CN110698615B - 一种蛋白质功能化冰胶材料、其制备方法和用途 - Google Patents

一种蛋白质功能化冰胶材料、其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种蛋白质功能化冰胶材料的制备方法,该方法包括以下步骤:(a)在蛋白质的非活性结构域连接可聚合性基团,得到经修饰的蛋白质;(b)将该经修饰的蛋白质与可共聚单体和交联剂混合,并在低温下使其聚合得到聚合物;(c)将所得聚合物放在室温下或对其真空干燥后得到蛋白质功能化冰胶材料。此外,本发明提供一种通过该制备方法得到的冰胶材料及其用途。

Description

一种蛋白质功能化冰胶材料、其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地,涉及一种冰胶材料,尤其涉及一种连接有蛋白质的蛋白质功能化冰胶材料、其制备方法和用途。
背景技术
冰胶(cryogel)是一类多孔材料,其是在冷冻状态下由单体或聚合物前体聚合或者交联得到的,在这个过程中冰晶作为致孔剂使用。其孔径范围通常在10到100微米之间。在冰晶微相下存在着微相分离,即冰晶相和液态相,水中溶质由于冰晶相的挤压在微液态相中浓度极大提高。聚合反应也发生在这些微液态相中,冰晶融化后就形成了具有贯通孔的聚合物网络。冰胶整体材料由于其优异的孔径特性和机械性能,在生物技术各个领域有着广泛的应用,例如,色谱、层析分离、细胞的分离、组织工程支架等(参照非专利文献1)。
通常,冰胶表面需要修饰诸如蛋白质功能分子以增加冰胶的某些功能。现有的方法中,大多在冰胶制备过程中直接在冰胶中掺杂可后续修饰基团的单体(如甲基丙烯酸缩水甘油酯),然后对成型的冰胶进行后续的功能化以连接蛋白质。这样导致制备过程比较繁琐而且耗时,同时引入了大量化学活性基团,对生物相容性影响较大,同时制备出的冰胶也是不均一的,特别是表面的基团及修饰的蛋白质分布不均。
非专利文献2公开了一种修饰有蛋白A的丙烯酰胺-N,N-亚甲基双丙烯酰胺冰胶,其在制备冰胶时加入甲基丙烯酸缩水甘油酯,使冰胶上具有可供反应的环氧基团,后续依次使用己二胺和戊二醛对冰胶进行修饰,最后加入蛋白A与戊二醛连接,连接反应后加入硼氢化钠还原席夫碱。可以看出其反应步骤较多,最终修饰密度也不均一,而且引入了氨基和醛基基团,对后续的生物相容性影响较大。
非专利文献3公开了一种先将蛋白N末端定向修饰含有烯烃基的化合物,然后利用自由基聚合共聚蛋白质制备水凝胶,但该水凝胶内并不具有大孔结构,液体的通过性和机械性能远远不如冰胶。
非专利文献4公开了一种紫外线引发的连接有蛋白的冰胶制备,但是冰胶中需要引入可供紫外线交联的二苯甲酮基及减少非特异性吸附的亲水基,引入的基团较多,而且蛋白是随机交联活性容易受到损失。
专利文献1公开了一种在制备时掺杂有蛋白的冰胶,蛋白质只是被冰胶物理包裹,其活性保持未知,而且只适用于蛋白质印迹用。
非专利文献1:Plieva,F.M.;Galaev,I.Y.;Mattiasson,B.,Macroporous gelsprepared at subzero temperatures as novel materials for chromatography ofparticulate-containing fluids and cell culture applications.Journal ofSeparation Science 2007,30(11),1657-1671
非专利文献2:Kumar,A.;Srivastava,A.,Cell separation using cryogel-based affinity chromatography.Nature Protocols 2010,5(11),1737-1747
非专利文献3:Xiao,J.;Tolbert,T.J.,Synthesis of Polymerizable ProteinMonomers for Protein-Acrylamide Hydrogel Formation.Biomacromolecules 2009,10(7),1939-1946
非专利文献4:Zinggeler,M.;Schoenberg,J.-N.;Fosso,P.L.;Brandstetter,T.;Ruehe,J.,Functional Cryogel Microstructures Prepared by Light-Induced Cross-Linking of a Photoreactive Copolymer.Acs Applied Materials&Interfaces 2017,9(14),12165-12170
专利文献1:CN105693922A
发明内容
本发明的目的在于,克服如上述的在制备蛋白质功能化冰胶过程中的步骤繁复、耗时较长和不必要的化学活性基团引入以及目的材料的不均一性的问题。
为了解决上述问题,本发明提供一种蛋白质功能化冰胶材料的制备方法,其中,蛋白质能够作为可聚合的单体在冰胶聚合的过程中参与聚合反应,实现一步制备连接蛋白的冰胶多孔材料,同时可保留较好的蛋白活性。此外,本发明还提供一种通过上述制备方法得到的冰胶材料及其用途。
本发明的技术方案如下:
本发明提供:
1.一种蛋白质功能化冰胶材料的制备方法,该方法包括以下步骤:
(a)在蛋白质的非活性结构域连接可聚合性基团,得到经修饰的蛋白质;
(b)将该经修饰的蛋白质与可共聚单体和交联剂混合,并在低温下使其聚合得到聚合物;
(c)将所得聚合物放在室温下或对其真空干燥后得到蛋白质功能化冰胶材料。
2.上述1的制备方法,前述非活性结构域是远离蛋白质活性位点的一端和/或与蛋白质的活性位点相对接近的部位。
3.上述1或2的制备方法,前述聚合性基团选自烯属不饱和基团、环氧乙基、氧杂环丁基、N-烷氧基甲基氨基或者这些基团的衍生物中的一种或多种。
4.上述3的制备方法,前述烯属不饱和基团选自乙烯基、苯乙烯基、烯丙基、炔丙基、丁烯基、乙炔基、苯基乙炔基、马来酰亚胺基、纳迪克酰亚胺基(nadiimide)、(甲基)丙烯酰基中的一种或多种。
5.上述1~4的制备方法,前述可共聚单体选自含羧基单体、(甲基)丙烯酸羟基酯、酸酐单体、含磺酸基单体、含磷酸基单体、丙烯酰胺(AAM)、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯腈、乙烯基吡咯烷酮中的一种或多种。
6.上述1~4的制备方法,前述交联剂选自二丙烯酸-1,4-丁二醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(mBAAm)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二缩水甘油酯、聚碳化二亚胺类交联剂和异氰酸酯类交联剂中的一种或多种。
7.上述6的制备方法,前述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯和/或N,N-亚甲基双丙烯酰胺。
8.上述1~7的制备方法,前述单体与前述交联剂的浓度比(质量浓度比)范围为1:1~50:1。
9.一种通过上述1~8的蛋白质功能化冰胶材料的制备方法得到的冰胶材料。
10.一种将上述1~9的蛋白质功能化冰胶材料在亲和层析、病毒颗粒分离(慢病毒、腺病毒等)、血液灌流、细胞分离(B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等)、血液中循环肿瘤细胞(乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、人皮肤鳞癌细胞等)的捕获及组织工程中(骨组织再生、软骨组织再生、皮肤修复)的用途。
本发明的“非活性结构域”是指蛋白质中发挥蛋白质功能的结构域以外的区域。
通过上述方法制备得到的蛋白质功能化冰胶材料,通过在蛋白质的固定位置(非活性结构域,即“远离活性一端的区域”)连接有可聚合性基团,最大程度上保留了蛋白质原有的活性,该方法不会引入其它化学活性基团,不影响胶体本身的性质及其应用。此外,该方法只需要一步聚合,极大缩减了蛋白冰胶的制备流程,并且所得冰胶材料具有优异的均一性。
在一些实施方案中,在上述步骤(a)中,所述蛋白质选自天然蛋白质、人工合成蛋白质及其衍生物中的一种或几种。作为具体的蛋白质,可列举纳米抗体、嵌合人Fc段的单域抗体、单链抗体scFv、可变区抗体Fab、人源单克隆抗体、鼠源单克隆抗体、骨形态发生蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、人血白蛋白、牛血清白蛋白、γ-球蛋白、白细胞介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、干扰素、凝血因子、转化生长因子-β家族、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)溶菌酶蛋白及各相关蛋白或蛋白衍生物等。
在一些实施方案中,在上述步骤(a)中,上述蛋白质的非活性结构域,只要是蛋白质的活性域以外的区域,则可以根据实际需要来适当选择,可以是远离蛋白质活性位点的一端,还可以是与蛋白质的活性位点相对接近的部位,例如,对于纳米抗体,纳米抗体的活性位点靠近N端,因而其“非活性结构域”可以是该纳米抗体的N端与C端的中间部位,还可以是接近C端的部位,也可以是在C端。
在一些实施方案中,在上述步骤(a)中,作为具体的可聚合性基团,可列举烯属不饱和基团、环氧乙基、氧杂环丁基、N-烷氧基甲基氨基或者这些基团的衍生物等。作为烯属不饱和基团,可列举例如:乙烯基、苯乙烯基、烯丙基、炔丙基、丁烯基、乙炔基、苯基乙炔基、马来酰亚胺基、纳迪克酰亚胺基(nadiimide)、(甲基)丙烯酰基等,从反应性的观点考虑,优选乙烯基、苯乙烯基、(甲基)丙烯酰基,更优选苯乙烯基。
作为前述苯乙烯基,可以是取代或非取代的苯乙烯基,作为取代的苯乙烯基,可以是在苯环上取代,也可以是在乙烯基上取代,还可以是在苯环上和乙烯基上均被取代。作为前述苯环上取代的苯乙烯基,可列举例如,在邻位、间位、对位取代的苯乙烯基,优选为4-取代苯乙烯基等。作为前述苯乙烯基的取代基,可列举例如,氨基、氧氨基、肼基等,优选为氨基、氧氨基,更优选为氨基。
前述“(甲基)丙烯酰基”是指包含甲基丙烯酰基及丙烯酰基以及它们的组合。
作为前述环氧乙基,可列举例如重复单元数为2~20的环氧乙基,优选为2~15,更优选为2~10,最优选为4~8。
在一些实施方案中,在上述步骤(a)中,所述可聚合性基团只要是能够与蛋白质的非活性结构域相连接,则没有特别限制。
作为在蛋白质的非活性结构域连接可聚合性基团的方法,例如,可以先将蛋白质的非活性结构域(例如C端)醛基化,然后加入聚合性化合物从而将该蛋白质的非活性结构域(例如C端)烯基化,得到经修饰的蛋白质。具体地,例如,可以预先在蛋白质的C末端上插入可被相应的修饰酶识别的序列,然后进行基因重组表达、纯化而得到。
作为前述修饰酶,可列举例如,甲酰甘氨酸生成酶-FGE、转肽酶A-SrtA、生物素连接酶BirA、法尼基转移酶、谷氨酰胺转移酶、硫辛酸连接酶,优选为甲酰甘氨酸生成酶-FGE、转肽酶A-SrtA。前述蛋白质与前述修饰酶的比例以摩尔比计优选为50:1~10:1的范围,优选为20:1~10:1的范围,更优选为20:1~15:1的范围,更具体的范围可以是15:1,10:1,5:1。作为前述蛋白质与前述酶的反应例如在pH9.0~10.0的范围、在温度20~25℃条件下反应4-6小时后,得到C末端连接有醛基的纳米抗体。
作为前述聚合性化合物,可列举,4-氨基苯乙烯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、二季戊四醇五丙烯酸酯、二季戊四醇六丙烯酸酯等,但并不限于这些物质。
此外,作为前述在蛋白质的非活性结构域连接可聚合性基团的方法,还可以是将含有烯基的化合物直接插入在预先设计的位置,例如,先在蛋白质的非活性结构域连接烯基,连接烯基的方法还可以采用引入非天然氨基酸的方式,由此得到经修饰的蛋白质。具体地例如,合成含有烯基的赖氨酸衍生物加入培养基,将含有目标蛋白基因的质粒,tRNA质粒和含有特定氨酰tRNA合酶基因的质粒,上述三种质粒导入大肠杆菌中,其tRNA合酶经过改造识别特定密码子(UAG),同时能将含烯基的赖氨酸衍生物与tRNA连接,这样在重组蛋白表达时,含有烯基的赖氨酸衍生物能够直接插入在预先设计的位置,由此得到经修饰的蛋白质。
在一些实施方案中,在上述步骤(b)中,作为前述可共聚单体,可列举饱和烃的(甲基)丙烯酸酯及其衍生物等,但不限于这些物质。前述饱和烃的碳原子数例如可列举1~30个左右,优选1~18个左右,更优选4~15个左右。作为饱和烃,可列举出烷基、环烷基或它们组合而成的基团。具体而言,可列举出(甲基)丙烯酸羟烷基酯及其衍生物、(甲基)丙烯酰胺类化合物及其衍生物、(甲基)丙烯酸烷基酯及其衍生物、(甲基)丙烯酸环烷基酯及其衍生物等。
作为前述烷基,例如可列举出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2-乙基己基、辛基、癸基、十二烷基、十三烷基、十八烷基等。作为前述环烷基,可列举出环丙基、环丁基、环己基等。
作为前述可共聚单体的具体例,可以是例如以下单体:(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸羧基乙酯、(甲基)丙烯酸羧基戊酯、衣康酸、马来酸、富马酸、巴豆酸等含羧基单体;(甲基)丙烯酸羟基乙酯、(甲基)丙烯酸羟基丙酯、(甲基)丙烯酸羟基丁酯等(甲基)丙烯酸羟基酯;马来酸酐、衣康酸酐等酸酐单体;苯乙烯磺酸、烯丙基磺酸、2-(甲基)丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、(甲基)丙烯酰胺丙磺酸、(甲基)丙烯酸磺丙酯、(甲基)丙烯酰氧基萘磺酸等含磺酸基单体;2-羟乙基丙烯酰基磷酸酯等含磷酸基单体;丙烯酰胺(AAM)、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯腈、乙烯基吡咯烷酮等。这些单体可以单独或将两种以上组合使用。从反应性等观点出发,优选为甲基丙烯酸酯系单体。
其中,上述“(甲基)丙烯酰胺”是指丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺,上述“(甲基)丙烯酸”是指丙烯酸或甲基丙烯酸。
在一些实施方案中,在上述步骤(b)中,作为交联剂,可列举二丙烯酸-1,4-丁二醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA,其中,Mn=250~10000,优选为Mn=500~10000,更优选为Mn=500~1000)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(mBAAm)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二缩水甘油酯、聚碳化二亚胺类交联剂和异氰酸酯类交联剂中的一种或几种。优选使用聚乙二醇二丙烯酸酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺。交联剂可以使用1种,也可以组合使用2种以上。
在一些实施方案中,在上述步骤(b)中,所述可共聚单体的浓度(质量浓度)范围为1%~10%,优选为1%~8%,进一步优选为2%~6%,更优选为2%~5%。
在一些实施方案中,在上述步骤(b)中,所述交联剂的浓度(质量浓度)范围为0.1%~5%,优选为0.1%~2.5%,进一步优选为0.2%~2.5%,更优选为0.2%~1%。
在一些实施方案中,在上述步骤(b)中,所述单体与所述交联剂的浓度比(质量浓度比)范围为1:1~50:1,优选为1:1~25:1,进一步优选为5:1~25:1。
在一些实施方案中,在上述步骤(b)中,聚合反应可以采用自由基聚合或者光聚合。从能在较低温度条件下引发聚合反应这方面考虑,优选光聚合引发剂。具体而言,可举出能通过光的作用而产生活性自由基或酸的光聚合引发剂,其中,优选通过光的作用产生自由基的光聚合引发剂优选通过光的作用产生自由基的光聚合引发剂。作为聚合引发剂,可举出苯偶姻化合物、二苯甲酮化合物、烷基苯酮化合物、酰基氧化膦化合物、三嗪化合物、碘鎓盐及锍盐。
在一些实施方案中,在上述步骤(b)中,聚合反应在低温下进行。作为该聚合反应的温度,可列举0℃以下,优选为-30℃~0℃,进一步优选为-20℃~0℃,更优选为-20℃~-10℃,进而可以在-20℃、-18℃、-15℃、-10℃、-5℃、0℃下进行。
在一些实施方案中,在上述步骤(b)中,聚合反应的时间为10~40小时,优选为10~30小时,进一步优选为15~30小时,更优选为18~25小时,进而优选为18~20小时。
在一些实施方案中,在上述步骤(b)中,可以预先将经修饰的蛋白质与聚合性单体、交联剂预先注入模具等容器中,充分混合均匀,然后再加入到冷冻环境中。
在一些实施方案中,在上述步骤(c)中,将上述步骤(b)中的聚合物固体放在室温下对聚合物固体进行解冻,此外,还可以对将上述步骤(b)中的聚合物固体真空干燥。解冻后通过例如磷酸缓冲盐溶液(PBS)对聚合物进行清洗,并将清洗后的聚合物在例如0.02%叠氮化钠中保存。
本发明提供一种蛋白质功能化冰胶材料,其通过包含下述步骤的方法制备得到:
(a)在蛋白质的非活性结构域连接可聚合性基团,得到经修饰的蛋白质;
(b)将该经修饰的蛋白质与可共聚单体和交联剂混合,并在低温下使其聚合得到聚合物;
(c)将所得聚合物放在室温下或对其真空干燥后得到蛋白质功能化冰胶材料。
此外,本发明还提供一种通过上述的制备方法得到的冰胶材料。通过在蛋白质的固定位置连接有可聚合性基团,最大程度上保留了蛋白质原有的活性,该方法不会引入其它化学活性基团,不影响胶体本身的性质及其应用,并且所得冰胶材料具有优异的均一性。
此外,本发明还提供一种将上述的蛋白质功能化冰胶材料在亲和层析、病毒颗粒分离(慢病毒,腺病毒等)、血液灌流、细胞分离(B淋巴细胞,T淋巴细胞,巨噬细胞等)、血液中循环肿瘤细胞(乳腺癌细胞,淋巴癌细胞,人皮肤鳞癌细胞等)的捕获及组织工程中(骨组织再生、软骨组织再生、皮肤修复)的用途。
有益的效果
通过上述方法制备得到的蛋白质功能化冰胶材料,通过在蛋白质的固定位置(远离活性一端)连接有可聚合性基团,最大程度上保留了蛋白质原有的活性,该方法不会引入其它化学活性基团,不影响胶体本身的性质及其应用。此外,该方法只需要一步聚合,极大缩减了蛋白冰胶的制备流程,并且所得冰胶材料具有优异的均一性。
附图说明
图1为本发明的蛋白质功能化冰胶材料的制备过程的示意图。
图2为实施例1中的纳米抗体NB1、C末端连接有醛基的纳米抗体、C末端连接有苯乙烯的纳米抗体的质谱峰图。
图3为显示实施例1~7的不同组成的冰胶的聚合效率以及目标抗原β2微球蛋白的吸附量的图。
图4中a为实施例4中制造的冰胶的扫描电镜图片,b为实施例4中制造的冰胶的红外吸收谱图。
图5为实施例8~12的冰胶材料的扫描电镜图。
图6为实施例4、8~13所制备的冰胶材料的溶胀率与表观孔隙率。
图7为实施例4、8~13所制备的冰胶材料对β2微球蛋白的等温吸附曲线。
图8为实施例8所制备的冰胶材料对细胞破碎上清中β2微球蛋白的吸附过程和结果。
图9为实施例8所制备的冰胶材料的保存稳定性测试结果图。
具体实施方式
实施例1
取纳米抗体(NB1,该纳米抗体的序列:SEQ ID No.1,分子量:18446.75Da,纯度:90%以上),将C末端融合甲酰甘氨酸(FGE)识别序列LCTPSR的纳米抗体(该FGE的序列:SEQID No.2,分子量:33727.33,纯度:90%以上)通过在大肠杆菌胞内进行基因重组表达,经过Ni螯合层析及凝胶筛分、纯化,对该纳米抗体进行修饰。将该经修饰的纳米抗体(终浓度:1mg/mL)与FGE(终浓度:0.2mg/mL)(纳米抗体与FGE的摩尔比为约10:1)的比例混合,在pH9.0、温度25℃条件下反应4~6小时后,得到C末端连接有醛基的纳米抗体。
将上述C末端连接有醛基的纳米抗体(终浓度:1mg/mL)与4-氨基苯乙烯(含量终浓度:1mM)(纳米抗体与4-氨基苯乙烯的摩尔比为约1:20)混合,在pH4.0、温度4℃条件下反应12~16小时后,使用15KDa超滤管去除多余4-氨基苯乙烯,得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
连接有苯乙烯的纳米抗体的鉴定
使用高效液相联用高分辨质谱仪(线性离子阱-高分辨液质联用仪LTQ OrbitrapXL,美国Thermo Scientific公司制),液相条件为溶剂A:0.5%(v/v)甲酸-水溶液,溶剂B:0.1%(v/v)甲酸-乙腈溶液。运行梯度为在80分钟内5%至70%B,流速0.2mL/min,将得出的液质数据导入BioPhamar Finder 2.0软件,在其中的Intact protein analysis项目中使用Default Xtract方法中Xtract(Isotopically resolved)算法进行解卷积运算,得到样品中各个组分的实际分子量,并且可以根据各个峰的相对丰度定量。
图2为实施例1中的纳米抗体NB1、C末端连接有醛基的纳米抗体、C末端连接有苯乙烯基的纳米抗体的质谱峰图,使用高效液相联用高分辨质谱仪(线性离子阱-高分辨液质联用仪LTQ Orbitrap XL,美国Thermo Scientific公司制)来进行测定,测定条件与上述一致。
其中,图2的a为实施例1的纳米抗体原料的质谱峰图,图2的b为实施例1的C末端连接有醛基的纳米抗体的质谱峰图,图2的c为实施例1的C末端连接有苯乙烯的纳米抗体产物的质谱峰图。
从图2的a可知,纳米抗体NB1的质谱峰的在可见18446.75Da处的质谱峰相对丰度为100%,说明样品内18446.75Da的纳米抗体为主要成分且与理论分子量18446.75Da相符,序列正确;从图2的b可知,在18428.76Da处的质谱峰相对丰度为100%,与醛基化后纳米抗体的理论分子量18428.69Da基本符合,说明样品内醛基化后的纳米抗体为主要成分,同时还存在约10%丰度的18447.74Da峰,利用峰面积相对定量可得醛基化纳米抗体相对含量为90%;从图2的c可知,在18529.82Da处的质谱峰相对丰度为100%,与苯乙烯修饰后的纳米抗体分子量18529.82Da基本符合,说明样品内苯乙烯修饰的纳米抗体为主要成分,同时还存在约10%丰度的18428.77Da峰为未被修饰的纳米抗体,相对定量后可得苯乙烯修饰的纳米抗体相对含量约为90%。
下表1为图2的信息汇总表,可以得出各个纳米抗体的实际分子量,由质谱峰面积定量计算而得到,从该表1可知,醛基化纳米抗体和苯乙烯修饰的纳米抗体各自的相对含量都在90%以上。
表1高分辨质谱鉴定蛋白质分子量
Figure GDA0003276936110000091
Figure GDA0003276936110000101
图2和表1均表明,含有醛基的纳米抗体和含有苯乙烯的纳米抗体的连接效率都较高。
进而,将上述得到的C末端连接有苯乙烯的纳米抗体(450μL,11.1mg/mL,即终浓度为10mg/mL)与25mg的丙烯酰胺(终浓度为5%)和5mg的N,N-亚甲基双丙烯酰胺(终浓度:1%)混合后加入的0.8mgAPS(即,终浓度为0.16%),0.7μL TEMED(即,终浓度为0.14%),将溶液体积补至500μL混合均匀后注入模具,放入-18℃冷藏柜中。18小时后取出,放于室温下解冻,用PBS清洗所得冰胶,并于0.02%叠氮化钠中保存,用于后续的表征和测试,记为“冰胶材料1”。
实施例2
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了丙烯酰胺的浓度为5%、N,N-亚甲基双丙烯酰胺的浓度为0.2%以外,采用与实施例1相同的方法和条件,得到“冰胶材料2”。
实施例3
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了使丙烯酰胺的浓度为2%、N,N-亚甲基双丙烯酰胺的浓度为0.2%以外,采用与实施例1相同的方法和条件,得到“冰胶材料3”。
实施例4
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,使丙烯酰胺的浓度为2%,将N,N-亚甲基双丙烯酰胺替换为聚乙二醇二丙烯酸酯(Mn=700),并使该聚乙二醇二丙烯酸酯的浓度为0.5%,除此以外,采用与实施例1相同的方法和条件,得到“冰胶材料4”。
实施例5
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了将丙烯酰胺替换为甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)以外,采用与实施例2相同的方法和条件,得到“冰胶材料5”。
实施例6
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了使甲基丙烯酸羟乙酯的浓度为2%以外,采用与实施例5相同的方法和条件,得到“冰胶材料6”。
实施例7
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了将丙烯酰胺替换为甲基丙烯酸羟乙酯以外,采用与实施例4相同的方法和条件,得到“冰胶材料7”。
实施例8
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了使丙烯酰胺的浓度为4%以外,采用与实施例4相同的方法和条件,得到“冰胶材料8”。
实施例9
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了使聚乙二醇二丙烯酸酯(Mn=700)的浓度为1%以外,采用与实施例4相同的方法和条件,得到“冰胶材料9”。
实施例10
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了使丙烯酰胺的浓度为4%、聚乙二醇二丙烯酸酯(Mn=700)的浓度为1%以外,采用与实施例4相同的方法和条件,得到“冰胶材料10”。
实施例11
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了使聚乙二醇二丙烯酸酯(Mn=700)的浓度为2%以外,采用与实施例4相同的方法和条件,得到“冰胶材料11”。
实施例12
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了使丙烯酰胺的浓度为4%、聚乙二醇二丙烯酸酯(Mn=700)的浓度为2%以外,采用与实施例4相同的方法和条件,得到“冰胶材料12”。
实施例13
通过与上述实施例1相同的方法得到C末端连接有苯乙烯的纳米抗体。
接着,除了使甲基丙烯酸羟乙酯的浓度为4%、N,N-亚甲基双丙烯酰胺的浓度为0.5%以外,采用与实施例5相同的方法和条件,得到“冰胶材料13”。
比较例1
将醛基化修饰的纳米抗体NB1(450μL,11.1mg/mL)与4-氨基苯乙烯(5μL,100mM)、20mg丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯(2.5μL)混合后加入0.8mgAPS、0.7μL TEMED,将溶液体积补至500μL,混合均匀后注入模具,放入-18℃冷藏柜中。18小时后取出,然后在室温下解冻,用PBS清洗所得冰胶,并于0.02%叠氮化钠中保存,用于后续的表征和测试,记为“冰胶材料14”
比较例2
将醛基化修饰的纳米抗体NB1(450μL,11.1mg/mL)、20mg丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯(2.5μL)混合后加入0.8mgAPS、0.7μL TEMED,将溶液体积补至500μL,混合均匀后注入模具,放入-18℃冷藏柜中。18小时后取出,然后在室温下解冻,用PBS清洗所得冰胶,并于0.02%叠氮化钠中保存,用于后续的表征和测试,记为“冰胶材料15”
以下,测定上述实施例1~13中制造的冰胶材料1~13以及比较例1的冰胶材料14和比较例2的冰胶材料15的性能。
具体地,分别测量冰胶的蛋白聚合效率、溶胀率和表观孔隙率,具体的测量方法如下:
蛋白聚合效率测定
使用清洗液,测定聚合前的反应体系的蛋白浓度,具体的每0.5mL冰胶加入2mLPBS溶液清洗三次,收集清洗液,用BCA法测定清洗液中的蛋白浓度。
蛋白聚合效率e按以下公式计算:
Figure GDA0003276936110000121
其中,Cw表示聚合后的冰胶清洗液中蛋白浓度,C0为聚合前反应体系中的蛋白浓度,Vw为清洗液的体积,Vc为冰胶的体积。
溶胀率
具体地,将冰胶浸泡在双蒸水中24小时,让冰胶充分吸水溶胀,用精密天平测量此时的冰胶质量记为Msw,然后将吸水后的冰胶放入60℃烘箱中干燥48小时,用精密天平测量烘干后的冰胶质量记为Mdry,做三组平行试验以测量标准差。
溶胀率Q按以下公式计算:
Figure GDA0003276936110000131
其中,Msw表示充分吸水后的冰胶质量,Mdry表示冰胶烘干后的质量。
表观孔隙率
具体地,将冰胶浸泡在双蒸水中24小时,让冰胶充分吸水溶胀,用精密天平测量此时的冰胶质量记为Msw,再将冰胶放入注射器中将多余水分挤出,用精密天平测量此时冰胶的质量记为Msq
表观孔隙率P按以下公式计算:
Figure GDA0003276936110000132
其中,Msw表示充分吸水后的冰胶质量(g),Msq表示将水分挤出的冰胶质量(g)。
作为吸附量A测量方法,具体地,每0.5mL清洗后冰胶加入2mLβM溶液(C0,1mg/mL),放入25℃摇床中100rpm震荡30min后,用BCA法测量溶液中剩余的β2M浓度(C1)。
A=2C0-2.5C1
C0为加入前β2M溶液的浓度(mg/mL),C1为吸附后溶液中的浓度(mg/mL)。
通过上述方法,测定实施例1~7的冰胶材料1~7的聚合效率。
图3示出了实施例1~7的不同组成的冰胶材料1~7的聚合效率以及目标抗原β2微球蛋白的吸附量的图。从结果显示,冰胶材料1~7的聚合效率都在50%至70%之间,体现了良好的效果。对β2微球蛋白的吸附量,各自差别较大。其中,以AAm为单体、PEGDA为交联剂的冰胶材料4的吸附量要优于以AAm为单体、mBAAm为交联剂的冰胶材料1~3,以HEMA为单体、mBAAm为交联剂的冰胶材料5的吸附能力优于冰胶材料1。此外,以HEMA为单体、PEGDA为交联剂的冰胶材料6和7虽然在吸附能力上与冰胶材料4相当,但是聚合效率只有不到50%,明显低于冰胶材料4。
进而,通过扫描电子显微镜观察(QUANTA450,美国FEI公司,放大100倍)上述实施例4制造的冰胶材料4,并利用傅里叶红外光谱仪(Nicolet iS5,美国ThermoFisherScientific制)测量上述实施例4制造的冰胶材料4的红外吸收。图4中a为实施例4中制造的冰胶材料4的扫描电镜图片,表明了冰胶材料内部孔隙率良好,孔之间连通性较好,b为实施例4中制造的冰胶材料4的红外吸收谱图。对比仅由AAm和PEGDA组成的冰胶材料(空白),冰胶材料4在1520cm-1处增加了一个吸收峰,此为苯环骨架特征峰,表明苯乙烯修饰的纳米抗体成功聚合在冰胶上。
进而,通过扫描电子显微镜观察(QUANTA450,美国FEI公司制,放大100倍)上述实施例8~12中制造的冰胶材料8~12,这些冰胶材料的扫描电镜图示于图5,从图5可知,这些不同单体浓度和交联剂浓度组成的冰胶都具有良好的孔隙率,孔径都在1-100μm之间,孔之间连通性较好,此外,交联剂浓度越低,孔径越大,孔壁越薄,可使聚合的纳米抗体能够更好地暴露于环境中从而发挥活性。
此外,通过上述方法测定实施例4、8~13的冰胶材料的溶胀率与表观孔隙率,图6示出了实施例4、8~13所制备的冰胶材料的溶胀率与表观孔隙率,从图6可知,不同浓度单体与交联剂所制备的冰胶材料都具有相似的溶胀率,几乎都在30至50倍之间,表明冰胶具有良好的吸水性。同时,它们也有着相似的表观孔隙率,都在80%以上,表明这些冰胶材料的内部具有大量的孔隙。此外,材料13的HEMA-mBBAm冰胶的溶胀率只有12倍左右,可能是因为HEMA的亲水性导致锁水能力较强,结合水较多。
此外,用实施例4、8~13的冰胶材料对β2微球蛋白进行吸附,将实施例中得到的冰胶用PBS清洗,将冰胶分成多组,每组中加入不同浓度的抗原,放入25℃摇床中混合,30min后取出测定上清液中抗原蛋白的浓度。将所得的数据拟合兰格缪尔方程可得到最大吸附容量。
用Langmuir等温线模型拟合实验值,模型如下:
Figure GDA0003276936110000141
其中,Qe(mg/mL gel)是平衡时的吸附量,Ce(mg/mL)为平衡时的浓度,Qm(mg/mLgel)是最大吸附容量,KD是冰胶对β2M吸附表现的亲和力。
图7示出了实施例4、8和13所制备的冰胶材料对β2微球蛋白的等温吸附曲线,其中,a表示实施例4、8和13的冰胶材料对β2微球蛋白的等温吸附曲线,b表示实施例9~12的冰胶材料对β2微球蛋白的等温吸附曲线。从图7可知,材料4、8、9、10、13对β2微球蛋白的吸附能够很好地拟合兰格缪尔等温吸附曲线,而材料11和12吸附能力较弱,不能拟合兰格缪尔等温吸附曲线。将图7的拟合结果汇总到下述表2当中,可知,冰胶材料4、8、9、10、13对β2微球蛋白的饱和吸附量都在2mg/mL gel以上,其中,冰胶材料8的吸附量最高达到3.42mg/mL,体现了较高的吸附容量。此外,各冰胶材料的亲和力都在0.09mg/mL以上,体现了这些冰胶材料对β2微球蛋白较强的吸附作用。
表2不同组成冰胶材料对β2M的等温吸附曲线拟合结果
Figure GDA0003276936110000151
进而,用实施例8的冰胶材料8对细胞破碎上清中β2微球蛋白进行吸附,具体地,以内径8mm的5mL注射器本体为模具制备冰胶材料,将注射器本体与蠕动泵和紫外检测器相连接,先用PBS冲洗,然后注入含有抗原蛋白的样品,收集流穿峰,随后用PBS冲洗,最后用pH1.5甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱结合在冰胶上的蛋白,收集洗脱峰,使用15%SDS-PAGE检测流穿和洗脱液中的目标蛋白。
图8示出了实施例8所制备的冰胶材料对细胞破碎上清中β2微球蛋白的吸附过程和结果,其中,a为对细胞破碎上清中β2微球蛋白的动态吸附示意图;b为色谱峰图,箭头表示上样;c为各个组分的电泳图箭头表示的为β2微球蛋白的条带。从图8可知,a为将冰胶材料8放入注射器中于蠕动泵和检测器相连接,以流动注入含有β2微球蛋白的复杂溶液实现动态捕获,具体复杂溶液为大肠杆菌破碎上清液;b为紫外检测器的实时信号图,检测信号为280nm吸收值,可以看出流穿蛋白峰值较高主要为大肠杆菌宿主蛋白,洗脱峰1较高,高于洗脱峰2;c为经过电泳检测流穿和洗脱溶液内的蛋白纯度,可以看出,经过冰胶材料8动态捕获β2微球蛋白后,流穿-1内的β2微球蛋白条带基本消失,体现了良好的吸附能力,同时,在洗脱-1内可见主要为β2微球蛋白的条带,纯度在80%以上,体现了冰胶良好的吸附特异性。以上体现了本发明的冰胶材料在亲和层析对目标蛋白进行分离纯化方面的应用。
进而,对实施例8的冰胶材料8进行保存稳定性测试,具体地,保存于0.02%叠氮化钠的PBS中,于4℃冰箱中放置。图9示出了实施例8所制备的冰胶材料的保存稳定性测试结果图,分别在第0天、第10天、第20天、第30天测定该冰胶材料对β2微球蛋白的吸附量,均稳定维持在约2.2(mg/ml冰胶)以上,表现出良好的保存稳定性。
此外,将比较例1的冰胶材料14用PBS缓冲液清洗,通过与上述同样的方法计算聚合效率。进而,加入人β2M,通过与上述同样的方法测定冰胶对人β2M的吸附量。结果可知,其聚合效率约为37.5%,远低于本发明的冰胶材料的50%~70%左右的聚合效率。此外,比较例1的冰胶材料对人β2M吸附量约为0.5mg/mL gel,低于本发明的冰胶材料约2mg/mL gel以上的吸附量。通过与上述同样的方法,得出比较例2(未添加“4-氨基苯乙烯”)的冰胶材料15的聚合效率为32.8%左右,对人β2M吸附量只有约0.1mg/mL gel,说明通过物理包埋作用对冰胶进行蛋白质功能化不仅效率较低,同时蛋白几乎损失全部的活性。
产业上的可利用性
通过本发明的蛋白质功能化冰胶材料的制备方法制备得到的冰胶材料,通过在蛋白质的固定位置连接有可聚合性基团,最大程度上保留了蛋白质原有的活性,该方法不会引入其它化学活性基团,不影响胶体本身的性质及其应用,并且所得冰胶材料具有优异的均一性。此外,本发明的制备方法只需要一步聚合,极大缩减了蛋白冰胶的制备流程,并且所得冰胶材料具有优异的均一性。本发明的蛋白质功能化冰胶材料可以在亲和层析等生物技术领域有广泛的应用。
序列表
<110> 大连理工大学
<120> 一种蛋白质功能化冰胶材料、其制备方法和用途
<141> 2019-10-16
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Ala Leu Thr Glu Leu Val Asp Leu Pro Gly Gly Ser Phe Arg Met Gly
1 5 10 15
Ser Thr Arg Phe Tyr Pro Glu Glu Ala Pro Ile His Thr Val Thr Val
20 25 30
Arg Ala Phe Ala Val Glu Arg His Pro Val Thr Asn Ala Gln Phe Ala
35 40 45
Glu Phe Val Ser Ala Thr Gly Tyr Val Thr Val Ala Glu Gln Pro Leu
50 55 60
Asp Pro Gly Leu Tyr Pro Gly Val Asp Ala Ala Asp Leu Cys Pro Gly
65 70 75 80
Ala Met Val Phe Cys Pro Thr Ala Gly Pro Val Asp Leu Arg Asp Trp
85 90 95
Arg Gln Trp Trp Asp Trp Val Pro Gly Ala Cys Trp Arg His Pro Phe
100 105 110
Gly Arg Asp Ser Asp Ile Ala Asp Arg Ala Gly His Pro Val Val Gln
115 120 125
Val Ala Tyr Pro Asp Ala Val Ala Tyr Ala Arg Trp Ala Gly Arg Arg
130 135 140
Leu Pro Thr Glu Ala Glu Trp Glu Tyr Ala Ala Arg Gly Gly Thr Thr
145 150 155 160
Ala Thr Tyr Ala Trp Gly Asp Gln Glu Lys Pro Gly Gly Met Leu Met
165 170 175
Ala Asn Thr Trp Gln Gly Arg Phe Pro Tyr Arg Asn Asp Gly Ala Leu
180 185 190
Gly Trp Val Gly Thr Ser Pro Val Gly Arg Phe Pro Ala Asn Gly Phe
195 200 205
Gly Leu Leu Asp Met Ile Gly Asn Val Trp Glu Trp Thr Thr Thr Glu
210 215 220
Phe Tyr Pro His His Arg Ile Asp Pro Pro Ser Thr Ala Cys Cys Ala
225 230 235 240
Pro Val Lys Leu Ala Thr Ala Ala Asp Pro Thr Ile Ser Gln Thr Leu
245 250 255
Lys Gly Gly Ser His Leu Cys Ala Pro Glu Tyr Cys His Arg Tyr Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Arg Ser Pro Gln Ser Gln Asp Thr Ala Thr Thr His Ile
275 280 285
Gly Phe Arg Cys Val Ala Asp Pro Val Ser Gly His His His His His
290 295 300
His
305
<210> 2
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Leu Asp Ser
20 25 30
Tyr Tyr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Ser Ile Arg Tyr Val Asp Ser
50 55 60
Val Lys Asp Arg Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu His Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Arg Arg Gly Arg Ile Pro Gly Leu Pro Cys Ser Leu Val
100 105 110
Arg Glu Arg Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro
130 135 140
Gln Pro Asp Pro Thr Thr Glu Gly Gly Gly Gly Ser His His His His
145 150 155 160
His His Gly Gly Gly Gly Ser Leu Cys Thr Pro Ser Arg
165 170

Claims (10)

1.一种蛋白质功能化冰胶材料的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(a)在蛋白质的非活性结构域连接可聚合性基团,得到经修饰的蛋白质;
(b)将该经修饰的蛋白质与可共聚单体和交联剂混合,并在低温下使其聚合得到聚合物;
(c)将所得聚合物放在室温下或对其真空干燥后得到蛋白质功能化冰胶材料,
所述非活性结构域是远离蛋白质活性位点的一端和/或与蛋白质的活性位点相对接近的部位。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述可聚合性基团选自烯属不饱和基团、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、N-烷氧基甲基氨基或者这些基团的衍生基团中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述烯属不饱和基团选自乙烯基、苯乙烯基、烯丙基、炔丙基、丁烯基、乙炔基、苯基乙炔基、马来酰亚胺基、纳迪克酰亚胺基、(甲基)丙烯酰基中的一种或多种。
4.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法,其特征在于,所述可共聚单体选自含羧基单体、(甲基)丙烯酸羟基酯、酸酐单体、含磺酸基单体、含磷酸基单体、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯腈、乙烯基吡咯烷酮中的一种或多种。
5.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法,其特征在于,所述交联剂选自二丙烯酸-1,4-丁二醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二缩水甘油酯、聚碳化二亚胺类交联剂和异氰酸酯类交联剂中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯和/或N,N-亚甲基双丙烯酰胺。
7.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法,其特征在于,所述单体与所述交联剂的质量浓度比范围为1:1~50:1。
8.一种通过上述权利要求1~7任一项所述的蛋白质功能化冰胶材料的制备方法得到的冰胶材料。
9.一种将上述权利要求1~8任一项所述的蛋白质功能化冰胶材料在亲和层析、病毒颗粒分离、细胞分离及组织工程中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于,所述病毒颗粒分离为慢病毒颗粒分离、腺病毒颗粒分离,所述细胞分离为B淋巴细胞分离、T淋巴细胞分离、巨噬细胞分离。
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