CN111109075A - 一种抗草甘膦、高亚麻酸的甘蓝型油菜选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗草甘膦、高亚麻酸的甘蓝型油菜的选育方法，选用抗草甘膦油菜与高亚麻酸油菜杂交，对衍生后代的大量单株进行接受草甘膦抗性以及高亚麻酸含量的双重筛选，即，筛选抗草甘膦且具有高亚麻酸品质的株系；经过若干世代选择，使得有关的基因型纯合，同家系单株间草甘膦抗性一致稳定且亚麻酸含量稳定高于15％，即获得抗草甘膦、高亚麻酸的甘蓝型油菜。草甘膦抗性使得高亚麻酸油菜能够适应化学除草，适应轻简化栽培要求，增加种植效益，拓展到难以估量的市场应用前景。

Description

一种抗草甘膦、高亚麻酸的甘蓝型油菜选育方法

技术领域

本发明属于农作物新品种培育领域，特别是一种兼具有除草剂草甘膦 抗性的高亚麻酸甘蓝型油菜选育方法。

背景技术

人类的美好生活需求对富含ω-3类脂肪酸的食用油的需求日益增长。 α-亚麻酸(符号C18:3，英文缩写LNA或ALA)是一种代表性的植物源ω -3类脂肪酸。动物(例如深海鱼虾)和人类摄入α-亚麻酸，就可以合成另 外两种ω-3类脂肪酸EPA和DHA。EPA和DHA分别被誉为血管清道夫、脑黄 金，对于保持人体健康具有十分重要的医疗保健功能。α-亚麻酸作为人体 自身不能合成而必须从食物中获得的一种必需脂肪酸，在人体新陈代谢的 过程中是不可缺少的成分，对人体的生长发育起着重要作用，所以被誉为 “陆地鱼油”。健康理念使得大众消费对多不饱和脂肪酸(PUFA)的需求大 为增加，世界卫生组织推荐的ω-3:ω-6(一般指亚油酸)的理想摄入比值 1:5左右，欧美发达国家膳食摄入该比例可以达到1:10～1:20，而目前国内食 用油ω-3严重不足，该比值在1:20～1:40(孙翔宇等，多不饱和脂肪酸的研 究进展，食品工业科技，2012，33(7):418-423)。

在通常的食物中，α-亚麻酸的含量极少，必须要靠改善食用油脂的成 分来补充。尤其中国人食谱普遍缺乏深海、远洋动物产品，更需要人工补 充ω-3。市场上所供应ω-3医疗保健油产品一般有两类：一类是富含EPA 和DHA的深海鱼油软胶囊，一类是富含α-亚麻酸的亚麻籽油或紫苏油等。 由于ω-3原料不足，过度捕捞导致深海鱼类产量日益不足，市场销售的鱼 油胶囊以假冒伪劣产品居多；而亚麻籽和紫苏等栽培区域面积小，产量低， 远不能满足市场需求。

油菜(rapeseed)是世界广泛种植的油料作物之一，是重要的食用油源 和蛋白质饲料来源，也是重要的工业原料。我国油菜种植面积和总产量均 居世界首位，然而每年的生物和非生物胁迫都对油菜的高产稳产造成严重 威胁，提高油菜抗胁迫能力将能显著提高产量。研究发现，杂草是油菜生 产过程中最重要的生物胁迫之一，严重影响油菜的产量和品质。是油菜高 产的主要障碍之一，不仅造成油菜大幅减产，还花费了大量的劳动力除草。 因此，对杂草的有效防治与根除对油菜生产具有重大意义。影响油菜生产 的杂草种类繁多，化学除草对施药时间和剂量都有严格要求，对作物有一 定的适用范围，对杂草有一定的选择性，往往难以达到理想的效果。因此， 培育和推广抗除草剂油菜品种可以有效控制草害，减少中耕除草用工，提 高油菜产量，增加效益。

甘蓝型油菜是世界第二大油料作物，中国本土第一大油料作物。由于 低芥酸油菜籽的脂肪酸中含有的亚麻酸(7-12％，平均9％左右)、亚油酸 (15-30％)、油酸(55-65％)三者合计可达93％左右，被认为是营养价值最 高的植物油。油菜在中国、加拿大、欧盟、印度等主要生产区域均有数千 万亩至上亿亩的栽培，在食用油中占25％以上比重。因此提高油菜油中亚麻 酸的比例可以显著地提高人类食物亚麻酸供给，极大地提升油菜的营养价值。

草甘膦是一种甘氨酸的衍生物，生产成本较低，其作为一种非选择性 的内吸传导型除草剂，除草效果较好，在生产中应用广泛，有研究报道， 草甘膦浓度为1200mg/L就能有效杀灭杂草。

在本领域，籽粒脂肪酸中亚麻酸比例≥15％的油菜被称为“高亚麻酸油 菜”(西北农林科技大学，于澄宇，练景龙，任莉锁等.一种高亚麻酸油菜供 体及其应用，中国专利申请，申请号201811207490.7。陕西省杂交油菜研 究中心(http://www.sxhrrc.com/news/697.html)等机构相继发现了高亚麻酸 油菜)。

申请人在长期的研究过程中，通过油菜品种间杂交，结合近红外光谱 仪大量筛选资源，2014年、2015年先后得到了5个不同来源的高亚麻酸、 低芥酸、低硫苷资源。其中：

(1)R8Q10(于澄宇，练景龙，任莉锁等，一种高亚麻酸油菜供体及 其应用，中国专利申请，申请号：201811207490.7，其中，高亚麻酸油菜供 体R8Q10的CCTCC保藏号NO：P201820)不同株系、不同年份间亚麻酸含量 15％-21％，含油量42％-47％。

(2)Lv2006的不同株系、不同年份间亚麻酸含量15％-17％，含油量 40％-44％；

(3)YH25005的不同株系、不同年份间亚麻酸含量14％-16％，含油量 41％-46％。

这些变异材料的亚麻酸控制、遗传方式不尽相同，但都比普通油菜的 亚麻酸提高了近一倍以上，为开展高亚麻酸油菜新品种的选育提供了物质 基础。在此基础上，为了在农业生产中进一步提高种植高亚麻酸油菜的简 便性，需要给其赋予抗除草剂等其他新特性。这种优势性状的组合，避免 了品种类型的单调，提高了高亚麻酸油菜新品种的环境适应特性，能够扩 大到难以估量的广阔市场应用前景。但是鉴于高亚麻酸资源的稀缺，还没有抗除草剂的高亚麻酸材料问世，开展抗草甘膦等除草剂的高亚麻酸油菜 育种具有积极的意义。

通过人工诱变或者转基因可以得到抗某些除草剂的植物。一般地，转 基因受强启动子如35S等驱动表达，遵循简单显性孟德尔遗传模式，因此 可做为一种重要的遗传筛选标记。

华中农业大学柳寒、周永明等通过农杆菌介导的遗传转化，将人工合 成改造的抗草甘膦基因CP4-EPSPS(mEPSPS)导入甘蓝型油菜(Brassica napusL.)自交系甲572，获得4株转基因植株，并对转基因后代进行了分 子检测和抗性鉴定分析。分子检测证明，外源mEPSPS基因已整合到转基 因油菜基因组中并能稳定遗传到下一代。各转基因植株中mEPSPS基因能 正确表达，但不同转化植株的基因表达量之间有差异。转mEPSPS油菜自 交一代在稀释100倍的41％农达异丙胺盐制剂(含草甘膦3039mg/L)喷洒 条件下仍能正常生长，而不含转基因的对照植株在稀释200倍农达(含草 甘膦1519mg/L)之后全部死亡。(柳寒，周永明，抗草甘膦基因mEPSPS 转化油菜研究，中国油料作物学报，2012，34(6)：582-585)。其中的人工 改造合成的mEPSPS基因(吴慧敏，抗除草剂水稻培育及应用研究，华中农业大学硕士学位论文2005)，与孟山都等国外公司专利所用CP4-EPSPS 有所不同。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种兼有高亚麻酸、抗草甘膦特性的甘蓝型 油菜选育方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种抗草甘膦、高亚麻酸的甘蓝型油菜选育方法，其特征在于，选用 抗草甘膦油菜与高亚麻酸油菜杂交，对衍生后代的大量单株进行草甘膦抗 性以及高亚麻酸含量的双重筛选，即，筛选抗草甘膦且具有高亚麻酸品质 的株系；经过若干世代选择，使得有关的基因型纯合，同家系单株间草甘 膦抗性一致稳定且亚麻酸含量稳定高于15％，即获得抗草甘膦、高亚麻酸 的甘蓝型油菜。

根据本发明，所述的高亚麻酸油菜种质材料选择R8Q10、YH25005或 Lv2006及其衍生的后代，其种子脂肪酸中亚麻酸含量大于15％。

进一步地，所述的抗草甘膦油菜种质材料是“甲H×6”与油菜自交系 或与品种Z530C、Z716C、Z9B、256B、ZH9、5005B、Sap黄、中双11等 分别杂交/或回交转育而来的品种/品系。

优选地，所述衍生后代的大量单株是植物育种常规的F₁、F₂、F₃、F₄、 F₅、F₆以及往后更多的自交世代，或者回交BC₁、BC₂、BC₃、…，以及往 后更多的回交世代，或者小孢子培养获得的双单倍体世代和群体。

进一步优选地，所述草甘膦抗性以及高亚麻酸含量的双重筛选的具体 方法是：

(1)对于遗传简单的草甘膦抗性，在芽苗期用草甘膦制剂按有效成份 草甘膦5g～100g/亩，兑水10～20Kg，处理幼芽或苗子进行筛选。草甘膦 制剂可以是草甘膦的异丙胺盐，铵盐，钠盐，或者三甲基硫盐等，例如选 用浓度为41％的草甘膦异丙胺盐或者浓度为38％的草甘膦三甲基硫盐，以 25g/亩～250g/亩喷雾、灌溉或涂抹处理植株；或以浓度41％的草甘膦异丙 胺盐或浓度38％的草甘膦三甲基硫盐配制成0.5ml/L～20ml/L的药液，喷雾、 灌溉或涂抹处理植株，然后着重筛选长势良好的抗性个体进行套袋自交繁 殖；

(2)对于遗传复杂的亚麻酸含量，每世代收获植株的种子进行亚麻酸 含量分析，保留亚麻酸含量最高，即亚麻酸含量至少≥13％的若干株系，继 续种植繁衍；

每一世代喷施草甘膦筛选抗性株，每一世代寻求亚麻酸含量比上一代 更高，或当代求亚麻酸含量最高的若干单株；

在入选的高亚麻酸株系后代中，逐世代加大对亚麻酸含量的选择，经 过若干世代的繁殖、筛选、纯化，获得比较性状稳定的草甘膦抗性且高亚 麻酸的甘蓝型油菜。

本发明的抗草甘膦、高亚麻酸的甘蓝型油菜选育方法，主要优势在于， 育成的新品种组合了高亚麻酸、草甘膦抗性两个可遗传的特性。草甘膦抗 性保证了播种的油菜可以化学除草，适应品种轻简化栽培的迫切需求；而 高亚麻酸性状提高了油菜的营养价值，这种性状的组合比普通油菜品种可 以获得更高的市场效益。

具体实施方式

西北农林科技大学从华中农业大学获得了授权使用抗草甘膦油菜种质 材料“甲H×6”，该抗草甘膦油菜种质材料“甲H×6”携带草甘膦抗性基 因mEPSPS。然后利用该草甘膦抗性油菜材料“甲H×6”和本地骨干亲本品 系Z530C、Z716C、Z9B、256B、ZH9、5005B、Sap黄及常规品种中双11等 杂交，然后进行回交和自交转育，培育出了一批适应黄淮生态区的抗草甘 膦转基因油菜新材料。

以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。

一种抗草甘膦、高亚麻酸的甘蓝型油菜选育方法，选用抗草甘膦油菜 与高亚麻酸油菜杂交，后代形成分离群体，染色体中控制草甘膦抗性和亚 麻酸含量的数量性状位点重新组合后，从中大量筛选抗草甘膦苗子套袋自 交结实，筛选亚麻酸含量较高(例如≥13％)的单株；入选单株继续繁殖， 每个世代继续筛选草甘膦抗性，然后逐步提高标准、筛选亚麻酸含量更高 (例如≥15％、≥17％)的株系。如此经过基因型反复纯化，就能选育同时 具有抗草甘膦、高亚麻酸两种优异表型的甘蓝型油菜。

其实施具体过程包括：

1、杂交的亲本之一选用高亚麻酸油菜，本实施例中，高亚麻酸油菜选 择西北农林科技大学油菜育种工作中所使用的R8Q10(中国典型培养物保藏 中心保藏号CCTCC NO：P201820，命名为甘蓝型油菜Brassica napus、高 亚麻酸油菜R8Q10。于2018年8月2日登记入册，于2018年8月2日起保 存30年，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学)、YH25005、Lv2006，或 者这些材料杂交衍生的后代，其种子脂肪酸中亚麻酸含量大于15％。

2、杂交的另一亲本选用草甘膦抗性油菜，在实施例中，草甘膦抗性油 菜包括但不限于用西北农林科技大学油菜育种工作中所使用的骨干品种(系)Z530C、Z716C、Z9B、256B、ZH9、5005B、Sap黄、中双11等分别与 “甲H×6”杂交(或回交)转育而来的新品种(系)。其抗性基因来源包括 但不限于华中农业大学选育的抗草甘膦油菜“甲H×6”。

3、首先用草甘膦抗性油菜与高亚麻酸油菜杂交，在后代中大量选株， 接受草甘膦抗性、高亚麻酸含量双重筛选，即筛选既抗草甘膦、又有高亚 麻酸品质的株系；经过若干世代选择，使得有关的基因型纯合，同家系单 株间草甘膦抗性一致稳定、且亚麻酸含量稳定高于15％，最终获得抗草甘膦 的高亚麻酸株系。

4、抗草甘膦油菜与高亚麻酸油菜杂交，其衍生后代的含义包括但不限 于育种常规的杂交F₁、F₂、F₃、…，F₆以及往后更多的自交世代世代或者回 交BC₁、BC₂、BC₃、…，以及往后更多的回交世代，或者小孢子培养获得的 双单倍体(DH系)世代和群体。

5、草甘膦抗性材料与高亚麻酸油菜杂交获得F₁代之后：可以选用如下 几种不同方案进一步进行：

1)每一世代自交分离，在F₂、F₃、……F₆以及往后更多的自交世代等 分离世代大量筛选单株。筛选的策略，可以在发芽或苗期筛选草甘膦抗性， 然后抗性植株结实后筛选高亚麻酸。

由于草甘膦抗性受单个位点显性基因控制，F₂世代约3/4的单株具有一 定抗性(1/4的mEPSPS位点纯合类型抗性最强，2/4的杂合类型抗性次之)， 可以在芽苗期优先筛选草甘膦抗性植株，保留的单株开花期套袋自交。

草甘膦处理幼芽或植株的方法、剂型、剂量可以有多种方式，例如， 以25g/亩至250g/亩的用量喷施浓度41％的草甘膦异丙胺盐水剂(曾用商品 名Roundup)或者浓度38％的草甘膦三甲基硫盐(曾用名Touchdown)，或用 浓度41％的草甘膦异丙胺盐水剂或以浓度38％的草甘膦三甲基硫盐配制成 1ml/L至20ml/L的药液，喷湿整个植株。

优选的，以75g/亩的用量喷施浓度41％草甘膦异丙胺盐或者浓度38％ 的草甘膦三甲基硫盐，或用浓度41％的草甘膦异丙胺盐水剂或以浓度38％的 草甘膦三甲基硫盐配制成5ml/L的药液对植株灌溉或喷雾。

收获的种子进行品质测试，筛选具有草甘膦抗性的高亚麻酸个体。如 果只考虑亚麻酸含量，据多年数据的经验大致估计，高亚麻酸×低亚麻酸 杂交的F₂世代中亚麻酸≥13％单株的出现概率约1/10到1/50(出现概率受 杂交双亲的基因型、自身亚麻酸含量大小影响)，出现亚麻酸大于15％的概 率低于1/50到1/100，而出现亚麻酸含量≥17％以上个体的概率微乎其微， 可能在数千分之一以下。所以F₂代如果数量不够大，不一定能一次性得到 亚麻酸18％以上个体。可以换一种思路，从F₂世代中亚麻酸大于13％单株进 行自交，而且尽量选用亚麻酸含量高的单株自交繁殖。其F₃、F₄、F₅等后代 大于13％单株的入选概率会逐渐提高，而出现≥15％、≥17％、甚至≥19％的 概率也会提高。这样就能比较有把握获得抗除草剂的高亚麻酸株系。

2)或者F₁与高亚麻酸材料回交，在回交BC₁、BC₂、BC₃…，以及往后更 多的回交等世代，筛选草甘膦抗性单株然后筛选高亚麻酸性状。回交BC₁约1/2的单株具有一定草甘膦抗性，因此可以在芽苗期优先筛选草甘膦抗 性植株，保留的单株开花期套袋自交。收获的种子进行品质测试，筛选具 有草甘膦抗性的高亚麻酸个体。用高亚麻酸亲本例如R8Q10回交的目的是 尽快让亚麻酸控制位点有利基因能聚合，比自交分离重组要快的多，具有 较高亚麻酸含量的单株，两种优异特性的油菜。优化的方法是，可以用高 亚麻酸亲本回交2次。

3)或者从F₁代等杂合世代植株的花药中分离小孢子，在培养基中接受 条件诱导形成胚状物，然后培养成单倍体或者染色体加倍的双单倍体(DH， doubled haploid)苗子。从种子中筛选兼有抗草甘膦、高亚麻酸两种优异 特性的油菜。这种情况下对于每个杂交，后代要培养、种植、筛选大约上 千个DH系，才能保证一次成功获得符合育种目标的新DH系。历时较短但 需要一次加大规模，否则一旦漏选就只能报废整个群体。

虽然抗草甘膦和高亚麻酸两种性状用常规育种手段可以获得，但是二 者的控制基因所在的染色体要在后代中重组，稳定的表现抗草甘膦和高亚 麻酸两种性状，需要经过大量的、反复的基因型筛选和表型筛选，因此并 非简单可获得，本领域普通技术人员非经反复摸索就能轻易获得的。其中 主要的难点和限制因素是目前发现的高亚麻酸性状是数量性状，遗传上至 少2个以上的受微效多基因或称为数量性状位点QTL控制，比草甘膦抗性基因的单位点遗传复杂得多，后代非经大量筛选单株，无法得到纯合的高 亚麻酸个体。一种比较乐观的情况是一个亲本的草甘膦抗性基因插入位点 和另一个亲本控制增高亚麻酸的若干主效数量性状位点QTL当中的任1个 都不在双亲的同一编号染色体(同源染色体)，相互不存在染色体位置互斥， 只要经过父母本染色体之间重新组合，让这些QTL和草甘膦抗性位点同时 进入到某一个后代个体。然后进行大量、反复筛选，在后代中寻求所有19 对同源染色体逐渐纯合的个体，形成纯合基因型，才可能获得稳定的高亚 麻酸、抗草甘膦表型。一种难度较大的情况是如果草甘膦抗性基因插入位 点和控制增高亚麻酸的QTL中某个或几个主效QTL分别在父母的同一编号 染色体(同源染色体)，那就存在一定的染色体位置互斥。就必须通过大量 杂交让同源染色体不同区段分离重组(遗传交换)，寻找两方基因交换到同 一染色体上的个体，然后这个重组的染色体还要和携带其他高亚麻酸QTL 进入同一个个体。此外，还要在后代中所有19对同源染色体逐渐纯合，形 成纯合基因型，才能够有稳定的高亚麻酸、抗草甘膦表型。

本实施例的抗草甘膦、高亚麻酸的甘蓝型油菜的选育方法，得到的甘 蓝型油菜具有抗草甘膦、高亚麻酸两种优异表型。草甘膦抗性使得高亚麻 酸油菜能够适应化学除草，适应轻简化栽培要求，增加种植效益，拓展到 难以估量的市场应用前景。

以下是发明人给出的具体应用实施例，需要说明的是，本发明不限于 这些实施例。

应用实施例1：

用品种中双11与草甘膦抗性油菜“甲H×6”杂交、回交，筛选出新的 抗性材料ZS11-R。

用抗性材料ZS11-R与高亚麻酸油菜R8Q10杂交，F₁亚麻酸含量与普通 油菜接近，为11.4％。F₁自交得到F₂代。

F₂代编号1355，种植F₂代植株322棵，以浓度41％的草甘膦异丙胺盐 或者浓度38％的草甘膦三甲基硫盐制成5ml/L的药液喷施植株，去掉无抗性 个体；剩余存活的具有草甘膦抗性个体205个，但因mEPSPS基因杂合、纯 合而表现为抗性程度有差别；

对205个单株套袋自交结实；在结实收获后用FOSS 5500近红外仪非 损伤性地测试种子的脂肪酸等品质指标，发现2株的种子具有比普通油菜 的10％含量稍高的亚麻酸,单株1355-62的为13.3％，单株1355-149的为 14.5％，并未达到15％以上；

利用1355-62、1355-149两个F₃株系继续自交，F₃代种植成苗后首先 进行草甘膦抗性筛选，分别存活291株、244株。自交套袋收获种子，继续 分析亚麻酸含量。1355-62、1355-149两个株系分别获得5株、9株亚麻酸 ≥14％的单株；

F₄代1355-62、1355-149株系入选的5株、9株亚麻酸≥14％的单株种 成株系行，每个株系约80株左右继续繁殖；先进行苗期以75g/亩的用量除 草剂(浓度41％的草甘膦异丙胺盐或浓度38％的草甘膦三甲基硫盐)筛选， 两个株系的草甘膦抗性基本稳定下来，各个株系均有一定抗性。但亚麻酸 含量仍明显分离，例如：1355-62-103后代亚麻酸含量仅有21株亚麻酸较 高(≥14％)，1355-149-48有32株亚麻酸含量较高(≥14％)。本世代入选 亚麻酸最高的1355-149-48-9、1355-62-103-17、1355-62-103-60、的亚麻 酸含量分别为16.7％、16.2％、15.9％。其他株系的含量在13-15％之间。

F₅继续挑选最高的株系繁殖，每个单株种植3行，形成每个株系约45 株；喷施浓度41％的草甘膦异丙胺盐药液5ml/L，发现草甘膦抗性基本趋于 稳定，各个株系抗性不再明显分离且抗性反应比较一致。但多数株系内保 留单株所结种子的亚麻酸含量仍有分离，仅有2个株系的不同个体比较稳 定，例如1355-62-103-17-2后代亚麻酸含量有19株较高(≥15％)， 1355-149-48-9-11有24株亚麻酸含量较高(≥15％)。本世代亚麻酸含量最 高的分别为18.3％、17.6％。

继续选高亚麻酸株种植，F₆世代草甘膦抗性、亚麻酸含量两个性状均比 较稳定，特别是草甘膦抗性在多数株系内不再分离。亚麻酸因为受基因型 及环境因素影响，同系内的单株之间仍然有变异，例如1355-62-103-17-2 的自交后代33株的亚麻酸含量16.7％—18.8％，1355-149-48-9-11单株自 交后代30株的亚麻酸含量15.2％—17.9％。表明初步得到了比较稳定的抗草 甘膦的高亚麻酸油菜，命名为抗草甘膦、高亚麻酸油菜HALA-R 1355。

应用实施例2：

用抗性材料ZS11-R与高亚麻酸油菜R8Q10杂交，F₁和R8Q10回交得到 BC₁代；种植BC₁代(编号1208BC)苗子62棵，喷施5ml/L的浓度41％的草 甘膦异丙胺盐，去掉无抗性个体；剩余存活的具有草甘膦抗性个体44个。

对上述草甘膦抗性个体44个单株中选健壮的35株，均与R8Q10再回 交一次；35个BC₂种植各50株左右，苗期以75g/亩的用量喷施草甘膦(浓 度41％的草甘膦异丙胺盐或浓度38％的草甘膦三甲基硫盐)杀死非抗性苗。 BC₂F₂代抗性苗在开花结实后收获种子，用FOSS 5500近红外仪测试种子的 脂肪酸等指标，这一世代共发现15个单株的种子的亚麻酸≥14％，其中最 高的单株1208BC-1-3的为16.2％，单株1208BC-14-5的亚麻酸为17.4％；

利用单株1208BC-1-3、1208BC-14-5自交，BC₂F₃代种植分别成苗，首 先进行草甘膦抗性筛选，存活株套袋自交收获种子，分析亚麻酸含量，含 量最高的1208BC-1-3-14、1208BC-14-5-7两个株系分别获得15株、23株 亚麻酸≥15％的单株，含量最高可达18.4％；

BC₂F₄将亚麻酸≥15％的单株种成株系行，每个株系约60-80株左右继续 繁殖；后代的草甘膦抗性基本稳定下来，各个株系均有一定抗性。亚麻酸 含量仍有分离，例如1208BC-1-3-14-1、1208BC-14-5-7-5后代亚麻酸含量 有29、26株亚麻酸含量较高(≥16％)，最高1208BC-1-3-14-1-22、 1208BC-14-5-7-5-9、1208BC-1-3-14-1-8、1208BC-14-5-7-5-2的亚麻酸分 别为18.6％、18.4％、18.1％、17.8％。

BC₂F₅继续挑选最高的株系繁殖；后代的草甘膦抗性基本稳定下来，各 个株系抗性不再有分离而且抗性反应比较一致。但多数后代株系的亚麻酸 含量仍有分离，有18个株系的不同个体比较稳定，例如1208BC-1-3-14-1、 1208BC-14-5-7-5后代亚麻酸含量均值≥16.5％，最高分别为18.5％、18.3％。

BC₂F₆世代草甘膦抗性、亚麻酸含量两个性状比较稳定，多数株系不再 明显分离。1208BC-1-3-14-1-10的自交后代28株的亚麻酸含量16.2％～ 19.3％，1208BC-14-5-7-5-18自交后代31株的亚麻酸含量15.8％～20.4％， 表明初步得到了比较稳定的抗草甘膦的高亚麻酸油菜，命名为抗草甘膦、 高亚麻酸油菜HALA-R 1208。

需要补充说明的是，申请人研究发现，相比草甘膦抗性，高亚麻酸性 状的遗传行为则非常复杂，如果没有丰富育种经验、正确筛选方法、必要 试验条件，本领域普通技术人员并不能显然易见的将高亚麻酸材料与具有 除草剂抗性(例如抗草甘膦)的油菜杂交就能得到抗除草剂的高亚麻酸油 菜新品系。需要确定的基本方法和原则至少包括：

(1)草甘膦喷施的浓度剂量、选择压力大小，要求可以区分杂合植株 和纯合植株的抗性水平，抗性表型鉴定需要具有经验、视觉灵敏的人员实 施，根据喷药后叶片大小、叶色变化、长势差异来区分；

(2)脂肪酸组分的测试方法，以前做芥酸定性分析所用的半粒法即切 取少半种子叶胚用于脂肪酸层析显色，另外半粒用于播种，但亚麻酸含量 无法定量，如果用半粒种子提取的脂肪酸上气相色谱仪测定，则因为提取 油分太少测定亚麻酸的误差太大而失去意义。单粒种子气相色谱分析结果 精确度提高，但该种子全部被用掉，便没有了以后播种的种子。因此目前 只能用单株收获的种子进行分析亚麻酸含量；

(3)种子繁殖方式的制约。油菜是常异花授粉，约有30％左右的异花 授粉概率，而亚麻酸遗传主要受胚基因型控制(即雌雄配子双方基因)，需 要隔离授粉，所以在未纯合群体中必须要单株套袋繁殖，只有在基因型纯 合群体中才能相互授粉。

(4)采用设计优化的策略去避免漏选高亚麻酸单株，还要节约成本、 以最小化规模、在最少的繁殖世代中尽快筛选出符合要求的个体及其后代 家系。

申请人的发明人曾研究过高亚麻酸亲本YH25005与中亚麻酸亲本Z9、 高亚麻酸亲本R8Q10与中亚麻酸亲本D636配制两个杂交组合，采用南京农 业大学盖钧镒提出的主基因+多基因混合遗传分离分析方法，用章元明等编 写的SEA软件对甘蓝型油菜的六世代遗传群体(P₁、P₂、F₁、B₁、B₂、F₂)的 脂肪酸含量进行研究并估计其遗传效应(未发表)，结果表明：亚麻酸含量 甚为复杂，符合“加性-显性-上位性多基因”遗传模型，多基因遗传率为37.037％，主要受到多基因和环境的影响。另外两个与亚麻酸含量负相关、 控制位点有所重叠的油酸、亚油酸遗传也比较复杂，例如油酸含量符合“2 对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因”或“2对加性-显性-上位性主基因”遗传模式。因此高亚麻酸含量有关QTL的重新聚合，需要 有必要的分离群体规模，特别是在杂交、回交的低世代必须保证后代中能 分离出足够的个体，同时还要适当控制每一世代的种植规模，避免工作量 太大，人力、财力难以为继。

Claims (5)

1.一种抗草甘膦、高亚麻酸的甘蓝型油菜选育方法，其特征在于，选用抗草甘膦油菜与高亚麻酸油菜杂交，对衍生后代的大量单株进行接受草甘膦抗性以及高亚麻酸含量的双重筛选，即，筛选抗草甘膦且具有高亚麻酸品质的株系；经过若干世代选择，使得有关的基因型纯合，同家系单株间草甘膦抗性一致稳定且亚麻酸含量稳定高于15％，即获得抗草甘膦、高亚麻酸的甘蓝型油菜。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高亚麻酸油菜种质材料选择R8Q10、YH25005或Lv2006及其衍生的后代，其种子脂肪酸中亚麻酸含量大于15％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗草甘膦油菜种质材料是“甲H×6”与油菜自交系或与品种Z530C、Z716C、Z9B、256B、ZH9、5005B、Sap黄、中双11等分别杂交/或回交转育而来的品种/品系。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生后代的大量单株是植物育种中常规的F₁、F₂、F₃、F₄、F₅、F₆以及往后更多的自交世代，或者回交BC₁、BC₂、BC₃、…，以及往后更多的回交世代，或者小孢子培养获得的双单倍体世代和群体。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述草甘膦抗性以及高亚麻酸含量的双重筛选的具体方法是：

(1)对于遗传简单的草甘膦抗性，在芽苗期用草甘膦处理幼芽或苗子进行筛选，即选用除草剂按活性成份草甘膦10g/亩～100g/亩喷雾、灌溉或涂抹处理植株；或配制成含草甘膦500mg/L～5000mg/L的药液，喷雾、灌溉或涂抹处理植株，然后着重筛选长势良好的抗性个体进行套袋自交繁殖；

(2)对于遗传复杂的亚麻酸含量，每世代收获植株的种子进行亚麻酸含量分析，保留亚麻酸含量最高，即亚麻酸含量至少≥13％的若干株系，继续种植繁衍；

每一世代喷施草甘膦异丙胺盐或者草甘膦三甲基硫盐筛选抗性株，每一世代寻求亚麻酸含量比上一代更高，或当代求亚麻酸含量最高的若干单株；

在入选的高亚麻酸株系后代中，逐世代加大对亚麻酸含量的选择，经过若干世代的繁殖、筛选、纯化，获得比较性状稳定的草甘膦抗性且高亚麻酸的甘蓝型油菜。