CN110714060A - 石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因masD含量的测定方法 - Google Patents

石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因masD含量的测定方法 Download PDF

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CN110714060A CN201810767133.XA CN201810767133A CN110714060A CN 110714060 A CN110714060 A CN 110714060A CN 201810767133 A CN201810767133 A CN 201810767133A CN 110714060 A CN110714060 A CN 110714060A
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Abstract

本发明公开了一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因masD含量的测定方法,方法以石油污染厌氧环境中烷烃、苯系物为目标降解组分，采用非培养的分子生物学技术实时荧光定量PCR对两种降解基因进行定量。方法主要包括DNA的提取，设计特异性扩增两种降解基因的简并引物，确定PCR条件，制作荧光定量PCR标准曲线，样品测定。本发明所述方法是一种能够检测厌氧条件下微生物降解石油烃活性的新型方法，同时能准确反映微生物的降解代谢途径和区域石油污染状况，在环境污染监测和治理方面有重要的应用价值。

Description

石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因masD含量的测定 方法
技术领域
本发明属于环境石油污染监测技术领域，具体来说涉及一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因masD含量的测定方。
背景技术
近几十年来，随着石油工业的迅速发展，石油烃在土壤和水体中的污染已成为一个普遍的环境问题。好氧生物修复被认为是处理石油烃污染的有效方法。然而，有许多污染的场所如沉积物和地下水环境，通过提供氧气来刺激微生物的生长，非常困难而且成本高昂。近几年的大量研究表明，在缺氧或厌氧条件下同样可以进行石油烃的降解，这一新颖的观点对于石油污染土壤及地下水进行原位生物修复，特别是针对一些污染源较为分散、现场操作条件较差的石油污染区域来说具有很重要的作用。
烷烃是石油污染的主要成分，占50％以上。富马酸加成反应是大多数烷烃厌氧降解菌活化烷烃降解的关键步骤，催化酶是(1-甲基烷基)琥珀酸合酶(mas)。芳烃是一类最常见的地下水污染物。在厌氧微生物，大多数芳香族碳氢化合物(如单环芳烃、多环芳烃)都经过微生物作用形成中间体6-十六氧环烯基-CoA。该中间体的开环反应的关键酶是由bam基因编码6-十六氧环-1-烯-1-羰基CoA水解酶，bamA基因在降解芳香化合物的厌氧微生物中广泛存在。因此，将编码这两种关键酶催化亚基masD和bamA基因作为遗传标记，为研究石油烃降解菌在厌氧环境下的多样性和分布特征提供了一种方法。
运用分子生物技术实时定量聚合酶链反应(Real Time-qPCR)对石油厌氧降解基因的定量分析可以反映厌氧微生物修复石油污染的潜力。目前，运用荧光探针和荧光引物的定量PCR检测石油降解基因技术虽然特异性高，但操作复杂、成本高。Real Time-qPCR技术利用荧光信号积累对未知模板进行定量分析，具有高效率、高通量、高敏感性、易操作等优点，在治理油田污染土壤中具有重要应用价值。
发明内容
针对石油组分的复杂性和现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因含量的测定方法。本发明采用SYBR Green I荧光染料RealTime-qPCR技术，建立一种对石油污染厌氧环境中烷烃降解基因masD及芳烃降解基因bamA的检测方法，确定最佳的Real Time-qPCR反应体系配方、引物浓度及最适的PCR升温程序。同时，对建立的Real Time-qPCR技术的灵敏性和重复性进行检验，并应用于氧化石墨烯促进石油烃厌氧降解中烷烃和芳烃降解基因的定量测定，对追踪石油污染物迁移及评价生物厌氧降解潜力具有重要意义。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。
一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因含量的测定方法，包括以下步骤：
1)获得能在厌氧环境中降解石油烃菌株的降解基因的DNA序列，根据降解基因的DNA序列利用Primer express软件遵循引物设计原则，设计出降解基因的简并性扩增引物的序列并合成该简并性扩增引物，其中，所述降解石油烃菌株的降解基因为masD或bamA；
在所述步骤1)中，通过Primer express软件得到：
在所述步骤1)中，通过Primer express软件得到：
Figure BDA0001729285780000022
Figure BDA0001729285780000031
2)取得含有步骤1)中降解基因的阳性样品，提取所述阳性样品中所有微生物的DNA；通过PCR仪利用步骤1)所得简并性扩增引物以所述微生物的DNA作为DNA模板进行降解基因的PCR扩增，得到扩增产物；
在步骤2)中，所述PCR扩增的体系如下：
组分 体积
正向引物(10μM) 0.5μL
反向引物(10μM) 0.5μL
Premix Taq 12.5μL
DNA模板 1.0μL
RNase-Free Water 10.5μL
在步骤2)中，所述PCR扩增的程序如下：
在94℃的条件下预变性4min；
再进行35次循环，每次循环的步骤为：在94℃的条件下变性30s，在退火温度T1条件下保持30s，在72℃条件下延伸30s，循环35次后在72℃条件下延伸5min；
其中，masD的T1为52℃，bamA的T1为56℃。
3)将步骤2)所得扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测是否得到特异性条带，如得到特异性条带，则进行切胶回收，再将特异性条带导入感受态细胞，将感受态细胞接种到LB液态培养基中培养，将培养后的感受态细胞接种到LB固态培养基平板上培养，然后进行蓝白斑阳性克隆子的筛选，通过挑选得到含有重组质粒的白色单菌落，将白色单菌落接种到LB液态培养基中培养，得到菌液；
在所述步骤3)中，所述感受态细胞在所述LB液态培养基中于37℃120rpm培养2小时。
在所述步骤3)中，所述LB固态培养基平板涂有20mg/ml X-gal和100mg/ml氨苄青霉素，所述X-gal和氨苄青霉素各20uL。
在所述步骤3)中，在所述LB固态培养基平板上培养的时间和温度分别为：37℃培养12小时。
在所述步骤3)中，白色单菌落接种到LB液态培养基中的温度、转速和培养时间为：37℃120rpm培养12小时。
4)对步骤3)所得菌液的特异性条带进行测序，判断测序结果是否为步骤1)所得降解基因的序列，如测序结果为步骤1)中的降解基因的序列，则将步骤3)所得菌液提取重组质粒；
5)使用微量核酸蛋白质分析仪测定降解基因的重组质粒的浓度X，通过公式(1)计算得到每微升重组质粒中降解石油烃菌株的降解基因的拷贝数CN，
CN＝[(X/(Tp+b)/660)]×10-9×6.02×1023；(1)
其中，b为降解石油烃菌株的降解基因的片断长度，660为每对碱基的平均分子量(单位：Da)；6.02×1023为阿伏伽德罗常量(单位：mol-1)，Tp为将特异性条带导入感受态细胞所采用克隆试剂盒中载体的序列长度；
将重组质粒按照10倍梯度依次稀释N次，N大于等于6，得到1个重组质粒和N个稀释后重组质粒，通过计算得到N个稀释后重组质粒每微升中降解基因的拷贝数CN；
6)将步骤5)所得1个重组质粒和N个稀释后重组质粒作为DNA模板进行荧光定量PCR，得到1个重组质粒和N个稀释后重组质粒的循环阈值Ct；
在所述步骤6)中，所述荧光定量PCR的温度程序为：在94℃保持30s，再循环40次下述周期：在变性温度为94℃的条件下保持5s，在退火温度为T2的条件下保持15s，再在72℃的条件下延伸10s；
循环40次后，在50℃的条件下保持5s，再以0.5℃/s的速率逐渐升至95℃保持5s；其中，masD的T2为52℃，bamA的T2为56℃。
步骤6)中荧光定量PCR的体系如下：
组分 体积
正向引物(10μM) 0.5μL
反向引物(10μM) 0.5μL
2×Trans-Start Top Green qPCR SuperMix 12.5μL
DNA模板 1.0μL
RNase-Free Water 10.5μL
7)以lg(CN)值为X轴，以循环阈值Ct为Y轴，建立坐标系，将1个重组质粒和N个稀释后重组质粒的lg(CN)值和循环阈值Ct绘入坐标系中，形成一标准曲线；其中，所述lg(CN)值和循环阈值Ct不成线性比例的最大Ct值所对应lg(CN)值为所述标准曲线的检测下限，获得该标准曲线呈线性比例部分线段的公式为所述标准曲线的公式；
8)通过荧光定量PCR确定待测样品的循环阈值Ct，将所述循环阈值Ct代入步骤7)所得标准曲线的公式，得到待测样品的降解基因的拷贝数。
本发明的优点和有益效果为：
(1)实时荧光定量PCR技术避免传统培养生物技术分析不全面的缺点，直接对环境中微生物总DNA进行提取，能对石油烃厌氧降解微生物降解基因的拷贝数进行定量测定，准确反映污染区域中石油烃的厌氧降解途径和代谢活性，反映降解菌的群落组成和变化，促进和监督绿色环保高效的生物修复技术在石油烃修复中的应用。
(2)该技术中所使用的引物是比对文献资料报道和研究的能厌氧降解石油烃的微生物菌株序列，能够获得的同源性较高的石油烃厌氧降解基因扩增产物，避免了单一菌株的降解特异性的缺点，对微生物降解性能分析更加全面。
(3)实时荧光定量PCR不用专门设计检测探针，操作简单且具有很高的重复性，比其他分析技术如杂交和克隆更加简便、经济、准确，具有很高的应用价值。
附图说明
图1为实施例1的masD降解扩增曲线(a)，标准曲线(b)(已移除不成线性比例部分)，熔解曲线(c)，熔解峰(d)，其中，图1(a)中标号与表1中序号相对；
图2为实施例2的bamA降解扩增曲线(a)，标准曲线(b)(已移除不成线性比例部分)，熔解曲线(c)，熔解峰(d)，其中，图2(a)中标号与表2中序号相对。
具体实施方式
LB液态培养基和LB固态培养基的组成参见：陈效杰,薛勇,穆丹,等.肇东苜蓿根圈长残留除草剂生物降解试验LB培养基配制的研究[J].科技信息,2012(35)54.
无机盐培养基的组成参见：Wang L Y,Gao C X,Mbadinga S M,etal.Characterization of an alkane-degrading methanogenic enrichment culturefrom production water of an oil reservoir after 274days of incubation[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2011,65(3):444-450.
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因含量的测定方法，包括以下步骤：
1)在NCBI数据库检索下载已报道的能在厌氧环境中降解石油烃菌株(即菌株具有降解石油烃功能)的降解基因的DNA序列，根据下载的降解基因的DNA序列利用Primerexpress软件遵循引物设计原则，设计出降解基因的简并性扩增引物的序列，再由生工生物工程(上海)股份有限公司合成简并性扩增引物。其中，在本发明的具体实施方式中，实施例1的降解石油烃菌株的降解基因为masD，实施例2的降解石油烃菌株的降解基因为bamA，masD的简并性扩增引物为作为正向引物的masDf和作为反向引物的masDr，bamA的简并性扩增引物为作为正向引物的bamAf和作为反向引物的bamAr。
简并性扩增引物的序列以及通过Primer express软件可获得的PCR扩增的理论条件如下：
Figure BDA0001729285780000061
2)取得含有步骤1)中降解基因的阳性样品，在本实施例中，阳性样品为从天津市津南区污水处理厂二沉池取得的厌氧活性污泥。提取得到该厌氧活性污泥中所有微生物的DNA；通过PCR仪(T 100梯度型PCR仪，Bio-Rad)利用步骤1)所得简并性扩增引物以所述微生物的DNA作为DNA模板进行降解基因的PCR扩增，得到扩增产物；
步骤2)中PCR扩增的体系如下：
组分 体积
正向引物(10μM) 0.5μL
反向引物(10μM) 0.5μL
Premix Taq 12.5μL
DNA模板 1.0μL
RNase-Free Water 10.5μL
注：Premix Taq(RR901A)及RNase-Free Water(9012)均购于宝生物工程(大连)有限公司。
步骤2)中PCR扩增的程序如下：
在94℃的条件下预变性4min。
进行35次循环，每次循环的步骤为：在94℃的条件下变性30s，在退火温度T1条件下保持30s，在72℃条件下延伸30s。循环35次后在72℃条件下延伸5min；
其中，masD的T1为52℃，bamA的T1为56℃；
3)将步骤2)所得扩增产物经过1.5wt％琼脂糖凝胶电泳检测是否得到特异性条带，如得到特异性条带，则按照琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209，天根生化科技有限公司)的操作步骤进行切胶回收。再按照pEASY-T1Cloning Kit试剂盒(CT101-01，北京全式金生物技术有限公司)的步骤将特异性条带导入Trans-T1感受态细胞，将感受态细胞接种到10mLLB液态培养基中于37℃120rpm培养2小时。将培养后的感受态细胞接种到涂有20mg/ml X-gal和100mg/ml氨苄青霉素(X-gal和氨苄青霉素各20uL)的LB固态培养基平板上37℃培养12小时，然后进行蓝白斑阳性克隆子的筛选。通过挑选得到含有重组质粒的白色单菌落，将白色单菌落接种到10mL LB液态培养基中于37℃120rpm培养12小时，得到菌液；
4)将1mL步骤3)所得菌液寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司对特异性条带进行测序，判断测序结果是否为步骤1)所得降解基因的序列，如测序结果为步骤1)中的降解基因的序列，则将步骤3)所得菌液经过E.Z.N.A.
Figure BDA0001729285780000071
Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒(D6943-01,Omega Bio-Tek)提取重组质粒；
5)使用微量核酸蛋白质分析仪(Nano-100，杭州奥盛仪器有限公司)测定降解基因的重组质粒的浓度X，通过公式(1)计算得到每微升重组质粒中降解基因的拷贝数CN，
CN＝[(X/(Tp+b)/660)]×10-9×6.02×1023；(1)
其中，b为降解石油烃菌株的降解基因的片断长度(扩增片段长度)，masD的片断长度为389bp，bamA的片断长度为354bp；660为每对碱基的平均分子量(单位：Da)；6.02×1023为阿伏伽德罗常量(单位：mol-1)，Tp为pEASY-T1Cloning Kit试剂盒中pEASY-T1载体序列的长度，在本具体实施方式中，Tp为3928(单位：bp)。
经计算，masD的重组质粒的X为31.2ng/μL，bamA的重组质粒的X为23.5ng/μL。降解基因masD和bamA的重组质粒的拷贝数依次分别为6.6×109copies/μL和5.0×109copies/μL。
将重组质粒按照10倍梯度依次稀释N次，N大于等于6，得到1个重组质粒和N个稀释后重组质粒，通过计算得到N个稀释后重组质粒每微升中降解石油烃菌株的降解基因的拷贝数CN；
其中，在本发明的实施例中，实施例1中masD的N等于9，实施例2中bamA的N等于10。
6)将步骤5)所得1个重组质粒和N个稀释后重组质粒作为DNA模板进行荧光定量PCR(CFX96，Bio-Rad)，得到1个重组质粒和N个稀释后重组质粒的循环阈值Ct；通过荧光定量PCR同时得到反映荧光定量PCR实时扩增情况及重复性的扩增曲线、反映荧光定量PCR扩增的特异性的熔解曲线和反应RT-Q PCR变性温度的熔解峰。所述荧光定量PCR的温度程序为：在94℃保持30s，再循环40次下述周期：在变性温度为94℃的条件下保持5s，在退火温度为T2的条件下保持15s，再在72℃的条件下延伸10s；循环40次后，在50℃的条件下保持5s，再以0.5℃/s的速率逐渐升至95℃保持5s(熔解曲线温度)；其中，MasD的T2为52℃，bamA的T2为56℃；
步骤6)中荧光定量PCR的体系如下：
组分 体积
正向引物(10μM) 0.5μL
反向引物(10μM) 0.5μL
2×TransStartTM Top Green qPCR Super 12.5μL
DNA模板 1.0μL
RNase-Free Water 10.5μL
注：2×TransStartTM Top Green qPCR Super(AQ131)购于北京全式金生物技术有限公司，RNase-Free Water(9012)购于宝生物工程(大连)有限公司。
7)以lg(CN)值为X轴，以循环阈值Ct为Y轴，建立坐标系，将1个重组质粒和N个稀释后重组质粒的lg(CN)值和循环阈值Ct绘入坐标系中，形成一标准曲线；其中，所述lg(CN)值和循环阈值Ct成非线性比例的最大Ct值所对应lg(CN)值为所述标准曲线的检测下限，获得该标准曲线呈线性比例部分线段的公式为所述标准曲线的公式；
实施例1(masD)中1个重组质粒和9个稀释后重组质粒的浓度X、拷贝数、lg(CN)和循环阈值Ct如表1所示。
表1实施例1-masD标准曲线
Figure BDA0001729285780000091
实施例1的标准曲线的公式为：
Ct＝-5.4911lg(CN)+42.27
标准曲线的相关系数R2＝0.9997，荧光定量PCR的扩增效率E为53.0％。
实施例2中1个重组质粒和10个稀释后重组质粒的浓度X、拷贝数、lg(CN)和循环阈值Ct如表2所示。
表2实施例2-bamA标准曲线
Figure BDA0001729285780000101
实施例2的标准曲线的公式为：
Ct＝-4.7832lg(CN)+40.856，
标准曲线的相关系数R2＝0.998，荧光定量PCR的扩增效率E为63.6％
8)通过荧光定量PCR确定待测样品的循环阈值Ct，将所述循环阈值Ct代入步骤7)所得标准曲线的公式，得到待测样品的降解基因的拷贝数。
在本发明的具体实施方式中，待测样品获得的方法如下：以0.01g天津市津南区污水处理厂二沉池取得的厌氧活性污泥为接种物加入到100mL含NO3 -、SO4 2-各10mM的N2预脱氧后的无机盐培养基中，再加入正构烷烃C15至C20和4种苯系物(苯、甲苯、乙苯和二甲苯)使各组分在培养基中的终浓度均为50ppm，得到石油烃厌氧降解培养体系。准备4份石油烃厌氧降解培养体系，向3份石油烃厌氧降解培养体系中加入不同浓度的氧化石墨烯GO(0.02、0.2、2mg/L)，剩余一份石油烃厌氧降解培养体系不加入氧化石墨烯GO，将4份石油烃厌氧降解培养体系密封30℃150rpm避光培养，分别在第2、4、6和10周取样，提取DNA进行荧光定量PCR得到循环阈值Ct，代入实施例1和2的标准曲线的公式，计算出所提取DNA中降解基因的拷贝数。其中，表3为实施例1石油烃厌氧降解培养体系中masD基因拷贝数，表4为实施例2石油烃厌氧降解培养体系中bamA基因拷贝数。
由表3可见，随着培养时间的增加，添加不同浓度氧化石墨烯的石油烃厌氧降解培养体系中masD的拷贝数在前6周逐渐降低，随后的略有增加。培养基中masD基因的拷贝数的最小值和最大值分别为97±3.6拷贝/mL和289±6.2拷贝/mL。氧化石墨烯的添加使masD的拷贝数在第6周显著低于对照组(P<0.05)，在第10周显著高于对照组(P<0.05)。氧化石墨烯的添加量对masD的拷贝数的影响无显著规律。
由表4可见，随着培养时间的增加，添加不同浓度氧化石墨烯的石油烃厌氧降解培养体系中bamA的拷贝数均逐渐减少。培养基中bamA基因的拷贝数的最小值和最大值分别为48±3.6拷贝/mL和366±9.5拷贝/mL。添加氧化石墨烯的各组bamA基因的拷贝数均显著高于空白组，其中0.02mg/L的氧化石墨烯在第2、4周对bamA基因促进效果最明显，0.2mg/L的氧化石墨烯在第6、10周对bamA基因促进效果最明显。
表3实施例1石油烃厌氧降解培养体系中masD基因拷贝数(Copies/μL)
表4实施例2石油烃厌氧降解培养体系中bamA基因拷贝数(Copies/μL)
Figure BDA0001729285780000112
准确性体现：根据建得的外标曲线测定供试样品中石油烃厌氧降解基因的拷贝数，空白为不加DNA的阴性对照，做三个平行，误差不超过5％(实施例1和2依次详见表1和表2的重复2和重复3)。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获得能在厌氧环境中降解石油烃菌株的降解基因的DNA序列，根据降解基因的DNA序列利用Primer express软件遵循引物设计原则，设计出降解基因的简并性扩增引物的序列并合成该简并性扩增引物，其中，所述降解石油烃菌株的降解基因为masD；
2)取得含有步骤1)中降解基因的阳性样品，提取所述阳性样品中所有微生物的DNA；通过PCR仪利用步骤1)所得简并性扩增引物以所述微生物的DNA作为DNA模板进行降解基因的PCR扩增，得到扩增产物；
3)将步骤2)所得扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测是否得到特异性条带，如得到特异性条带，则进行切胶回收，再将特异性条带导入感受态细胞，将感受态细胞接种到LB液态培养基中培养，将培养后的感受态细胞接种到LB固态培养基平板上培养，然后进行蓝白斑阳性克隆子的筛选，通过挑选得到含有重组质粒的白色单菌落，将白色单菌落接种到LB液态培养基中培养，得到菌液；
4)对步骤3)所得菌液的特异性条带进行测序，判断测序结果是否为步骤1)所得降解基因的序列，如测序结果为步骤1)中的降解基因的序列，则将步骤3)所得菌液提取重组质粒；
5)使用微量核酸蛋白质分析仪测定降解基因的重组质粒的浓度X，通过公式(1)计算得到每微升重组质粒中降解石油烃菌株的降解基因的拷贝数CN，
CN＝[(X/(Tp+b)/660)]×10-9×6.02×1023； (1)
其中，b为降解石油烃菌株的降解基因的片断长度，660为每对碱基的平均分子量(单位：Da)；6.02×1023为阿伏伽德罗常量(单位：mol-1)，Tp为将特异性条带导入感受态细胞所采用克隆试剂盒中载体的序列长度；
将重组质粒按照10倍梯度依次稀释N次，N大于等于6，得到1个重组质粒和N个稀释后重组质粒，通过计算得到N个稀释后重组质粒每微升中降解基因的拷贝数CN；
6)将步骤5)所得1个重组质粒和N个稀释后重组质粒作为DNA模板进行荧光定量PCR，得到1个重组质粒和N个稀释后重组质粒的循环阈值Ct；
7)以lg(CN)值为X轴，以循环阈值Ct为Y轴，建立坐标系，将1个重组质粒和N个稀释后重组质粒的lg(CN)值和循环阈值Ct绘入坐标系中，形成一标准曲线；其中，所述lg(CN)值和循环阈值Ct不成线性比例的最大Ct值所对应lg(CN)值为所述标准曲线的检测下限，获得该标准曲线呈线性比例部分线段的公式为所述标准曲线的公式；
8)通过荧光定量PCR确定待测样品的循环阈值Ct，将所述循环阈值Ct代入步骤7)所得标准曲线的公式，得到待测样品的降解基因的拷贝数。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，在所述步骤1)中，通过Primerexpress软件得到：
Figure FDA0001729285770000021
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，在步骤2)中，所述PCR扩增的体系如下：
组分 体积 正向引物(10μM) 0.5μL 反向引物(10μM) 0.5μL Premix Taq 12.5μL DNA模板 1.0μL RNase-Free Water 10.5μL
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，在步骤2)中，所述PCR扩增的程序如下：
在94℃的条件下预变性4min；
再进行35次循环，每次循环的步骤为：在94℃的条件下变性30s，在退火温度T1条件下保持30s，在72℃条件下延伸30s，循环35次后在72℃条件下延伸5min；
其中，masD的T1为52℃。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，在所述步骤3)中，所述感受态细胞在所述LB液态培养基中于37℃120rpm培养2小时。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，在所述步骤3)中，所述LB固态培养基平板涂有20mg/ml X-gal和100mg/ml氨苄青霉素，所述X-gal和氨苄青霉素各20uL。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，在所述步骤3)中，在所述LB固态培养基平板上培养的时间和温度分别为：37℃培养12小时。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，在所述步骤3)中，白色单菌落接种到LB液态培养基中的温度、转速和培养时间为：37℃120rpm培养12小时。
9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于，在所述步骤6)中，所述荧光定量PCR的温度程序为：在94℃保持30s，再循环40次下述周期：在变性温度为94℃的条件下保持5s，在退火温度为T2的条件下保持15s，再在72℃的条件下延伸10s；
循环40次后，在50℃的条件下保持5s，再以0.5℃/s的速率逐渐升至95℃保持5s；其中，masD的T2为52℃。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，步骤6)中荧光定量PCR的体系如下：
Figure FDA0001729285770000031
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