CN110741930A

CN110741930A - 一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质及方法

Info

Publication number: CN110741930A
Application number: CN201910637895.2A
Authority: CN
Inventors: 郭方其; 吴超; 袁峰; 黑银秀; 柴金甫; 刘君; 丁晓瑜; 徐智豪; 黎侠
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Suzhou Shengjingtai Garden Environment Construction Co ltd
Priority date: 2019-07-15
Filing date: 2019-07-15
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2039-07-15
Also published as: CN110741930B

Abstract

本发明公开了一种适于菊花热处理茎尖脱毒组培基质及方法、属于植物培育栽培技术领域，组培基质由分阶段依次顺序使用的诱导培养基组合、脱毒茎尖诱导培养基组合、壮苗培养与增殖培养基组合、生根培养基组合组成：诱导培养基组合由依次顺序使用的外植体诱导培养基、外植体初代诱导培养基、外植体诱导培养基组成；脱毒茎尖诱导培养基组合由依次顺序使用的外植体诱导培养基、茎尖诱导培养基Ⅰ、茎尖诱导培养基Ⅱ组成、壮苗培养与增殖培养基组合：其包括依次顺序使用的壮苗培养基和增殖培养基；本发明解决因长期的无性繁殖，导致植株体内病毒的大量积累，引起菊花品种退化和生长势减弱，影响切花品质，同时种苗无法高效大规模化生产的问题。

Description

一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质及方法

技术领域

本发明属于植物培育栽培技术领域，具体为一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质及方法。

背景技术

目前我省栽培的切花菊主要是夏菊和秋菊，其中夏菊采收期为6月-7月，生长特点是在温暖的环境下，夜温10℃-23℃，昼温23℃-30℃环境下，能表现品种良好的生长特性，对光周期反应不敏感，可自然光照栽培，但不耐高温，在夏季高温下栽培，易出现花萼增厚，花径变小，花瓣卷曲不平，甚至现蕾后无法发育和开花等现象，代表品种为“优香”、“金扇”、“白舟”、“黄小”、“夏姬”、“白马”；而秋菊的采收期为10月-12月，生长特点是在凉爽的环境下，夜温16℃-23℃，昼温25℃-30℃环境下，能表现品种良好的生长特性，对光周期反应敏感，适合作遮黑栽培，代表品种“神马”、“十月黄中”、“精兴光玉”、“精兴荣山”、“诚”、“秋芳”、“金秀”、“调”、“红昌”，总体上无论是夏菊还是秋菊，生长期均会经历气温相对较高的阶段，高温期易加重切花菊病毒病的危害，目前我国栽培的切花菊品种主要从日本引进，生产上主要采用扦插繁殖的方式繁育种苗，由于长期的无性繁殖，导致植株体内病毒的大量积累，引起品种退化和生长势减弱，影响切花品质。此外，切花菊还可用作茶饮，浙江省淳安县王阜乡等地民间有种植紫花野菊用于制作花茶，由于传统上采用分株繁殖方式生产种苗，易感染病毒和真菌病害，田间发病严重，缺株率高，影响产量和品质。

生产上切花菊母本培育的具体做法是将开花植株中拨除变异和混杂的植株，挑选保留原品种典型农艺性状，花色纯正，无明显病虫侵害的健壮植株，秋菊于切花采收后，每年11月份将开花后的老桩移栽至母本苗培育大棚建立一级母本园，而紫花野菊则采用田间留生长状况良好的植株进行下年度的种苗繁育。

由于繁殖用母本采自开过花的植株，长期无性繁殖，易感染病毒病和镰刀菌、丝核菌和腐霉菌等真菌性病害，而且田间存在蚜虫和蓟马等害虫等传播切花菊B病毒和番茄不孕病毒等病毒。因此，采用茎尖脱毒组培快繁技术来繁育无病虫害侵染的材料，以达到有效防止病虫害的侵染与传播。，目前该项技术已在国外切花菊种苗生产上得到广泛的应用。一般是通过茎尖脱毒组培技术培育成脱毒苗后，将脱毒苗经过温室防虫网条件下进行驯化炼苗，培育原原种，在防虫网内进行扦插扩繁培育原种，将原种苗供应种苗商作母本苗进行扩繁，生产用于切花栽培的种苗。

由于农户自留母本进行扦插繁殖，防护措施不到位，由蚜虫和蓟马等传播切花菊B病毒和番茄不孕病毒等病毒，导致品种退化和生长势下降，每年需要从国外进口种苗，而国内缺乏切花菊茎尖脱毒培养技术，由于茎尖诱导培养中易发生坏死等，茎尖培养诱导率低，因此开发提高切花菊组培苗热处理茎尖脱毒培养和高效繁育方法，这对加快优良切花菊品种脱毒种苗生产，促进优质种苗规模化生产具有重大的意义。

发明内容

针对目前切花菊和紫花野菊等品种退化、组培苗移栽种植技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种提高适于切花菊热处理茎尖脱毒组培苗高效增殖方法，解决因长期的无性繁殖，导致植株体内病毒的大量积累，引起切花菊品种退化和生长势减弱，影响切花品质，同时种苗无法高效大规模化生产的问题。

本发明的第一目的是提供一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质，所述组培基质由分阶段依次顺序使用的诱导培养基组合、脱毒茎尖诱导培养基组合、壮苗培养与增殖培养基组合、生根培养基组合组成：

所述诱导培养基组合由依次顺序使用的外植体诱导培养基、外植体初代诱导培养基、外植体诱导培养基组成；

所述脱毒茎尖诱导培养基组合由依次顺序使用的外植体诱导培养基、茎尖诱导培养基Ⅰ、茎尖诱导培养基Ⅱ组成；

壮苗培养与增殖培养基组合：其包括依次顺序使用的壮苗培养基和增殖培养基；

所述外植体诱导培养基的配方为：MS+6-BA0.2~1.0 mg/L + IBA 0.1~0.5mg/L；

所述茎尖诱导培养基Ⅰ的配方为：蔗糖20~30g/L，琼脂粉4~5 g/L，pH5.6~5.8的1/2 B5+Ca（NO3）2 、500mg/L+1/2 B5+Ca（NO3）2 500mg/L+6-BA 0.01~0.2 mg/L + NAA 0.1~0.2mg/L+AC 0.5~1.0mg/L；

所述茎尖诱导培养基Ⅱ的配方为：普通培养基+MS+6-BA 0.1~0.2mg/L+ IBA 0.1~0.2mg/L。

作为优选，本发明提供的基质进一步设置为，所述外植体初代诱导、壮苗培养基中也含有所述普通培养基，所述普通培养基的配方为：蔗糖25~35g/L，琼脂粉4~5 g/L，pH5.6~5.8。

作为优选，本发明提供的基质进一步设置为，所述生根培养基组合的配方为蔗糖30g/L，琼脂粉4~5 g/L，pH5.6~6.0的1/2MS培养基。

作为优选，本发明提供的基质进一步设置为，所述增殖培养基的配方为蔗糖20~35g/L，琼脂粉4~5 g/L，pH5.6~5.8的T20-4培养基，其1L培养基中的配制成分含量如下：KNO₃:1250mg、NH4NO₃:225mg、KH₂PO₄:175mg、MgSO₄·7H₂O:325mg、CaCl₂:165mg、KI:0.83mg、H₃BO₃:6.2mg、MnSO₄·4H₂O:22.3mg、ZnSO₄·7H₂O:8.6mg、CuSO₄·5H₂O：0.025mg、CoCl₂·6H₂O：0.025mg Na2MnO₄·2H₂O：0.25mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO₄·7H2O:27.8mg、肌醇：100mg、烟酸0.5mg、盐酸吡哆醇0.5mg、盐酸硫胺素0.1mg、甘氨酸2.0mg。

本发明的第二目的在于提供一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培方法，所述方法使用如上所述的基质，所述方法包括以下步骤：

（1）培养基配置：配置组培所需的所述诱导培养基组合、脱毒茎尖诱导培养基组合、壮苗培养与增殖培养基组合、生根培养基组合；

（2）种源处理与灭菌：将经过自然低温的切花菊品种“神马”冬至芽取回，用1%洗洁精液浸泡10min，经清水冲洗后进行种源茎段灭菌处理，备用；

（3）茎段芽的诱导培养：取灭菌后种源茎段切成每节带一个腋芽为一段，作为外植体，接种于外植体诱导培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养30d至诱导出茎段芽；将该茎段芽切下转接在外植体初代诱导培养基上，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导培养基上，在上述环境条件下培养30d进行扩繁，重复接种培养直至足够数量用于脱毒茎尖诱导培养；

（4）脱毒茎尖诱导培养：当诱导的茎段芽扩繁一定基数后，进行热处理脱毒培养，利用高温培养条件，抑制切花菊病毒的繁殖，剥取茎尖进行诱导培养，至形成生长正常的有1片~2片展开叶的幼苗；

（5）壮苗培养与增殖培养：将上述培养的具有1片~2片展开叶的幼苗，转接至壮苗培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下培养25d，形成具有5片~7片叶片的组培苗，将组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至增殖培养基上（T20-4），在上述环境条件下培养30d进行增殖培养，每丛形成3株~5株具5片~7片叶片的组培苗，再重复切茎段转接增殖培养基，直至能满足进行病毒检测取样和保留病毒检测后需要进一步扩繁组培苗数量，由于整个培养过程丛生芽发生数控制在每丛3个~5个芽，组培苗未见形态变异，无玻璃化苗发生；

（6）采用高通量Small RNA测序技术进行病毒快速鉴定，将步骤（5）组培苗完全伸展叶片进行sRNA提取，经上机测序后与NCBI 病毒基因组数据库比对分析，筛选与病毒数据库相似序列，进行病毒全长拼接与分析后，判定实验样品是否含有病毒感染，经该法检测上述脱毒茎尖诱导培养的组培苗均无病毒相似sRNA检出，确定未检测出病毒；

（7）生根培养：将经过上述方法检测未发现切花菊病毒的组培苗，即步骤（5）培养的组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，直接转接至生根培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下培养25d，形成具有5片~7片叶片和4条~6条完整根系的脱毒组培苗；

（8）选择2月下旬至4月中旬进行脱毒组培苗移栽培育原原种，将步骤（7）培养的组培瓶苗移至具有防虫网隔离连栋大棚的架空苗床上进行组培苗移栽；

（9）扦插育苗：在具防虫网的连栋大棚内移动苗床基质上进行扦插育苗，插穗插于苗床上，株行距为3cm～4 cm，并立即用花洒淋水，第二天喷25%嘧菌酯1000倍+58%可湿性粉剂甲霜锰锌800倍或45%烯酰锰锌（15%烯酰吗啉+30%甲霜锰锌）1000倍，定期喷水保湿，或覆盖地膜保湿，培育的生根苗用作培育一级母本苗；

（10）一级母本苗的培育：采用连栋大棚土壤栽培，宽度7米的连栋温室可做6畦，沟宽45cm，棚两头各留80cm作操作道，畦长最好不超过40米，以便使用滴灌更均匀；定植前二天畦面浇透水，株行距以10cm×10cm，中间空20cm为宜；步骤（9）扦插的种苗当天起苗当天定植，尽量减少伤根，栽植时使用穴植法，应将根系舒展于穴中，尽量减少根弯曲重叠，然后覆土，轻压土实，最后浇上定根水，第二天再喷灌浇透水，之后几天要保持土壤湿润，但不可灌水过多。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，种苗繁育全程采用长日照处理，从瓶苗移至大棚当天至一级母本苗培育整个过程，全部开始长日照处理，采用高光效钠灯（150w），每56平方米挂一个灯，使大棚内远离灯光处电照强度最低达70lux以上，每天日照时数16~17小时。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，种苗培育过程中适时施用水溶性配方肥，一般每7~10d浇1次1000~1500倍水溶性肥料，为全矿物营养液肥，含有氮、磷、钾大量元素及钙、镁、硫、铁、锰、锌、铜、硼、钼等微量元素，N-P-K（20-20-20）。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，栽培管理中进行重要病虫害防治，包括组培苗在定植后当天或第二天喷施80%代森锰锌1000倍+25%阿米西达1000倍或25%苯醚甲环唑1000倍，此后轮换喷，每7天一次预防叶斑病和白锈病；根据田间虫害发生情况及时喷施艾绿士1500倍和10%虫螨腈1000倍防治小菜蛾、蓟马，或喷10%烯啶虫胺可溶性液剂1500 倍液，或 20%啶虫脒乳油 1500 倍液或5%吡丙醚EC800倍液，或20％吡虫虫螨腈SC750倍液等防治蚜虫和螨虫。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，步骤（3）中方法具体如下：将预先培养的组培苗，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导培养基上，在茎段芽的诱导培养同样的环境条件下培养15d，当新芽萌发苗长至1cm时将组培瓶苗放入光照培养箱内，光照12h/d，光照强度3000Lx，按昼夜温度28℃~32℃、30℃~35℃、33℃~38℃的顺序，每2d变换一档，使组培苗逐渐适应高温生长环境，然后在33℃~38℃下继续热处理脱毒培养30d，组培苗生长势逐渐变弱，叶色变浅，当组培苗坏死约50%~60%时，选取具有一定活力的组培苗，在无菌操作台上置组培苗于生物镜下放大100倍，剥取0.1~0.3mm的茎尖作为外植体，接种于茎尖诱导培养基Ⅰ，进行茎尖诱导培养，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养25d，将已有萌动的茎尖转接至茎尖诱导培养基Ⅱ，在同样环境条件下培养30d，将明显转绿的茎尖组织转接至茎尖诱导培养基Ⅰ，在同样环境条件下培养30d，如此交替培养，至形成生长正常的有1片~2片展开叶的幼苗。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，步骤（4）中，具体方法如下：将预先培养的组培苗，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导培养基上，在茎段芽的诱导培养同样的环境条件下培养15d，当新芽萌发苗长至1cm时将组培瓶苗放入光照培养箱内，光照12h/d，光照强度3000Lx，按昼夜温度28℃~32℃、30℃~35℃、33℃~38℃的顺序，每2d变换一档，使组培苗逐渐适应高温生长环境，然后在33℃~38℃下继续热处理脱毒培养30d，组培苗生长势逐渐变弱，叶色变浅，当组培苗坏死约50%~60%时，选取具有一定活力的组培苗，在无菌操作台上置组培苗于生物镜下放大100倍，剥取0.1~0.3mm的茎尖作为外植体，接种于茎尖诱导培养基Ⅰ，进行茎尖诱导培养，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养25d，将已有萌动的茎尖转接至茎尖诱导培养基Ⅱ，在同样环境条件下培养30d，将明显转绿的茎尖组织转接至茎尖诱导培养基Ⅰ，在同样环境条件下培养30d，如此交替培养并形成幼苗。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，所述步骤（8）中，组培苗移栽具体方法如下：瓶苗上覆盖70%的遮荫网，在大棚内施置15d，使组培苗适应自然光照条件，将组培苗瓶盖打开，早晚不遮荫，中午强光时段在组培瓶苗上覆盖70%的遮荫网，对组培苗开瓶煅炼3d~5d，然后小心取出组培苗，在清水中洗去培养基，将组培苗移栽至准备好椰糠为基质的苗床中，上述种苗移栽前一星期将椰糠块铺放在苗床上，先浇透水使椰糠块松开，并在基质中施入复合肥N-P-K（15-15-15）20kg/亩，椰糠厚度6cm~8cm，种植深度以将基质覆盖到生根节位部为宜，小心将根系展开于基质中，轻压根部，然浇透定根水，3月中旬后移栽需要遮盖70%遮荫率的遮阳网，防止因强光造成叶片损伤和萎蔫，约一星期根系恢复生长后可去掉遮荫网，组培苗移栽成活率达95%以上，组培苗长至8cm~10cm高时，可摘心促进侧枝发生，当侧枝生长至8cm~10cm时，进行采穗，侧枝基部留3叶~4叶，插穗长度5 cm～6 cm。

作为优选，本发明提供的方法进一步设置为，步骤（9）中，所述扦插育苗使用椰糠作为基质，厚度约为8 cm，在地面苗床上使用泥炭作基质，厚度15cm~18cm。

所述扦插前还包括如下步骤：从步骤（8）原原种母株上采取5cm～6 cm长的插穗，去掉基部部分叶片，使插穗留有3片～4片展开叶，整理后将插穗基部尽快插入25%嘧菌酯500倍+58%可湿性粉剂甲霜锰锌500倍或45%烯酰锰锌（15%烯酰吗啉+30%甲霜锰锌）500倍药液中浸吸1分钟，再将插穗基部沾上含有0.2%的萘乙酸（NAA）的滑石粉后进行扦插。

有益效果

本发明提供的一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质及方法，具有以下优点：

（1）本发明步骤（4）脱毒茎尖诱导培养，以1/2 B5+Ca（NO3）2 500mg/L为基本培养基，通过调节培养基中6-BA、 NAA 和AC的用量，对茎段诱导培养的组培苗进行脱毒培养处理，按昼夜温度28℃~32℃、30℃~35℃、33℃~38℃的顺序，每2d变换一档，使组培苗逐渐适应高温生长环境，然后在33℃~38℃下继续热处理脱毒培养25~30d，抑制切花菊病毒的繁殖，但组培苗生长势也因高温影响而逐渐变弱，叶色变浅，当组培苗坏死约50%~60%时，选取具有一定活力的组培苗进行脱毒茎尖诱导培养，茎尖初代诱导率达30%以上，茎尖未出现大量愈伤组织生长，而采用MS基本培养基进行茎尖初代诱导培养，茎尖出现愈伤组织生长的比率达50%以上。

（2）本发明步骤（5）壮苗培养与增殖培养，将壮苗培养基上形成具有5片~7片叶片的组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至增殖培养基上（T20-4），培养30d~40d进行增殖培养，每丛形成3株~5株具5片~7片叶片的组培苗，再重复切茎段转接增殖培养基，直至能满足进行病毒检测取样和保留病毒检测后需要进一步扩繁组培苗数量，由于整个培养过程丛生芽发生数控制在每丛3个~5个芽，组培苗未见形态变异，无玻璃化苗发生，而在常规MS基本培养基进行增殖培养时易发生切口基部形成明显增大的愈伤组织，组培苗增殖过程中玻璃化苗占10%以上，而且组培苗顶端易发生坏死现象。

（3）本发明步骤（10）一级母本苗的培育，采用步骤（9）原原种扦插的种苗当天起苗当天定植，定植成活率达95%以上，所培育的脱毒一级母本苗的长势明显优于目前生产上采用开花后的老桩移栽培育的一级母本苗。

（4）本发明提供的方法，脱毒组培苗增殖培养无玻璃化苗发生，丛生芽发生率高，组培苗种苗质量好，移栽成活率达95%以上，通过组培苗原原种繁殖的一级母本苗生长势明显优于传统上采用开花植株老桩培育成的一级母本。

（5）本发明提供的方法，能够大大减少植株体内病毒的大量积累，不会造成和品种退化和生长势减弱，有效保证了切花菊的培育品质。

（6）综合使用本发明的方法，能够高效完成切花菊的培育，具有较高的经济价值。

（7）使用本发明提供的方法，能够促进切花菊的优质种苗规模化生产，为切花菊的市场推广奠定基础和重要的大规模市场化应用保障。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

实施例1：

本发明的第一目的在于形成切花菊热处理茎尖脱毒组培苗高效繁育方法，实施地点为浙江省农业科学院园艺研究所园林花卉遗传育种实验室和嘉兴嘉德园艺有限公司切花菊生产基地，上述方法包括如下步骤：

（1）培养基的配制：包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与各组分每升所含重量为：

a）基本培养基：其中，

茎尖诱导培养基Ⅰ为蔗糖20g/L，琼脂粉4.4 g/L，pH 5.8的1/2 B5+Ca（NO3）₂ 500mg/L培养基；

普通培养基（外植体初代诱导、壮苗培养基和茎尖诱导培养基Ⅱ）为蔗糖30g/L，琼脂粉4.4 g/L，pH5.6的MS培养基；

增殖培养基为蔗糖20g/L，琼脂粉4.4 g/L，pH 5.8的T20-4培养基，其1L培养基中的配制成分含量如下：KNO3:1250mg、NH4NO3:225mg、KH2PO4:175mg、MgSO4•7H2O:325mg、CaCl2:165mg、KI:0.83mg、H3BO3:6.2mg、MnSO4•4H2O:22.3mg、ZnSO4•7H2O:8.6mg、CuSO4•5H2O：0.025mg、CoCl2•6H2O：0.025mg Na2MnO4•2H2O：0.25mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO4•7H2O:27.8mg、肌醇：100mg、烟酸0.5mg、盐酸吡哆醇0.5mg、盐酸硫胺素0.1mg、甘氨酸2.0mg。

生根培养基为蔗糖30g/L，琼脂粉4.4 g/L，pH5.8的1/2MS培养基；

b）茎尖诱导培养基Ⅰ：1/2 B5+Ca（NO3）2 500mg/L+6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.1mg/L+AC0.5mg/L；

c）茎尖诱导培养基Ⅱ：MS+6-BA 0.2mg/L+ IBA 0.1mg/L；

d）外植体初代诱导培养基：MS+6-BA0.2mg/L + IBA 0.1mg/L；

e）增殖培养基：T20-4培养基+6-BA0.2 mg/L + IBA 0.1mg/L；

f）壮苗培养基：3/4MS +6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1mg/L；

g）生根培养基：1/2MS +IBA 0.5mg/L +AC 0.5mg/L；

（3）茎段芽的诱导培养：取灭菌后种源茎段切成每节带一个腋芽为一段，作为外植体，接种于外植体诱导培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下培养30d至诱导出茎段芽；将该茎段芽切下转接在外植体初代诱导培养基上，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导培养基上，在上述环境条件下培养30d进行扩繁，重复接种培养直至足够数量用于脱毒茎尖诱导培养；

（4）脱毒茎尖诱导培养：当诱导的茎段芽扩繁一定基数后，进行热处理脱毒培养，利用高温培养条件，抑制切花菊病毒的繁殖，剥取茎尖进行诱导培养，具体方法：将预先培养的组培苗，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导培养基上，在茎段芽的诱导培养同样的环境条件下培养10d，当新芽萌发苗长至1cm时将组培瓶苗放入光照培养箱内，光照12h/d，光照强度3000Lx，按昼夜温度28℃~32℃、30℃~35℃、33℃~38℃的顺序，每2d变换一档，使组培苗逐渐适应高温生长环境，然后在33℃~38℃下继续热处理脱毒培养30d，组培苗生长势逐渐变弱，叶色变浅，当组培苗坏死约50%~60%时，选取具有一定活力的组培苗，在无菌操作台上置组培苗于生物镜下放大100倍，剥取0.1~0.3mm的茎尖作为外植体，接种于茎尖诱导培养基Ⅰ，进行茎尖诱导培养，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养25d，将已有萌动的茎尖转接至茎尖诱导培养基Ⅱ，在同样环境条件下培养30d，将明显转绿的茎尖组织转接至茎尖诱导培养基Ⅰ，在同样环境条件下培养30d，如此交替培养，至形成生长正常的有1片~2片展开叶的幼苗；

（5）壮苗培养与增殖培养：将上述培养的具有1片~2片展开叶的幼苗，转接至壮苗培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养25d，形成具有5片~7片叶片的组培苗，将组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至增殖培养基上（T20-4），在上述环境条件下培养30d进行增殖培养，每丛形成3株~5株具5片~7片叶片的组培苗，再重复切茎段转接增殖培养基，直至能满足进行病毒检测取样和保留病毒检测后需要进一步扩繁组培苗数量，由于整个培养过程丛生芽发生数控制在每丛3个~5个芽，组培苗未见形态变异，无玻璃化苗发生；

（6）采用高通量Small RNA测序技术进行病毒快速鉴定，将步骤（5）组培苗完全伸展叶片进行sRNA提取，经上机测序后与NCBI 病毒基因组数据库比对分析，筛选与病毒数据库相似序列，进行病毒全长拼接与分析后，判定实验样品是否含有病毒感染，经该法检测上述脱毒茎尖诱导培养的组培苗均无病毒相似sRNA检出，确定未检测出病毒。

（7）生根培养：将经过上述方法检测未发现切花菊病毒的组培苗，即步骤（5）培养的组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，直接转接至生根培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养25d，形成具有5片~7片叶片和4条~6条完整根系的脱毒组培苗。

（8）选择2月下旬至4月中旬进行脱毒组培苗移栽培育原原种，将步骤（7）培养的组培瓶苗移至具有防虫网隔离连栋大棚的架空苗床上，瓶苗上覆盖70%的遮荫网，在大棚内施置15d，使组培苗适应自然光照条件，将组培苗瓶盖打开，早晚不遮荫，中午强光时段在组培瓶苗上覆盖70%的遮荫网，对组培苗开瓶煅炼3d~5d，然后小心取出组培苗，在清水中洗去培养基，将组培苗移栽至准备好椰糠为基质的苗床中，上述种苗移栽前一星期将椰糠块铺放在苗床上，先浇透水使椰糠块松开，并在基质中施入复合肥N-P-K（15-15-15）20kg/亩，椰糠厚度6cm~8cm，种植深度以将基质覆盖到生根节位部为宜，小心将根系展开于基质中，轻压根部，然浇透定根水，3月中旬后移栽需要遮盖70%遮荫率的遮阳网，防止因强光造成叶片损伤和萎蔫，约一星期根系恢复生长后可去掉遮荫网，组培苗移栽成活率达95%以上，组培苗长至8cm~10cm高时，可摘心促进侧枝发生，当侧枝生长至8cm~10cm时，进行采穗，侧枝基部留3叶~4叶，插穗长度5 cm～6 cm。

（9）扦插育苗：在具防虫网的连栋大棚内移动苗床上，使用椰糠作为基质，厚度约为8 cm。在地面苗床上使用泥炭作基质，厚度15cm~18cm。从步骤（8）原原种母株上采取5cm～6 cm长的插穗，去掉基部部分叶片，使插穗留有3片～4片展开叶，整理后将插穗基部尽快插入25%嘧菌酯500倍+58%可湿性粉剂甲霜锰锌500倍或45%烯酰锰锌（15%烯酰吗啉+30%甲霜锰锌）500倍药液中浸吸1分钟，再将插穗基部沾上含有0.2%的萘乙酸（NAA）的滑石粉后进行扦插，插穗插于苗床上，株行距为3cm～4 cm，并立即用花洒淋水，第二天喷25%嘧菌酯1000倍+58%可湿性粉剂甲霜锰锌800倍或45%烯酰锰锌（15%烯酰吗啉+30%甲霜锰锌）1000倍，定期喷水保湿，或覆盖地膜保湿，培育的生根苗用作培育一级母本苗。

（10）一级母本苗的培育：采用连栋大棚土壤栽培，宽度7米的连栋温室可做6畦，沟宽45cm，棚两头各留80cm作操作道，畦长最好不超过40米，以便使用滴灌更均匀。定植前二天畦面浇透水，株行距以10cm×10cm，中间空20cm为宜。步骤（9）扦插的种苗当天起苗当天定植，尽量减少伤根，栽植时使用穴植法，应将根系舒展于穴中，尽量减少根弯曲重叠，然后覆土，轻压土实，最后浇上定根水，第二天再喷灌浇透水，之后几天要保持土壤湿润，但不可灌水过多。

实施例2

a）基本培养基：其中，

普通培养基（外植体初代诱导、壮苗培养基和茎尖诱导培养基Ⅱ）为蔗糖35g/L，琼脂粉4.4 g/L，pH5.6的MS培养基；

增殖培养基为蔗糖20g/L，琼脂粉4.4 g/L，pH 5.6的T20-4培养基，其1L培养基中的配制成分含量如下：KNO3:1250mg、NH4NO3:225mg、KH2PO4:175mg、MgSO4•7H2O:325mg、CaCl2:165mg、KI:0.83mg、H3BO3:6.2mg、MnSO4•4H2O:22.3mg、ZnSO4•7H2O:8.6mg、CuSO4•5H2O：0.025mg、CoCl2•6H2O：0.025mg Na2MnO4•2H2O：0.25mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO4•7H2O:27.8mg、肌醇：100mg、烟酸0.5mg、盐酸吡哆醇0.5mg、盐酸硫胺素0.1mg、甘氨酸2.0mg。

生根培养基为蔗糖30g/L，琼脂粉4.4 g/L，pH5.8的1/2MS培养基；

c）茎尖诱导培养基Ⅱ：MS+6-BA 0.2mg/L+ IBA 0.1mg/L；

d）外植体初代诱导培养基：MS+6-BA0.5mg/L + IBA 0.1mg/L；

e）增殖培养基：T20-4培养基+6-BA0.2 mg/L + IBA 0.1mg/L；

f）壮苗培养基：3/4MS +6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1mg/L；

g）生根培养基：1/2MS +IBA 0.5mg/L +AC 0.5mg/L；

（4）脱毒茎尖诱导培养：当诱导的茎段芽扩繁一定基数后，进行热处理脱毒培养，利用高温培养条件，抑制切花菊病毒的繁殖，剥取茎尖进行诱导培养，具体方法：将预先培养的组培苗，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导培养基上，在茎段芽的诱导培养同样的环境条件下培养15d，当新芽萌发苗长至1cm时将组培瓶苗放入光照培养箱内，光照12h/d，光照强度3000Lx，按昼夜温度28℃~32℃、30℃~35℃、33℃~38℃的顺序，每2d变换一档，使组培苗逐渐适应高温生长环境，然后在33℃~38℃下继续热处理脱毒培养30d，组培苗生长势逐渐变弱，叶色变浅，当组培苗坏死约50%~60%时，选取具有一定活力的组培苗，在无菌操作台上置组培苗于生物镜下放大100倍，剥取0.1~0.3mm的茎尖作为外植体，接种于茎尖诱导培养基Ⅰ，进行茎尖诱导培养，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养25d，将已有萌动的茎尖转接至茎尖诱导培养基Ⅱ，在同样环境条件下培养30d，将明显转绿的茎尖组织转接至茎尖诱导培养基Ⅰ，在同样环境条件下培养30d，如此交替培养，至形成生长正常的有1片~2片展开叶的幼苗；

（7）生根培养：将经过上述方法检测未发现切花菊病毒的组培苗，即步骤（5）培养的组培苗切成带1个~2个腋芽的茎段，直接转接至生根培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度2000Lx的环境条件下培养25d，形成具有5片~7片叶片和4条~6条完整根系的脱毒组培苗。

实施例3

在本实施例中：在浙江淳安地区采集紫花野菊驯化品种在杭州进行组织培养，于2017年4月中旬选取高度7-10cm的生根组培苗200瓶，平均每瓶10棵，进行杭州温室移栽试验。

具体操作步骤：组培苗经清水清洗，沥干水分，自然风干。用药剂（50%多菌灵可湿性粉剂600倍、97%恶霉灵1700~2000倍、80%代森锰锌可湿性粉剂400-600倍、40%嘧菌酯800-1000倍）消毒配置好的基质。将晾干的组培苗插入处理好的泥炭基质中进行穗条培养。经1-2个月的生长将7-10cm的嫩芽剪下蘸取生根粉。生根椰糠基质拌入消毒药剂（50%多菌灵可湿性粉剂600倍、80%代森锰锌可湿性粉剂400-600倍、43%戊唑醇3000-5000倍、50%烯酰吗啉可湿性粉剂1500-2000倍）进行消毒，铺满扦插苗床。将处理好的穗条进行生根扦插。穗条生根后将其移栽到大田中。观测组培苗出瓶后种苗成活率及大田移栽的生长情况。

结果分析：紫花野菊的组培苗从出瓶数量，到田间扦插穗条数为组培苗成活率的统计，以此为检验基础，进行紫花野菊组培苗的成活率鉴定。紫花野菊的田间种植要求出花率高，且花朵大，花瓣厚，以此来判断组培苗的移栽质量。结果表明，在杭州基地种植的紫花野菊组培苗成活率为80%，高于原始分株栽培种植，及低海拔穗条扦插成活率。该方法移栽的种苗出花率高，且花朵大、花瓣厚，可以达到高山栽培种植水平。

实例4

在本实施例中：在浙江淳安地区采集紫花野菊驯化品种在杭州进行组织培养，于2017年5月选取高度7-10cm的生根组培苗200瓶，平均每瓶10棵，进行浙江海宁田间移栽试验。

具体操作步骤：组培苗经清水清洗，沥干水分，自然风干。用药剂（50%多菌灵可湿性粉剂600倍、97%恶霉灵1700~2000倍、80%代森锰锌可湿性粉剂400-600倍、40%嘧菌酯800-1000倍）消毒配制好的基质。将晾干的组培苗插入处理好的泥炭基质中进行穗条培养。经1-2个月的生长将7-10cm的嫩芽剪下蘸取生根粉。生根椰糠基质拌入消毒药剂（50%多菌灵可湿性粉剂600倍、80%代森锰锌可湿性粉剂400-600倍、43%戊唑醇3000-5000倍、50%烯酰吗啉可湿性粉剂1500-2000倍）进行消毒，铺满扦插苗床。将处理好的穗条进行生根扦插。穗条生根后将其移栽到大田中。观测组培苗出瓶后种苗成活率及大田移栽的生长情况。

结果分析：紫花野菊的组培苗从出瓶数量，到田间扦插穗条数为组培苗成活率的统计，以此为检验基础，进行紫花野菊组培苗的成活率鉴定。紫花野菊的田间种植要求出花率高，且花朵大，花瓣厚，以此来判断组培苗的移栽质量。结果表明，在浙江海宁基地种植的紫花野菊组培苗成活率为80%，高于原始分株栽培种植，及低海拔穗条扦插成活率。该方法移栽的种苗出花率高，且花朵大、花瓣厚，可以达到高山栽培种植水平。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质，其特征在于，所述组培基质由分阶段依次顺序使用的诱导培养基组合、脱毒茎尖诱导培养基组合、壮苗培养与增殖培养基组合、生根培养基组合组成：

壮苗培养与增殖培养基组合：其包括依次顺序使用的壮苗培养基和增殖培养基。

2.根据权利要求1所述的一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质，其特征在于，所述外植体诱导培养基的配方为：MS+6-BA0.2~1.0 mg/L + IBA 0.1~0.5mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质，其特征在于，所述茎尖诱导培养基Ⅰ的配方为：蔗糖20~30g/L，琼脂粉4~5 g/L，pH5.6~5.8的1/2 B5+Ca（NO3）2、500mg/L+1/2 B5+Ca（NO3）2 500mg/L+6-BA 0.01~0.2 mg/L + NAA 0.1~0.2mg/L+AC 0.5~1.0mg/L；

所述茎尖诱导培养基Ⅱ的配方为：普通培养基+MS+6-BA 0.1~0.2mg/L+ IBA 0.1~0.2mg/L；

根据权利要求1所述的一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质，其特征在于，所述外植体初代诱导、壮苗培养基中也含有所述普通培养基，所述普通培养基的配方为：蔗糖25~35g/L，琼脂粉4~5 g/L，pH5.6~5.8。

4.根据权利要求1所述的一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质，其特征在于，所述生根培养基组合的配方为蔗糖30g/L，琼脂粉4~5 g/L，pH5.6~6.0的1/2MS培养基。

5.根据权利要求1所述的一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培基质，其特征在于，所述增殖培养基的配方为蔗糖20~35g/L，琼脂粉4~5 g/L，pH5.6~5.8的T20-4培养基，其1L培养基中的配制成分含量如下：KNO₃:1250mg、NH4NO₃:225mg、KH₂PO₄:175mg、MgSO₄·7H₂O:325mg、CaCl₂:165mg、KI:0.83mg、H₃BO₃:6.2mg、MnSO₄·4H₂O:22.3mg、ZnSO₄·7H₂O:8.6mg、CuSO₄·5H₂O：0.025mg、CoCl₂·6H₂O：0.025mg Na2MnO₄·2H₂O：0.25mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO₄·7H2O:27.8mg、肌醇：100mg、烟酸0.5mg、盐酸吡哆醇0.5mg、盐酸硫胺素0.1mg、甘氨酸2.0mg。

6.一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培方法，其特征在于，所述方法使用如权利要求1或2或3或4或5所述的基质，所述方法包括以下步骤：

7.根据权利要求1所述的一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培方法，其特征在于：步骤（3）中方法具体如下：茎段芽的诱导培养，取灭菌后种源茎段切成每节带一个腋芽为一段，作为外植体，接种于外植体诱导培养基上，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养30d至诱导出茎段芽；将该茎段芽切下转接在外植体初代诱导培养基上，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导培养基上，在上述环境条件下培养30d进行扩繁，重复接种培养直至足够数量用于脱毒茎尖诱导培养。

8.根据权利要求1所述的一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培方法，其特征在于：步骤（4）中，具体方法如下：将预先培养的组培苗，当苗长高至6cm~7cm，将苗切成带1个~2个腋芽的茎段，转接至外植体诱导培养基上，在茎段芽的诱导培养同样的环境条件下培养15d，当新芽萌发苗长至1cm时将组培瓶苗放入光照培养箱内，光照12h/d，光照强度3000Lx，按昼夜温度28℃~32℃、30℃~35℃、33℃~38℃的顺序，每2d变换一档，使组培苗逐渐适应高温生长环境，然后在33℃~38℃下继续热处理脱毒培养30d，组培苗生长势逐渐变弱，叶色变浅，当组培苗坏死约50%~60%时，选取具有一定活力的组培苗，在无菌操作台上置组培苗于生物镜下放大100倍，剥取0.1~0.3mm的茎尖作为外植体，接种于茎尖诱导培养基Ⅰ，进行茎尖诱导培养，在温度24±1℃，光照12h/d，光照强度3000Lx的环境条件下培养25d，将已有萌动的茎尖转接至茎尖诱导培养基Ⅱ，在同样环境条件下培养30d，将明显转绿的茎尖组织转接至茎尖诱导培养基Ⅰ，在同样环境条件下培养30d，如此交替培养并形成幼苗。

9.根据权利要求6所述的一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培方法，其特征在于，所述步骤（8）中，组培苗移栽具体方法如下：瓶苗上覆盖70%的遮荫网，在大棚内施置15d，使组培苗适应自然光照条件，将组培苗瓶盖打开，早晚不遮荫，中午强光时段在组培瓶苗上覆盖70%的遮荫网，对组培苗开瓶煅炼3d~5d，然后小心取出组培苗，在清水中洗去培养基，将组培苗移栽至准备好椰糠为基质的苗床中，上述种苗移栽前一星期将椰糠块铺放在苗床上，先浇透水使椰糠块松开，并在基质中施入复合肥N-P-K（15-15-15）20kg/亩，椰糠厚度6cm~8cm，种植深度以将基质覆盖到生根节位部为宜，小心将根系展开于基质中，轻压根部，然浇透定根水，3月中旬后移栽需要遮盖70%遮荫率的遮阳网，防止因强光造成叶片损伤和萎蔫，约一星期根系恢复生长后可去掉遮荫网，组培苗移栽成活率达95%以上，组培苗长至8cm~10cm高时，可摘心促进侧枝发生，当侧枝生长至8cm~10cm时，进行采穗，侧枝基部留3叶~4叶，插穗长度5 cm～6 cm。

10.根据权利要求1所述的一种适于切花菊热处理茎尖脱毒组培方法，其特征在于：步骤（9）中，所述扦插育苗使用椰糠作为基质，厚度约为8 cm，在地面苗床上使用泥炭作基质，厚度15cm~18cm；