CN110735002B - 一种基于浅层基因组序列开发的槲蕨ssr引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于浅层基因组序列开发的槲蕨SSR引物及其应用，本发明基于第2代测序技术的基因组浅层测序技术进行槲蕨的基因组测序，根据得到的序列开发并筛选出了7对稳定性好多态性高的SSR引物，对槲蕨的基因组作图、群体和进化遗传研究、遗传多样性分析、种质资源保护与利用或分子标记育种提供了基础。
Description
技术领域：
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种基于浅层基因组序列开发的槲蕨SSR引物及其应用。
背景技术：
槲蕨Drynaria roosii Nakaike是一种重要的多年生草本药用植物，是《中华人民共和国药典》(2015版)中药材“骨碎补”的正品，以其干燥根茎入药，具有补肾坚骨，活血止痛之功效，主治跌打损伤、腰膝酸痛。槲蕨的化合物组成复杂，主要成分为柚皮苷、新北美圣草苷、咖啡酸-4-О-β-D-葡萄糖苷、5，7-二羟基色原酮-7-O-芸香糖苷。《中华人民共和国药典》(2015版)以柚皮苷含量为质量标准。但研究表明，不同种源的槲蕨的有效药用成分柚皮苷含量的差异较大，而种群水平的遗传分化是道地药材形成的遗传学基础，遗传的多样性与分化研究是药用植物槲蕨开发与利用的一个重要基础。
SSR分子标记又称简单重复序列，也称微卫星DNA，是真核生物基因组中普遍存在的一种重复序列，重复单元由1～6个碱基组成，重复单元的重复次数在不同种或同一种不同个体之间是高度可变的。SSR分子标记技术数量丰富,覆盖整个基因组,而且分布均匀,不仅多态性高,比RAPD、RFLP等分子标记技术产生的等位基因丰富且多样性高，还呈共显性遗传，广泛应用于基因组作图、群体和进化遗传研究、遗传多样性分析、种质资源保护与利用、分子标记育种等诸多领域。
SSR标记的引物具有高度的物种特异性，每一植物的SSR引物一般仅限用于该植物。SSR分子标记引物开发比较费时、操作繁琐、成本较高。因此，SSR引物开发这是限制SSR标记应用的一大瓶颈。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种基于浅层基因组序列开发的槲蕨SSR引物及其应用，本发明基于第2代测序技术的基因组浅层测序技术进行槲蕨的基因组测序，根据得到的序列开发并筛选除了7对多态位点丰富的SSR引物，对槲蕨的基因组作图、群体和进化遗传研究、遗传多样性分析、种质资源保护与利用或分子标记育种提供了基础。
为解决上述问题，本发明的技术方案是：
一种基于浅层基因组序列开发的槲蕨SSR引物，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和第七引物对中的任意一种或多种组合；所述第一引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述第二引物对包括SEQ ID NO.3和SEQID NO.4；所述第三引物对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；所述第四引物对包括SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8；所述第五引物对包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；第六引物对包括SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；第七引物对包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
进一步的改进，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和第七引物对。
进一步的改进，所述第一引物对、第二引物对、第三引物对的PCR最适退火温度为58℃，第四引物对、第五引物对、第六引物对和第七引物对的最适PCR退火温度为55℃。
上述基于浅层基因组序列开发的槲蕨SSR引物的用途，所述引物用于基因组作图、群体和进化遗传研究、遗传多样性分析、种质资源保护与利用或分子标记育种。
进一步的改进，所述引物用于检测槲蕨的遗传多样性分析。
进一步的改进，所述槲蕨包括江西新余、云南文山、四川雷波、广西融安、湖南通道和云南勐腊地方的6个居群槲蕨。
具体实施方式：
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
(1)结合槲蕨的地理分布和形态变异，选择6个代表性个体，分别来自江西新余、云南文山、四川雷波、广西融安、湖南通道、和云南勐腊等6个居群。
(2)采用基于第2代测序技术的基因组浅层测序(Genome Skimming based onnext-generation sequencing)方法进行基因组测序，每个个体获得1G的数据，通过对双端测序所得reads进行拼接，去除低质量片段，采用基于Linux系统的检索工具QDD，进行SSR位点查找，分析其中的consensus序列，共得到28条consensus序列，大部分SSR为两碱基重复位点，对每条consensus序列设计了PCR引物，详细信息如表1：
表1根据consensus序列的28对PCR引物
(3)来自江西新余、云南文山、四川雷波、广西融安、湖南通道、和云南勐腊等6个居群，每个居群随机选择了3个个体的样品，进行DNA提取和PCR扩增，检验引物的扩增效率，筛选扩增效率好的引物进一步通过荧光引物扩增检测多态性。荧光标记的引物对504份样品扩增，扩增产物在ABI 3130xl遗传分析仪上来进行片段大小测定，具体操作步骤如下：(a)取扩增的PCR产物2μL，2种荧光标记引物FAM、HEX扩增产物分别稀释为50倍、30倍、10倍、1倍；(b)将每组的2种荧光标记产物每种取1μL混合，离心混匀，取1μL加入96孔板中；(c)按照每孔10μL体系，每孔含有1μL稀释后的扩增产物、8.9μL甲酰胺和0.1μL片段大小标准的GS500(-250)LIZ，计算所需要的甲酰胺和LIZ的量，并将两者混合做成预混液，分装到96孔板中；(d)95℃变性5min；(e)上机进行毛细管电泳；(f)用Genemapper对上机结果进行片段大小及基因分型分析。
(4)筛选出槲蕨7对稳定性好、多态性高、特异性较强的SSR引物，其中重复单元中二核苷酸重复数量最多，有4个；三核苷酸重复数量为2个；四核苷酸重复数量为1个，如表2所示。
表2筛选得到的7对SSR引物
利用7对SSR引物，检测了槲蕨6个居群18个个体的遗传多样性，具体遗传信息如下表：
统计表明，平均多态位点百分比高达92.87％，各SSR标记的平均观测杂合度(Ho)和遗传指数(Nei’s)分别为0.48和0.38、Shannon信息指数(I)为1.0,有效等位基因数(Ne)为2.38较为接近等位基因数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 怀化学院
<120> 一种基于浅层基因组序列开发的槲蕨SSR引物及其应用
<130> 2019-12-03
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tggataatcc ttcttttggg c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tagattgcaa ttgccacaat g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gccgatacac ctccaaacat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cagaattgat ggcattgacg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tctacacaaa tgtgggtgcg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tgcacacact tacccaaaca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ccatcccttc caaaatttca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
atgcttgacc cctttccttt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
ccacaaccaa ggactgaagg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
gaacagcgtc ttgcttgatg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
tggcattttg ggctctactc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ccttgccatt caagtggatt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
ggccctcttg agttgttgtc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
agctcataaa gctcacccca 20
Claims (3)
1.一种基于浅层基因组序列开发的槲蕨SSR引物，其特征在于，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和第七引物；所述第一引物对包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述第二引物对包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述第三引物对包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；所述第四引物对包括SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8；所述第五引物对包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；第六引物对包括SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；第七引物对包括SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
2.如权利要求1所述的基于浅层基因组序列开发的槲蕨SSR引物，其特征在于，所述第一引物对、第二引物对、第三引物对的PCR最适退火温度为58℃，第四引物对、第五引物对、第六引物对和第七引物对的最适PCR退火温度为55℃。
3.一种权利要求1或2所述的基于浅层基因组序列开发的槲蕨SSR引物的用途，其特征在于，所述引物用于检测槲蕨的遗传多样性分析；所述槲蕨包括江西新余、云南文山、四川雷波、广西融安、湖南通道和云南勐腊的6个居群槲蕨。
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