CN103882104A - 一种石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法 - Google Patents

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刘庆龙
唐景春
朱文英
张海荣
孙克静
刘�英
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明提供了一种石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，以石油污染土壤中含有三致毒性芳香烃萘为目标降解组分，采用非培养的分子生物学技术实时荧光定量PCR对萘降解基因Nah进行定量。方法主要包括土壤中DNA的提取，设计特异性扩增萘降解基因的简并引物，确定PCR条件，制作荧光定量PCR标准曲线，样品测定。本发明所述方法是一种能够检测芳香烃生物降解活性的新型方法，同时能准确反映微生物的降解代谢途径和区域石油污染状况，在油田污染监测和治理方面有重要的应用价值。

Description

一种石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法
技术领域
本发明属于环境石油污染监测领域，具体地说是一种石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法。 
背景技术
石油是推动社会发展的重要能源，但是每年全世界约有1×109t石油及其产品在石油开采、炼制、贮运、使用以及各种泄露事故中进入地下水、地表水和土壤，其中我国占60多万吨，直接造成我国面积500万公顷土壤受石油污染，石油组分中的芳香烃组分含有致癌、致畸、致突变毒性，给当地带来植物减产、粮食安全隐患、生态环境破坏等一系列严重问题。 
绿色经济高效的生物降解石油途径引起了国内许多学者研究和倡导，但是传统微生物筛选培养的方法只能分离占石油降解菌总数的1％～10％的微生物种类，根本无法体现微生物的真实降解水平和反映土壤中微生物多样性及分布。此外，芳香烃降解基因BTEX能编码代谢芳香烃重要的末端氧化酶已有很多研究和报道，但是他们在引物设计上往往受到降解菌类型的限制，合成的代谢酶不能代表大部分的降解菌所含的基因类型。 
近十年兴起的分子生物学技术实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)能避免传统平板培养方式的弊端，直接对提取土壤微生物总DNA进行分析，通过荧光染料和目标DNA在延伸过程结合所产生的荧光信号的强度，对关键的石油烃生物降解基因拷贝数进行定量测定，在国内外微生物种群的多样性和群落分布监测分析上有重要的应用。该技术在石油降解基因特异性扩增所需引物的合成上，对大部分能降解石油烃的菌株序列进行比对，设计同源性较高的石油烃降解基因扩增引物。此外，实时荧光定量PCR技术不用专门设计检测探针，具有比其他分析技术如杂交和克隆更加简便、经济、准确。 
发明内容
本发明的目在于提供一种石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，可以对降解微生物的芳香烃代谢途径和降解活性进行准确检测，又能反映土壤石油污染程度。 
本发明的技术方案： 
一种石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，主要步骤如下： 
1)采集石油污染0～20cm表层土壤进行-20℃保存，按照ZR Soil Microbe DNA MiniPrepTM土壤DNA提取试剂盒步骤进行DNA提取。 
2)引物设计遵循引物设计原则，从土壤中能降解石油烃的菌株序列中比对设计同源性较高的萘降解基因扩增引物Nahf/Nahr，见下表。 
Figure BSA0000097347930000021
3)将提取净化后的DNA经过PCR仪(Techne TC5000)进行Nah降解基因特异性扩增，产物经过2.0％琼脂糖凝胶电泳检测是否是目的片段。 
4)按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒的操作步骤进行切胶回收目的基因，按照pEASY-T1Clonning Kit步骤将目的基因导入Trans-T1感受态细胞，培养后涂有20mg/ml X-gal和100mg/ml氨苄青霉素平板上进行蓝白斑阳性克隆子的筛选。 
5)挑选白色菌落培养后的载体细胞经过Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒进行质粒的提取，对获得的质粒经过Nah降解基因特异性PCR后上2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用微量核酸蛋白质分析仪测定所提质粒的拷贝数。 
6)将所提质粒中含有目的基因Nah的DNA模板依次稀释10倍梯度进行荧光定量PCR(BioRad CFX96)完成外标曲线的建立，同时将不同的石油污染样品DNA进行荧光定量PCR，温度程序为：95℃保持5min；经过以下40个周期：变性温度为94℃，保持5s，退火温度57℃，保持60s，后经过72℃的延伸30s。熔解曲线温度：Nah基因从57℃保持5s，然后逐渐升到95℃(增量为0.5℃) 
7)根据建得的外标曲线测定供试土样中萘降解基因Nah拷贝数，空白为不加DNA的阴性对照，做三个平行。 
8)检测限为建立外标曲线时，荧光信号和稀释目标DNA浓度不成线性比例时，所得到对应目的基因拷贝数。 
荧光定量PCR体系如下： 
Figure BSA0000097347930000031
本发明的优点和有益效果是： 
(1)实时荧光定量PCR技术避免传统培养生物技术分析不全面的缺点，直接对土壤微生物总DNA进行提取，能对关键的石油烃生物降解基因拷贝数进行定量测定，准确反映污染地区中石油烃的生物降解途径和代谢活性，反映降解菌的群落组成和变化，促进和监督绿色环保高效的生物修复技术在石油烃修复中的应用。 
(2)该技术中所使用的引物是比对文献资料报道和研究的能降解芳香烃中微生物菌株序列，能够获得的同源性较高的石油烃降解基因扩增产物，避免了单一菌株的降解特异性的缺点，对微生物降解性能分析更加全面。 
(3)实时荧光定量PCR不用专门设计检测探针，操作简单且具有很高的重复性，比其他分析技术如杂交和克隆更加简便、经济、准确，具有很高的应用价值。 
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述，但本实施例所叙述的技术内容是说明性的，而不是限定 性的，不应依此来局限本发明的保护范围 
实施例1 
1)采集某油田采油区、石油加工炼制区、生活区共计14个点位的表层土壤，每一样点在直径20m范围内按“S”型选择5个0～20cm耕层土样混合，所有样品迅速转移到-20℃冰箱保存。 
2)引物设计遵循引物设计原则，从土壤中能降解石油烃的菌株序列中比对设计同源性较高的萘降解基因扩增引物Nahf/Nahr，见表1。 
Figure BSA0000097347930000041
3)将提取净化后的DNA经过PCR仪(Techne TC5000)进行Nah降解基因特异性扩增，产物经过2.0％琼脂糖凝胶电泳检测是否是目的片段。 
4)按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒的操作步骤进行切胶回收目的基因，按照pEASY-T1Clonning Kit步骤将目的基因导入Trans-T1感受态细胞，培养后涂有20mg/ml X-gal和100mg/nl氨苄青霉素平板上进行蓝白斑阳性克隆子的筛选。 
5)挑选白色菌落培养后的载体细胞经过Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒进行质粒的提取，对获得的质粒经过Nah降解基因特异性PCR后上2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用微量核酸蛋白质分析仪测定所提质粒的拷贝数。 
6)将所提质粒中含有目的基因Nah的DNA模板依次稀释10倍梯度进行荧光定量PCR(BioRad CFX96)完成外标曲线的建立，同时将不同的石油污染样品DNA进行荧光定量PCR，温度程序为：95℃保持5min；经过以下40个周期：变性温度为94℃，保持5s，退火温度57℃，保持60s，后经过72℃的延伸30s。熔解曲线温度：Nah基因从57℃保持5s，然后逐渐升到95℃(增量为0.5℃) 
7)根据建得的外标曲线测定供试土样中萘降解基因Nah拷贝数，空白为不加DNA的阴性对照，做三个平行。 
8)检测限为建立外标曲线时，荧光信号和稀释目标DNA浓度不成线性比例时，所得到对应目的基因拷贝数。 
荧光定量PCR体系如下： 
Figure BSA0000097347930000051
 
表2实施例1石油污染土壤中Nah降解基因拷贝数 
土壤样品 Cq C 拷贝数(copy/g土)
采油区1 21.54 168696.1 4.82E+07
采油区2 21.76 139380.7 3.98E+07
采油区3 21.34 199591.3 5.70E+07
采油区4 22.60 68037.78 1.94E+07
采油区5 21.85 128890.6 3.68E+07
石油加工炼制区1 21.16 233074.3 6.66E+07
石油加工炼制区2 21.91 122170.8 3.49E+07
石油加工炼制区3 21.81 134062.6 3.83E+07
石油加工炼制区4 21.30 206464.8 5.90E+07
石油加工炼制区5 21.49 174857.5 5.00E+07
生活区1 21.07 251620.6 7.19E+07
生活区2 21.07 249836.5 7.14E+07
生活区3 22.66 64663.36 1.85E+07
生活区4 20.55 389856.8 1.11E+08
注：Cq为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 
C为每μl样品中萘基因的拷贝数 
附图说明
图1为实施例1的Nah降解扩增曲线(a)，标准曲线(b)，熔解曲线(c)，熔解峰(d) 。

Claims (4)

1.一种石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，其特征在于步骤如下： 
1)采集石油污染0～20cm表层土壤进行-20℃保存，按照ZR Soil Microbe DNA MiniPrepTM土壤DNA提取试剂盒步骤进行DNA提取。 
2)引物设计遵循引物设计原则，从土壤中能降解石油烃的菌株序列中比对设计同源性较高的萘降解基因扩增引物Nahf/Nahr，见下表。 
Figure FSA0000097347920000011
3)将提取净化后的DNA经过PCR仪(Techne TC5000)进行Nah降解基因特异性扩增，产物经过2.0％琼脂糖凝胶电泳检测是否是目的片段。 
4)按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒的操作步骤进行切胶回收目的基因，按照pEASY-T1Clonning Kit步骤将目的基因导入Trans-T1感受态细胞，培养后涂有20mg/ml X-gal和100mg/ml氨苄青霉素平板上进行蓝白斑阳性克隆子的筛选。 
5)挑选白色菌落培养后的载体细胞经过Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒进行质粒的提取，对获得的质粒经过Nah降解基因特异性PCR后上2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用微量核酸蛋白质分析仪测定所提质粒的拷贝数。 
6)将所提质粒中含有目的基因Nah的DNA模板依次稀释10倍梯度进行荧光定量PCR(BioRad CFX96)完成外标曲线的建立，同时将不同的石油污染样品DNA进行荧光定量PCR，温度程序为：95℃保持5min；经过以下40个周期：变性温度为94℃，保持5s，退火温度57℃，保持60s，后经过72℃的延伸30s。熔解曲线温度：Nah基因从57℃保持5s，然后逐渐升到95℃(增量为0.5℃) 
7)根据建得的外标曲线测定供试土样中萘降解基因Nah拷贝数，空白为不加DNA的阴性对照，做三个平行。 
8)检测限为建立外标曲线时，荧光信号和稀释目标DNA浓度不成线性比例时，所得到对应目的基因拷贝数。 
荧光定量PCR体系如下： 
Figure FSA0000097347920000021
2.根据权利要求1所述的石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，其特征在于：Nah降解基因PCR退火温度范围为55～57℃。 
3.根据权利要求1所述的石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，其特征在于：Nah降解基因PCR的最适变性温度为94℃。 
4.根据权利要求1所述的石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的测定方法，其特征在于：定量PCR温度设计为：95℃保持5min；经过以下40个周期：Nah降解基因变性温度为94℃，保持5s，退火温度为57℃，保持60s，后经过72℃的延伸30s。熔解曲线温度：57℃保持5s，然后升到95℃(增量为0.5℃)。 
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