CN110693841A

CN110693841A - 一种具有抗氧化和抑菌作用的人参多糖的提取及其片剂的制备方法

Info

Publication number: CN110693841A
Application number: CN201910962408.XA
Authority: CN
Inventors: 周鸿立; 曹冬雪; 王泽宇; 汪笑笑; 李博; 李朔
Original assignee: Jilin Institute of Chemical Technology
Current assignee: Jilin Institute of Chemical Technology
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2020-01-17

Abstract

本发明公开一种微波辅助提取具有抗氧化活性人参多糖的制备方法，最优提取条件为提取功率550W，液料比30g/ml，提取时间6min，提取温度70℃，提取率为69.34%±0.07%；在相同条件下热水提取人参多糖提取率为43.67%±0.07%。对微波提取后人参粗多糖进行抗氧化研究，对羟基、ABTS和DPPH自由基的清除能力的IC₅₀分别为9.49、0.17、0.55mg/mL；人参多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短小芽孢杆菌和枯草杆菌微波提取的最低抑菌浓度MIC为0.25、0.025、0.01、0.5mg/mL，热水提取MIC为0.5、0.05、0.05、0.5mg/mL。结果得出微波辅助提取人参多糖具有较为显著的抗氧化和抑菌作用。经提取之后的人参多糖取0.10g加入0.04g淀粉、0.04g微晶纤维素等辅料混匀，制成200mg/片的片剂。

Description

一种具有抗氧化和抑菌作用的人参多糖的提取及其片剂的制备方法

技术领域

本发明涉及植物有效成分提取领域，具体涉及一种具有抗氧化活性和抑菌作用的人参多糖的提取及其片剂的制备方法。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)是五加科类植物，其根、根茎以及叶皆能入药。人参是我国著名的中草药材之一，也是东北三宝之首，在民间有“百草之王”的美誉，是“滋阴补生，扶正固本"之极品,其具有多种生理活性。2015版的中国药典收载的人参入药部位包括:根茎和人参叶。它的根和根茎具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智的功效。人参叶具有补气，益肺，祛暑，生津之功。

张波等人通过单因素实验和正交实验优化微波提取人参多糖的工艺，得到微波提取人参多糖的最佳工艺条件为:微波功率600W、微波提取时间6min、料液比1∶50。张艳荣等人在提取人参多糖的实验中，用超临界脱脂并脱皂苷后的人参渣为原料，用超临界辅助热水浸提法提取人参多糖,并在单因素的基础上采用正交试验确定提取人参多糖的最佳工艺条件。在此条件下人参多糖的提取率为

（38.03±1.43）%。

抗氧化能力的测定主要是通过对羟基自由基的清除、ABTS自由基的清除及DPPH自由基的清除等方法进行评测，对自由基清除能力越强，则表明抗氧化能力越强。万茜等通过测定人参花多糖清除羟基自由基活性、金属离子螯合能力以及铁离子还原能力等体外抗氧化参数，从而判断人参花多糖的体外抗氧化能力。

李珊珊等通过测定人参果多糖DPPH自由基活性和羟基自由基活性的数据，从而判断人参花多糖的体外抗氧化能力。

目前人参多糖的结构和药理活性越来越多的被人们重视起来,已有文献报道人参多糖结构特征复杂，生物活性多样，能增强机体的免疫功能,可作为辅助药剂预防和治疗肿瘤, 能明显抑制四氯化碳所致的肝损伤和降低血糖；同时还能够有效提高机体抗氧化酶类的含量，有助于提高机体防御自由基的能力，有助于清除自由基，增强机体抗氧化能力；并且还含有糖蛋白,在抗血栓、抗病毒、抗辐射等方面亦具有显著的药理作用。随着对多糖生物活性越来越深入的研究和了解,多糖逐渐成为当今新药开发的重要方向之一。严铭铭在人参蛋白及多肽药理活性实验中表明，人参蛋白GSPⅡ对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

本专利研究人参多糖，旨在为人参多糖的提取和生物活性开发与利用提供科学的理论基础。

发明内容

本专利采用微波提取法和热水提取法提取人参多糖，通过响应面实验设计优化提取工艺，以期提高人参多糖的提取率，抗氧化以及抑菌活性的测定。

一种如权利要求1所述采用响应面优化微波辅助提取多糖及其纯化工艺，其特征在于按如下步骤进行：

1. 提取

（1）称取5g干燥粉碎后的人参多糖粉末，提取条件为提取功率550W，液料比30g/ml，提取时间6min，提取温度70℃，采用苯酚-硫酸显色法对人参多糖的含量测定并计算人参总多糖的提取率，微波提取法提取率为69.34%±0.07%；在相同条件下热水提取人参多糖提取率为43.67%±0.07%。

抗氧化

（1）取不同浓度的人参多糖溶液以及不同VC水溶液进行清除DPPH自由基的抗氧化实验，计算清除率，结果得微波提取人参多糖、热水提取人参多糖以及VC的IC₅₀(半抑制浓度)依次是9.49±0.01 mg/mL，20.12±0.04 mg/mL、0.48±0.03mg/mL。

（2）取不同浓度的人参多糖溶液以及不同VC水溶液进行清除DPPH自由基的抗氧化实验，计算清除率，计算得热水、微波提取多糖及VC的IC₅₀(半抑制浓度)依次是0.5784±0.02mg/mL，0.1736±0.01 mg/mL，0.0009±0.01mg/mL。

（3）取不同浓度的人参多糖溶液以及不同VC水溶液进行清除DPPH自由基的抗氧化实验，计算清除率。计算热水、微波提取多糖及VC及提取多糖的IC₅₀依次是1.17±0.02mg/mL，0.55±0.01 mg/mL，0.0046±0.0001mg/mL。

结果证明：微波提取人参粗多糖的三种体系抗氧化能力大于热水提取的人参粗多糖，清除能力随着浓度的提高而增强。

抑菌活性

实验选取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短小芽孢杆菌和枯草杆菌进行抑菌活性实验。分别将热水、微波提取的人参多糖倍半稀释到0.78-200mg/mL范围内，将每个菌株的标准悬浮液加入到96孔板中的每个孔中，采用二甲基亚砜溶解沉淀物的最终浓度为20%（v/v)。实验平行操作三次，记录数据。用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短小芽孢杆菌和枯草杆菌对不同方法提取的人参多糖进行抑菌活性实验，微波提取最低抑菌浓度MIC分别为0.25、0.025、0.01、0.5mg/mL，热水提取MIC为0.5、0.05、0.05、0.5mg/mL。结果得出微波辅助提取人参多糖具有较为显著的抑菌作用。

片剂

制药规格200mg×1000片时处方，人参多糖0.10g，填充剂：0.04g的微晶纤维素，崩解剂:0.04g的淀粉，润滑剂：1g的硬脂酸镁，防腐剂：0.02g的β-环状糊精，粘合剂：0.24g羧甲基纤维素钠，湿润剂：适量的50%稀乙醇作溶剂，加入上述辅料混匀、干燥，压制成片。

附图说明

图1是提取时间与吸光度A关系；图2是液料比对人参总多糖提取率的影响；图3是温度对提取率的影响；图4是功率对提取率的影响；图5-10是四因素对提取率影响的响应面图；图11是热水提取、微波提取的人参粗多糖羟基自由基清除能力图；图12 是VC羟基自由基清除能力图；图13是热水提取、微波提取的人参粗多糖ABTS自由基清除能力；图14是VC的ABTS自由基清除能力；图15是热水提取、微波提取的人参粗多糖DPPH自由基清除能力；图16是VC的DPPH自由基清除能力。

具体实施方式

以下结合图表和具体实施操作对本发明作具体的介绍。

实施方案一葡萄糖标准曲线的绘制

应用硫酸-苯酚法来测定葡萄糖的标准曲线。以葡萄糖标准溶液的浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。绘制标准曲线方程为y =7.09x-0.0602，R²= 0.9996，在20-120μg/mL之间成良好线性关系

测定人参粗多糖含量（mg/mL）。

式中：C：多糖浓度（mg/mL）；V：稀释倍数（mL）；M：人参粉末的质量（g）；M：人参粗多糖质量（g）。

根据公式计算出人参多糖提取率。

实施方案二人参多糖提取工艺的优化

为了找寻微波提取人参多糖的最佳工艺条件，需要对影响提取的四个因素进行考察分析，为后续用响应面法模拟工艺条件打好基础。下面分别研究微波提取时间、液料比、提取温度和提取功率对人参多糖提取率的影响。

（1）提取时间对人参多糖提取率的影响

准确称取人参粉末5g，固定提取温度70℃，液料比为30 g/ml，提取功率550W不变，考察提取时间在2min，4min，6min，8min，10min条件下人参总多糖提取率。使用微波进行提取，提取后的人参提取液使用布氏漏斗抽滤。,测量提取液的体积，计算人参多糖提取率，见图1。

由图1看出。随着提取时间的增加，人参多糖的提取率也增加提取时间为6min的时候达到最大，之后随着时间的推移，提取率减小。可以看出在6min时，提取率达到一个饱和值，再延长提取时间可能会对多糖造成破坏，因此曲线趋势向下，提取率降低。

（2）液料比对人参总多糖提取率的影响

取人参粉末5g，固定提取温度60℃，提取时间6 min，微波提取功率550W，改变固液比进行单因素实验，选取5组液料比，分别为10 mL/g、20 mL/g、30 mL/g、40、50 mL/g，其它步骤同上。

如图2所示不同的液料比对人参总多糖的提取率影响的数据。随着提取时间的延长，人参总多糖的提取率不断增加，液料比达到30 g/mL的时候达到最大，这是因为液料比增加意味着浓度变大，使得微波提取更高效，然而，液料比增加到一定程度，水和人参多糖接触面积变小，反而不易于增加提取率，同时水对多糖的溶解度也会达到上限，因此液料比会有一个最佳点。

（3）提取温度对人参总多糖提取率的影响

固定提取时间6 min，液料比30 mL/g，微波提取功率550W，改变提取温度进行单因素实验，选取5组提取温度作为实验变量，分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下提取，其它步骤同上。

由图3可知随着温度的上升，多糖吸光度A 增加，因此人参总多糖提取率同比增大，当温度达到70℃时，提取率达到最大，超过70℃时，提取率开始下降，这是由于温度过低导致人参多糖提取不完全，温度过高会使多糖结构发生破坏，影响人参总多糖的提取率。

（4）提取功率对人参总多糖提取率的影响

固定提取温度70℃，提取时间使用6 min，液料比30 mL/g，改变微波提取功率进行单因素实验，选取5组提取功率作为实验变量，分别为400W、450W、500W、550W、600W下提取，其它步骤同上。

由4图可知，随着提取功率的上升，多糖吸光度A 增加，因此人参总多糖提取率同比增大，当功率达到550W时，提取率达到最大，超过550W时，提取率开始下降，这是由于在低功率时，升高功率有助于充分提取，但功率过高会使多糖结构发生破坏，反而影响人参总多糖的提取率。

实施方案三人参多糖提取工艺响应面实验

以提取功率（A）、液料比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）四个因素为自变量，人参总多糖提取率为响应值，采用统计分析软件Design-Expert V 8.0.6.1TriaL进行Box-Behnken中心组合试验设计，建立四因素三水平29组实验的响应面分析试验。

由表3中所展示的方差得分析结果进行进一步分析，实验过程中的各个因素

与响应目标值之间存在的复杂的交互影响关系。本专利从整体模型可以看出,B²，C²及D²极其显著，一次项因子中B显著，交互项中AB、CD交互影响比较显著，而其它项不显著。通过p值比较发现单因素对模型的影响顺序为液料比>提取功率>提取时间>提取温度。根据模型的确定系数R²=0.9173可知，模型的可靠性较好。由该使用模型的失拟项p=0.4993>0.05可已看出，表该模型的失拟检验是极其不显著的，这个实验结果充分是说明了该实验结果和与之相对应的多项式进行拟合推测出来的理论数值之间有可以表现出极强的相关性。该模型预测在参数允许的范围内是可靠和可重复的。方差分析的结果表明，模型的精密度10.447>4，这意味着该模型公式在提取功率、液料比、提取温度及提取时间的任何组合之后都能够进行预测。从实验室数据来看，该模型适用于人参总多糖的提取结果的分析和预测。响应面如图5-10所示。

响应面最优提取工艺为提取功率550W、液料比为30 g/mL、提取时间6 min、提取温度70 ℃，在最优条件下，微波提取人参多糖提取率为69.34%，与微波条件相同的条件下测得热水提取的人参多糖提取率为43.67%，由此可见微波提取人参多糖更加高效。

实施方案四人参粗多糖抗氧化研究

1. 清除羟基自由基法测定人参多糖抗氧化活性

先于10 mL试管中取1 mL 0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液，再加入2 mL pH为7.40的PBS溶液和1 mL蒸馏水，震荡混匀后加1 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁，再震荡混匀，最后加质量分数为0.12%的H₂O₂溶液1 mL，在40 ℃水浴条件下加热30 min，在511 nm处测定其吸光度值为Ap。

在上述方法中，用蒸馏水来代替H₂O₂溶液，其他操作均正常进行，测定的吸光度值记为Ab；取0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL不同质量浓度的人参多糖溶液代替蒸馏水1 mL，测定其吸光度As值。并用同浓度梯度的VC代替人参多糖溶液作阳性对照。计算样品对羟自由基的清除率。如图11-12。

2. 清除ABTS自由基法测定人参多糖抗氧化活性

取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88μl 140 mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温条件下放置过夜12~16 h，制成ABTS自由基储备液，在用1:70比例的蒸馏水稀释，成为ABTS自由基工作液，使之在室温条件下，于734 nm波长处测得的吸光度值为0.7±0.02。

精密移取0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，1.0 mg/mL不同质量浓度的自提样液2.0 mL于试管中，分别加入ABTS和测定液2.0 mL。准确震荡10 s，静置6 min后，于734 nm处测得吸光度Ai。同时移取蒸馏水2.0 mL和ABTS 2.0 mL于试管中，按同样方法处理，测得A₀。重复三次，并用同浓度梯度的VC代替人参多糖溶液作阳性对照计算清除率。如图13-14。

3. 清除DPPH自由基法测定人参多糖抗氧化活性

取人参多糖样品溶液2.0 mL，加入2.0 mL浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液（用无水乙醇配制）混合，在室温黑暗中条件下反应30 min，于517 nm下测定吸光度值，记为Ai；并以2.0mL无水乙醇和2.0 mL蒸馏水混合液作为空白组调零，以2.0 mL样品溶液加上2.0 mL无水乙醇作为空白对照组，其在517 nm处的测得的吸光度值为Aj，空白对照组的存在是为了去除多糖样品本身存在的吸光度；2.0 mL DPPH溶液加上2.0 mL无水乙醇作为模型对照组，在517 nm处测得的吸光度值记为A0。并用0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL的VC代替人参多糖溶液作阳性对照。根据如下公式计算样品对DPPH自由基清除率：如图15-16。

实验方案五抑菌活性

实验选取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短小芽孢杆菌和枯草杆菌进行抑菌活性实验。分别将热水、微波提取的人参多糖倍半稀释到0.78-200mg/mL范围内，将每个菌株的标准悬浮液加入到96孔板中的每个孔中，采用二甲基亚砜溶解沉淀物的最终浓度为20%（v/v)。实验平行操作三次，记录数据。

从表4可以看出人参多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短小芽孢杆菌和枯草杆菌均有较强的抑制作用，尤其对大肠杆菌。热水提取的人参多糖MIC高于微波提取的人参多糖，因此微波提取的人参多糖抑菌活性强于热水提取的人参多糖。

实验方案六制片

本专利进行单因素实验，利用响应面法对提取工艺进行优化，最佳提取工艺条件：提取功率550W，液料比30mL/g，提取时间6min，提取温度70℃，人参多糖的提取率为69.34%±0.07%，在相同条件下热水回流提取人参多糖提取率为43.67%±0.07%。

通过清除羟基、ABTS和DPPH自由基实验比较热水回流和微波提取人参多糖的抗氧化活性。实验结果显示，在三个体外抗氧化实验中，微波提取的人参多糖抗氧化活性均比热水回流提取的人参多糖高。

人参多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短小芽孢杆菌和枯草杆菌均有较强的抑制作用，尤其对大肠杆菌。微波提取的人参多糖MIC高于热水提取的人参多糖，微波提取的人参多糖抑菌活性强于热水提取的人参多糖。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明的构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.本发明是一种通过单因素实验筛选、响应面优化微波辅助提取人参多糖的方法，微波提取法最优提取工艺条件为提取功率550W，液料比30g/ml，提取时间6min，提取温度70℃，提取率为69.34%±0.07%；对提取后人参羟基、ABTS和DPPH自由基的清除能力的IC₅₀分别为9.49、0.17、0.55mg/mL，具有较为显著的抗氧化能力；用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短小芽孢杆菌和枯草杆菌对不同方法提取的人参多糖进行抑菌活性实验，微波提取最低抑菌浓度MIC分别为0.25、0.025、0.01、0.5mg/mL，热水提取MIC为0.5、0.05、0.05、0.5mg/mL；结果得出微波辅助提取人参多糖具有较为显著的抗氧化和抑菌作用，经提取之后的人参多糖取0.10g加入0.04g淀粉、0.04g微晶纤维素等辅料混匀，制成200mg/片的片剂。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于液料比为30g/ml。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于提取温度为70℃。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于微波提取功率为550W。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于提取时间为6min。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于人参多糖，并对其抗氧化活性进行研究，热水提取人参总多糖对羟基、ABTS和DPPH自由基的清除能力的IC₅₀分别为20.116、0.5784、1.17mg/mL；微波提取人参总多糖对羟基、ABTS和DPPH自由基的清除能力的IC₅₀分别为9.493、0.1736、0.55mg/mL；结果显示人参多糖两种提取方法对羟基、ABTS和DPPH自由基均有抗氧化能力，但是微波提取的人参多糖抗氧化能力比热水提取的更好。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、短小芽孢杆菌和枯草杆菌对不同方法提取的人参多糖进行抑菌活性实验，微波提取最低抑菌浓度MIC分别为0.25、0.025、0.01、0.5mg/mL；热水提取MIC分别为0.5、0.05、0.05、0.5mg/mL，结果显示人参多糖对四种菌均有抑菌作用，微波提取的人参多糖抑菌效果比热水提取的人参多糖更好。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于经提取之后的人参多糖取0.10g加入0.04g淀粉、0.04g微晶纤维素等辅料混匀，制成200mg/片的片剂。