后进行紫外线照射，照射剂量为最小红斑量，每天1次，连持8周；(3)辅酶Q10脂质体组(COQ)，小鼠脱毛后涂抹实施例1制备得到的辅酶Q10脂质体霜剂30min后，其余操作同模型组；(4)二氧化钛组(TiO₂)，小鼠脱毛后涂抹二氧化钛霜剂30min后，其余操作同模型组。小鼠每周称量体重一次，实验结束后小鼠眼球取血处死，剪下小鼠背部脱毛部位皮肤组织进行指标检测。

实验期间各组小鼠体重变化见图2，从图2中可以看出，CON、MOL组大鼠体重呈现先降低后增高的趋势，最后处于稳定状态；COQ、TiO₂组大鼠体重则呈现一直增长，最后处于稳定的趋势。图2结果表明，辅酶Q10脂质体和二氧化钛对小鼠体重的增长影响不大。

(2)小鼠皮肤匀浆生化指标的测量

实验结束后，剪取3g左右皮肤组织放进匀浆管中，加入适量生理盐水进行冷冻匀浆，待组织块充分匀浆后，4℃12000r/min离心15min，取离心管上层液，参照试剂盒提供的检测方法对皮肤组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)进行检测，并计算其活力。

各组大鼠皮肤组织丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的含量见表1。

表1大鼠皮肤组织生化指标值n＝8，

与CON组比较，*：P<0.05，MOL组比较，#：P<0.05。

从表1可以看出，与CON组比较，MOL组小鼠MDA含量升高(P<0.05)，SOD活力下降(P<0.05)，GSH-Px活力下降(P>0.05)；以上结果说明，经过紫外线照射，小鼠皮肤组织的丙二醛含量升高、超氧化物歧化酶与谷胱甘肽活力下降，说明紫外线照射造成小鼠皮肤损伤，造模成功。与MOL组比较，COQ组小鼠MDA含量下降(P>0.05)，SOD活力上升(P<0.05)，GSH-Px活力上升(P>0.05)；TiO₂组小鼠MDA含量降低(P<0.05)，SOD活力上升(P>0.05)，GSH-Px活力上升(P>0.05)；以上结果说明，经过紫外线照射，辅酶Q10脂质体组和二氧化钛组相比模型组，小鼠皮肤组织丙二醛含量均降低、超氧化物歧化酶与谷胱甘肽活力均升高；而二氧化钛组小鼠皮肤组织丙二醛含量、超氧化物歧化酶与谷胱甘肽活力均低于辅酶Q10脂质体组，表明辅酶Q10脂质体能有效的发挥抗紫外线作用，其作用效果比二氧化钛更好。

(3)小鼠皮肤病理学切片染色

实验结束后，剪下小鼠背部脱毛部位皮肤进行多聚甲醛固定、石蜡包埋，再进行HE染色，染色详细方法参照伊红-苏木素染色试剂盒说明书。

各组小鼠皮肤组织病理切片染色见图3，从图3中可以看出，CON组小鼠表皮层完整，厚度均匀；MOL组小鼠表皮层脱落严重，厚度较厚；COQ组小鼠表皮层完整，厚度较薄；TiO₂组小鼠表皮层稍微脱落，厚度大小均一；以上结果说明，辅酶Q10脂质体组和二氧化钛组可以保持小鼠皮肤完整，但辅酶Q10脂质体的作用强于二氧化钛。

(4)小鼠皮肤组织基质金属蛋白酶(MMP-1mRNA)表达水平的检测

人真皮成纤维细胞在紫外线照射后主要产生MMP-1，MMP-3和MMP-9，并认为它们在光老化的过程中起很大的作用。MMP-1及其相关通路在皮肤光老化中起重要作用，MMP-1能特异性降解几乎所有细胞外基质成分，造成正常胶原成分和弹性纤维降解，导致皮肤光老化。

实验结束后，剪取3g皮肤组织用Trizol进行匀浆，提取组织RNA，再参照RT-qPCR反逆转录试剂盒方法进行RNA转录，最后在SYBR荧光颜料的作用下，利用PCR扩增仪进行基因相对表达量检测，以β-actin为内参。

各组小鼠皮肤组织基质金属蛋白酶相对表达量见图4，从图4中可以看出，与MOL组比较，CON组小鼠MMP-1相对表达量降低，具有统计学差异；COQ组小鼠MMP-1相对表达量降低，具有统计学差异；TiO₂组小鼠MMP-1相对表达量升高，不具有统计学差异。以上结果说明，辅酶Q10脂质体组小鼠MMP-1相对表达量比模型组、二氧化钛组低，表明辅酶Q10脂质体具有抗紫外线损伤作用，并且其作用比二氧化钛好。

辅酶Q10脂质体对紫外线照射损伤的小鼠皮肤损伤有明显的保护作用，其保护作用可能与其抗氧化机制有关。辅酶Q10脂质体是一种油相包裹辅酶Q10的制剂，通过水合机制、融合机制、穿透机制可以快速地将辅酶Q10“运输”进皮肤从而发挥作用。辅酶Q10作为一种抗氧化剂，其可以清除皮肤组织自由基及抑制其产生的一系列连锁反应从而发挥抗紫外线损伤作用。辅酶Q10可以降低MMP-1相对表达量，从而使得正常胶原成分和弹性纤维降解降低，抑制细胞外基质成分的降解从而抑制皮肤光老化，发挥抗紫外线损伤作用。

本发明制备的辅酶Q10脂质体可以作为供外用的护肤膏霜，如润肤霜，晚霜，防晒霜等。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种抗紫外线损伤的辅酶Q10脂质体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)制备油相：将辅酶Q100.5-1.5％、硫辛酸0.45％、大豆卵磷脂1.3-1.9％、胆固醇0.33％、无水乙醇7％和吐温80 1.5％，混合加热溶解，制备得到油相；所述百分比为占辅酶Q10脂质体的质量百分比；

2.根据权利要求1所述的一种抗紫外线损伤的辅酶Q10脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)制备油相所述混合加热溶解的条件为在50-60℃水浴条件下搅拌20min。

3.根据权利要求1所述的一种抗紫外线损伤的辅酶Q10脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)制备油相：将辅酶Q100.9％、硫辛酸0.45％、大豆卵磷脂1.3％、胆固醇0.33％、无水乙醇7％和吐温80 1.5％，混合加热溶解，制备得到油相；所述百分比为占辅酶Q10脂质体的质量百分比。

4.根据权利要求1所述的一种抗紫外线损伤的辅酶Q10脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(3)制备辅酶Q10脂质体的具体步骤如下：将步骤(2)制备得到的水相在恒温磁力搅拌器上加热搅拌30min，转速为1000r/min，温度为50-60℃，用注射器将步骤(1)制备的油相快速注入搅拌中的水相，继续搅拌30min，获得辅酶Q10脂质体颗粒。