CN1107362A - 组织保护和再生组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于制备组合物的方法，该组合物 适用于保护受刺激或损伤皮肤免受进一步的氧化和 生化损伤，从而使自然愈合过程进行，还适用于加快 烧伤和外科创伤的愈合速度，以及适用于增加毛囊的 大小和毛发生长的速度。该组合物一般含有由各种 蛋白的蛋白胨消化产物与铜(Ⅱ)盐、铟(Ⅲ)盐、锡 (Ⅱ)盐和锡(Ⅳ)盐配合形成的沉淀物。

Description

对于受刺激、损伤和破损皮肤的治疗，尽管开发出了许多药物，但仍然是一个重要的健康问题。而且，在不发达国家对于护肤产品和药剂的需求很大，特别是在热带国家，那里的一些状况如缺乏医疗保健，广泛传播的皮肤真菌性疾病，和使用燃料如煤油做饭及类似情况会引起皮肤损伤的高发病率。对于这些国家来说，非常需要以容易获得的原料低造价地生产出有效的药剂。目前已经有许多使伤口愈合的方法，如通过重组DNA方法生产生长因子蛋白，使用具有损伤愈合特性的药物，和封闭包扎伤口，这些方法对于上述国家来说在今后几十年内仍然超出了病人的经济支付能力。

在较发达的国家，由于医疗服务中支出费用的压力不断增加，也需要研究低成本的护肤产品和伤口愈合药物。有些治疗方法如对静脉曲张性溃疡的住院治疗，尽管治疗上有效，目前很少能得到医疗保险机构的允许，而门诊治疗越来越普遍。尽管已开发出了许多不同的治疗方法，如使用生长因子促进皮肤修复，但这也必定是相当高费用的治疗方法。

人和其他的动物中的延迟愈合或不完全愈合会给病人带来额外的疼痛和痛苦，并且会显著地增加损伤并发症和医疗费用，而且常常是该损伤发展成慢性溃疡，需要更多的照顾和医疗保护以控制感染和组织坏死。甚至当这种损伤最终愈合后，该损伤区域经常失去对触觉刺激的反应能力，而且经常出现过量的不成熟胶原蛋白沉积，产生永久性斑痕。对于外科手术产生的伤口也急需改进的伤口愈合组合物。手术后的完全和快速愈合对于外科手术的成功，尤其是在重病人或老年患者身上，通常起着重要的作用。

损坏正常愈合反应的另一个因素是损伤或创伤皮肤的过度炎症。虽然炎症过程及其伴行的白细胞浸入损伤区是自然愈合过程中的一个组成部分，在某些情况下炎症过程会变得过度，并延迟了愈合。损伤的组织在愈合过程的早期变为固定而不能继续到完全修复。在这种情况下，要使用具有抗炎活性的化合物以维持该过程正常进行。

一种对有关炎症和伤口愈合受损的临床问题的可靠医疗处理措施是使用金属离子与有机分子或氨基酸、氨基酸衍生物和肽类的配合物。这些配合物中有些具有抗炎活性，而另外一些兼有抗炎活性和愈合作用。而其他的一些配合物据报道除具有抗炎和/或愈合活性外还具有毛发生长刺激作用。

使用铜盐或配合物作为抗炎剂用于急性或慢性关节炎患者的治疗过程中可使胃溃疡愈合可追逆到40年代和50年代（见，如Sorenson的文章，Inflammation    3∶317-331（1976）;Agents    and    Actions    8∶305-331（1981），和Comprehensive    Therapy    11∶49-64（1985））。对铜盐和配合物，如铜-水杨酸配合物的使用似乎已被淘汰，这主要是因为类固醇类抗炎剂，如氢化可的松的早期疗效被肯定之缘故。已经对铜与氨基酸（色氨酸、赖氨酸），与非类固醇抗炎药物（消炎痛、苯酮苯丙酸、乙酰水杨酸）或与脂肪酸（油酸、月桂酸和辛酸）这些配合物进行了研究，但是，尽管它们疗效确定，却由于刺激性、毒性和功效不足的问题，很少能研制到前期临床阶段。

在许多铜配合物被报道具有抗炎特性的同时，已报道有一组更为局限的此类物质也具有愈合作用，Heintze（美国专利号No.4，123，511）报道铜-油酸配合物具有抗炎和皮肤愈合活性。Sorenson（美国专利号No.4，440，754）描述了使用铜（Ⅱ）盐和氨基酸，如色氨酸或赖氨酸，或者和有机分子如3，5-二异丙基水杨酸，乙酰水杨酸或水杨酸的配合物来预防和愈合胃肠道溃疡。利用伤口愈合模型，Townsend和Sorenson（Sorenson等，Agents    and    Actions    8∶305-325（1981）发现水杨酸-铜可以加快鼠的外科诱导溃疡的愈合速度和改善愈合质量。而且，Sorenson写到（出处同上，和Inflammation    3∶317-331（1976）∶Townsend证明了铜（Ⅱ）-（色氨酸）₂可增加外科诱导溃疡模型中溃疡愈合的速度。愈合的加速主要是由于伤口的较快上皮再生和胶原蛋白在数量和质量方面的提高。在治疗组动物中，形成细的正常方位的胶原蛋白纤维，相对而言，在未治疗组动物中，新的胶原蛋白非常致密，并且由粗的，波浪不规则蛋白束组成，形成斑痕组织。

Federici和Bertolotto（EP450，398和IT9，019，948）报道硫酸软骨素-铜（Ⅱ）配合物具有抗炎活性。欧洲专利号No.EP66，283公开了“eustatic”组合物，它含有一种非毒性金属离子（包括铜）和一种透明质酸的氨基葡萄聚糖（glycosaminoglycan）或硫酸软骨素，可用作一种结瘢剂（通过闭合愈合伤口）。

英国专利申请GB2044265描述了三磷酸腺苷的金属配合物（包括铜）可有助于骨折以及骨质疏松和骨囊肿情况下的骨组织恢复。

Konishi（美国专利号No，4，461，724）报道四肽G1y-Ser-His-Lys和相关结构的肽与金属，如离子态铜和锌，配合后具有抗炎和愈合作用。

Yu（美国专利4，053，630）公开了使用磺基丙氨酸及其衍生物亚磺酸半胱氨酸或高磺基丙氨酸与金属离子如三价铁、二价铜、锌或铝螯合形成组分，可减缓以角化缺陷为特征的疾病症状，并且达到缓解鳞 癣、皮屑和痤疮的目的。Bertelli（美国专利4，156，737）指出对-氨甲基-苯-磺酰胺的铜配合物对皮肤烧伤具有愈合和保护作用。Van    Scott（美国专利4，283，386）指出磺基丙氨酸、亚磺酸半胱氨酸和高磺基丙氨酸的金属（铜、锌或铝）盐形式具有缓解皮肤干燥和破损、角化病、和掌、跖角化过度症的治疗作用。

Niwa    （Dermatologica    179S1∶101-106（1989））和Bergren等（Am.Surg.54∶333-336（1988））发现抗炎性蛋白质Cu、Zn-超氧化物歧化酶也具有加快愈合的作用。

Pickart（PCT公开号WO91/14437，WO91/12267，WO91/05797，WO91/03488，WO89/12441，WO88/26448，WO88/08851，欧洲专利EP190，736，EP189，182;和美国专利号No.4，767，753）描述了Gly-L-His-L-Lys的金属配合物的合成和作为抗炎和愈合剂的使用。

许多金属配合物已被用于促进毛发生长。Yamashiki（日本专利70018997）使用一种铜-泛酸的配合物主要用于促进毛发根部的生长和促进皮肤的功能。Morelle（英国专利GB2097256，德国专利32212448）使用氨基酸衍生物（N-丁酰氨基酸）与铜和其他金属的配合物作为化妆品和治疗剂，包括用作毛发和皮肤刺激剂。Banfi等人（美国专利号No.4，503，047）公开了一种组合物，它主要含有一种或几种含硫氨基酸和铜（Ⅱ）离子加上少量的异硫氰酸烯丙酯和硫氰酸盐离子以发挥毛发生长刺激作用。Pickart（WO90/07431，88/08695和EP288，278）发现Gly-L-His-L-Lys的衍生物的一些金属配合物可以增加毛囊的大小和毛发生长的速度。

尽管上述的金属配合物具有肯定的治疗作用，但许多金属配合物有毒性和组织刺激性（见，如Johnson等人，Inorg.Chem.Acta    67∶159-165（1982）;Pickart等人，Biochem.Pharm.    32∶3868-3871（1983）;和Pickart等人，Lymphokines    8∶425-446（1983））。例如，虽然铜-水杨酸配合物和一些铜-水杨酸类似物具有抗炎活性，但其他的水杨酸类似物如水杨醛苯甲酰腙的铜（Ⅱ）配合物对组织具有很高的毒性。同样，铜（Ⅱ）-Gly-L-His-L-Lys可支持细胞的存活力并具有抗炎和愈合作用，但是其铜结合区的紧密合成的芳酰基腙类似物对细胞和组织有高度的毒性。

与铜配合物治疗应用有关的另一个问题是铜离子对配合分子的结合亲合力问题。尽管可以合成一个确定的铜配合物，但在其治疗应用中此配合物要处于一个事实上有上百个之多的化合物竞争来与铜离子结合的组织生理环境中，这样它可以形成针对六个独立分了的静电键。如果从配合物中去除铜，变成松散结合，那么就会出现组织刺激（见.Raju等人，J.Natl.Cancer    Inst.    69∶1183-1188（1982））。

如果将这种金属配合物加入到膏或油膏载体中制成制剂会出现进一步复杂的情况。将各种化学物质加入到制剂中以增加对皮肤和创伤表面的粘合力，并增加配合物向靶组织的渗透。但是，由于这些物质中有许多也可以与金属离子结合，因此所期望的治疗效果会失去或明显减弱。虽然可使用一些洗涤剂如十二烷基硫酸钠来帮助乳化液的油水相混合，并稳定该制剂，但是，这些洗涤剂本身就是组织刺激剂，从而延迟了愈合。

在将许多金属配合物用于治疗应用时所遇到的另一个问题是不能对它们进行加热消毒;因此，为了达到安全要求，在生产过程中必须加入高浓度的抗微生物化学药品以抑制微生物的生长和病毒传播。这些抗微生物试剂也会抑制公宿主细胞如巨噬和成纤维细胞的存活能力和功能，而这些宿主细胞与皮肤和其他组织的维持和修复有关，因此这些试剂会使愈合反应迟钝。

本发明的目的在于提供本领域中所需求的可用于组织保护、组织愈合，和/或刺激毛发生长的组合物，这种组合物可以方便简易地生产且成本低。优选的是，这种组合物可以进行消毒而不损失生物活性，并且在不使用洗涤剂或其他可能有刺激性的化合物情况下制成局部使用的药剂。甚至更优选的是，该组合物通常被管理机构认可安全的，因此，在使用过程中不会有安全方面的担心和管理方面的障碍。十分令人惊奇地是，本发明满足了这处和其他有关的需要。

本发明提供了用于温血动物加快其局部损伤和皮肤刺激愈合，用于预防皮肤受氧化作用损伤，和用于增加毛囊大小及毛发生长速度的组合物和方法。用于这些方法的组合物，包括药物组合物，是由与一种离子态过渡金属配合的蛋白胨制备的。

因此，本发明的一个方面提供了用于制备药物组合物的方法，该药物组合物用于加快温血动物的局部伤口愈合或增加其毛囊大小及毛发生长。使一种蛋白胨消化产物与一定量的过渡金属盐水溶液结合使之足以诱发沉淀。典型的是，该蛋白胨消化产物是从酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肉类、丝蛋白、大豆蛋白等制备的，而离子态过渡金属选自铜（Ⅱ）、铟（Ⅲ）、锡（Ⅱ）和锡（Ⅳ）。

所得到的沉淀物由来源于蛋白胨的疏水肽和金属的配合物组成。然后分离胨-金属配合物沉淀物，如通过离心分离，并且再按其应用和给药方式的要求配制成制剂。一般是将配合物与一种药学上可接受的载体结合形成一种乳膏或洗液，浓度为从大约5%至大约25%的蛋白胨-金属配合物或更多。该制剂可以按需灭菌或巴氏消毒，而不会破坏该白胨-金属配合物的愈合或毛发生长刺激活性。

在另一个实施方案中，本发明提供了加快温血动物从皮肤伤口，如外科手术切口，烧伤，氧化性损伤产生的炎症或轻度刺激等中恢复的方法。该方法包括给皮肤损伤或刺激处施用一治疗或在某些情况下施用一预防有效果的含有蛋白胨-过渡金属离子配合物的组合物。由于本发明组合物的粘着性增加，与其他局部愈合剂和制剂相比，本组合物一般很少在皮肤上多次使用。

另外一种方案涉及到增加温血动物，如人的毛囊大小和毛发生长速度的组合物和方法。该方法包括在需要毛发生长的区域皮肤上施用一足够量的蛋白胨-金属配合物以增加所说动物的毛囊大小和毛发生长的速度。典型的是，该组合物可以制成乳膏局部给药，并且可以每天使用直至观察到毛发生长，而且还可以在此之后使用足够的时间以维护所需量的毛发生长。

本发明提供的组合物和方法可用于部皮肤治疗以保护受损皮肤，从而使自然愈合过程继续进行，以加强温血动物皮肤中的组织再生过程，并刺激温血动物中的毛发生长。该组合物是由酶促蛋白消化产物和过度金属如铜、锢或锡离子的配合而形成的。还提供了用于温血动物中改善损伤皮肤的恢复、加快烧伤或手术切口的愈合及刺激毛发生长的方法。

本发明的蛋白胨-金属配合物是由蛋白质的酶消化产物制备的。蛋白胨一般是由在蛋白部分水解过程中形成的中间多肽产物和小肽混合物组成的。可用于本发明的一些类型的酶促蛋白消化产物是大豆蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肉类（如PRIMATONE），如牛肉、肝、丝蛋白和此类的消化产物。蛋白胨消化产物的含义是指根据公知方法使用酶，如木瓜蛋白酶，通过酶消化使蛋白降解的产物，如按Remington's    Pharmaceutical    Science，Mack    Publishing    Co.，East    on，PA    PP.428-429（1975）中所述方法，本文引用该文献作为参考。许多蛋白胨消化物可以广泛地购买到，如购自Sigma    Chemical    Company，St.Louis，Mo.

为了生产可用于本发明的配合物，将蛋白胨消化物与一种或几种离子态过渡金属，如铜、锢、锡、锌或其盐，如硫酸盐、乙酸盐、磷酸盐等配合。在制备蛋白胨-金属配合物的一种方法中，将一种胨溶于温水中（约40℃），浓度大约5至50%（重量/体积），然后与一种金属盐（氯化铜（Ⅱ），氯化锡（Ⅱ），氯化锡（Ⅳ），氯化锢（Ⅲ）或氯化锌（Ⅱ）以盐浓度约10至50%（w/v），优选为约20%（w/v）的水溶液混合。所加入的金属盐溶液的体积是在溶液中诱发大量沉淀所需（在大豆蛋白胨情况下约20至50%的起始体积）且在将pH调至pH6至7之间后可诱发最大量沉淀形成所需的体积。该沉淀物含有大量的疏水金属盐。所说的配合是指肽与金属离子形成静电键，但这种配合机制只是一种可能的解释，而不约束性的。

然后通过任何合适的分离或纯化方法，如过滤、提取、离心、结晶或这些方法的结合来完成蛋白胨、金属配合物的分离和纯化。参考下面的实施例可以得到对合适分离步骤的具体解释。但是，其他等同的分离步骤当然也可以使用。

本发明的蛋白胨-金属配合物可以根据治疗、预防或化妆等不同应用而施用，可以给人或在兽医上给其他温血动物施用。特别适合本发明组合物治疗的兽医动物是马、牛、猪、绵羊、山羊、犬、鸟、猫等。

该组合物及其药物制剂在预防和/或治疗或化妆应用时可以局部、表面、口服或非胃肠道（如，皮下注射）给药。优选的是，该药物组合物可以局部，如在表面以糊剂、乳膏或软膏给药。

如果是给温血动物给药，该蛋白胨-金属组合物典型的是要进行灭菌，并配制成药物或兽医剂型。可以通过惯用的、公知的灭菌技术，如蒸煮或巴氏灭菌对含有蛋白胨-金属配合物的组合物进行灭菌，而基本上不会对蛋白胨-金属配合物的生物活性产生不利影响。为了接近生理状况所需和制备方便给药的组合物，该组合物可以含有药学上可接受的辅料，如pH调节和缓冲剂，以及释放载体。用于制备药学上可给药的化合物的实际方法对于本领域中的技术人员来说是已知或显而易见的，并且详细地记载于，如Remington's    Pharmaceutical    Science，如前所述。

根据所要使用的给药方式和应用，该组合物可以是固体、半固体、或液体剂量形式，如，粉剂、颗粒剂、结晶、液体、混悬液、脂质体、糊剂、乳膏、软膏等，并且可以是适合于相对精确剂量的给药的单位剂量形式。该组合物可以包括一种惯用的药物载体或赋形剂，另外，还可以包括其他药物试剂，生长因子，伤口愈合剂（sealant），载体等等，如下面所进一步描述的。

对于半固体组合物来说，由于它适合于制成表面局部给药的糊剂和乳膏，该蛋白胨-金属配合物可以单独提供或者与惯用的无毒性载体如，芦荟胶、鲨烷、硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、鲸蜡醇、硬脂酸，和1，2-丙二醇等一起混合。这种组合物可以含有大约5-100%活性成分，更优选的是大约5-25%。这些制剂中蛋白胨-金属配合物的浓度可以在很宽的范围内变化，并且可以根据所选择的特定给药方式因使用、粘度等不同而进行选择。制备这种剂量形式的实际方法对于本领域中的技术人员来说是习惯性在或显而易见的，例如，参见Remington's    Pharmaceutical    Science，17th    ed.，Mack    Pulbishing    Company，East    on，PA（1985），本文引用了该文献作为参考。所要给药的组合物或制剂在任何情况下都含有足以达到对所治疗客体的所需治疗或预防作用的一定量的蛋白胨-金属配合物。

本发明的组织愈合组合物在给已患有如上述的创伤、氧化的皮肤损伤、炎性皮肤损伤的温血动物，如人，给药时，所使用的量要足以使愈合过程比未治疗的宿主进行的更快。对于患有毛囊减小和毛发生长受损的动物来说，本发明的组合物的给药量要足以增加毛囊的大小和毛发生长的速度。足以达到这些效果的量定义为“治疗有效剂量”。这种使用的有效量对于伤口愈合来说要取决于伤口、溃疡等的严重程度，对于毛发生长受损患者来说要取决于毛囊减小的程度，而且还取决于所治疗的患者的一般健康状况，但一般范围是每平方厘米创面每天使用大约1mg至大约50mg的蛋白胨-金属配合物，更为普遍使用的剂量是每平方厘米创面每天大约10mg至大约25mg。可以根据需要来调节在一段持续时间内的维持剂量。对于兽医应用，如果需要，可以施用更高的剂量。对于治疗如上所述的特定创伤或状况所必需的蛋白胨-金属配合物实际用量要通过本领域中公知的标准经验方法确定。

在预防性使用时，可以给可能有或者说有皮肤损伤或类似损伤危险的宿主使用含有蛋白胨-金属配合物的组合物，以增加宿主的自身创伤愈合或抗氧化能力。这种用量定义为“预防有效剂量”。在这种使用中，准确的用量同样取决于宿主的状况和一般健康状态，但一般范围是每平方厘米皮肤每天大约0.1mg至大约10mg，更为普遍的是每天每cm²皮肤大约1mg至大约3mg。可能一次或多次给药该组合物。

本发明的蛋白胨-金属配合物可以相当大的用量给药而不会产生严重的副作用，不过不加选择的使用可能会引起皮肤变色。在将该组合物用于皮肤以抑制氧化或生化损伤或者用于那些患有仅仅是轻度皮肤刺激或炎症的皮肤时，该剂量要相应地调节到较低的维持水平。

本发明的组合物，包括药物组合物，可以是单独给药或者以辅助治疗或预防性给药。该蛋白胨-金属组合物可以与其他的发现能改善其他方面愈合的因子结合使用。在这种情况下，可以获得协同作用，产生比任何单独给药所带来的更大的临床有效率。而且，尽管本文所述的组合物可激发一系列愈合过程，但临床创伤在其性质和愈合方式方面有很大的不同，这使得医生要使用本文所述的组合物与其他因子结合使用。例如，在许多烧伤病人中有神经再生缺陷，因此医生可以在该组合物中加入一种特定的神经生长因子以促进烧伤区域的神经再生。据报道具有其他愈合特性的因子举例包括表皮生长因子，成纤维细胞生长因子、神经生长因、转化生长因子，血管生成生长因子，纤维坏死素（fibronectin）、纤维蛋白、血小板来源的生长因子，超氧化物歧化酶，血液提取物或来源于血液的因子，以及其他类似因子。

下面的实施例用于解释本发明，但不具有约束作用。

实施例Ⅰ

制备活性蛋白胨-金属配合物

本实施例描述了用于制备具有生物活性的蛋白胨-金属配合物的方法，下面进一步描述。

从Sigma    Chemical    Company（St.Louis，MO）获得大豆蛋白胨（Ⅳ型，No.P    0521），同样从该公司获得氯化铜水合物（no.C    6641）。从Aldrich    Chemical    Company（Milwaukee，WI）获得氯化锢（Ⅲ），纯度99%;氯化锡（Ⅱ），纯度99%;和氯化锡（Ⅳ），纯度99%。

将大豆蛋白胨（大豆蛋白的酶消化产物）溶于温水（40℃）中，浓度为20%（重量/体积），然后与一种金属盐（氯化铜（Ⅱ），氯化锡（Ⅱ），氯化锡（Ⅳ），氯化锢（Ⅲ），或氯化锌（Ⅱ））且盐浓度为20%（w/v）的水溶液混合。所加入的盐溶液的体积用量是在该溶液中诱发大量沉淀所需的量，大约是大豆蛋白胨起始体积的20至50%，在加入所述盐溶液之前用氢氧化钠调pH（在6.0至7.0之间）以诱导最大量的沉淀形成。该沉淀物含有大量的疏水肽，加上少量（经检测为3.8-4.2%）的与肽配合的金属盐。

通过以10，000G离心20分钟去除沉淀物，然后把湿的糊状物加工成进一步的产品。可以将稠的糊剂直接用于皮肤，或者制成皮肤乳膏剂和洗液，其浓度通常为5至20%（w/w），当然更高的浓度也是有效的。

可以将大豆蛋白胨-铜配合物用作皮肤保持剂，充当受损或受刺激皮肤上的皮肤屏障。该疏水肽粘着在皮肤上，形成一层保护屏障，同时该配合的铜在混合物中发挥一种抗氧化活性。用这种组合物处理之后受损或受刺激的皮肤能更快地明显愈合。

正如下面进一步描述的，使用蛋白胨-铜、蛋白胨-锡和蛋白胨-锢配合物可促进毛发生长和毛囊的增大。在毛发生长鼠模型中，将这些配合物应用于皮肤上10至14天之后可产生明显的毛发生长刺激。

其他类型的酶促蛋白消化产物如酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肉类、丝蛋白等的消化产物，以及上述金属的其他金属盐，如硫酸盐，乙酸盐，磷酸盐等预期有类似的作用。

实施例Ⅱ

用蛋白胨-铜配合物使外科创伤愈合

本实施例描述了使用由蛋白胨-铜配合物制备的糊剂加快动物外科手术切口创面的愈合。

在麻醉的35g重Swiss-Webster鼠背上进行外科手术切口（1.25cm）。在手术后的即刻和24小时之后，用一层薄的含有上述实施例Ⅰ中的活性蛋白胨-铜配合物的糊膜覆盖创面。对照组创面未治疗。如表1中所示，用活性胨-铜配合物处理的创口比对照组创口愈合的要快。由于快速愈合的伤口倾向于收缩和变得更为圆滑，因此愈合活性与15天后伤口的长度有相关性。每组由12只鼠组成。

表1：蛋白胨-铜配合物对切口长度的影响

测试组        15天后伤口的长度(cm)

对照组        0.81±0.10

胨-铜配合物        0.20±0.13

实施例Ⅲ

外科皮肤缺损的愈合

本实施例证明了通过表面给药这种蛋白胨-铜配合物使动物皮肤损伤愈合。

从麻醉鼠背部去除皮肤（圆状，直径1.25cm，面积＝1.22平方厘米）造成外科皮肤缺损。在手术后即刻和24小时之后，用含有上述实施例Ⅰ中活性蛋白胨-铜配合物的一层薄糊膜覆盖创面。对照组创未处理。如表2所示，用活性胨铜配合物处理的创面比对照创面愈合的快。愈合活性与15天后剩余未愈合创面面积有相关性。每组由12只鼠组成。

表2：蛋白胨-铜配合物对手术皮肤缺损愈合的影响

测试组 15天后创面面积(cm²)

对照组        0.27±0.14

胨-铜配合物        0.02±0.01

实施例Ⅳ

用蛋白胨-铜配合物使烧伤愈合

本实施例证明了表面局部使用蛋白胨-铜配合物使动物烧伤愈合的加快。

通过将一个圆（1.25cm直径，创面面积＝1.2cm²）与麻醉鼠去毛背部的皮肤接触7秒钟诱导二度烧伤。在烧伤后即刻和之后24小时及48小时，用含有上述实施例Ⅰ的活性蛋白胨-铜配合物的一个薄糊膜覆盖创面。对照组未治疗。每间隔5天对创面拍照，并且通过测平仪由照片上计算创面面积。与未处理的对照创面相比较。用活性胨铜配合物处理的烧伤较少出现烧伤后炎症，且愈合显著加快。每组由12只鼠组成。

表3：蛋白胨-铜配合物对烧伤的影响

测试组 15天后创面面积(cm²)

对照组        0.84±0.10

胨-铜配合物        0.24±0.13

实施例Ⅴ

用以乳膏为基质的蛋白胨-铜配合物使烧伤创面愈合

本实施例证明用表面乳膏油膏中的活性胨-铜配合物处理的烧伤在愈合程度上的剂量反应增加。

按实施例Ⅳ中方式诱发烧伤。制备一种可使用的乳膏，含有55%（重量）的芦荟胶，12%鲨烷，12%硬脂酸、甘油酯，5%PEG-100和4%的鲸蜡醇。向这种基质乳膏中加入不同浓度的铜-蛋白胨组合物（2.5%，5%，10%和20%），并混合该混合物。在烧伤之后即刻，和之后的24和48小时，给动物使用这种乳膏，用含有活性配合的一层薄乳膏膜覆盖创面。只用基质乳膏处理对照创面。每间隔5天给创面拍照通过测平仪从照片上计算创面面积。

结果表明用活性胨铜配合物处理的烧伤在愈合程度上有剂量反应增加。在最低剂量时，即2.5%浓度，即使愈合没有明显加快，但创面仍表现出较少的发炎。每组由10只鼠组成。

表4：蛋白胨-铜配合物对烧伤的作用

测试组 15天后创面面积(cm²)

对照组        0.71±0.17

2.5%胨配合物        0.74±0.19

5%胨配合物        0.44±0.05

10%胨配合物        0.38±0.14

20%胨配合物        0.29±0.10

实施例Ⅵ

烧伤后皮肤炎症的减退

本实施例证明了蛋白胨-铜配合物减少轻度皮肤烧伤相关性性炎症的能力。

使用一种圆形（1.25cm直径，刺激面积＝1.22cm²）黄铜棒（60℃）置于麻醉鼠（每组12只）背部去毛皮肤上接触5秒钟诱发非常轻度的热损伤。如此产生的轻度皮肤刺激其特征是红肿，但很少有皮肤组织损失。在诱发热损伤之后即刻，用一含有上述实施例Ⅰ中活性配合物的薄糊膜覆盖刺激区。对照组损伤仍未处理。隔天观察损伤情况，在第3天，未处理组的热损伤仍然红肿，而治疗的皮肤表现为将近正常外观，仅仅有很少的红肿。

实施例Ⅶ

活性蛋白胨-铜组合物的巴氏消毒

巴氏消毒包括将该溶液加热至160度30分钟，这样除了耐受性最强的微生物之外可以杀死其他所有的微生物。为了进行这种高度，按照实施例Ⅰ中的上述方法将10g的大豆蛋白胨水解物与氯化铜混合。向大豆蛋白胨水解物溶液中加入氯化铜溶液之后，使所得到的溶液充分混合，然后加热至160°F（71℃）30分钟。冷却至室温之后，按照上述方式制备活性组合物，然后以实施例Ⅱ所述的方式施用于鼠的手术切口创面。其愈合活性类似于用未经巴氏消毒的活性组合物所观察到的愈合活性。

表5：巴氏消毒对活性配合物的影响

测试组        15天后伤口的长度(cm)

N=6

对照组        0.86±0.16

未经巴氏消毒的        0.26±0.13

活性配合物

巴氏消毒的

活性配合物        0.24±0.15

实施例Ⅷ

活性组合物的煮沸消毒

本实施例证明了可以通过煮沸使蛋白胨-铜配合物消毒，并且基本上保留了消毒制剂的所有活性。这种优越性是避免了必须在该组合物中加入带刺激性的抗菌剂。

煮沸消毒可以最终杀死全部的微生物。为了进行这种测试，将10克的大豆蛋白胨水解物与氯化铜按照实施例Ⅰ中的上述方法进行配合。将氯化铜溶液加至大豆胨水解物溶液中之后，使所得到的溶液充分混合，然后加热至沸腾5分钟。冷却至室温之后，按照实施例Ⅰ中的上述方法制备活性组合物，然后以上述实施例Ⅱ中的方式施用于鼠手术切口。用消毒过的蛋白胨-铜配合物观察到的愈合活性类似于用未经上述煮沸消毒过的活性组合物获得的结果。

表6：煮沸消毒对活性配合物的影响

测试组        15天后伤口的长度(cm)

N=6

对照组        0.90±0.22

未经煮沸消毒的

活性配合物        0.28±0.15

煮沸消毒的

活性配合物        0.28±0.09

实施例Ⅸ

蛋白胨-铜乳膏对皮肤的粘着力

本实施例描述了使用蛋白胨-铜活性配合物改善皮肤乳膏对皮肤表面的粘着力。因此可以使用蛋白胨-铜配合物乳膏作为一种有效的创伤愈合剂（sealant），或者促进其他生长因子和化合物向创伤、损伤等传递。

制备第一种基质乳膏，它含有55%（重量）芦荟胶，12鲨烷，12%硬脂酸甘油酯，5%PEG-100和4%鲸蜡醇。将10克铜-胨组合物混合到第一种乳膏（50克）中制备第二种乳膏。在10个志愿者（人）的手（第一种乳膏涂于一只手，第二种乳膏涂于另一只手）背上，每个3cm直径的圆内平均涂上每种乳膏（0.5克）。使该样品“停留”三分钟，然后在恒定流速的自来水下冲洗掉。洗掉乳膏的时间是从至少90%的覆盖表面去除掉乳膏所需的时间。一般情况下，对照乳膏在4至9秒（平均6秒）内洗掉。而含有蛋白胨-金属配合物的乳膏在22至65秒（平均34秒）之间洗掉。

如果将实际应用的铜-胨乳膏（第二种乳膏）施用于皮肤，使之“停留”1小时，它似乎在某程度上粘结在皮肤表面，并且只有通过用肥皂用车擦洗皮肤才能去除掉特征性的蓝绿色乳膏。相对而言，对照乳膏（第一种乳膏）在停留1小时之后仍然能容易地从皮肤上洗掉。

对于锡-胨组合物和锢-胨组合物来说发现了类似的增加乳膏对皮肤粘着力的结果。

实施例Ⅹ

通过注射刺激毛发生长

本实施例描述了使用含有蛋白胨-铜配合物的组合物刺激温血动物毛囊的生长。

在本试验中所用的模型是一种鼠模型，已发现它能成功地预测出人体中的治疗反应（见，如美国专利5，118，665，本文引用作为参考）。哺乳动物中的毛发生长过程是经过活动生长期（毛发生长期），接着是休止期（毛发生长终期）。该测试方法一般包括将毛发生长刺激剂施用毛发生长终期鼠的皮肤上。雌性的Swiss-Webster鼠在大约45天龄时开始毛发生长终期，持续到90天龄。在使用活性物质之后，在10至14天内可观察到加强的毛发生长。在此试验中，使用了50天龄的鼠。

对含有铜（Ⅱ），铟（Ⅲ）、锡（Ⅱ）和锡（Ⅳ）的蛋白质组合物进行了测试。为了进行测试，将该组合物与盐水混合（5%胨组合物和95%生理盐水，重量百分比）。将鼠剃毛，然后通过注射将0.05毫升的混合物立即注射到皮下。对照鼠用一种等体积的盐水注射。每组有10只鼠。14天之后，将各级进行比较。确定在注射部位有毛发生长的鼠的百分数和毛发生长反应的相对强度（以1至5的级别评价，1代表几乎观察不到生长，而5代表有非常强的毛发生长）。

如表7所示，结果表明所有的组合物都是活性毛生长刺激，而蛋白胨-锡（Ⅱ）配合物是最有效的试剂。

表7：用蛋白胨-金属配合物刺激毛发生长

在注射部位有毛发        毛发生长的

生长的百分数        平均强度

对照鼠        0        0

胨-铜(II)        100        2.5

胨-铟(III)        80        2.5

胨-锡(II)        100        4.5

胨-锡(IV)        100        4.0

实施例Ⅺ

通过局部使用刺激毛发生长

本试验中所用模型与实施例Ⅹ相同，不同的是在鼠皮肤表面使用该活性物质。对含有铜（Ⅱ）、铟（Ⅲ）、锡（Ⅱ）和锡（Ⅳ）的胨组合物进行了测试。为了进行测试，将该组合物与盐水混合（25%胨组合物和75%生理盐水，重量百分比）以形成浆液。将鼠剃毛，然后在剃区尽可能平坦地涂上0.20克该混合物。对照组用盐水拭抹。每组有10只鼠。14天之后，对各组鼠进行比较。确定在剃毛区中心有毛发生长的鼠的百分率和毛发生长反应的相对强度（以1至5的等级评价，1代表几乎观察不到生长，5代表非常强的毛发生长）。所有组合物都具有活性，而锡（Ⅱ）是最有效的试剂。

表8：表面使用蛋白胨-金属配合物以刺激毛发生长

在剃毛区中心有        毛发生长的

生长的百分数        平均强度

对照鼠        10        0.2

胨-铜(II)        90        2.0

胨-铟(III)        80        2.0

胨-锡(II)        100        4.0

胨-锡(IV)        100        3.0

从上面的结果可以明显看出本发明提供了用于表面皮肤、创伤和手术处理的蛋白胨-金属配合物的组合物，以对温血动物保护其受损皮肤和促进自然愈合过程，促进其表面组织再生过程和刺激毛发生长。本发明还提供了制备和配制适合表面的组合物制剂的经济方法。

本说明书中所得到的所有出版物和专利文献代表了本发明相关技术领域中那些熟练技术人员的技术水平。本文所引用参考的所有出版物和专利文献与明确指出的单独和具体引用每篇独立的出版物或专利文献效力相同。

尽管前述的本发明通过解释和实施例的方式进行了详细地描述，但目的是为了更清楚地理解本发明，显然在所附带的权利要求范围内可以进行一定的变化和修改。

Claims (41)

1、一种加快温血动物表面创伤愈合的方法，包括：

给创伤部位施用一治疗有效量的组合物，该组合物含有一种与一种离子态过渡金属配合的蛋白胨消化物。

2、按照权利要求1所述的方法，其中离子态过渡金属是铜（Ⅱ），铟（Ⅲ），锡（Ⅱ）或锡（Ⅳ），和其治疗学上可接受的盐。

3、按照权利要求1所述的方法，其中的蛋白离子态过渡金属是铜（Ⅱ）。

4、按照权利要求1所述的方法，其中的蛋白胨消化物是从酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肉类、丝蛋白或大豆蛋白制得的。

5、按照权利要求1所述的方法，其中的蛋白胨消化物是以大豆蛋白制得的。

6、按照权利要求5所述的方法，其中与大豆蛋白胨配合的离子态过渡金属是铜（Ⅱ）、铟（Ⅲ）、锡（Ⅱ）或锡（Ⅳ）。

7、一种加快温血动物皮肤从刺激状态恢复的方法，包括：

给刺激的皮肤施用一治疗有效量的组合物，该组合物含有一种与一种离子态过渡金属相配合的蛋白胨消化物。

8、一种保护温血动物皮肤免受氧化损伤和辅助受伤皮肤恢复的方法，包括：

给皮肤或受伤部位施用一预防或治疗有效量的组合物，该组合物含有一种与一种离子态过渡金属相配合的蛋白胨消化物。

9、按照权利要求8所述的方法，其中离子态过渡金属是铜（Ⅱ），铟（Ⅲ），锡（Ⅱ）或锡（Ⅳ），及其治疗学上可接受的盐。

10、按照权利要求8所述的方法，其中离子态过渡金属是铜（Ⅱ）。

11、按照权利要求8所述的方法，其中的蛋白胨消化物是由酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肉类、丝蛋白或大豆蛋白制得的。

12、按照权利要求8所述的方法，其中的蛋白胨消化物是从大豆蛋白制得的。

13、按照权利要求12所述的方法，其中与大豆蛋白胨配合的离子态过渡金属是铜（Ⅱ）、铟（Ⅲ）、锡（Ⅱ）或锡（Ⅳ）。

14、一种增加温血动物毛囊大小和毛发生长速度的方法，包括：

给所说动物的皮肤施用一种组合物，该组合物含有一种与一种离子态过渡金属配合的蛋白胨消化物，该组合物的使用量要足以增加所说动物的毛囊大小和毛发生长速度。

15、按照权利要求14所述的方法，其中的组合物是局部使用或者注射到皮肤下。

16、按照权利要求15所述的方法，其中的组合物是给需要增加毛发生长的皮肤区每天局部使用。

17、按照权利要求14所述的方法，其中的离子态过渡金属是铜（Ⅱ）、铟（Ⅲ）、锡（Ⅱ）或锡（Ⅳ），及其治疗学上可接受的盐。

18、按照权利要求14所述的方法，其中的离子态过渡金属是铜（Ⅱ）。

19、按照权利要求14所述的方法，其中的离子态过渡金属是锡（Ⅱ）。

20、按照权利要求14所述的方法，其中的蛋白胨消化物是由酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白或大豆蛋白制备的。

21、按照权利要求20所述的方法，其中的蛋白胨消化物是由大豆蛋白制得的。

22、按照权利要求21所述的方法，其中与大豆蛋白胨配合的离子态过渡金属是铜（Ⅱ）、铟（Ⅲ）、锡（Ⅱ）或锡（Ⅳ）。

23、一种制备用于加快温血动物的表面创伤愈合或增加其毛囊大小和毛发生长速度的药物组合物的方法包括：使一种蛋白胨消化物与足以能诱发沉淀的一定量的过渡金属盐水溶液结合，该沉淀物含有与过渡金属配合的蛋白胨;

分离蛋白胨-金属配合物的沉淀物。

24、按照权利要求23所述的方法，其中还进一步包括使分离的蛋白胨-金属配合物消毒或巴氏消毒的步骤。

25、按照权利要求23所述的方法，其中进一步包括使分离的蛋白胨-金属配合物与一种药学上可接受载体结合物的步骤。

26、按照权利要求25的方法，其中药学上可接受的载体是适合于给温血动物局部使用的载体。

27、按照权利要求25所述的方法，其中分离的蛋白胨-金属配合物是与一种药学上可接受的载体结合形成一种乳膏或洗液。

28、按照权利要求25所述的方法，其中分离的蛋白胨-金属配合物在药物组合物中的浓度是大约5%至25%。

29、按照权利要求23所述的方法，其中的蛋白胨消化物是由酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肉类、丝蛋白或大豆蛋白制得的。

30、按照权利要求23所述的方法，其中的离子态过渡金属是铜（Ⅱ）、铟（Ⅲ）、锡（Ⅱ）或锡（Ⅳ）。

31、按照权利要求23所述的方法，还进一步包括将蛋白胨-过渡金属盐结合物的pH调至大约pH6.0至7.0的步骤。

32、按照权利要求23所述的方法，其中蛋白胨-金属配合物的沉淀物是通过离心分离的。

33、一种用于加快温血动物的局部损伤愈合的药物组合物，包含一种治疗有效量的与一种离子态过渡金属相配合的蛋白胨消化物和一种药学上可接受的载体。

34、按照权利要求33所述的药物组合物，其中的离子态过渡金属是铜（Ⅱ）、铟（Ⅲ）、锡（Ⅱ）或锡（Ⅳ），和其治疗学上可接受的盐。

35、按照权利要求33所述的药物组合物，其中的离子态过渡金属是铜（Ⅱ）。

36、按照权利要求33所述的药物组合物，其中的蛋白胨是酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肉类、丝蛋白或大豆。

37、按照权利要求33所述的药物组合物，其中的蛋白胨-金属配合物存在于组合物中的浓度是5%至20%。

38、一种用于增加温血动物的毛囊大小和毛发生长速度的药物组合物，它包括一种毛发生长刺激量的蛋白胨-离子态过渡金属配合物和一种药学上可接受的载体。

39、按照权利要求38所述的药物组合物，其中的蛋白胨-金属配合物存在于该组合物中的浓度是5%至25%。

40、按照权利要求39所述的药物组合物，其中离子态过渡金属是铜（Ⅱ）、铟（Ⅲ）、锡（Ⅱ）或锡（Ⅳ），和其治疗学上可接受的盐。

41、按照权利要求39所述的药物组合物，其中的蛋白胨是酪蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肉类、丝蛋白或大豆。