CN110699451B - Gpd1表达量检测试剂盒和二甲双胍辅助癌症治疗的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测甘油‑3‑磷酸脱氢酶1表达量的试剂在制备抗前列腺癌药物的辅助试剂中的应用，检测甘油‑3‑磷酸脱氢酶1表达量的试剂盒以及能提高或/和检测甘油‑3‑磷酸脱氢酶1表达量的试剂和二甲双胍的联合使用在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的提供的GPD1蛋白表达量检测试剂盒，可实现体外精确检测患者前列腺癌组织中的GPD1蛋白表达情况及阳性表达程度，能准确预测前列腺癌患者对二甲双胍的疗效；GPD1过表达结合二甲双胍治疗还能在一定程度上补充雄激素抵抗的负面效果；在经济效益方面，二甲双胍毒副作用少，成本低，能普及所有前列腺癌患者。因此，对临床上内分泌治疗前列腺癌提供新的治疗靶点产生重大意义。

Description

GPD1表达量检测试剂盒和二甲双胍辅助癌症治疗的应用
技术领域
本发明涉及前列腺癌治疗技术领域，尤其是一种用于检测GPD1表达量的试剂盒以及一种辅助抗肿瘤的药物。
背景技术
前列腺癌是世界范围内最常见的男性恶性肿瘤之一，其死亡率在男性肿瘤中排在第二位。80％的前列腺癌患者通过早期的诊断和治疗能获得良好预后。临床上对于早期的前列腺癌治疗一般采用根治性治疗方法，包括根治性前列腺切除术和根治性外放射治疗。而中期前列腺癌患者则一般采取内分泌治疗结合手术治疗的方法。常用的内分泌疗法为去势治疗，但几乎所有的患者在去势治疗的过程中会发展为雄激素抵抗状态，对去势治疗不再敏感，从而预后不良。另外，晚期前列腺癌发生转移也是导致患者死亡的主要原因之一。因此，发现新的、有效的前列腺癌治疗方法或辅助治疗显得十分迫切。
代谢治疗是现今研究热点，许多临床试验表明结合干扰肿瘤代谢疗法对患者的预后有积极的成效。前列腺癌是一种与内分泌相关的肿瘤，流行病学发现糖尿病患者患前列腺癌风险较非糖尿病患者高。基础研究发现正常前列腺细胞有一种独特能量代谢途径，它的三羧酸循环和氧化磷酸化水平收到抑制，保持在一种低能效状态，而葡萄糖则转化为柠檬酸盐作为精液的一部分被释放。前列腺癌细胞与正常细胞不同，在氧气充足下，其糖酵解活动仍然活跃，表现为葡萄糖摄取率高和代谢产物乳酸含量高，称为瓦博格效应(Warburgeffect)。在这种异常糖代谢活动下，前列腺癌细胞快速生长和增殖的能量需求得到满足，并且转移潜能变大。因此，干扰前列腺癌细胞的糖代谢途径可以抑制其恶性进展，有望成为新的治疗靶点。
二甲双胍(Met)是现今一线口服降糖药物，其有效的降糖能力和患者耐受性好的特点，使它在众多双胍类药物中脱颖而出。二甲双胍可以通过多个途径发挥降糖作用，包括降低肝脏葡萄糖的产生，增加骨骼肌摄取葡萄糖的能力，降低外周组织中的胰岛素敏感性和抑制肝脏糖异生。它还可以参与降低甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的水平。
因此，二甲双胍在近年来被广泛用于肿瘤的辅助治疗的研究与应用。二甲双胍被证明可直接作用于肿瘤细胞内线粒体，影响呼吸电子连从而改变ATP/ADP和NADH/NAD+比值，降低肿瘤细胞的能量代谢和抑制糖酵解。另外，它还可以通过抑制甘油-3-磷酸脱氢酶2(GPD2)的表达，降低线粒体内氧化磷酸化水平。除此之外，二甲双胍还能调控AMPK、mTOR和IGF等重要细胞信号通路，从整体上达到一个抑制肿瘤生长的效果。在前列腺癌应用方面，二甲双胍还被证明可以降低雄激素受体表达，抑制雄激素通路对前列腺癌的促进作用，还可以调控TGF-β1-STAT3信号轴扭转癌细胞对药物恩杂鲁胺的抗性。而且大部分临床试验结果也表明二甲双胍应用于前列腺癌治疗可以改善患者预后或降低糖尿病患者发生前列腺癌的风险。
但是，由于肿瘤异质性的存在，肿瘤细胞对药物作用的应答是不一致的。我们通过CCK-8实验对15株肿瘤细胞株的二甲双胍半抑制浓度(Met-IC50)进行检测，每个孔接种5000个细胞数(96孔板)，分别设计0，6.25，12.5，25，50，100和200毫摩尔(mM)7个不同浓度二甲双胍对细胞进行培育28小时，然后每孔加入20微升(ul)的CCK8试剂(C0038，Beyotime)并在培养箱中孵育2小时，随后使用酶标仪进行检测并分析。实验结果表明，不同肿瘤细胞对二甲双胍的敏感性不一，各自的Met-IC50不相同(表1)。尽管是同一种肿瘤细胞，不同的细胞表型对二甲双胍的治疗应答也是不一致的，如表1中的DU145，PC3和LNCaP均是前列腺癌细胞株，但它们的Met-IC50差别很大。
表1 15株肿瘤细胞株的Met-IC50
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可提高二甲双胍抗肿瘤疗效的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，本发明提供了检测甘油-3-磷酸脱氢酶1表达量的试剂在制备抗前列腺癌药物的辅助试剂中的应用。
优选地，所述检测甘油-3-磷酸脱氢酶1表达量的试剂为检测甘油-3-磷酸脱氢酶1的mRNA表达量的试剂。
优选地，所述检测甘油-3-磷酸脱氢酶1的mRNA表达量的试剂为一对引物，其碱基序列如SEQ ID NO.3和4所示，或者是甘油-3-磷酸脱氢酶1的单克隆抗体。
在另一个方面，本发明提供了一种检测GPD1表达量的试剂盒，包括检测甘油-3-磷酸脱氢酶1的mRNA表达量的试剂，所述试剂为一对引物，其碱基序列如SEQ ID NO.3和4所示，或者是甘油-3-磷酸脱氢酶1的单克隆抗体。
在另一个方面，本发明提供了能提高甘油-3-磷酸脱氢酶1表达量的试剂在制备抗肿瘤药物中的应用。其中，所述肿瘤包括但不限于前列腺癌。
在又一个方面，本发明提供了能提高甘油-3-磷酸脱氢酶1表达量的试剂和二甲双胍的联合使用在制备抗肿瘤药物中的应用。
在另一个方面，本发明提供了能提高或/和检测甘油-3-磷酸脱氢酶1表达量的试剂和二甲双胍的联合使用在制备抗肿瘤药物中的应用。
在又一个方面，本发明提供了能提高或/和检测甘油-3-磷酸脱氢酶1表达量的试剂、二甲双胍和能降低雄激素含量的试剂的联合使用在制备抗前列腺癌的药物中的应用。
在另一个方面，本发明提供了一种抗肿瘤的药物组合，包括能提高或/和检测甘油-3-磷酸脱氢酶1表达量的试剂和二甲双胍。其中，所述肿瘤包括但不限于前列腺癌。
在又一个方面，本发明提供了一种抗前列腺癌的药物组合，包括能提高或/和检测甘油-3-磷酸脱氢酶1表达量的试剂、二甲双胍和能降低雄激素含量的试剂。
综上所述，本发明的有益效果为：
1)本发明的提供的GPD1蛋白表达检测试剂盒，可实现体外精确检测患者前列腺癌组织中的GPD1蛋白表达情况及阳性表达程度，试验结果证明GPD1与Met-IC50呈负相关(图1，表2)，而且动物体内实验也表明GPD1表达量提升3-4倍即可以促进二甲双胍的抗肿瘤作用(图3～6)；
2)使用本试剂盒对GPD1蛋白进行检测，染色强度越强，可预测患者对二甲双胍治疗越有效；
3)相对于盲目给予二甲双胍作辅助治疗的方式，检测GPD1的表达量，能为是否使用二甲双胍提供有力的依据，有利于提高药物的使用效率，而且GPD1能增加肿瘤细胞对二甲双胍的敏感性，可适当调整二甲双胍的用量，进一步降低胃肠道的毒副作用；
4)GPD1过表达结合二甲双胍治疗还能在一定程度上补充雄激素抵抗的负面效果；在经济效益方面，二甲双胍毒副作用少，成本低，能普及所有前列腺癌患者。因此，对临床上内分泌治疗前列腺癌提供新的治疗靶点产生重大意义。
附图说明
图1为GPD1的mRNA的ΔCT值与Met-IC50的关系图，其中显示GPD1的mRNA的ΔCT值与Met-IC50呈正相关；
图2为过表达GPD1的DU145细胞株的鉴定结果图；
图3为Seahorse实验结果图，其中显示揭示GPD1过表达和二甲双胍抑制线粒体呼吸链功能，曲线前三点趋势表明基础耗氧量，曲线4-6点趋势表明ATP生成量，曲线7-9点趋势表明最大耗氧能力，曲线10-12点趋势表明备用耗氧能力；
图4为过表达GPD1的PC3与LNCaP细胞株的鉴定结果图；
图5为体内实验结果图，其证明GPD1的表达量上调能增加肿瘤对二甲双胍治疗的敏感性；
图6为去势条件下，GPD1过表达的结果图，其中显示GPD1过表达能促进二甲双胍的抗肿瘤作用；
图7为GPD1表达阴性(左)和阳性(右)的肿瘤细胞照片。
具体实施方式
本发明提供了一种应用于二甲双胍辅助癌症治疗的检测试剂盒，通过对前列腺癌组织进行GPD1蛋白阳性程度的检测，为临床上使用二甲双胍作辅助内分泌治疗提供依据，并且可以提高前列腺癌对抗糖药物的敏感性，为除抗雄激素治疗外的内分泌治疗提供新的治疗靶点。上述检测试剂盒对临床上获得的前列腺癌组织均可进行检测，可以通过诊断性检查或手术获得前列腺组织，并且是通过体外实验进行检测，对患者危险性少，无毒副作用。
在一些实施例中，用于二甲双胍辅助癌症治疗的检测试剂盒包含GPD1单克隆一抗，特异性高，而且实验步骤简单、快捷，十分高效，可对GPD1的阳性颜色强度进行评分，初步预测二甲双胍对前列腺癌患者疗效。
在一些实施例中，本发明提供的GPD1蛋白表达检测试剂盒，可实现体外精确检测患者前列腺癌组织中的GPD1蛋白表达情况及阳性表达程度。相对于传统盲目给予二甲双胍作辅助治疗的方式，检测GPD1的表达量能为是否使用二甲双胍提供有力的依据，有利于提高药物的使用效率，而且GPD1能增加肿瘤细胞对二甲双胍的敏感性，可减少二甲双胍的用量，进一步降低胃肠道的毒副作用。另外，GPD1过表达结合二甲双胍治疗还能在一定程度上补充雄激素抵抗的负面效果。在经济效益方面，二甲双胍毒副作用少，成本低，能普及所有前列腺癌患者。因此，对临床上内分泌治疗前列腺癌提供新的治疗靶点产生重大意义。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度；如无特别说明，本发明中的方法均为常规方法；如无特别说明，本发明中的试剂或材料均可从市场上或其它公开渠道获得。
实施例1
对二甲双胍作用于甘油-3-磷酸脱氢酶2(GPD2)的机制进行充分调研，发现甘油-3-磷酸脱氢酶1(GPD1)与GPD2共同编码3-磷酸甘油脱氢酶，并且参与同一个甘油-3-磷酸穿梭途径发挥功能，影响糖脂代谢途径的交汇点。在本发明中，为了对GPD1与二甲双胍的关系进行深入探究，通过RT-qPCR实验(实时荧光定量聚合酶链式反应)检测15株肿瘤细胞株(参见表2)的GPD1的mRNA表达量，包括步骤如下：
首先利用RNA提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对15株肿瘤细胞株进行总RNA提取、浓度测定，并于-20℃保存。随后设计GPD1和内参ACTB的引物序列备用：
ACTB：
Forward primer：ACAGAGCCTCGCCTTTGCC(SEQ ID NO.1)；
Reverse primer：AGGGAAACTTGTCTACCAGGC(SEQ ID NO.2)；
GPD1：
Forward primer：CTGTGGTGTTGCTGACCTGA(SEQ ID NO.3)；
Reverse primer：AGGGAAACTTGTCTACCAGGC(SEQ ID NO.4)。
材料准备充分后利用逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)分别对15株肿瘤细胞株的总RNA进行逆转录(总反应体系20ul，分别是11ul的DEPC水含1ug RNA，Oligo(dt)1ul，5×buffer 4ul，核糖核苷酸酶抑制剂1ul，dNTP MIX 2ul，M-Mulu逆转录酶1ul)及聚合酶链反应PCR(25ul的反应体系，分别是Primer 1 1ul，Primer 2 1ul，2×Master12.5ul，ddH2O补至总体系25ul)检测GPD1的mRNA表达量。
得到GPD1的mRNA表达量结果后把15株细胞株的GPD1的ΔCT值与其Met-IC50进行相关性分析，总体趋势和统计学分析表明当GPD1的ΔCT值升高时，Met-IC50随之升高(图1，表2)，而ΔCT值与mRNA实际值相反，即GPD1的mRNA实际表达量与Met-IC50呈负相关。
表2 15株肿瘤细胞株的GPD1表达量与其Met-IC50的关系
细胞株 Met-IC50 GPD1的ΔCT值
LNCaP 62.57 15.46
DU145 36.77 17.07
HCT116 25.42 17.17
769-P 42.72 17.45
A549 42.72 17.65
CAL27 96.62 17.81
SKOV3 102.5 17.86
U2-OS 58.33 17.9
MDA-MB-231 66.08 18.01
PC3 46.09 18.31
SIHA 117.9 18.44
786-0 69.97 19.38
ACHN 91.54 21.18
A498 77.18 21.77
CAKI-1 123.9 21.95
实施例2
通过包装过表达质粒载体(嘌呤霉素，绿色荧光蛋白元件和GPD1 ORF序列(NM_005276.4))，利用慢病毒转染技术构建了GPD1过表达的DU145和对照组细胞株(图2，DU145-WT，DU145-GPD1)，并通过最新的Seahorse实验技术，探究GPD1抑制肿瘤的机制。
Seahorse实验主要用于验证线粒体功能是否受损，实验前一天将8000/孔的实验用细胞接种到Seahorse XF 24孔细胞培养板中，在培养基中过夜培养，实验当天配制“检测液”：Seahorse XF Base Medium检测液与25mM的二甲双胍混匀至5ml，然后加入所需要的丙酮酸钠和L谷氨酰胺并加热至37℃，用NaOH调pH值至7.4，过滤，置37℃水浴中备用。随后将培养基换为检测液，然后放置在37℃无CO2培养箱中1小时，加入稀释好的试剂盒检测药物(Agilent Technologies)后上机并运行实验程序，最后采用wave软件(SeahorseBioscience)对实验数据进行分析。
实验结果(图3)表明当GPD1在细胞内表达量增加时，它对线粒体呼吸链(OCR)的抑制能力较对照组(GPD1-NC)变强，而且还发现单独使用二甲双胍治疗也可以对线粒体呼吸链进行抑制(图3，DU145-NC与DU145-NC+Met比较)。当联用GPD1过表达和二甲双胍治疗时，线粒体的呼吸链功能被完全抑制(图3，DU145-GPD1与DU145-GPD1+Met比较)，整体结果进一步揭示了GPD1联合二甲双胍抗肿瘤的分子机制。
实施例3
利用前面所述的方法另外构建了GPD1过表达和对照组的前列腺癌LNCaP和PC3细胞株(图4，PC3-WT，PC3-GPD1，LNCaP-WT，LNCaP-GPD1)，并通过动物荷瘤实验验证GPD1对二甲双胍的抗肿瘤作用的影响。
首先用0.25％的胰蛋白酶液消化待细胞变圆，加入培养液终止消化，吹打制成待测细胞悬液，再进行细胞计数达1×107，将细胞全部移到离心管，离心机中1000r/min离心5分钟，弃上清液，用5％血清培养基重悬悬液，于裸鼠左侧腋窝处接种对照组细胞，右侧接种GPD1过表达组细胞，接种前将细胞与等体积matrix胶混合均匀，接种体积均为100μL，成瘤后即测量瘤体体积一次，然后每天喂食浓度为40mg/kg二甲双胍，每三天观察测量并记录瘤体大小，待裸鼠出现恶病质状态前取瘤体最后测量一次并拍照。
实验结果表明接种DU145-GPD1(图5A)，LNCaP-GPD1(图5C)和PC3-GPD1(图5E)细胞株的裸鼠分别与其对照组裸鼠在同一个二甲双胍浓度的喂养下，过表达GPD1组的裸鼠种植瘤体积较对照组小，统计学分析也表明过表达GPD1组的裸鼠种植瘤体积曲线与对照组的体积曲线均具有统计学差异(图5B，5D，5F)。而且，本实施例所使用的二甲双胍喂养浓度是40mg/kg，比其他文献中常用的动物实验浓度低6倍。因此，本实施例从体内层面证明了GPD1的表达量上调能增加肿瘤对二甲双胍治疗的敏感性。
实施例4
另外，抗雄激素治疗是临床上主要的前列腺癌内分泌治疗的方式，因此需要在体内层面进一步验证GPD1过表达在去势情况下是否能继续增加二甲双胍的抗肿瘤能力。
利用图5中的实验方法，在去势的裸鼠(手术切除睾丸，雄激素下降)上利用过表达GPD1的DU145和LNCaP细胞株作荷瘤实验，二甲双胍喂养浓度仍保持是每天40mg/kg。DU145为雄激素非依赖型细胞株，而LNCaP为雄激素依赖型细胞株，整体结果表明所有过表达GPD1组的裸鼠种植瘤体积较对照组小(图6A，6C)，统计学分析也表明过表达GPD1组的裸鼠种植瘤体积曲线与对照组的体积曲线均具有统计学差异(图6B，6D)，证明GPD1过表达在去势情况下也能增加二甲双胍的抗肿瘤能力。
相对于传统给药方式，通过检测GPD1表达量，有针对性地对前列腺患者予以二甲双胍给药辅助治疗，有利于提高药物的使用效率，改正盲目用药的缺点，并且上述发现能减少二甲双胍的用量，进一步降低二甲双胍可能引起的胃肠道反应副作用。此外，上述实施例的结果还表明二甲双胍与GPD1过表达能有效结合去势治疗，抑制前列腺癌生长。虽然目前并没有有效手段可以靶向提高前列腺癌患者组织中GPD1的表达量，但因为个体差异性的存在，可以有针对性地检测GPD1表达辅以二甲双胍治疗，对于提高临床前列腺癌内分泌治疗效果具有重大意义。
实施例5
本发明中检测GPD1蛋白表达量的试剂盒的一种实施例，该试剂盒内容包括：1.鼠来源GPD1单克隆抗体200μg/ml(sc-390379，Santa Cruz Biotechnology)；2.羊血清1ml(Gibco)；3.羊抗鼠二抗500μg/ml(ab205719，abcam)；4.EDTA抗原修复液100ml(Beyotime)；5.Biotin-Avidin封闭试剂盒(Vector Laboratories)6.ABC系统复合物(VectorLaboratories)；7.DAB染色剂(Dako Products)；8.TBS漂洗缓冲液(TBST)(BOSTERBiological Technology)。
以手术获取前列腺癌组织作石蜡切片为例，采用上述试剂盒检测GPD1蛋白表达情况，其具体步骤如下：
1.组织包埋，石蜡切片切好后，置于60摄氏度烘箱中烘烤30-45分钟；
2.人工操作对烘烤后的切片进行脱蜡水化(自上而下)：
3.将切片慢慢地置于枸橼酸钠抗原修复液中进行抗原修复，再在高压蒸汽锅中加热15min，让其在室温下自然冷却1.5-2小时。
4.把切片放到蒸馏水里并在摇床上洗3次，每次2分钟。
5.把切片放到TBST里并在摇床上洗3次，每次5分钟。
6.把切片放到3％的H2O2中在摇床上室温孵育20分钟。
7.把切片放到蒸馏水里并在摇床上洗3次，每次2分钟。
8.把切片放到TBST里并在摇床上洗3次，每次5分钟。
9.用阻水笔小心地把组织圈住，每张切片分别加用含Avidin溶液的含5％的血清的TBST溶液中，室温下摇床孵育封闭30分钟。
10.甩去Avidin溶液，每张切片分别加GPD1单克隆抗体(1∶200，抗体稀释于混有Biotin的含5％的动物血清的TBST溶液中)。
11.室温下孵育1小时。
12.把切片放到TBST里并在摇床上洗3次，每次5分钟。
13.甩掉TBST溶液，每张切片分别加入羊抗鼠二抗(1∶300)，于室温下摇床上孵育30分钟。
14.把切片放到TBST里并在摇床上洗3次，每次5分钟。
15.甩掉TBST溶液，加入ABC溶液，于室温下摇床上孵育30分钟。
16.把切片放到TBST里并在摇床上洗3次，每次5分钟。
17.甩掉TBST溶液，每张切片分别滴加适量新鲜配制的DAB，于镜下观察到目标染色后将切片浸入蒸馏水以中止染色反应。
18.将切片放入苏木精复染5-10秒，在温水中冲洗干净，在碳酸锂里浸润一下再次用温水冲洗干净。
19.人工操作复染后的切片进行脱水(自下而上)
取出二甲苯中的切片，用中性树脂封片，于显微镜下观察GPD1蛋白染色情况，如图7所示，若GPD1表达呈阳性反应，则提示患者可以服用二甲双胍作癌症辅助治疗。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院）
<120> GPD1表达量检测试剂盒和二甲双胍辅助癌症治疗的应用
<130> 2019
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acagagcctc gcctttgcc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agggaaactt gtctaccagg c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgtggtgtt gctgacctga 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agggaaactt gtctaccagg c 21

Claims (2)

1.甘油-3-磷酸脱氢酶1过表达的试剂和二甲双胍的联合使用在制备抗肿瘤药物中的应用；
所述肿瘤为前列腺癌；
所述甘油-3-磷酸脱氢酶1过表达的试剂是通过甘油-3-磷酸脱氢酶1的过表达质粒载体表达产生。
2.甘油-3-磷酸脱氢酶1过表达的试剂、二甲双胍和能降低雄激素含量的试剂的联合使用在制备抗前列腺癌的药物中的应用；
所述甘油-3-磷酸脱氢酶1过表达的试剂是通过甘油-3-磷酸脱氢酶1的过表达质粒载体表达产生。
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二甲双胍降糖机制研究进展;潘小康;《中国糖尿病杂志》;20160720(第07期);全文 *

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