CN110699469A

CN110699469A - 一种鉴别滑液囊支原体野毒株与疫苗株ms-h的实时荧光定量pcr试剂盒

Info

Publication number: CN110699469A
Application number: CN201911071771.9A
Authority: CN
Inventors: 张小荣; 陈梦瑶; 吴艳涛; 郭梦娇; 张成成; 曹永忠
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-11-05
Also published as: CN110699469B

Abstract

本发明涉及一种区分滑液囊支原体野毒株和疫苗株MS‑H的实时荧光定量PCR试剂盒，试剂盒含有：序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示的PCR引物，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的探针，所述探针的5’端分别标记有FAM和VIC报告基团，3’端均标记有MGB荧光淬灭基团。经过体外实验证明本发明的试剂盒敏感性高、特异型强、重复性好，能准确区分MS温度敏感型疫苗株(MS‑H株)和MS野毒株，既可用于对已经经过分离培养并纯化的MS分离株进行鉴别，也可用于免疫鸡群MS‑H疫苗株在鸡体内的复制效率评估与野毒感染的监测。

Description

一种鉴别滑液囊支原体野毒株与疫苗株MS-H的实时荧光定量 PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种荧光定量PCR试剂盒及其应用，特别涉及一种区分滑液囊支原体野毒株和疫苗株(MS-H株)的实时荧光定量PCR试剂盒及其应用。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染主要发生于鸡和火鸡，但鸭、鹅、珍珠鸡、鹦鹉、雉鸡和鹌鹑也易感。本病发展缓慢，病程长，可经种蛋发生垂直传播，也能经呼吸道途径进行水平传播，一旦在鸡群中感染，根除很困难，因此在鸡群中长期蔓延，导致饲料利用率低、生长发育迟缓、淘汰率增高、产蛋量下降等。鸡群如存在该病原时，易与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等其他病原发生混合感染，导致病情加剧，死亡率增高，造成严重的经济损失。

近年来，MS感染对我国家禽养殖业的危害日趋严重，从零星发病到现在发病率居高不下，黄羽肉鸡、白羽肉鸡、肉杂鸡和蛋鸡均有发病。临床症状主要表现为上呼吸道的亚临床感，严重病例也可引起系统性感染并导致传染性滑膜炎，病变部位主要涉及关节的滑液囊膜及腱鞘，引起渗出性滑膜炎、腱鞘滑膜炎或黏液囊炎等。

目前控制MS感染的措施主要包括三种方式：(1)种鸡群的净化。如美国国家家禽改良计划于1974年即将MS列入必须净化的疾病之一，通过釆取严格的生物安全控制和定期的血清学、病原学监测程序相结合的措施，最终实现在种鸡群MS感染完全阴性的状态。但由于MS的水平传播速度很快，因此该方法的实施难度较大，且成本高、周期长，目前世界绝大多数养鸡国家和地区均未能完全实现MS的净化。(2)在饲料中添加抗生素。某些抗生素对预防MS感染有一定作用，但对治疗确诊病例并不是十分有效，且在养殖业推行“抗生素减量化行动”和“无抗养殖”的大趋势下，抗生素的使用受到了严格的限制。另外大剂量长期使用抗生素也存在诱导产生细菌耐药性的潜在风险，因此并不是一种长期可持续的控制措施。(3)使用疫苗免疫进行预防。目前生产中使用的主要是活疫苗，活疫苗的应用一方面可通过在上呼吸道的定植对野毒株感染产生竞争排斥作用，另一方面也能产生有效的粘膜免疫应答，被认为是一种比较有应用前景的防控途径。目前在世界范围内已经通过注册并进入临床应用的主要是澳大利亚生物资源公司的温度敏感型活疫苗MS(MS-H株)和MSD公司的减毒活疫苗

MS Live(MS1株)，其中在中国已允许商品化应用的是温度敏感型活疫苗(MS-H株)[(2017)外兽药证字33号]。

对于活疫苗的使用，对其免疫效果的评价最直接的方式就是定期监测免疫后野毒株的感染和在体内的定植情况。由于活疫苗免疫后往往能在体内长期存在，甚至终生带毒，因此在进行野毒感染监测的时候需要一种能够准确区分疫苗株和野毒株(DIVA)的方法。目前已经报道的DIVA方法均是根据MS obg基因367位SNP设计的，根据Shahid M A等(ShahidM A,Markham P F,Markham J F,et al.Mutations in GTP Binding Protein Obg ofMycoplasma synoviae Vaccine Strain MS-H:Implications in Temperature-Sensitivity Phenotype[J].PLOS ONE,2013,8.)的研究发现，所有MS野毒株obg基因367位核苷酸均为G，而疫苗株MS-H在该位点对应核苷酸突变为A，从而使其获得了对温度敏感的特性，只能在33℃温度下生长良好，而在39.5℃以上则不能正常生长。Ogino S等(Ogino S,Munakata Y,Ohashi S,et al.Genotyping of Japanese Field Isolates of Mycoplasmasynoviae and Rapid Molecular Differentiation from the MS-H Vaccine Strain[J].Avian Diseases,2011,55(2):187-194.)最早于2011年建立了一种基于Cycling Probe技术的实时荧光定量PCR反应。Cycling Probe法是由RNA和DNA构成的杂合探针与RNase H组合使用的高灵敏度检出法，能够高效率地检出扩增过程中及扩增结束时的目的基因片段，Cycling Probe内部含有RNA碱基、一端标记荧光物质、另一端标记淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光。当探针与扩增产物中互补序列杂交后，RNase H在RNA碱基处切断探针，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光。此时通过测定荧光强度，能够实时监控扩增产物量。如果探针的RNA部分与模板不匹配，RNase H将不能切断探针。该方法具有良好的检测特异性，但是探针的合成难度较高，只有少数生物公司可以合成，且成本显著高于常规实时荧光定量PCR探针(为常规荧光定量PCR技术成本的数倍)，其最大的缺陷是只能用于纯培养菌株的鉴别，而不能用于临床样品中野毒株和疫苗株共存状态下的鉴别检测。Shahid M A等(Shahid M A,Markham P F,Marenda M S,et al.High-Resolution Melting-Curve Analysis of obg Gene to Differentiate theTemperature-Sensitive Mycoplasma synoviae Vaccine Strain MS-H from Non-Temperature-Sensitive Strains[J].PLoS ONE,2014,9(3):e92215.)于2014年报道了一种基于高分辨率溶解曲线(HRM)的鉴别方法，该方法操作相对比较繁琐，需要进行套式PCR以增加扩增的特异性和敏感性，且只能进行定性分析而不能进行定量分析。Kreizinger Z等(Kreizinger Z,Kinga Mária Sulyok,Alexandra Pásztor,et al.Rapid,Simple andCost-Effective Molecular Method to Differentiate the Temperature Sensitive(ts+)MS-H Vaccine Strain and Wild-Type Mycoplasma synoviae Isolates[J].PLOS ONE,2015,10.)于2015年建立了一种基于错配扩增的突变分析方法(mismatch amplificationmutation assays,MAMA)。该方法提供了两种选择，一种是通过琼脂糖凝胶分析PCR产物大小，不需要特殊设备，但敏感性较低；另一种选择是通过PCR产物溶解曲线分析Tm值差异区分不同的PCR扩增产物，操作简便，具有良好的特异性和敏感性，但同样也只能进行定性分析而不能进行定量分析。因此，目前尚没有一种有效的区分方法，能够同时具备以下特性：(1)在确保特异性和敏感性的同时兼顾检测成本；(2)能够同时实现对MS野毒株和疫苗株的定性和定量鉴别检测；(3)既可用于已经经过分离纯化的MS菌株鉴别检测，也能用于临床样品中野毒株和疫苗株共存状态下的鉴别检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可定量检测并区分滑液囊支原体野毒株和温度敏感型疫苗株(MS-H株)的实时荧光定量PCR试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明所述的一种区分野毒株和疫苗株(MS-H株)的实时荧光定量PCR试剂盒，含一对可扩增包含MS obg基因367位SNP位点(G/A)特异片段的PCR引物以及2条分别特异性识别野毒株和疫苗株(MS-H株)SNP位点的MGB-Taqman探针，其中通用PCR引物序列MS-uni-F312和MS-uni-R432如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，野毒株和疫苗株特异性探针MS367-PW和MS367-PV序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述的探针MS367-PW和MS367-PV的5’端分别标记有FAM和VIC报告基团，3’端均标记有MGB荧光淬灭基团。

其中，优选的，试剂盒中还包括2×qPCR扩增预混液(2×qPCR Probe Master Mix)以及2种阳性标准品。

其中，优选的，所述的阳性标准品包括分别含有野毒株和疫苗株(MS-H株)片段的质粒，所述的质粒是用完整obg基因片段的特异性引物以野毒株(WVU1853株)和疫苗株(MS-H株)基因组DNA为模板分别扩增出各自的obg基因片段并连接到

CloningVector载体(北京全式金生物技术有限公司，目录号：CT301)上得到的。

其中，优选的，使用所述的试剂盒用于区分野毒株和疫苗株(MS-H株)时，按照以下步骤进行：

(1)提取待检样本的DNA；

(2)实时荧光定量PCR方法标准曲线建立

将阳性标准品质粒从10⁸拷贝/μL到10¹拷贝/μL系列稀释作为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，用于建立标准曲线；

(3)以步骤(1)提取的总DNA为模板，以本发明所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增；

(4)PCR反应过程中自动检测、采集荧光信号，根据标准曲线和荧光信号对待检样本中的病毒含量进行定量。

其中，优选的，荧光定量PCR的反应体系为20μL，20μL体系里含有10μL 2×qPCRProbe Master Mix，1.8μL MS-uni-F312，1.8μL MS-uni-R432，0.4μL MS367-PW，0.2μLMS367-PV，2μL模板DNA和3.8μL无菌水。

其中，优选的，反应条件为：95℃30s；95℃10s、60℃30s，45个循环；60℃30s收集信号。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

MS对养禽业有重大危害，目前中国主要的免疫方式是使用澳大利亚生物资源公司的温度敏感型活疫苗

MS(MS-H株)，MS-H通过“占位效应”和“局部粘膜免疫应答”有效阻断MS自然感染的入侵门户，具有良好的安全性。MS-H疫苗不一定能完全清除MS野毒株的感染和阻止野毒株排毒，因此野毒株和疫苗株往往在鸡体内共存，在监测和评估疫苗免疫效果时需要一种能区分野毒株和疫苗株的定量检测方法。

本发明根据滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)温度敏感型疫苗株(MS-H株)与野毒株相比在obg基因367位存在一个独特的单核苷酸多态性位点(SNP)突变(G→A)的特点，设计出一对可扩增包含该SNP位点(G/A)特异片段的PCR引物以及2条分别特异性识别疫苗株(MS-H株)和野毒株SNP位点的MGB-Taqman探针，研制了可区分疫苗株(MS-H株)和野毒株的实时荧光定量PCR试剂盒。经过体外实验证明本发明的试剂盒敏感性高、特异型强、重复性好，能准确区分MS温度敏感型疫苗株(MS-H株)和MS野毒株，既可用于对已经经过分离培养并纯化的MS分离株进行鉴别，也可用于免疫鸡群MS-H疫苗株在鸡体内的复制效率评估与野毒感染的监测。

附图说明

图1为梯度稀释的野毒株对应阳性标准品扩增曲线；

图2为根据野毒株对应阳性标准品扩增结果绘制的标准曲线；

图3为梯度稀释的疫苗株对应阳性标准品扩增曲线；

图4为根据疫苗株对应阳性标准品扩增结果绘制的标准曲线；

图5为特异性试验中单独收集FAM荧光信号(野毒)下的扩增曲线；

图6为特异性试验中单独收集VIC荧光信号(疫苗)下的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1鉴别MS野毒株与疫苗株(MS-H)的实时荧光定量PCR方法的建立

1、引物和探针设计

根据所有MS菌株obg基因保守区设计一对可扩增包含367位SNP位点片段的通用上下游引物，分别命名为MS-uni-F312(SEQ ID NO.1)和MS-uni-R432(SEQ ID NO.2)。针对367位SNP位点核苷酸的差异分别设计野毒株特异性探针MS367-PW(SEQ ID NO.3)和疫苗株特异性探针MS367-PV(SEQ ID NO.4)。其中探针MS367-PW 5’端标记有报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；探针MS367-PV 5’端标记有报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。引物以及探针的设计见表1。

表1.引物和探针序列

2、实时荧光定量PCR反应体系及反应条件优选

通过不同的引物和探针浓度组合进行优化试验，优选确定的荧光定量PCR的反应体系为20μL，20μL体系里含有10μL 2×qPCR Probe Master Mix，1.8μL MS-uni-F312，1.8μL MS-uni-R432，0.4μL MS367-PW，0.2μL MS367-PV，2μL模板DNA和3.8μL无菌水。反应条件为：95℃30s；95℃10s、60℃30s，45个循环；60℃30s收集信号。

3、实时荧光定量PCR检测阳性标准品的制备

根据文献(Shahid M A,Markham P F,Markham J F,et al.Mutations in GTPBinding Protein Obg of Mycoplasma synoviae Vaccine Strain MS-H:Implicationsin Temperature-Sensitivity Phenotype[J].PLOS ONE,2013,8.)报道的方法，用引物obg-comF(SEQ ID NO.5)和obg-comR2(SEQ ID NO.6)，以MS野毒株(WVU1853株)(GenBank登录号：CP011096.1)和疫苗株(MS-H)(GenBank登录号：CP021129.1)基因组DNA为模板分别扩增出完整obg基因片段，分别克隆到

Cloning Vector载体(北京全式金生物技术有限公司，目录号：CT301)上用作阳性标准品。

扩增完整obg基因的引物序列如下：

obg-comF：5＇-CTGAAGAACAAACAGTTAATGG-3＇(SEQ ID NO.5)

obg-comR2：5＇-AATAGCACCAAGATAATTTCC-3＇(SEQ ID NO.6)

4、实时荧光定量PCR方法标准曲线建立与敏感性试验

用高纯度质粒小提试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，产品号：CW0502S)分别从大肠杆菌中提取疫苗株和野毒株对应的阳性标准品质粒，根据公式N＝(C×10^-9)/(M×660)×6.02×10²³(C为标准品浓度，M为构建的质粒碱基数)计算质粒拷贝数。将质粒从10⁸copies/μl到10¹copies/μl 10倍系列稀释作为模板，用于建立实时荧光定量PCR方法的标准曲线。根据步骤2中优选的条件进行实时荧光定量PCR扩增，试验中使用的PCR试剂为ChamQ Geno-SNP Probe Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司，产品号：Q811)，野毒株阳性标准品的扩增曲线和绘制的标准曲线分别见图1和图2，疫苗株(MS-H)阳性标准品的扩增曲线和绘制的标准曲线见图3和图4。从图中可以看出，该实时荧光定量PCR方法针对两种阳性标准品的检测灵敏度均能达到10¹拷贝。

5、特异性试验

MS野毒株(WVU1853株)(保藏号：CVCC385)和鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum，MG)F株(保藏号：CVCC1652)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，MS疫苗株(MS-H株)购自澳大利亚生物资源公司。分别从WVU1853株、MS-H株和F株培养物提取基因组DNA，以其为模板，分别进行实时荧光定量PCR试验，验证这套荧光定量方法的特异性。以所有MS野毒株(WVU1853株)基因组DNA为模板只能检测到野毒株特异性探针MS367-PW的荧光信号，检测不到疫苗株特异性探针MS367-PV的荧光信号，结果见图5；以疫苗株(MS-H)基因组DNA为模板仅能检测到疫苗株特异性探针MS367-PV的荧光信号，检测不到野毒株特异性探针MS367-PW的荧光信号，结果见图6。以MG(F株)基因组DNA为模板则两种探针信号均检测不到。上述结果说明本发明建立的鉴别MS野毒株与疫苗株(MS-H)的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性，可以对纯培养的MS野毒株和疫苗株进行准确鉴别检测。

6、重复性试验

分别以3种不同浓度的阳性标准品为模板，分别进行组内和组间平行试验。组内平行试验方法是在一次PCR检测中，每个样品做3个重复；组间平行试验方法是每个样品做3次不同批次的检测。计算组内和组间变异系数，分析试验的可重复性。实验结果显示这套荧光定量PCR检测方法的组内变异系数和组间变异系数均低于2％。野毒株对应阳性标准品的重复性试验结果见表2，疫苗株对应阳性标准品的重复性试验结果见表3。

表2.野毒株检测的重复性试验

表3.疫苗株检测的重复性试验

7、MS野毒株与疫苗株(MS-H)基因组DNA混合样品的检测

将MS野毒株(WVU1853)基因组DNA(对数生长期培养物提取)作1:10000、1:1000、1:100、1:10四个梯度稀释，每个稀释度分别与疫苗株(MS-H)基因组DNA(对数生长期培养物提取)和对照(无菌水)等量混合，应用上述方法行检测，检测结果见表4。

同样的方法将疫苗株(MS-H)基因组DNA(对数生长期培养物提取)作1:10000、1:1000、1:100、1:10四个梯度稀释，每个稀释度分别与野毒株WVU1853基因组DNA(对数生长期培养物提取)和对照(无菌水)等量混合，应用上述方法进行检测，结果见表5。

由表4和表5可见，在野毒株和疫苗株基因组DNA浓度相似到浓度相差10000倍的情况下检测结果均较为稳定，特异性和敏感性未发生明显变化。说明该试剂盒具有良好的抗干扰能力，可以用于野毒株和疫苗株同时存在的情况下分别对野毒株和疫苗株进行准确区分和定量检测。

表4.疫苗株对野毒株检测的干扰试验结果

表5.野毒株对疫苗株检测的干扰试验结果

实施例2鉴别MS野毒株与疫苗株(MS-H)的实时荧光定量PCR试剂盒在临床样品检测中的应用

对山东某种鸡场免疫MS-H活疫苗一个月后的鸡群进行随机抽样检测，具体方法为用灭菌棉签采集鸡的腭裂拭子样品，样品总数为48份。

首先根据Sprygin A V等(Sprygin A V,Andreychuk D B,Kolotilov A N,etal.Development of a duplex real-time TaqMan PCR assay with an internalcontrol for the detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviaein clinical samples from commercial and backyard poultry[J].Avian Pathology,2010,39(2):99-109.)报道的检测MS的广谱性实时荧光定量PCR方法对样品进行检测，该方法针对的靶基因为vlhA基因，对MS野毒株和疫苗株均能检出，试验中只要CT值不为0均判定为阳性。以下该方法称为非鉴别法。

然后同时使用Kreizinger Z等发明的MAMA法(Kreizinger Z,Kinga MáriaSulyok,Alexandra Pásztor,et al.Rapid,Simple and Cost-Effective MolecularMethod to Differentiate the Temperature Sensitive(ts+)MS-H Vaccine Strain andWild-Type Mycoplasma synoviae Isolates[J].PLOS ONE,2015,10.)和本发明所述试剂盒对该批样品进行野毒株和疫苗株鉴别检测，检测结果见表6。从表6可以看出，本发明所述试剂盒敏感性显著优于MAMA法，48份临床样品经非鉴别法检测均为MS阳性，进一步鉴别检测结果显示，本发明所述试剂盒对48份样品中的47份可实现鉴别检测，而MAMA法仅能对其中14份进行鉴别检测。在MAMA法检出的阳性样品，用本发明方法检测结果均一致，说明本发明方法在拥有显著高于MAMA法的敏感性的基础上同样也具备良好的特异性。

表4.临床样品检测结果

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种鉴别滑液囊支原体野毒株与疫苗株MS-H的实时荧光定量PCR试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 1

tgccgatgtt attaaagaaa atcatc 26

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 2

cattccattt tcggcaattc tag 23

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 3

atttcctctt ccgcctt 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 4

tttcctcttc tgccttt 17

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 5

ctgaagaaca aacagttaat gg 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（manual sequence）

<400> 6

aatagcacca agataatttc c 21

Claims

1.一种鉴别滑液囊支原体野毒株和疫苗株MS-H的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，试剂盒中含有：

PCR引物MS-uni-F312和MS-uni-R432，序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，探针MS367-PW和MS367-PV，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述探针的5’端分别标记有FAM和VIC报告基团，3’端均标记有MGB荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括2×qPCR扩增预混液以及2种阳性标准品。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的2种阳性标准品为分别含有滑液囊支原体野毒株WVU1853和疫苗株MS-H株完整obg基因片段的质粒。

4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，用于区分MS疫苗株MS-H株和野毒株时，按照以下步骤进行：(1)提取待检样本的总DNA；(2)荧光定量方法标准曲线建立将阳性标准品质粒从10⁸拷贝/μL到10¹拷贝/μL梯度稀释作为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，用于建立标准曲线；(3)以步骤(1)提取的总DNA为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增；(4)PCR反应过程中自动检测、采集荧光信号，根据标准曲线对待检样本中的病毒含量进行定量。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，荧光定量PCR的反应体系为20μL，20μL体系里含有10μL 2×qPCR Probe Master Mix，1.8μL MS-uni-F312，1.8μL MS-uni-R432，0.4μL

MS367-PW，0.2μL MS367-PV，2μL模板DNA和3.8μL无菌水。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，荧光定量PCR的反应条件为：95℃30s；95℃10s、60℃30s，45个循环；60℃30s收集信号。