CN110741927B - 抗除草剂油菜突变体m342的化学杀雄方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗除草剂油菜突变体M342的化学杀雄方法，所述化学杀雄方法包括选用ALS3基因突变的抗除草剂油菜M342为诱导材料，通过喷施化杀诱导剂诱导整株植株花蕾产生雄性不育。本发明还公开了所述的化学杀雄方法在抗除草剂油菜的杂交育种方面的应用。本发明能有效诱导植株全部花蕾产生雄性不育，不育率和不育度均达到100%，诱导植株在自然状态下自由授粉，不育株的结角率和结实率正常，充分表明本发明基于ALS基因突变的抗除草剂油菜化学杀雄技术的安全性和稳定性，为化杀杂交种生产提供了一种高效、可靠的新技术。

Description

抗除草剂油菜突变体M342的化学杀雄方法及其应用
技术领域
本发明涉及到一种抗除草剂油菜突变体M342的化学杀雄方法及其应用，属植物育种领域，具体涉及利用抗磺酰脲类除草剂油菜M342进行化学杀雄的方法及其抗除草剂油菜的杂交育种方面的应用。
背景技术
甘蓝型油菜化学诱导雄性不育系是利用杀配子剂或化学杂交剂(简称CHA)处理常规油菜品种(或品系)的花蕾而诱导产生的一种雄性不育现象。化学诱导的雄性不育系在杂交油菜品种选育中具有诸多优点，如目前所有的常规油菜品种(或品系)都可以通过化学诱导成为雄性不育，同时所有的常规油菜品种(或品系)都是其恢复系，因此杂交组合的亲本来源广泛，选配自由，容易选配到强优势组合，并大大缩短了育种周期。由于化学诱导雄性不育所具有的明显优势，近年来受到油菜育种家的高度关注，全国许多科研院所、高等院校和种业公司都先后开展了化学杀雄杂交育种工作，成为油菜杂种优势利用的一个重要途径。当前应用最广泛、杀雄效果较好的化杀诱导剂为低剂量磺酰脲类除草剂苯磺隆，一般诱导正常油菜雄性不育的药剂浓度为4～6mg/L，每株用药剂量为6～8ml，在油菜主花序最大花蕾长度约2～3mm时，即油菜花粉母细胞单核期，喷施第1次化杀诱导剂，12天后再复喷一次(于澄宇，何蓓如，氨基酸合成抑制剂类除草剂诱导油菜雄性不育效果评价，作物学报，2014，40(2)：264～272)。配制的化杀杂交种主要有2大类，一是以常规油菜品种(或品系)喷施化杀剂诱导不育系作母本，用另一常规油菜品种(或品系)作父本，配制普通杂交油菜品种。该方法配制的杂交油菜品种在杂交种生产时，当母本喷施苯磺隆化杀剂时需要对父本进行遮挡，以防苯磺隆化杀剂漂移到父本，影响制种产量。二是以常规油菜品种(或品系)喷施化杀剂诱导不育系作母本，用抗除草剂的油菜品种(或品系)作父本，配制抗除草剂的杂交油菜品种(刘克德，吴江生，刘超，李海涛，李娟娟，赵波，利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法，CN 104126496 A)。该方法配制的杂交油菜品种具有除草剂抗性，在杂交种生产时，母本喷施苯磺隆化杀剂无需对父本进行遮挡，便于杂交种生产。但配制的杂交油菜品种能否在生产上使用SU类除草剂进行杂草的化学防控，需要视父本的抗性效应而定。生产上安全使用除草剂的浓度应为除草剂有效杀草浓度的2～3倍以上，由于除草剂突变体的抗性为不完全显性，一般F1杂交种的抗性仅为亲本的1/2左右，若要F1杂交种的抗性达到除草剂有效杀草浓度的2～3倍以上，则父本对除草剂的抗性必须要达到除草剂有效杀草浓度的4倍以上，否则在实际生产应用中不能使用除草剂或使用除草剂存在较大的风险。
虽然化学诱导雄性不育在杂交油菜新品种选育中具有诸多优点，但在杂交种生产过程中也存在许多技术难点。首先，剂量浓度不易确定。目前应用的化杀剂苯磺隆是一种磺酰脲类除草剂，在单子叶作物生产中防治双子叶杂草，油菜为双子叶作物，对磺酰脲类除草剂极为敏感，并且不同油菜品种对苯磺隆的耐受程度也存在较大基因型差异。油菜蕾薹期即使喷施4～6mg/L低剂量的苯磺隆对较敏感的品种也会产生不同程度的药害，影响制种产量，而对不敏感的品种化杀效果会变差，化杀不彻底，花蕾产生的花粉会影响制种质量。其次，喷药时期较难把握。同一油菜品种在不同田块种植，因肥力水平、土壤水份、管理程度不同，生育进程有较大差异，甚至同一田块因肥水差异，油菜的生育进程也不一致，需要针对每一块田检查生育进程，才能确定喷药时期，工作量较大。再次，药剂适喷期较窄。从油菜主花序最大花蕾长度约2～3mm时第1次喷药，到第2次喷药中间只有12天左右时间，如果适喷期内遇到连续阴雨天气，喷药必将推迟，错过适喷期会严重影响化杀效果与制种质量，甚至导致制种失败。第四，喷施4～6mg/L低剂量苯磺隆的技术要求较高，药剂浓度配制要精准，喷药人员要专业，剂量稍有差异或喷药人员走动的快慢都会影响化杀效果与制种质量。因此，用苯磺隆化杀剂诱导常规油菜品种(或品系)作不育系，在大规模杂交种生产中还有许多技术难点需要克服。创新化学杀雄技术，改进现有技术不足，对进一步提高化学诱导雄性不育杂交种制种质量和产量具有重要意义。
发明内容
发明目的：我们通过EMS诱变创制了一批基于ALS基因突变的抗除草剂油菜新种质，并按常规方法对获得的抗性新种质在油菜苗期进行抗性效应鉴定，其中M342苗期鉴定的抗性效应达到了苯磺隆除草剂有效杀草浓度的3～4倍(即1350～1800mg/L药液浓度，用药量每亩30L药水)，但在更高除草剂浓度下也会严重影响菜苗生长，产生药害症状。为了更全面了解M342在油菜不同生长时期对苯磺隆除草剂的抗性，我们在油菜生长过程的返青期、抽薹期和蕾薹期分别喷施不同浓度的苯磺隆除草剂，发现返青期和抽薹期在喷施1～2倍(即450～900mg/L药液浓度，用药量每亩30L药水)液浓度的苯磺隆后，开花植株雄蕊退化无花粉，而雌蕊发育正常。这一偶然发现的现象提示我们尽管M342是基于ALS3基因突变的抗除草剂油菜材料，对磺酰脲类除草剂苯磺隆的抗性达到了苯磺隆除草剂有效杀草浓度的3～4倍，但在蕾薹期喷施低于抗性浓度的苯磺隆是否也能完全诱导雄性不育？为此，我们对抗性突变体M342在油菜蕾薹期再次喷施1倍液(450mg/L，用药量每亩30L药水)和2倍液(900mg/L，用药量每亩30L药水)浓度的苯磺隆除草剂，喷等量清水作对照，油菜开花后调查植株育性，发现处理植株都诱导成了雄性不育，而对照花药正常，证实了我们的猜想。本发明正是基于上述背景提出的抗除草剂油菜化学杀雄技术及其应用方法。
本发明能够弥补已有专利或技术的不足，提供了一种抗除草剂油菜的化学杀雄方法及其应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗除草剂油菜突变体M342的化学杀雄方法，所述化学杀雄方法包括选用ALS3基因突变的抗除草剂油菜M342为诱导材料，通过喷施化杀诱导剂诱导整株植株花蕾产生雄性不育。
其中，所述化杀诱导剂喷施适宜时间为在油菜春季返青后到自然生长状态下植株主花序现蕾期间任意时期。
其中，所述化杀诱导剂喷施最适时间为冬油菜区油菜开始抽薹至拨开植株主花序心叶能明显看到花蕾为至。
其中，所述化杀诱导剂为苯磺隆。
其中，所述苯磺隆的浓度为225mg/L～900mg/L。
本发明内容还包括所述的化学杀雄方法在抗除草剂油菜的杂交育种方面的应用。
其中，所述杂交育种以抗除草剂油菜突变体M342作母本诱导不育系，父本选择相应的抗除草剂油菜进行杂交。
其中，所述父本选用ALS1和ALS3双基因突变的抗除草剂油菜或ALS1基因突变的抗除草剂油菜。
其中，当所述父本选用ALS3基因突变的抗除草剂油菜，其基因的突变位点必须和母本M342相同。
本发明内容还包括以下的在抗除草剂油菜的杂交育种的具体步骤中的一个或多个：
A、母本诱导材料的选用：选择由ALS3基因突变的抗除草剂油菜M342为材料，诱导雄性不育作杂交种的母本；
B、诱导剂的适喷时期：用抗除草剂油菜M342为诱导材料，诱导剂适喷期较长，冬油菜可从油菜春季返青后一直到自然生长状态下植株主花序现蕾为至，最适喷施期为油菜开始抽薹至拨开油菜主花序心叶能明显见到花蕾为至，在适喷施期内诱导剂喷施宜早不宜迟；
C、诱导剂的喷施剂量：由于雄性不育的诱导材料M342为ALS3基因突变的抗除草剂油菜，对苯磺隆有较强耐受性，喷施的剂量也要相应提高，我们推荐诱导剂喷施浓度为苯磺隆除草剂杂草防控的推荐剂量，即10％苯磺隆15克兑水30L/亩(450mg/L，用药量每亩30L药水)，按母本实际面积喷施，这一剂量可有效兼顾大田的杂草防控，一举多得。
D、杂交父本材料选择：用ALS3基因突变的抗除草剂油菜M342作母本诱导不育系，为了配制高抗除草剂的杂交品种，父本材料也需应用相应的抗除草剂油菜，优先选择以ALS1+ALS3双基因突变的抗除草剂油菜，也可选用ALS1基因突变的抗除草剂油菜，以确保配制的杂交品种具有双基因抗性。
E、如果父本选用ALS3基因突变的抗除草剂油菜，其基因的突变位点必须和母本M342相同，在单基因抗性条件下必须确保配制的抗除草剂杂交品种抗性基因型是纯合，有利于提高杂交种的抗性水平。
所述的方法在抗除草剂油菜M342的化学杀雄方法在抗除草剂油菜杂交育种方面的具体应用，包括以下步骤：
1)选用ALS3基因突变的抗除草剂油菜M342作诱导材料，在油菜开始抽薹至拨开主花序心叶能明显见到花蕾的最适喷施期或油菜春季返青至自然状态下主花序现蕾的适宜喷施期内喷施喷施1倍液(450mg/L，用药量每亩30L药水)～2倍液(900mg/L，用药量每亩30L药水)浓度的苯磺隆除草剂诱导雄性不育作为母本材料；
2)父本材料优先选择以ALS1+ALS3双基因突变的抗除草剂油菜或以ALS1基因突变的抗除草剂油菜；如果父本选用ALS3基因突变的抗除草剂油菜，其突变位点应与母本相同；
3)父母本同为抗除草剂材料配制的杂交组合，可确保选育的杂交油菜品种高抗除草剂。如以ALS3基因突变的抗除草剂油菜作母本和ALS1+ALS3双基因突变的抗除草剂油菜或ALS1基因突变的抗除草剂油菜作父本配制的杂交组合，F1杂交种具有ALS1和ALS3双基因抗性；如以ALS3基因突变的抗除草剂油菜作母本和ALS3基因同位点突变的抗除草剂油菜作父本配制的杂交组合，F1杂交种具有ALS3抗性纯合基因型，从而确保了选育的杂交油菜除草剂抗性能够达到安全生产标准。
作为进一步优选的，所述父本为高抗磺酰脲类除草剂油菜突变体DS3。
有益效果：本发明通过上述方法，在确保化学诱导雄性不育杂交油菜品种选育诸多优点的基础上，同时有效克服了杂交种生产中的许多技术难题，为抗除草剂杂交油菜种子生产提供了安全、高效、可靠的新技术、新方法。
1、油菜是双子叶作物，对为单子叶作物开发的防治双子叶杂草的除草剂极为敏感，因此应用磺酰脲类除草剂苯磺隆作为油菜雄性不育诱导剂，存在较大的技术风险，喷施不当极易发生不同程度的药害，影响制种产量和质量。磺酰脲类除草剂苯磺隆是以ALS为靶标开发的除草剂，所以应用基于ALS基因突变的抗除草剂油菜进行化学杀雄，可有效解决上述技术难题。
2、由于常规油菜对化杀剂苯磺隆极为敏感，而且不同油菜品种对苯磺隆的耐受程度也存在较大差异，喷施量过重会产生药害，过轻化杀效果又较差，喷施剂量不易确定，一般需要对诱导材料进行多年、多点的化杀剂梯度浓度试验，才能最终确定适宜的喷施剂量。而M342抗除草剂油菜对苯磺隆具有较好的抗性，剂量浓度范围较宽，因此喷施苯磺隆除草剂杂草防控推荐剂量的1倍液浓度(450mg/L，用药量每亩30L药水)，对抗除草剂油菜M342是极其安全的，喷施剂量也不需要十分精准。
3、常规油菜化杀剂适喷期为第1次喷药在油菜主花序最大花蕾长度约2～3mm时，第2次复喷中间只有10多天时间，化杀剂适喷期较窄，喷药时间较难把握。油菜不同基因型材料生育进程存在较大差异，即使是同一品种在不同田块种植，因肥力水平、土壤水份、管理程度不同，生育进程也有很大差异，甚至同一田块不同地段因肥水差异，生育进程也不一致，喷药时间较难把握，喷药前需要每块田检查植株生育进程，确定花蕾大小，才能确定喷药时期，不仅工作量较大，而且技术要求较高。应用M342抗除草剂油菜为诱导材料，诱导剂适喷期可从油菜春季返青后一直到自然状态下植株主花序现蕾，最适喷施期为油菜开始抽薹至拨开植株主花序心叶能明显见到花蕾，这一时期冬油菜区长达1～2个月时间，化杀剂适喷期较宽，喷药时间较长。
4、由于常规油菜化杀剂适喷期较窄，如在油菜适喷期内遇到连续多天阴雨天气，按期喷药必会影响化杀效果，而推迟喷药，又极易错过适喷期，影响化杀效果与制种质量，甚至导致制种失败。而M342抗除草剂油菜化杀剂适喷期较宽，冬油菜区适喷期长达1个多月，只要在适喷期内选择睛天喷药即可。
5、常规油菜化杀由于喷施的化杀剂浓度仅为4～6mg/L，剂量极低，因此喷药的技术要求较高，药剂浓度须精准配制，喷药人员需专业培训，因为低剂量药剂喷施如果浓度配制不精准或喷药人员走动有快慢都会导致化杀剂喷施过量或不足，影响化杀效果与制种质量。而M342抗除草剂油菜化杀剂喷施剂量较高，且浓度范围较宽，推荐剂量为苯磺降杀草浓度的1倍液(450mg/L)，有效浓度范围为0.5倍液(225mg/L)～2倍液(900mg/L)，喷药技术要求不高，一般生产人员都能胜任。
6、常规油菜诱导雄性不育需要喷施2次化杀剂，而M342抗除草剂油菜只需喷施1次化杀剂，且可有效兼顾母本大田的杂草防控，一举多得，节工省本。
7、本发明在抗除草剂油菜的杂交育种中是以抗除草剂油菜诱导不育系作母本，同时选用抗除草剂油菜作父本，育成的杂交品种可高抗磺酰脲类除草剂，生产上有广阔的应用价值。
附图说明
图1喷施苯磺隆的诱导效果(右边为经苯磺隆诱导的不育花序，左边为正常花序)
图2喷施1倍液(450ppm)和2倍液(900ppm)浓度苯磺隆植株自交结角情况；
图3喷施1倍液(450ppm)和2倍液(900ppm)浓度苯磺隆植株自由授粉的结角情况。
具体实施方式：
实施例1：抗除草剂突变体M342诱导雄性不育的适喷期
抗磺酰脲类除草剂油菜突变体M342是ALS3基因的574位点(参照拟南芥的氨基酸位置)由色氨酸(Trp)突变成亮氨酸(Leu)，其突变体对磺酰脲类除草剂苯磺隆的抗性浓度为苯磺隆除草剂有效杀草浓度的3～4倍(胡茂龙，浦惠明，龙卫华，高建芹，张洁夫，陈松，陈锋，付三雄，周晓婴，张维，彭琦，戚存扣，一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用，ZL201310111739.5)，秋季将M342正常直播于江苏省农业科学院溧水植物科学试验基地油菜育种田，油菜生长期间田间管理同于大田。
第2年春季，分别在油菜越冬后开始返青时、油菜开始抽薹时、拨开植株主花序心叶能明显见到花蕾时和在自然状态下植株主花序现蕾4个时期，各喷施苯磺隆除草剂杂草防控推荐剂量的1倍液(450mg/L)和2倍液浓度(900mg/L)，以喷等量清水作对照，每个处理喷5行，小区面积6.67m2。
油菜初花后每隔5天检查开花花药中的花粉，直到油菜终花期，喷施1倍液浓度和2倍液浓度的各个处理，均没有发现有花粉或有微粉的植株，不育诱导率达到100％。自然状态下主花序现蕾处理的植株开花期较其他3个处理要推迟3-5天，其中喷施1倍液浓度的植株花期推迟3天左右，喷施2倍液浓度的植株花期推迟5天左右，即在适喷期内化杀诱导剂的喷施宜早不宜迟。而喷等量清水的对照植株开花正常。
结角后期观察在自由授粉状态下植株的结角率和结实率，植株结角率和结实率正常，处理间无明显差异。
实施例2：抗除草剂突变体M342诱导雄性不育的剂量浓度
秋播在江苏省农业科学院油菜育种田直播种植抗磺酰脲类除草剂突变体M342，试验分成二组共4个外理，其中一组在油菜4叶期喷苯磺隆除草剂防控杂草，设喷施1倍液(450mg/L)和2倍液(900mg/L)浓度处理。另一组为人工除草，油菜苗期不喷施苯磺隆除草剂防治田间杂草。小区处理面积6.67m2，5行区。
第2年春季油菜抽薹后，待大部分植株拨开主花序心叶见到花蕾时各处理再喷施化杀剂苯磺隆。杂草化控和人工除草的二个组都分别喷施1倍液(450mg/L)和2倍液(900mg/L)浓度的苯磺隆。以喷等量清水作对照。
油菜初花后检查开花花药中的花粉，结果苗期喷施苯磺隆除草剂防控杂草+花蕾期喷施1倍液和2倍液苯磺隆化杀剂的2个处理和苗期不喷施苯磺隆除草剂仅花蕾期喷施1倍液和2倍液苯磺隆化杀剂的2个处理不育诱导率均达到100％，没有发现有花粉或有微粉的植株。同时试验还表明苗期喷施苯磺隆除草剂进行杂草化学防控，对M342蕾薹期雄性不育诱导没有任何影响，即对蕾期喷施苯磺隆化杀剂诱导雄性不育的油菜，苗期可正常使用苯磺隆除草剂进行田间杂草的化学防控。而喷等量清水的对照植株开花正常。
每个处理分别随机选择5株植进行套袋自交，隔绝外来花粉对不育株授粉，其他植株在自然状态下自由授粉。
油菜终花前再次检查正在开花花药中的花粉，4个处理均没有发现有花粉或有微粉的植株，表明喷施1倍液和喷2倍液浓度的化杀剂均能稳定诱导M342整株植株花蕾产生雄性不育。
油菜结角后期检查套袋植株花序的结角率和结实率，4个处理均未发现有效角果，结角率和结实率为0％，表明M342蕾薹期只要喷施1倍液浓度的苯磺隆就能完全诱导整株植株花蕾产生雄性不育，不育诱导率达到100％(图1、图2)。在自然状态下自由授粉的植株结角率和结实率良好，处理间无明显差异(图3)。
实施例3：高抗除草剂杂交组合的配制
将抗磺酰脲类除草剂油菜突变体M342作母本，高抗磺酰脲类除草剂油菜突变体DS3作父本(胡茂龙，浦惠明，龙卫华，高建芹，张洁夫，陈松，彭琦，陈锋，付三雄，周晓婴，张维，王晓东，具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用，CN201710568511.7)，秋播直播种植于6×30m隔离大棚内，父母本行比为2∶4。
第2年春季油菜抽薹后，待大部分母本植株拨开主花序心叶见到花蕾时喷施1倍液(450mg/L)苯磺隆，诱导母本雄性不育。母本开花时用60目尼龙网罩将大棚隔离，防止外来花粉串粉，影响制种纯度。母本终花后将尼龙网罩去除，并将父本提前收割，以防母本收割时机械混杂。
油菜成熟后及时收获，收获的母本种种子即为(M342×DS3)F1杂交种子。我们将M342母本、DS3父本和F1杂交种在3～4叶的苗期进行抗性效应鉴定，苯磺隆的药液浓度设为0(CK)、1倍、2倍、4倍、8倍、12倍和16倍的梯度浓度(1倍浓度为450mg/L，2倍浓度为900mg/L，4倍浓度为1800mg/L，8倍浓度为3600mg/L，12倍浓度为5400mg/L，16倍浓度为7200mg/L，亩用药量30kg)，结果表明M342对SU类除草剂苯磺隆的抗性为苯磺隆除草剂有效杀草浓度的3～4倍，DS3对SU类除草剂苯磺隆的抗性为苯磺隆除草剂有效杀草浓度的12～16倍，(M342×DS3)F1杂交种对SU类除草剂苯磺隆的抗性为苯磺隆除草剂有效杀草浓度的8倍(表1)。生产上安全使用除草剂的浓度应为除草剂有效杀草浓度的2～3倍以上，因此(M342×DS3)F1杂交种可安全用于大田生产。
表1 2个抗除草剂油菜配制的F1代杂交种的抗性表现
Figure BDA0002277314160000091
注：表1中的R代表除草剂处理后油菜植株生长良好，无药害表现；R-代表除草剂处理后油菜植株生长受到一定程度抑制，出现药害表型，但是植株不会死亡，能正常结实；S代表除草剂处理后油菜植株生长受到严重抑制，药害表现明显，部分植株最终死亡)。
综上，抗磺酰脲类除草剂油菜突变体M342，在春季油菜开始抽薹至拨开植株主花序心叶能明显见到花蕾时，喷施苯磺隆除草剂推荐使用剂量浓度，就能有效诱导植株全部花蕾产生雄性不育，不育率和不育度均达到100％，诱导植株在自然状态下自由授粉，不育株的结角率和结实率正常，充分表明本发明基于ALS基因突变的抗除草剂油菜化学杀雄技术的安全性和稳定性，为化杀杂交种生产提供了一种高效、可靠的新技术。

Claims (1)

1.一种抗除草剂油菜突变体M342的化学杀雄方法，其特征在于，所述化学杀雄方法包括选用ALS3基因突变的抗除草剂油菜M342为诱导材料，通过喷施化杀诱导剂诱导整株植株花蕾产生雄性不育，所述化杀诱导剂喷施时间为冬油菜区油菜开始抽薹至拨开植株主花序心叶能明显看到花蕾为止 ，所述化杀诱导剂为苯磺隆，所述苯磺隆的浓度为450 mg/L～900 mg/L。
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