CN110724726B - 一种鱼肉腐败菌氨基酸脱氨能力的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鱼肉腐败菌氨基酸脱氨能力的检测方法，包括：用磷酸盐缓冲液溶解待测氨基酸底物配制得到待测氨基酸的底物溶液，将含待测腐败菌的菌悬液加入到待测氨基酸的底物溶液中作为评价组，将含待测腐败菌的菌悬液加入到磷酸盐缓冲液中作为对照组，将无菌生理盐水加入到所述待测氨基酸的底物溶液中作为空白组，分别在相同条件下培养，随后检测得到评价组、对照组和空白组的游离氨浓度C评价、C对照和C空白，计算得到腐败菌对待测氨基酸的脱氨能力。本发明所提供的方法能广泛适用于多种鱼肉中各类腐败菌的氨基酸脱氨能力的检测；适用于定量检测和评价腐败菌对多种特定氨基酸的脱氨能力；适用于评价鱼肉腐败菌代谢利用游离氨基酸的能力。

Description

一种鱼肉腐败菌氨基酸脱氨能力的检测方法
技术领域
本发明属于水产品贮藏保鲜技术与质量安全领域，具体涉及一种鱼肉腐败菌氨基酸脱氨能力的检测方法。
背景技术
鱼肉由于营养丰富、易于消化、味道鲜美等特点，一直以来是我国居民日常膳食的重要组成部分；然而，鱼肉自身水分活度高、营养丰富，因而其在贮运过程中极易因腐败菌的生长繁殖而发生腐败变质，最终影响鱼肉产品的加工和消费。
研究表明，鱼肉中腐败菌具有较强的氨基酸脱氨能力。微生物通过氨基酸脱氨反应，一方面可利用脱氨后的氨基酸碳骨架进行能量代谢和物质合成，促进自身生长；另一方面脱氨产生的游离氨是鱼肉中重要的挥发性异味物质，可严重影响鱼肉感官品质。此外，不同腐败菌的氨基酸脱氨能力和代谢特性也具有较大差异。因此，广泛研究和评价各类腐败菌的氨基酸脱氨能力，对研究鱼肉腐败菌的致腐机制，设计开发鱼肉品质控制技术具有重要意义。
现有技术中，水产品腐败菌致腐能力和代谢活性的评价主要通过挥发性盐基氮(TVB-N)指标进行。
申请号为200910051437.7中国发明专利采用单位数量腐败菌产生的挥发性盐基氮(TVB-N)的量来表征鱼类腐败菌的腐败能力；申请号为201810532768.1中国发明专利则将腐败期间的TVB-N产量纳入考量范围。然而，腐败菌的氨基酸脱氨作用是引发鱼肉腐败，产生不良风味，降低鱼肉商业价值的重要因素。
然而，迄今为止，尚未见到有关鱼肉腐败菌氨基酸脱氨能力的评价方法的报道。
发明内容
针对现有技术中鱼肉腐败菌致腐能力评价和方法存在的问题，本发明提供一种鱼肉腐败菌氨基酸脱氨能力的检测方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种鱼肉腐败菌氨基酸脱氨能力的检测方法，包括：用磷酸盐缓冲液溶解待测氨基酸底物配制得到待测氨基酸的底物溶液，将含待测腐败菌的菌悬液加入到所述待测氨基酸的底物溶液中作为评价组，将含待测腐败菌的菌悬液加入到磷酸盐缓冲液中作为对照组，将无菌生理盐水加入到所述待测氨基酸的底物溶液中作为空白组，分别在相同条件下培养，随后检测得到评价组、对照组和空白组的游离氨浓度C评价、C对照和C空白，计算得到腐败菌对待测氨基酸的脱氨能力。
在上述技术方案中，所述腐败菌对待测氨基酸的脱氨能力采用下式计算：
DMA＝(T×V)×(C评价-C对照-C空白)/(M×TVC×t)；
式中：
DMA为腐败菌氨基酸的脱氨能力，μmol/h；
T为检测游离氨浓度时的稀释倍数；
V为检测游离氨浓度时反应体系的总体积；
M为游离氨的分子量，g/mol；
TVC为菌悬液的菌落总数，log CFU/mL；
t为反应时间，h。
进一步地，在上述技术方案中，所述游离氨浓度的检测采用靛酚蓝法。
具体地，在上述技术方案中，所述游离氨浓度的检测具体包括以下步骤：
S1、采用0.005M的硫酸溶液将培养后的反应液稀释10-50倍；
S2、取步骤S1中稀释后的反应液2mL与含5wt％水杨酸和5wt％柠檬酸钠的混合溶液100μL、1wt％的亚硝基铁氰化钠溶液20μL及0.05M的NaClO溶液20μL混合均匀，避光反应1h；
S3、取步骤S2中避光反应后的反应液200μL于96孔板中，在695nm波长下测吸光度；
S4、利用游离氨标准溶液浓度和靛酚蓝法测得的各浓度标准溶液在695nm波长下的吸光度建立标准曲线，根据标准曲线求得待测溶液中相应游离氨的浓度C；
吸光度-浓度标准曲线形式为：Y＝aC+b，要求R2>0.995。式中：C为游离氨浓度，单位μg/mL，Y为695nm波长下的吸光度。
再进一步地，在上述技术方案中，所述培养的温度为30-35℃。
再进一步地，在上述技术方案中，所述培养的时间为36-54h。
又进一步地，在上述技术方案中，所述待测氨基酸的底物溶液的配制具体包括，用0.045M、pH 7.50的磷酸盐缓冲液溶解得到4.0-6.5mM的待测氨基酸的底物溶液，121℃灭菌15-20min，冷却后再加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，并控制氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的终浓度为0.06-0.08mM。
还进一步地，在上述技术方案中，所述含待测腐败菌的菌悬液的配制具体包括，挑取分离纯化后的待测腐败菌单菌落于胰蛋白胨大豆肉汤中，30℃水浴摇瓶培养至肉汤菌落总数达9.0-10.0log CFU/mL，并用无菌生理盐水调整菌悬液浓度至8.0-9.0log CFU/mL。
本发明另一方面还提供了上述检测方法在鱼肉腐败菌氨基酸脱氨能力检测中的应用。
本发明的优点：
(1)本发明所提供的方法不受腐败菌来源和种类的限制，能广泛适用于多种鱼肉中各类腐败菌的氨基酸脱氨能力的检测；
(2)本发明所提供的方法适用于定量评价腐败菌对多种特定氨基酸的脱氨能力的检测；
(3)本发明所提供的方法适用于评价鱼肉腐败菌代谢利用游离氨基酸的能力。
附图说明
图1为本发明实施例中Pseudomonas helmanticensis和Shewanellaputrefaciens的氨基酸脱氨能力对照结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
若未特别指明，本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得。
若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1冷藏鳙鱼肉特定腐败菌Pseudomonas helmanticensis的氨基酸脱氨能力检测
具体包括以下步骤：
(1)微生物菌悬液的制备：挑取分离纯化后的Pseudomonas helmanticensis单菌落于胰蛋白胨大豆肉汤中，30℃水浴摇瓶培养至肉汤菌落总数达9.0log CFU/mL，并用无菌生理盐水调整菌悬液浓度至8.0log CFU/mL备用。
(2)氨基酸底物溶液的配制：以0.045M、pH＝7.50的磷酸盐缓冲液(PBS)，溶解甘氨酸底物，使甘氨酸浓度为5.0mM；该溶液121℃灭菌15min，冷却后再加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，使NAD+终浓度为0.07mM，即得甘氨酸的底物溶液。丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸等其他单一氨基酸底物溶液的配制与上述方法相同。
(3)Pseudomonas helmanticensis氨基酸脱氨活性测定方法：无菌操作条件下，吸取0.2mL的菌悬液加入到1.0mL氨基酸底物溶液中，在35℃环境下培养48h后，测定游离氨的生成量(此为评价组)。对照组以相同浓度和pH的PBS缓冲液代替氨基酸底物溶液，空白组以0.2mL的无菌生理盐水代替腐败菌的菌悬液。
(4)游离氨的生成量的检测：采用靛酚蓝法。
具体包括：
S1、采用0.005M的硫酸溶液将培养后的反应液稀释50倍；
S2、取步骤S1中稀释后的反应液2mL与含5wt％水杨酸和5wt％柠檬酸钠的混合溶液100μL、1wt％的亚硝基铁氰化钠溶液20μL及0.05M的NaClO溶液20μL混合均匀，避光反应1h；
S3、取步骤S2中避光反应后的反应液200μL于96孔板中，在695nm波长下测吸光度；
S4、利用游离氨标准溶液浓度和靛酚蓝法测得的各浓度标准溶液在695nm波长下的吸光度建立标准曲线，根据标准曲线求得稀释50倍后的反应液中游离氨浓度；
吸光度-浓度标准曲线形式为：Y＝0.4494C+0.0656；R2＝0.9988。
式中：
Y为695nm波长下吸光值(Abs)；
C为游离氨浓度，单位μg/mL。
(5)氨基酸脱氨能力的计算：
Figure BDA0002255226350000051
式中：
DMA为腐败菌对某种氨基酸的脱氨能力，单位μmol/h；
C1，C对和C空分别为靛酚蓝法测得的评价组、对照组和空白组稀释后反应液中游离氨的浓度，单位μg/mL；
N为检测游离氨浓度时的稀释倍数，50倍；
1.2为检测游离氨浓度时反应体系的总体积，mL；
17为游离氨的分子量，g/mol；
TVC为菌悬液的菌落总数，8.0log CFU/mL；
t为反应时间，48h。
(6)具体实验结果：
具体结果如图1所示；由图1可知，鳙鱼特定腐败菌Pseudomonas helmanticensis对天冬酰胺、精氨酸和天冬氨酸的脱氨活性最高，其次是丙氨酸和甘氨酸，而对亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等苦味氨基酸及苏氨酸等的脱氨能力较弱。
实施例2冷藏鲢鱼肉特定腐败菌Shewanella putrefaciens的氨基酸脱氨能力检测
具体包括以下步骤：
(1)微生物菌悬液的制备：挑取分离纯化后的Shewanella putrefaciens单菌落于胰蛋白胨大豆肉汤中，30℃水浴摇瓶培养至肉汤菌落总数达9.0log CFU/mL，并用无菌生理盐水调整菌悬液浓度至8.0log CFU/mL备用。
(2)氨基酸底物溶液的配制：以0.045M，pH＝7.50的磷酸盐缓冲液(PBS)，溶解甘氨酸底物，使甘氨酸浓度为5.0mM；该溶液121℃灭菌15min，冷却后再加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，使NAD+终浓度为0.07mM，即得甘氨酸的底物溶液。丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸等其他单一氨基酸底物溶液的配制与上述方法相同。
(3)Shewanella putrefaciens氨基酸脱氨活性测定方法：无菌操作条件下，吸取0.2mL菌悬液加入到1.0mL氨基酸底物溶液中，在35℃环境下培养48h后，测定游离氨的生成量(此为评价组)。对照组以相同浓度和pH的PBS缓冲液代替氨基酸底物溶液，空白组以0.2mL的无菌生理盐水代替腐败菌的菌悬液。
(4)游离氨的生成量的检测：采用靛酚蓝法。
具体包括：
S1、采用0.005M的硫酸溶液将培养后的反应液稀释20倍；
S2、取步骤S1中稀释后的反应液2mL与含5wt％水杨酸和5wt％柠檬酸钠的混合溶液100μL、1wt％的亚硝基铁氰化钠溶液20μL及0.05M的NaClO溶液20μL混合均匀，避光反应1h；
S3、取步骤S2中避光反应后的反应液200μL于96孔板中，在695nm波长下测吸光度；
S4、利用游离氨标准溶液浓度和靛酚蓝法测得的各浓度标准溶液在695nm波长下的吸光度建立标准曲线，根据标准曲线求得稀释20倍后的反应液中游离氨浓度；
吸光度-浓度标准曲线形式为：Y＝0.4494C+0.0656；R2＝0.9988。
式中：
Y为695nm波长下吸光值(Abs)；
C为游离氨浓度，单位μg/mL。
(5)氨基酸脱氨能力的计算：
Figure BDA0002255226350000071
式中：
DMA为腐败菌对某种氨基酸的脱氨能力，单位μmol/h；
C1，C对和C空分别为靛酚蓝法测得的评价组、对照组和空白组稀释后反应液中游离氨的浓度，单位μg/mL；
N为检测游离氨浓度时的稀释倍数，20倍；
1.2为检测游离氨浓度时反应体系的总体积，mL；
17为游离氨的分子量，g/mol；
TVC为菌悬液的菌落总数，8.0log CFU/mL；
t为反应时间，48h。
(6)具体实验结果：
具体结果如图1所示；由图1可知，鲢鱼特定腐败菌Shewanella putrefaciens的氨基酸脱氨能力，特别是对精氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺的脱氨能力比Pseudomonashelmanticensis弱。此外，与实施例1的结果对比可知，Shewanella putrefaciens对半胱氨酸的脱氨能力强于Pseudomonas helmanticensis。
最后，以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种鱼肉腐败菌氨基酸脱氨能力的检测方法，其特征在于，包括：用磷酸盐缓冲液溶解待测氨基酸底物配制得到待测氨基酸的底物溶液，将含待测腐败菌的菌悬液加入到所述待测氨基酸的底物溶液中作为评价组，将含待测腐败菌的菌悬液加入到磷酸盐缓冲液中作为对照组，将无菌生理盐水加入到所述待测氨基酸的底物溶液中作为空白组，分别在相同条件下培养，随后检测得到评价组、对照组和空白组的游离氨浓度C评价、C对照和C空白，计算得到腐败菌对待测氨基酸的脱氨能力；评价组、对照组和空白组的培养温度为30-35℃，培养时间为36-54h；
所述待测氨基酸的底物溶液的配制具体包括，用0.045M、pH 7.50的磷酸盐缓冲液溶解得到4.0-6.5mM的待测氨基酸的底物溶液，121℃灭菌15-20min，冷却后再加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，并控制氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的终浓度为0.06-0.08mM；
含待测腐败菌的菌悬液的制备方法如下：挑取分离纯化后的待测腐败菌单菌落于胰蛋白胨大豆肉汤中，30℃水浴摇瓶培养至肉汤菌落总数达9.0-10.0log CFU/mL，并用无菌生理盐水调整菌悬液浓度至8.0-9.0log CFU/mL；
所述游离氨浓度的检测采用靛酚蓝法；
所述腐败菌对待测氨基酸的脱氨能力采用下式计算：
DMA＝(T×V)×(C评价-C对照-C空白)/(M×TVC×t)；
式中：
DMA为腐败菌氨基酸的脱氨能力，μmol/h；
T为检测游离氨浓度时的稀释倍数；
V为检测游离氨浓度时反应体系的总体积；
M为游离氨的分子量，g/mol；
TVC为菌悬液的菌落总数，log CFU/mL；
t为反应时间，h。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述游离氨浓度的检测具体包括以下步骤：
S1、采用0.005M的硫酸溶液将培养后的反应液稀释10-50倍；
S2、取步骤S1中稀释后的反应液2mL与含5wt％水杨酸和5wt％柠檬酸钠的混合溶液100μL、1wt％的亚硝基铁氰化钠溶液20μL及0.05M的NaClO溶液20μL混合均匀，避光反应1h；
S3、取步骤S2中避光反应后的反应液200μL于96孔板中，在695nm波长下测吸光度；
S4、利用游离氨标准溶液浓度和靛酚蓝法测得的各浓度标准溶液在695nm波长下的吸光度建立标准曲线，根据标准曲线求得待测溶液中相应游离氨的浓度C；
吸光度-浓度标准曲线形式为：Y＝aC+b，要求R2>0.995，式中：C为游离氨浓度，单位μg/mL，Y为695nm波长下的吸光度。
3.权利要求1或2所述的检测方法在鱼肉腐败菌氨基酸脱氨能力检测中的应用。
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