CN110724667A - 一种低成本光雕制备石墨烯3d微图案及该3d微图案在导向神经细胞生长中的应用 - Google Patents

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路娇扬
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Abstract

本发明公开了一种低成本光雕制备石墨烯3D微图案及该3D微图案在导向神经细胞生长中的应用，所述石墨烯3D微图案是通过使用消费级光雕DVD刻录机直接刻录在GO膜上获得的。本发明利用消费级光雕DVD刻录机在任意基底上直接批量制备大面积光雕石墨烯(LSG)3D微图案，并将该图案用于神经元细胞的导向生长。这种在常温常压下一步光雕的过程，具有简单、快速、易于扩展、价格低廉等优势。商用光雕DVD刻录机和标准尺寸DVD价值共计约200多元人民币，只需用20分钟或更少的时间就可在一个光盘上产生尺寸范围从分米到微米级(甚至纳米级)的晶片级(面积约为100cm2)的定制石墨烯3D图案。通过对光雕参数的精确控制，在任意衬底上产生的具有各种特定的形状、线宽、密度的石墨烯3D微图案，可作为细胞培养基底来直接支持细胞的附着、生长、排列等。

Description

一种低成本光雕制备石墨烯3D微图案及该3D微图案在导向神 经细胞生长中的应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术，具体涉及一种低成本光雕制备石墨烯3D微图案及该3D微图案在导向神经细胞生长中的应用。
背景技术
石墨烯家族材料，如原始石墨烯、氧化石墨烯(GO)和还原态氧化石墨烯(rGO)，由于其显著的高比表面积，独特的电学、化学、光学和机械特性，引起了越来越多在电子、生物医学、传感器、光子学和能源等多个研究领域工作的科学家的兴趣和想象力。可控批量制备石墨烯及其衍生物图案，将带来一些有趣新特性，允许精确调节石墨烯材料的特性，并将其应用于在定制化柔性材料或装置中。最近，为了实现这个目标，已经发展出通过各种印刷技术制造石墨烯图案的方法(例如石墨烯微/纳米带，微/纳米筛)。虽然这些方法中有些具有图案制造精度高的特点，但是这些传统平版印刷技术(包括光刻、软光刻、电子束刻蚀、纳米压印、浸笔微影术、干涉刻蚀和离子束刻蚀等)存在耗时长、劳动强度大、工序复杂且成本高昂等不足，通常需要繁琐的步骤，昂贵的遮罩或模板，后处理或复杂的洁净环境操作，这严重阻碍了其广泛的商业应用。在各种创新技术中，因为激光具有较多的波长和能量选择，在现代工业中其广泛应用于加工和制造。因此，基于激光加工石墨烯材料的技术为其商业应用带来了希望。最近，激光辐射技术因其具有处理速度快、无物理接触和大扫描面积等优点，已经被广泛应用于石墨烯的合成、还原和图案化中以及各种柔性电子设备的制造上。尽管在通过激光技术制备石墨烯图案方面取得了重大进展，但仍存在一个重大挑战，即现有技术仍需要利用笨重、大型并且昂贵的设备，在特殊条件(如真空或惰性气体保护)下工作，这阻碍了低成本和大规模的石墨烯图案的微/纳米制造及其实际应用。
通过释放现有(甚至废弃)技术的潜力，以全新的方式重新再利用它们，Kaner等人创造性地发明了光雕GO-rGO转换和图案化技术，该技术仅使用一个消费级的光雕DVD刻录机。这个过程成本非常低、高效、无需转移且操作灵活，所以是一个极具吸引力和希望的策略。自其发展以来，该光雕技术已被用于进行各种加工，例如实现带隙调节、增强导电率、去除表面官能团、剥离和形成多孔结构、以及掺杂石墨烯或类似石墨烯的材料(例如MoS2)的相位逆转。这些显示了该技术在电子、光电和电声器件中的应用潜力，例如电容器、传感器和存储器记忆芯片。然而，在光雕技术的实际应用以及与其他技术的竞争中仍然存在两个障碍。一方面，尽管光雕技术可以创建许多具有不同尺寸和形状的宏观石墨烯图案，但是如何制造定制的、精细的石墨烯二维或三维(2D/3D)图案，使该图案可达到从分米到微米尺度(甚至纳米尺度)的变换，并在任意基体上对图案参数(形状、线宽、密度)进行精确控制仍然充满挑战。另一方面，包括光雕技术在内的各种技术制备的石墨烯图案很少用于除了电子学和光子学(如传感器和设备)的其他领域，如生物医学中的细胞生物学和力学生物学、干细胞分化或药物筛选。
最近，一些有趣的尝试已经利用由传统印刷和激光辐射技术制造的尺寸从几十到几百微米的石墨烯微图案(例如氟化的石墨烯线，rGO线，GO凹槽、线和网格)，作为控制细胞粘附、对准、分化和基因传递的细胞导向物理线索，这在生物医学应用(如组织工程)中具有巨大的潜力。不幸的是，这些方法在生成低成本、量产化石墨烯图案方面存在缺陷，这极大地阻碍了将控制细胞行为相关的有趣发现转变为实际应用。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明利用消费级光雕DVD刻录机在任意基底上直接批量制备大面积光雕石墨烯(LSG)3D微图案，并将该图案用于神经元细胞的导向生长。
本发明的技术方案是：一种低成本光雕制备石墨烯3D微图案，所述石墨烯3D微图案是通过使用消费级光雕DVD刻录机直接刻录在GO膜上获得的。
所述的一种低成本光雕制备石墨烯3D微图案，具体制备过程包括：将15ml浓度为0.34 mg/ml的GO水溶液直接滴涂到可光雕的DVD光盘或粘在DVD表面的薄层基底上，并允许在自然条件下干燥过夜；然后将制得有GO涂层的DVD光盘插入到刻录机激光处理；通过支持光雕的应用软件控制光雕参数，使用普通计算机软件设计的图案可直接批量、精确光雕到GO膜上。
本发明的另一目的在于提供上述的石墨烯3D微图案在导向神经细胞生长中的应用。
所述的应用，将PC12细胞在37℃的5％CO2的水饱和条件下，培养在补充有10％马血清， 5％胎牛血清，10units/ml的青霉素和10μg/ml的链霉素的RPMI-1640培养基中培养；在细胞接种之前，将GO和LSG图案裁剪成适合24孔或96孔板的大小；然后GO和各种不同图案的LSG在75％乙醇中浸泡2小时，紫外照射1小时，然后用PBS溶液冲洗2次后接种。
这种在常温常压下一步光雕的过程，具有简单、快速、易于扩展、价格低廉等优势。商用光雕DVD刻录机和标准尺寸DVD价值共计约200多元人民币，只需用20分钟或更少的时间就可在一个光盘上产生尺寸范围从分米到微米级(甚至纳米级)的晶片级(面积约为100cm2) 的定制石墨烯3D图案。通过对光雕参数的精确控制，在任意衬底上产生的具有各种特定的形状、线宽、密度的石墨烯3D微图案，可作为细胞培养基底来直接支持细胞的附着、生长、排列等。
附图说明
图1.通过采用不同的打印模式、灰度值和对比度获得的直径0.6cm的18个LSG圆圈光学显微镜(a)、SEM(b)图像。从左到右打印模式为最佳、标准、草图。灰色值从上到下依次是 0、100、200。
图2.光雕参数和由此产生的LSG图案之间的关系。其中线宽(a)、线间距(b)、线密度(c)、相对面积(d)的统计图，用于比较不同光雕参数的作用。
图3.使用最佳模式、增强对比度、灰度值＝0获得的LSG图案的SEM图像，由此获得的剥离还原石墨烯层具有大面积平整的形貌。
图4.LSG微图案的形貌和化学变化。其中：(a)LSG微图案和未处理的GO区域的SEM图像。箭头表示激光扫描方向。(b)在图2a黄框中的LSG和GO区域的放大视图。插图：高倍SEM下的LSG表面的多孔结构和GO表面的平坦形貌。光雕参数：标准模式，灰度值为 100，默认对比度。(c)GO和LSG的拉曼和(d-f)XPS比较。
图5.GO和LSG基底对PC12细胞培养的生物相容性。其中(a)GO和LSG对细胞的代谢活动的影响(MTT法)和(b)LDH释放(细胞膜损伤的标记物)。
图6.在LSG线形图案上的分化培养48小时的PC12细胞的典型ESEM图像。其中(a)低和高倍ESEM图像显示了分化培养在由各种打印方式和重复次数(D1、D2、N1、N1D1、B1) 获得的LSG图案上的PC12细胞具有不同的生长形貌。其他光雕参数：灰度值为0，增强对比度。插图为其相应的2D FTT频谱。比例尺为20μm。(b)对图6a进行统计分析获得的PC12 细胞取向的角度直方图，其显示细胞沿GO-LSG-GO沟槽的方向伸长。
图7.在LSG线形图案(draft 1次和normal 1次)上分化48小时的PC12细胞的典型SEM 图像。
图8.在由各种打印方式和重复次数(D1、D2、N1、N1D1、B1)获得的LSG线上分化PC12细胞的2D FFT频谱的径向总强度对角度分布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明。
LSG图案的制造。LSG图案是通过使用消费级光雕DVD刻录机(HP 557S)直接刻录在GO膜上获得的。GO通过以石墨为原料(光谱纯，国药试剂公司，中国)的改进Hummer法合成。简单地，将15ml的GO水溶液(0.34mg/ml)直接滴涂到可光雕的DVD光盘或粘在DVD 表面的薄层基底上，如聚乙烯对苯二酸酯或玻璃盖玻片上，并允许在自然条件下干燥过夜。然后将有GO涂层的DVD光盘插入到刻录机激光处理。通过支持光雕的应用软件(SureThing DiscLabeler Gold 6)控制光雕参数，如打印模式、灰度值和对比度，各种使用普通计算机软件设计的图案可直接批量、精确光雕到GO膜上。改变光雕参数不仅可转换金棕色GO成为不同深浅的由微图案(如微米级线和/或点)组成的黑色LSG图案，而且还能控制石墨烯微图案的间距、密度、宽度、高度和长度。
申请人在任意基底上用一层GO膜覆盖光盘表面，然后直接快速的大批量制备任意定制形状的图案。图1显示了通过使用不同的打印模式、灰度值、对比度在GO膜上制备的直径0.6cm的18个圆圈图案的光学显微镜、扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)图像。正如预期的那样，788nm红外激光使金棕色GO层变成黑色并使GO还原。最佳打印模式、灰度值0、增强的对比度，可产生最黑的图案。切换打印模式(标准或草图)或改成更高的灰度值可产生更浅的图案。相比增强对比度，默认对比度进一步使图案变浅。因此，使用刻录机的最佳模式、增强对比度、最低灰度值可产生最佳质量图案。使用草图或标准打印模式、默认对比度、更高灰度值的光雕时间更短，但也导致更浅的图案。
表征和测量。GO和LSG图案的表面形貌通过JSM-7100F场发射扫描电子显微镜(JEOL Ltd.,Japan)观察。TX 500H旋滴界面张力仪(KINO Ltd.,USA)测量接触角。在BrukerMultimode 8AFM/SPM(Bruker,Germany)系统上采集原子力显微镜(AFM)图像。利用免费软件： Gwyddion 2.30处理所有的AFM图像(http://gwyddion.net/)。利用EscaLab 250高性能光电子能谱仪(Thermo VG Scientific,UK)在Al Kα(1486.6eV)辐射下获得X射线光电子能谱(XPS)数据。 XPS结果使用曲线拟合程序(XPSPEAK41)以结合能形式进行拟合。通过Renishaw InVia Reflex 拉曼显微系统(Renishaw Plc.,New Mills,Wotton-under-EdgeGloucestershire,UK)使用514nm 氩离子激光收集100–4000cm–1的拉曼光谱。在奥林巴斯BX51显微镜上进行LSG图案的光学显微镜成像。
为了更好的理解LSG的过程，通过光学显微镜和SEM对LSG宏观图案进行表征(图1b,c)。有趣的是，如图1b所示，深浅不一的宏观LSG图案由微米级线和/或点组成。图1c显示了LSG微图案在低倍下的典型SEM图像。原始GO膜显示出相对平坦的表面。与此相反，由于在激光处理过程中气体的快速产生和释放，LSG区域呈现出膨胀的3D形貌，且形成了不同长度、宽度、高度或间距的有序线条和/或点。越暗的区域暗示了，微米级线和/或点的光雕面积越大，间距越小，宽度越大和密度越高，而越浅的区域对应于越小的光雕面积，越宽间距，越小宽度，越低密度的微米级线和/或点(图1b,c,图2)。因此，可以得出结论，时间成本和图像质量主要取决于激光的能量密度和持续时间，其直接影响了微米级线和/或点的光雕面积、间距、密度、宽度、高度和长度。调整打印模式(最佳、标准、草图)可由高到低控制激光能量密度和调节LSG微米级线和/或点宽度(图2a)以及间距(0～50μm，图2b)。切换对比度可以进一步控制激光能量密度，调整线和/或点的宽度、高度和密度。有趣的是，用最佳方式、增强对比度、灰度值0可发出最大的激光能量，导致大面积平坦的剥离还原态石墨烯(图3)。从0到200改变灰度值可控制微米级LSG点或线长度从50μm～11.4cm范围内变化。此外，在同一区域重复光雕还可进一步加粗线条，减小间距，增大光雕面积。这些结果不仅清晰显示了LSG与未处理GO区域，而且也展示出该方法精确光雕GO的可能性。因此，在任意基底上，只需简单地改变或组合不同的光雕参数(打印模式、灰度值、对比度、重复次数)即可精确地制造高度定制的大小从分米到微米级石墨烯图案，并且可以很好控制图案3D形貌(线和/或点、线和/或点的粗细、高度、间距、密度)。
为进一步研究LSG微图案的形貌和化学变化，申请人利用SEM、Raman光谱、X射线光电子能谱(XPS)和接触角(CA)进行表征。图4a显示了LSG微图案和未处理的GO区域的典型高倍SEM图像。未处理GO区域表面平坦，而LSG表现出膨胀和剥离的层状形貌。在LSG 表面的高倍SEM图像中，可以发现大小范围从～25到～200nm的多孔结构(图4b，插图)。这可能主要由于焦耳加热引发局部膜氧化物产气膨胀。通过Raman光谱和XPS表征对比LSG 微图案的化学变化。如图4c所示，GO(红线)和LSG(黑线)都有D、G、2D和3S峰。LSG 光谱显示了由石墨烯边缘导致～1354cm─1处D带的轻微增加；这一增长是由于存在更大的结构性缺陷边缘。这与SEM分析结果(图4b)是一致的。G带峰值降低，并且波长从1599移动到1593cm─1。这些结果与sp2碳的重建和基底平面内结构性缺陷减少是一致的。LSG中的2D 峰说明GO膜被明显还原并且生成了少层石墨烯。D-G的组合导致在～2928cm─1生成一个S3 二阶峰，并且，正如所料，激光处理后随着无序的降低而减弱。LSG和GO的XPS结果如图4d-f所示。图4d表明，GO膜在激光处理前后C/O比例显著不同。GO膜的C/O比为～2.3，对应碳/氧含量～69％和31％。另一方面，LSG碳含量增加到88.8％和氧含量下降到11.2％，总体C/O比率为8.3。这表明LSG微图案只是被部分还原。GO的C1XPS谱显示两个宽峰(图4e)，其可以进一步分解为三个不同的碳组分，分别对应于羧基(288.1eV)，环氧化物形式的 sp3碳(286.9eV)和羟基碳(284.6eV)，以及一个小π-π*峰(290.4eV)。然而，LSG的XPS光谱显示含氧官能团明显减少并且C-C sp2碳峰整体增强(图4f)。同时，激光处理后，因为氧原子的消除，LSG膜电阻大大降低。这是由于激光辐射过程消除了氧原子造成导电性增强(根据图4d XPS结果，激光处理后，氧原子含量从31％降低到11.2％)。CA常作为表面疏水亲水性的定量指标。未经处理的GO薄膜CA为49°，LSG的CA显著地增加到了77°，表明其表面疏水性增强和氧含量减少。此外，LSG表面粗糙度增强也增加了界面中气泡体积和固-气界面尺寸，这些与材料的疏水度成正比。表面化学的变化和激光辐射在微米尺度上的表面粗糙度的增加，可能都有助于LSG薄膜疏水性的增强。
细胞培养。PC12细胞(CRL-1721,ATCC)在37℃的5％CO2的水饱和条件下，培养在补充有10％马血清(sigma)，5％胎牛血清(sigma)，10units/ml的青霉素和10μg/ml的链霉素的 RPMI-1640培养基(Invitrogen，USA)中。在细胞接种之前，将GO和LSG图案裁剪成适合24孔或96孔板的大小。然后GO和各种不同图案的LSG在75％乙醇中浸泡2小时，紫外照射1小时，然后用PBS溶液冲洗2次。
细胞毒性实验。将实验分为三组：细胞培养板(对照组)，GO膜(GO组)和LSG(LSG组，注意此处LSG基底是通过增强对比度、最佳模式、灰度为0等参数制造的)。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)和乳酸脱氢酶(LDH)分析三种基底的细胞毒性。对于MTT测定，密度为2×10 4个细胞/孔的PC12细胞被接种到含有三种基底的96孔板内，并培养1、2、3、4天。在孵育结束时，从5mg/ml的储备液中取20μl的MTT(Sigma)加入 200μl细胞悬浮液中，然后在CO2培养箱中37℃孵育4小时。然后用100μl二甲基亚砜(Sigma，USA)代替培养基。使用ELx800酶标仪(Bio-Tek，USA)，在570nm的波长下测定吸收值。对于LDH测定，密度为2×10 4个细胞/孔的PC12细胞被接种到含有三种基底的96孔板内，并培养1、2、3、4天。然后，利用细胞毒性LDH测定试剂盒，参照生产厂家的操作规程进行LDH的分析。利用酶标仪测定490nm波长下的吸收值。
为了研究LSG图案的潜在生物医学应用，申请人首先评估了LSG(最佳模式，灰度值＝0，增强对比度，重复3次)和GO基底用于类神经元PC12细胞培养的生物相容性。根据MTT和LDH结果(图5a,b)，与生长在细胞培养板上的PC12细胞(对照组)相比，GO和LSG基底上生长的PC12细胞的细胞活力和LDH释放无显著差异(P>0.05)。利用特异性DNA荧光染料Hoechst 33258，进一步研究了三种基底对PC12细胞DNA和核结构的影响。结果显示对照组PC12细胞具有正常的蓝色细胞核。经过48h的培养，其他两种基底上的细胞核没有显示出明显的差异，并没有明亮的蓝色细胞核、浓缩的染色质甚至碎裂的细胞核等这些凋亡细胞的典型特征。氧化应激是包括碳纳米材料在内的许多纳米材料毒性的常见生物标志物。在三种基底上培养后，利用细胞渗透性指示剂DCFH-DA测定细胞内ROS水平。结果显示，与对照组比较，GO和LSG组的ROS水平没有显著增加(P＞0.05)。这些结果表明，GO与 LSG膜无细胞毒性。
Hoechst 33258染色。在三种基底上孵育48小时后，将PC12细胞在4％多聚甲醛(Sigma) 中固定30分钟，用PBS漂洗3次，最后用Hoechst 33258(Sigma)染色10分钟。随后，在荧光显微镜(Nikon ECLIPSE TE2000-u，Japan)上UV激发对细胞进行观察成像。用相同光学参数拍摄了一系列图像。凋亡细胞是基于核形态变化定义的：染色质凝集和碎片。
细胞内活性氧测定(ROS)。使用ROS测定试剂盒(Beyotime Institute ofBiotechnology， China)测定ROS水平。将PC12细胞在三种基底上接种48小时后，将溶解于培养基中的 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA，终浓度为5μmol/l)加入到6孔板中培养的细胞中，孵育30分钟。用PBS洗涤两次后，在488nm的激发下，在荧光显微镜(NikonECLIPSE TE2000-u，Japan)下观察细胞并拍照。所有操作步骤注意严格避光。用相同光学参数拍摄了一系列图像。使用NIH ImageJ软件包(http://rsbweb.nih.gov/ij/)进行光密度分析。使用两个重复实验的至少五个图像进行分析。
细胞分化。PC12细胞在利用神经生长因子(100ng/ml，Sigma)刺激分化前允许其与不同基底贴壁生长10小时。PC12对不同基底的神经分化响应通过定量测定神经突对齐来反映。
相比传统的扫描电镜，环境扫描电子显微镜(ESEM)，不需要额外的样品制备步骤(即干燥或涂层)，允许在其自然的水化状态下原位观察生物样品。为了探究不同形貌的LSG线对 PC12细胞的对齐效果，申请人利用SEM(图7和ESEM(图6)进一步研究五种用不同光雕参数制造的LSG基底上细胞生长和分化情况。如图6a,i-iv所示，PC12细胞的神经突在有明显 GO-LSG-GO沟槽的LSG线基底上，更倾向于附着在GO-LSG交界处，并且沿着LSG线的方向表现出两极生长。相应的2D FFT频谱显示更细长的椭圆形，这说明细胞朝某一方向对齐(图6a，插图)。通过分析在这些基底上细胞的长-短轴指数，其值显著高于1，表现出各向异性分布。此外，这些2D FFT输出的径向强度图表现出尖锐的峰，这进一步证实了其具有高度各向异性。这个结果与前面是一致的，进一步证明基底上的线形图案是细胞对齐的主要决定因素。
然而，对于通过最佳打印模式打印1次的B1产生的没有GO-LSG-GO沟槽的LSG基底，PC12细胞显示出更低的对齐生长趋势(图6a,v)。此外，其相应的2D FFT频谱近似圆形，并且其长-短轴指数明显低于有明显GO-LSG-GO沟槽的LSG线基底。在没有明显GO-LSG-GO 沟槽基底上的细胞径向强度图由许多低频率的峰组成，这反映了其低各向异性取向。如风玫瑰图所示，在有明显GO-LSG-GO沟槽的LSG线基底上分化的PC12细胞，表现出±15°之间的高度对齐(图6b，i-iv)。相反，在没有明显GO-LSG-GO沟槽的LSG基底上的PC12细胞，细胞角度在±30°之间变化(图6b，v)。这些结果表明，GO-LSG-GO沟槽的线形形貌特征对导向神经细胞生长起关键作用。
苏木精染色。在三种基底上分化48小时后，PC12细胞在4％福尔马林中固定30分钟，用PBS漂洗3次，最后用苏木精溶液(阿拉丁试剂，中国)染色5秒并立即用双蒸水冲洗。随后，在光学显微镜(Olympus BX51，Japan)下观察细胞并拍照。
为了探讨透明玻璃盖玻片上的LSG微图案与细胞相互作用，PC12细胞在不同形貌的LSG 图案上分化培养48h，然后为便于光学显微镜观察进行苏木精染色。由于与GO和LSG表面的物理接触，PC12细胞在GO表面或在GO-LSG交界处具有良好的黏附性和延伸。并且在平坦的GO膜，LSG点和LSG线上，表现出不同生长图案。接种于GO膜的细胞表现出随机取向生长。而分化在LSG点图案的细胞随着点的密度增加，开始出现对齐生长。细胞在LSG 线图案上沿着线生长和分化，并随着线的间隔减少以双极方式进一步拉长。为了进一步量化 PC12细胞在LSG图案中取向，申请人利用二维快速傅里叶变换(2D FFT)方法分析相应的光学显微镜图像，将空间信息转换成数学定义的光学数据。对于分化在平坦GO和稀少LSG 点基底上的随机取向的细胞，其2D FFT频谱呈中心点对称分布，说明其不具有方向性。而分化在密集LSG点和LSG线上对齐的细胞，其2D FFT频谱呈椭圆形，这指示细胞沿一定方向对齐生长。通过对长-短轴指数的分析，进一步量化了2D FFT频谱的各向异性。指数为1 和高于1分别显示各向同性分布和细胞对齐取向。申请人观察到，在平坦的GO和稀疏LSG 点基底上的细胞，长-短轴指数不显著高于1，表现出各向同性分布。然而，在密集的LSG点和LSG线基底上的细胞，其值高于1.5，显示各向异性分布，这进一步证实了LSG线图案可诱导细胞对齐。通过对径向强度与角度绘图可见，LSG线上对齐的细胞谱图有尖峰，而在GO 和LSG点上的随机分布细胞显示出随机峰分布。在LSG线上的大多数PC12细胞表现出±30°内对准。相反，当接种于GO和LSG点上时，PC12细胞表现出较少的有序生长图案，分别具有±75°(对于GO，稀疏LSG点)和±°52(对于密集LSG点)的分布。这些结果支持了 LSG线形貌可能是细胞对齐的主要决定因素。
细胞的SEM成像。分化在不同LSG图案上PC12细胞，用4％多聚甲醛固定，然后用2.5％的戊二醛水溶液在4℃处理30分钟。用浓度依次为0％、25％、50％、75％和100％的乙醇溶液清洗样品进行梯度脱水。样本先后干燥一夜并在SEM检测前喷金。对于环境扫描电镜(ESEM)成像，分化在LSG图案上的细胞用4％多聚甲醛和2.5％戊二醛固定，然后直接使用ESEM方式(Quanta 200,FEI,USA)，在20kV水合状态下成像。使用气体二次电子探测器(GSED)收集信号。
图像分析。利用ImageJ软件分析LSG图案的SEM或光学显微镜图像，测定其微米级LSG线和/或点(或DVD标签层上的线)的宽度、间距、密度和长度。这些图像也被转换为 8位灰度图，使用ImageJ阈值功能进行处理，然后统计光雕面积。对于二维快速傅立叶变换 (2DFFT)，首先利用ImageJ阈值功能对光学显微镜和不同基底上细胞形态的ESEM图像进行调整，然后用PhotoScape v3.7软件(http://www.photoscape.org/)去除图片背景中的LSG线或点，再在ImageJ中应用2D FFT功能进行处理。为了分析各向异性，使用由2D FFT生成椭圆的长轴-短轴比作为指数。所产生的2D FFT频谱用椭圆形轮廓插件 (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/oval-profile.html)进行分析。通过测量神经突轴和LSG线或点之间的角度来评估细胞对齐。然后用风玫瑰图表示各组的方向分布。
统计分析。结果以平均值±SD(标准偏差)表示。连续变量通过Student’s t test进行比较。使用GraphPad Prism软件版本5(GraphPad Software，USA)进行所有统计分析。P值小于 0.05被认为具有显著性。
与通过其他技术在某些基底(如Si/SiO2)上的制备石墨烯图案相比，光雕制备石墨烯3D 微图案可选择性、精确地调节从GO到rGO转换，并且控制GO-rGO-GO图案，这有利于利用GO和rGO的不同性质(导电性、亲水性、吸附性)，并将其应用到电子、生物医药、能源等领域。这种光雕技术的再利用策略为高效、低成本的微/纳加工提供了一种标准、通用、强大的平台，并且可很容易地将该平台扩展到生产以及图案化各种石墨烯杂化材料(如聚合物-石墨烯、金属-石墨烯纳米结构)、其他新兴的二维非石墨烯纳米材料及其杂化材料。这将满足改进石墨烯图案基设备性能的需求，并推动其在各种领域中的广泛应用。虽然，有些方法可以创造更高分辨率的纳米图案，但是，光雕技术由于其成本低，可大规模制造和操作简单，使其具有竞争优势。在未来，只要简单地改进光雕DVD刻录机系统，如激光波长(蓝光技术)、能量、光束聚焦等，就可获得具有更高精度和深度的更强大光雕系统。这将允许研究人员将细胞排列用于心脏、骨骼或神经元细胞的常规培养，以支持细胞和组织研究以及药物测试应用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (4)

1.一种低成本光雕制备石墨烯3D微图案，其特征在于，石墨烯3D微图案是通过使用消费级光雕DVD刻录机直接刻录在GO膜上获得的。
2.根据权利要求1所述的一种低成本光雕制备石墨烯3D微图案，其特征在于，具体制备过程包括：将15ml浓度为0.34mg/ml的GO水溶液直接滴涂到可光雕的DVD光盘或粘在DVD表面的薄层基底上，并允许在自然条件下干燥过夜；然后将制得有GO涂层的DVD光盘插入到刻录机激光处理；通过支持光雕的应用软件控制光雕参数，使用普通计算机软件设计的图案可直接批量、精确光雕到GO膜上。
3.如权利要求1或2所述的石墨烯3D微图案在导向神经细胞生长中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将PC12细胞在37℃的5％CO2的水饱和条件下，培养在补充有10％马血清，5％胎牛血清，10units/ml的青霉素和10μg/ml的链霉素的RPMI-1640培养基中培养；在细胞接种之前，将GO和LSG图案裁剪成适合24孔或96孔板的大小；然后GO和各种不同图案的LSG在75％乙醇中浸泡2小时，紫外照射1小时，然后用PBS溶液冲洗2次后接种。
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