CN110699332A - 溶解性多糖单加氧酶、其编码基因pclpmo176及其应用 - Google Patents

溶解性多糖单加氧酶、其编码基因pclpmo176及其应用 Download PDF

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Abstract

一种溶解性多糖单加氧酶、其编码基因pclpmo176及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；其真核表达充足酶PcLPMO176为一种中温溶解性多糖单加氧酶，具有多种底物活性，其最适温度根据底物不同而呈现出40‑50℃不等，最适pH在不同底物中分别为6‑8。本发明通过设计引物成功克隆得到序列，并在真核表达系统GS115中成功表达，经甲醇诱导表达，所得溶解性多糖单加氧酶对多种底物均有活性。该重组溶解性多糖单加氧酶具有良好的工业应用价值。

Description

溶解性多糖单加氧酶、其编码基因pclpmo176及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种新型溶解性多糖单加氧酶、其编码基因pclpmo176及其应用。
背景技术
在全球化石燃料枯竭，新能源特别是基于电池的新能源发展遇到瓶颈之际，开发新的能源替代品成了当务之急。利用酵母发酵的一代生物乙醇并在汽油中添加生物乙醇得到的乙醇汽油已经在国内六省获得推广。然而在一代乙醇发展之际却遭到国家叫停，原因是利用玉米淀粉发酵的生物乙醇产生了“与人争粮”的境地。
因此利用木质纤维素降解酶系来降解传统意义上的“农业废料”成了科研工作者们的目标。传统的糖苷水解酶(Glycosyl hydrolase,GH)对于木聚糖、甘露聚糖、葡聚糖等都有较好的降解效果，其降解模式较为单一，是打开聚糖中特定的糖苷键，对于木质纤维素中较为复杂的结晶结构降解效率低；而溶解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharidemonooxygenase,LPMO/PMO)是近年来新发现的一类酶，归类于辅助酶家族(多为真菌分泌的AA9家族)，它是一种能够结合金属和电子供体，来断裂多糖底物的酶，以此来产生更多的木质纤维素降解酶系的结合位点，提高木质纤维素的降解效率。此外，黄孢原毛平革菌作为降解木质纤维素的模式生物，其木质纤维素降解酶系较为健全，因此，黄孢原毛平革菌AA9家族多糖单加氧酶具有重要研究、开发价值。
发明内容
本发明提供一种新型的溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176，其真核表达充足酶PcLPMO176为一种中温溶解性多糖单加氧酶，具有多种底物活性，其最适温度根据底物不同而呈现出40-50℃不等，最适pH在不同底物中分别为6-8。
为了解决上述技术问题，首先本发明提供一种溶解性多糖单加氧酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供一种编码上述溶解性多糖单加氧酶的胞外AA9家族多糖单加氧酶基因PcLPMO176(溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176)，所述胞外AA9家族多糖单加氧酶PcLPMO176基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，其来自于黄孢原毛平革菌转录组数据。
进一步的，本发明所述胞外AA9家族多糖单加氧酶基因PcLPMO176为胞外表达。
本发明还提供一种包含所述溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176的重组载体pPIC9K/pclpmo176。
本发明还提供一种包含所述溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176的重组菌。
本发明还提供一种制备溶解性多糖单加氧酶的方法，该方法是通过发酵培养上述的重组菌，得到上述溶解性多糖单加氧酶。
本发明还提供一种扩增上述溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176采用的特异性引物，该特异性引物为：176-EcoRI：5’CGAATTCCACTTCACGATGCAGTACAT 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；176-NotI：5’CGCGGCCGCTCAACCAAGTTCATTTACAG 3’，其核苷酸序列如SEQID No.4所示。
本发明所述一种溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176的获取方法如下：
(a)pclpmo176溶解性多糖单加氧酶基因的克隆及重组质粒pPIC9K/pclpmo176的构建；
(b)重组质粒pPIC9K/pclpmo176在毕赤酵母GS115中的表达；
(c)重组蛋白的诱导、纯化及酶学特性分析。
作为优选，步骤(a)pclpmo176溶解性多糖单加氧酶基因的克隆及重组质粒pPIC9K/pclpmo176的构建过程具体如下：
①PCR扩增溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176；
②同时用EcoRI和NotI对pPIC9K载体和pclpmo176基因进行双酶切，纯化后连接；
③重组质粒pPIC9K/pclpmo176转化至毕赤酵母GS115感受态细胞。
本发明还提供一种其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的溶解性多糖单加氧酶在降解木质纤维素中的应用。
本发明具有下列优点和积极效果：
1.本发明中所克隆的基因来自黄孢原毛平革菌转录组数据，保证基因的新颖性。
2.本发明中选用真核表达系统，具有遗传背景清楚、操作简便和生产周期短等优点。
3.本发明中PCR扩增目的片段时采取的是自行设计的特异性引物，可以有效保证扩增效率和产物特异性。
4.本发明通过设计引物成功克隆得到序列，并在真核表达系统GS115中成功表达，经甲醇诱导表达，所得溶解性多糖单加氧酶对多种底物均有活性。该重组溶解性多糖单加氧酶具有良好的工业应用价值。
附图说明
图1是克隆pclpmo176 PCR产物；
图2是重组蛋白PcLPMO176的SDS-PAGE分析图；
图3是PcLPMO176酶的最适pH；
图4是PcLPMO176酶的最适温度；
图5是协同降解甘露聚糖为主要成分的刺槐豆胶底物实验结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一、黄孢原毛平革菌总RNA提取
取底物诱导培养的黄孢原毛平革菌提取总RNA(以下RB Buffer、WI、WII均购自美国Omega Bio-Tek公司)在液氮中迅速研磨成粉末，每50～100mg样品加600μl的RB Buffer后匀浆，剧烈震荡混匀以裂解细胞。在离心管中加入500μl苯酚和100μl 2M NaAc(pH 4.0)混匀15s，加入200μl氯仿，用力混匀，冰上10min。4℃12000rpm离心15min，小心吸取上层液体于新的离心管中，与同等体积的70％乙醇，混匀后将混合液体加入收集管中，4℃10000rpm离心30s，加入500μl WI 4℃10000rpm离心30s，加入700μl WII 4℃10000rpm离心30s，加入500μl WII 4℃10000rpm离心30s，加入预热过的RNase free水溶解RNA，4℃10000rpm离心30s。得到黄孢原毛平革菌总RNA，立即使用或者在-80℃保存。
二、pclpmo176基因的克隆
(1)以黄孢原毛平革菌总RNA为模板，利用一步法合成第一链cDNA(以下反转录所用试剂均购自爱必梦生物科技有限公司)
①在微量离心管中配制下列混合液：
Figure BDA0002220457600000031
Figure BDA0002220457600000041
③陆续将反应液于25℃孵育10min；42℃孵育50min；85℃孵育5min；短暂离心得到黄孢原毛平革菌cDNA第一链。
(2)pclpmo176基因扩增
①设计含有EcoRI和NotI酶切位点的上下游PCR扩增引物:
176-EcoRI：5’CGAATTCCACTTCACGATGCAGTACAT 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；176-NotI：5’CGCGGCCGCTCAACCAAGTTCATTTACAG 3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
②以合成的cDNA为模板PCR扩增pclpmo176基因，扩增体系如下(其中2×PhantaMax Master Mix购自南京诺唯赞生物技术有限公司)：
Figure BDA0002220457600000042
涡旋振荡混匀，稍离心后放入PCR仪中。cel5A-h37基因的扩增条件如下：
Figure BDA0002220457600000043
PCR结果见图1，扩增得到837bp的条带。
三、重组质粒pPIC9K/pclpmo176的构建
(1)线性化pPIC9K和基因酶切产物的制备
限制性内切酶切割pPIC9K载体，制备线性化载体(限制性内切酶试剂均购自英国NEB生物有限公司)。体系如下：
Figure BDA0002220457600000051
涡旋振荡混匀，稍离心后放入37℃金属浴中4-5个小时。
Figure BDA0002220457600000052
(2)目的基因与pET-28a载体连接
将带有相同粘性末端的基因和载体利用T4连接酶进行连接(连接酶购自上海生工生物有限公司)。反应体系如下：
Figure BDA0002220457600000053
10μl体系，目的基因与表达载体摩尔比为5:1，50℃反应30min。
四、重组质粒在毕赤酵母中的表达
(1)重组质粒的构建和线性化
热激转化取10μl连接产物与大肠杆菌感受态TOP10小心混匀，冰浴30min；42℃水浴热激50s，立即取出冰浴2min；加入500μl 37℃预热的LB溶液，150rpm恒温培养1h；吸取转化后的菌液，涂布于含卡那霉素的LB筛选培养基中，37℃恒温培养12-16h；挑取菌斑进行PCR鉴定，确认为阳性的克隆子转接到含卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒，利用SalI酶线性化后纯化。
(2)重组毕赤酵母的构建
将-80℃保存的GS115菌种划线于YPD平板，30℃培养2-3d，挑取单菌落至5mlYPD液体培养基中，30℃、220rpm，培养2d。培养好的GS115种子液以1％接种于100mlYPD液体培养基中，30℃、220rpm培养过夜，当OD达到1.2左右，将菌液置于冰上静置30min，转移至预冷的50ml离心管中，4℃、4500rpm离心5min，弃上清液，加入100ml预冷的ddH2O重悬菌体，4℃、4500rpm离心5min，弃上清液，加入50ml预冷的ddH2O重悬菌体，4℃、4500rpm离心5min，弃上清液，加入25ml预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体，4℃、4500rpm离心5min，弃上清液，加入0.75ml预冷的1mol/L山梨醇重悬菌体。即制成GS115感受态细胞，分装后立即使用。
(3)毕赤酵母电击转化
将干净的电击杯于70％乙醇中浸泡30min，于超净工作台中风干后置于冰上备用。将刚刚制备的酵母感受态与线性化后的pPIC9K/pclpmo176混匀，并加入电击杯中，电压2500V进行电击转化，立即加入500μl预冷的1mol/L山梨醇，吸出转化后的菌液，在30℃复苏1h。
(4)阳性克隆子的筛选与验证
挑取MD平板上菌落，接种于2mlBMGY中，30、220rpm培养2d后离心利用2mlBMMY培养基重悬菌体，30℃、220rpm诱导培养3d，每隔24h补加1％甲醇。上清液为粗酶液。将GS115用于基因组DNA提取，并PCR验证阳性转化子。
五、阳性菌株的诱导、纯化及酶学特性分析
(1)阳性菌株的诱导表达
将上述筛选得到转化子后按照上述方法对阳性转化子进行甲醇诱导培养，得到粗酶液。将粗酶液进行SDS-PAGE分析(图2)，结果显示：重组酶P176的蛋白有三个不同大小的蛋白，分别在200kDa、100kDa和25kDa处。
(2)酶学特性分析
溶解性多糖单加氧酶活力单位定义：每分钟产生1μmol还原糖的酶量为1个活力单位(U)，计算公式：
Figure BDA0002220457600000061
A:产生还原糖的浓度(μmol/mL)
K:纯酶稀释倍数
T:酶解反应时间(min)
C:纯酶蛋白浓度(mg/mL)
最适pH:分别采用pH 5.0-9.0的缓冲液(其中pH5.0-8.0采用McIlvaine‘s缓冲液，pH8.0-9.0采用Tris-HCl缓冲液)配置1％羧甲基纤维素钠(CMC、LBG、CHITIN、XYLAN)反应底物，取450μl底物于50℃预热5min，加入50μl酶液，在50℃条件下反应10min，加入500μl DNS溶液，采用DNS法分别测定相对活性。结果显示(图3)：重组酶pclpmo176的最适pH为6.0-8.0。
最适温度：用pH6.0缓冲液配制1％CMC底物，采用DNS法分别测定内切葡聚糖酶酶在30℃-70℃时的酶活，计算相对活性。结果显示(图4)：重组酶pclpmo176的最适反应温度为40℃。
结果如图5所示：协同降解甘露聚糖为主要成分的刺槐豆胶底物实验：按照摩尔比例为pclpmo176:MtMAN1(实验室表达的嗜热毁丝霉甘露聚糖基因MtMAN1)80:1在pH为6.0的醋酸钠缓冲液中，单独或共同作用与浓度为0.5％的刺槐豆胶，40℃静置12h，发现可以使嗜热毁丝霉甘露聚糖酶还原糖产量提升40倍，在上述体系中再次加入等摩尔比的AA10lpmo(米曲霉来源；实验室自备)发现在原来基础上还有167％的还原糖产生量的提升。充分证实本发明的物质可以有效的降解木质纤维素类物质。
以上所述的实施例是本发明挖掘基因和体外制备内切葡聚糖酶方法的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 浙江万里学院
<120> 溶解性多糖单加氧酶、其编码基因pclpmo176及其应用
<130> 2019.09.29
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 906
<212> DNA
<213> 天然序列()
<400> 1
atgaagctcg ctctcctctc tctcctctcg ctcctggccg cgtcggccag cgcgcacttc 60
acgatgcagt acatctgggt gaacggcgtg gaccaggggc agaacgtcga catccgcgtg 120
ccgccgaaca acaacccggt gacggacgtg acgagcaagg acctgacgtg caatgtgaac 180
gggctctcgg gcgcgggcgt cggcaccgtg acggtgcccg caggcgcgac gatcacgttc 240
gagtggcacc agcacgcgca gcgcacgggc gaggacgcga tctcgggcgg ccacaagggc 300
cccgtgcaag tgtacatcgc caaggcgccc tcggatgcat cgtcgttcga cggccagggg 360
acggtctgga ccaagatcta ctcgtctggc ctcgtcaatg cgcagacgca gcagtgggcg 420
acggacgtcg tgaacgcgaa cggcggcaag catagcgtca ccctcccgaa gtcgctgccg 480
ccggggcagt acctgctccg tgccgagatt attgcgctgc acgtcgctca gagctacccc 540
ggtgctcaat tcgtgagtat tctcgtaaat tgctgggtct tactgaccgt cttgtgcctg 600
ctacctccag tacatcggct gcgcccaaat caacatcagc ggtggaggca acgcgaaccc 660
tcccaagatt gctatcccag gcaactacaa gccgaccgat cctggcatca ctgtcaacat 720
ctacaacaac ctgcagagct acacggctcc cggcggccct gtctggtctg gctgagagag 780
tcaatgtatt ttttatgtct tgtatgcctt caatgcagaa tggttcgaag ttggaaaatg 840
gacctagttg tgcacttaca gagccgcaaa gcctccgcgc atcgggctgt aaatgaactt 900
ggttga 906
<210> 2
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Met Lys Leu Ala Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ser Ala
1 5 10 15
Ser Ala His Phe Thr Met Gln Tyr Ile Trp Val Asn Gly Val Asp Gln
20 25 30
Gly Gln Asn Val Asp Ile Arg Val Pro Pro Asn Asn Asn Pro Val Thr
35 40 45
Asp Val Thr Ser Lys Asp Leu Thr Cys Asn Val Asn Gly Leu Ser Gly
50 55 60
Ala Gly Val Gly Thr Val Thr Val Pro Ala Gly Ala Thr Ile Thr Phe
65 70 75 80
Glu Trp His Gln His Ala Gln Arg Thr Gly Glu Asp Ala Ile Ser Gly
85 90 95
Gly His Lys Gly Pro Val Gln Val Tyr Ile Ala Lys Ala Pro Ser Asp
100 105 110
Ala Ser Ser Phe Asp Gly Gln Gly Thr Val Trp Thr Lys Ile Tyr Ser
115 120 125
Ser Gly Leu Val Asn Ala Gln Thr Gln Gln Trp Ala Thr Asp Val Val
130 135 140
Asn Ala Asn Gly Gly Lys His Ser Val Thr Leu Pro Lys Ser Leu Pro
145 150 155 160
Pro Gly Gln Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Ile Ile Ala Leu His Val Ala
165 170 175
Gln Ser Tyr Pro Gly Ala Gln Phe Val Ser Ile Leu Val Asn Cys Trp
180 185 190
Val Leu Leu Thr Val Leu Cys Leu Leu Pro Pro Val His Arg Leu Arg
195 200 205
Pro Asn Gln His Gln Arg Trp Arg Gln Arg Glu Pro Ser Gln Asp Cys
210 215 220
Tyr Pro Arg Gln Leu Gln Ala Asp Arg Ser Trp His His Cys Gln His
225 230 235 240
Leu Gln Gln Pro Ala Glu Leu His Gly Ser Arg Arg Pro Cys Leu Val
245 250 255
Trp Leu Arg Glu Ser Met Tyr Phe Leu Cys Leu Val Cys Leu Gln Cys
260 265 270
Arg Met Val Arg Ser Trp Lys Met Asp Leu Val Val His Leu Gln Ser
275 280 285
Arg Lys Ala Ser Ala His Arg Ala Val Asn Glu Leu Gly
290 295 300
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cgaattccac ttcacgatgc agtacat 27
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cgcggccgct caaccaagtt catttacag 29

Claims (9)

1.一种溶解性多糖单加氧酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种编码权利要求1所述溶解性多糖单加氧酶的溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种包含权利要求2所述溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176的重组载体。
4.一种包含权利要求2所述溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176的重组菌。
5.一种制备溶解性多糖单加氧酶的方法，其特征在于：通过发酵培养权利要求4所述的重组菌，得到溶解性多糖单加氧酶。
6.一种扩增权利要求2所述溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176采用的特异性引物，其特征在于：所述的特异性引物为：
176-EcoRI：5’CGAATTCCACTTCACGATGCAGTACAT 3’；
176-NotI：5’CGCGGCCGCTCAACCAAGTTCATTTACAG 3’。
7.一种溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176的获取方法，其特征在于：步骤包括：
(a)pclpmo176溶解性多糖单加氧酶基因的克隆及重组质粒pPIC9K/pclpmo176的构建；
(b)重组质粒pPIC9K/pclpmo176在毕赤酵母GS115中的表达；
(c)重组蛋白的诱导、纯化及酶学特性分析。
8.根据权利要求7所述的溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176的获取方法，其特征在于：步骤(a)pclpmo176溶解性多糖单加氧酶基因的克隆及重组质粒pPIC9K/pclpmo176的构建过程具体如下：
①PCR扩增溶解性多糖单加氧酶基因pclpmo176；
②同时用EcoRI和NotI对pPIC9K载体和pclpmo176基因进行双酶切，纯化后连接；
③重组质粒pPIC9K/pclpmo176转化至毕赤酵母GS115感受态细胞。
9.一种其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的溶解性多糖单加氧酶在降解木质纤维素中的应用。
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