CN110687304A - 检测ezh2的r342位点非对称性二甲基化修饰的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，该抗体为多克隆抗体，抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述抗体的制备方法：采用多肽合成技术，合成SEQ ID No.1所示抗体的多肽，然后与血蓝蛋白KLH交联，得到抗原；将抗原与完全佐剂或者不完全佐剂混合后注入动物体内免疫8次，取动物全血，进行纯化，即得。本发明人研究发现，EZH2的R342位能够被PRMT1进行非对称性二甲基化修饰，并能显著增强EZH2的蛋白稳定性，本发明提供的抗体能有效的特异性识别EZH2中R342位的非对称性二甲基化修饰情况，对于今后研究EZH2蛋白翻译后修饰的调控，有至关重要的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，属于生物技术领域。
背景技术
EZH2(Enhancer ofZeste Homolog 2)是一个重要的组蛋白甲基转移酶，能够催化其靶基因的组蛋白H3第27位赖氨酸发生三甲基化修饰(H3K27me3)。人源EZH2是一个包含有20个外显子长约40kb的基因。EZH2基因编码产生一个约100KD大小的蛋白，包含746个氨基酸残基，在人和小鼠等多个物种间序列保守性很强。随着研究的深入，越来越多的研究报道发现EZH2蛋白的翻译后修饰(Post-Translational Modification，PTM)对其多种生物学功能的发挥起着重要作用。目前已知的EZH2翻译后修饰主要集中在EZH2蛋白的磷酸化、乙酰化、糖基化和泛素化修饰，EZH2的甲基化修饰研究很少。
精氨酸甲基转移酶(Protein Arginine Methyltransferases,PRMTs)是一类能够对组蛋白和非组蛋白精氨酸残基进行甲基化修饰的酶。精氨酸甲基转移酶PRMTs(ProteinArginine Methyltransferases,PRMTs)能够催化来自S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基团转移到精氨酸胍基的氮原子上，可以形成三种类型的精氨酸甲基化修饰：单甲基化(MMA)、非对称性二甲基化(ADMA)和对称性二甲基化(SDMA)。蛋白的精氨酸非对称性二甲基化修饰是一种非常重要的翻译后修饰类型，在细胞核和细胞质中均发现许多受精氨酸非对称性二甲基化修饰的蛋白。例如，PRMT1介导Twist的34位精氨酸发生非对称性二甲基化修饰，可抑制E-cadherin表达，促进肺癌细胞的转移；PRMT1催化C/EBPα的35、156和165位精氨酸发生非对称性二甲基化修饰，可促进cyclin D1表达，促进乳腺癌肿瘤形成，等等。
EZH2是否能够发生精氨酸非对称性二甲基化修饰，迄今为止还没有相关的任何研究报道，也没有检测EZH2非对称性二甲基化修饰的抗体报道。本发明人研究发现精氨酸甲基转移酶1(Protein Arginine Methyltransferases 1，PRMT1)能够催化EZH2的R342精氨酸发生非对称性二甲基化修饰，并且修饰后能够增强EZH2蛋白稳定性，从而导致EZH2在癌细胞中高表达，因此迫切需要一种用于检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，来检测EZH2的R342位点的非对称性二甲基化修饰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，可以实现对EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的快速特异性检测。
本发明的另一目的在于提供上述抗体的制备方法。
技术方案
PRMT1是PRMTs家族中酶活性最高的精氨酸甲基转移酶，也是最主要的I类PRMT酶，细胞内85％的精氨酸非对称性二甲基化修饰都是由PRMT1介导产生的。发明人发现PRMT1能够对EZH2的R342位点进行非对称性二甲基化修饰。本发明人运用纯化的GST-EZH2和GST-PRMT1蛋白，通过体外3H-SAM放射自显影实验，检测发现EZH2能够被PRMT1进行直接的甲基化修饰，并进一步通过质谱检测分析发现：EZH2-R342能够进行非对称性二甲基化修饰。
一种检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1(TAERIKTPPKRPGGC)所示。
进一步，所述抗体为多克隆抗体。
上述抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用多肽合成技术，合成氨基酸序列如SEQ ID No.1所示抗体的多肽，然后与血蓝蛋白KLH交联，得到抗原；
(2)将抗原与完全佐剂(CFA)或者不完全佐剂(IFA)混合后注入动物体内进行免疫，免疫8次后，取动物全血，进行纯化，得到抗体。
进一步，步骤(2)中，抗原与完全佐剂(CFA)或者不完全佐剂(IFA)的体积比为1:1。
进一步，步骤(2)中，所述动物为新西兰大白兔，所述免疫的方法：对新西兰大白兔进行阴性血采集及第一次免疫(0天)；第二周进行第二次免疫；第四周进行第三次免疫；第五周进行第四次免疫；第六周进行第五次免疫；第七周进行第六次免疫；第八周进行第七次免疫；第九周进行第八次免疫；最后在第十周取动物全血；第一次和第二次免疫，抗原的体积为0.5mL，抗原的质量为0.25mg；第三次到第八次免疫，抗原的体积为0.3mL,抗原的质量为0.15mg。
进一步，步骤(2)中，所述纯化的方法，包括如下步骤：
1)取抗原亲和层析柱，用缓冲液TE buffer平衡柱床；
2)将需纯化抗体按1-2ml/min的速度上样于相应的层析柱，反复上样4-5遍使能与多肽发生特异性结合的抗体吸附在柱床上；
3)上样完毕，用缓冲液TE buffer平衡柱床；
4)用洗脱液glycine buffer以1-2ml/min的速度洗脱结合在柱床上的抗体；
5)样品收集完毕，用缓冲液TE buffer平衡柱床；
6)用洗脱液glycine buffer清洗柱床；
7)再次用TE buffer平衡柱床，置于4℃保存；
8)将洗脱得到的抗体用PBS buffer透析48h后，即得纯化后的抗体。
本发明的有益效果：本发明人经实验证实，EZH2的R342位能够被PRMT1进行非对称性二甲基化修饰，并能显著增强EZH2的蛋白稳定性，这对于全面了解EZH2的翻译后修饰网络具有重要意义。本发明提供的抗体(meR342-EZH2抗体)能有效的特异性识别EZH2中R342位的非对称性二甲基化修饰情况，对于今后研究EZH2蛋白翻译后修饰的调控，有至关重要的作用。
附图说明
图1为GST pull down实验的结果；
图2为GST-PRMT1分别和GST-EZH2(1-522AA)和GST-EZH2(523-746AA)反应后的体外甲基化检测结果；
图3为Flag-EZH2-WT过表达的HEK293T细胞和Flag-EZH2-R342K过表达的HEK293T细胞分别用MG132处理后的EZH2蛋白的表达量变化的Western Blot检测结果；
图4为Flag-EZH2-WT过表达的HEK293T细胞和Flag-EZH2-R342K过表达的HEK293T细胞分别用CHX处理后的EZH2蛋白半衰期变化的Western Blot检测结果；
图5为meR342-EZH2抗体的Dot-Blot检测结果；
图6为meR342-EZH2抗体识别Flag-EZH2-WT和Flag-EZH2-R342K蛋白中meR342-EZH2甲基化的Western Blot检测结果；
图7为meR342-EZH2抗体识别EZH2-R342位点非对称性二甲基化修饰的免疫组化检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中，所用的材料的来源如下：
用到的质粒：
pGEX-4T-1载体的GST、GST-PRMT1、GST-EZH2(1-522AA)、GST-EZH2(523-746AA)和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体的Vector对照、3xFlag-EZH2-WT和3xFlag-EZH2-R342K质粒均来自于徐州医科大学。
用到的抗体：
一抗：anti-Flag M2 affinity gel来自Bimake公司(货号#B23101)；鼠源Flag和GST标签抗体来自SUNGENE BIOTECH公司(货号#KM8004和#KM8005)；鼠源EZH2抗体来自CST公司(货号#3147)；鼠源GAPDH抗体来自Proteintech公司(货号#60004-1)，兔源Ubiquitin抗体来自CST公司(货号#3933)；鼠源IgG抗体来自CST公司(货号#5415)。
二抗：辣根过氧化物酶偶联的山羊抗鼠IgG二抗和山羊抗兔IgG二抗购买自北京中杉金桥生物技术有限公司(货号#ZB-2305和#ZB-2301)。
用到的细胞及培养基：
HEK293T细胞，从ATCC(美国模式培养物集存库)购买(货号为#CRL1573)；胎牛血清从北京全式金生物技术有限公司购买(货号#FS201-02)；细胞培养所用的细胞培养基均来自Sigma公司(货号DMEM培养基#D7777)。
用到的组织样本：
所使用的乳腺癌患者临床组织样本，来自徐州医科大学附属医院；小鼠乳腺癌肺组织转移组织样本，来自于徐州医科大学。
其它试剂耗材：
CHX(Cycloheximide)购自Sigma公司(货号#C7698)；MG132购自Sigma公司(货号#S2619)，同位素标记的3H-SAM(S-腺苷甲硫氨酸)购自Perkin-Elmer。
其它材料如无特殊说明，均可从商业途径得到，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1 PRMT1介导EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰
1.PRMT1和EZH2结合检测：通过构建的原核表达GST-PRMT1质粒，转化到BL21细菌中原核表达GST-PRMT1，超声破碎并运用GST-Beads富集蛋白，和MDA-MB-231乳腺癌细胞裂解液进行孵育，进行GST pull down实验，用anti-EZH2抗体，进行Western Blot检测EZH2信号，从而检测GST-PRMT1和EZH2结合情况。
具体操作如下：
GST标签蛋白(GST-EZH2和GST-PRMT1)纯化：
1)活化菌种，取50μl菌液加入到3ml LB培养基中，37℃200rpm摇过夜。
2)菌液转接：将上述菌液转接到100ml LB培养基中，37℃170rpm培养1-2h，测OD600在0.5左右，加入IPTG诱导蛋白表达。
3)收集菌液，10000rpm离心5min，PBS洗两次，每管加入10ml GST裂解液重悬，转移到1.5ml dorf管中，冰上放置30min，超声：超3s停5s超15次，功率200W。
4)12000rpm离心10min，收集上清，加入GST珠子100μl/10ml，珠子事先用预冷PBS洗2次。
5)4℃缓慢摇过夜，4℃2000rpm离心2min，用10ml GST裂解液洗3次，5min/次。
6)将珠子转至1.5ml dorf管，加入1倍柱体积谷胱甘肽洗脱液，室温轻轻摇晃10min，4℃500g离心3min，上清转移至新管中，重复2次，合并洗脱液，标定蛋白浓度，跑SDS-PAGE胶验证蛋白纯化效果。
该部分所用试剂配方如下：
①GST裂解液配方：
50mM Tris PH8.0，2mM EDTA，100mM NaCl，100μg/ml溶菌酶，0.1％Triton X-100，0.1％NP-40。
②谷胱甘肽洗脱液配方：
10mM还原型谷胱甘肽，50mM Tris PH8.0，调PH8.0。
GST pull down实验：
1)用RIPA细胞裂解液充分裂解MDA-MB-231细胞中的蛋白，得到MDA-MB-231细胞裂解液，取5μg纯化的GST-PRMT1蛋白与MDA-MB-231细胞裂解液在4℃环境中孵育过夜。
2)加入20μl GST珠子，继续在4℃孵育2h。
3)1000rpm离心2min，弃上清，washing buffer洗5次，5min/次。
4)1000rpm离心2min，弃上清完全，加入50μl 2xloading buffer金属浴10min，后续再通过SDS-PAGE蛋白胶进行电泳(结果见图1A)，用anti-EZH2抗体，进行Western Blot，检测GST-PRMT1和EZH2结合情况，结果见图1B。
该部分试剂配方如下：
①bindingbuffer配方：
75mM NaCl，50mM HEPES(PH7.9)。
②washing buffer配方：
142.5mM NaCl，10mM HEPES(PH7.9)，5mM MgCl2，1mM EDTA，2.5mg/ml BSA。
图1为GST pull down实验的结果，其中图1A为GST蛋白与GST-PRMT1蛋白的SDS-PAGE电泳图，可以看出，GST蛋白与GST-PRMT1蛋白在实验中存在；图1B为GST-PRMT1和EZH2结合情况的Western Blot检测结果，可以看出，只有GST-PRMT1组和EZH2能够结合，这说明PRMT1能够和EZH2直接结合。
2.PRMT1甲基化EZH2的检测：通过构建的原核表达GST-EZH2分段质粒，即GST-EZH2(1-522AA)和GST-EZH2(523-746AA)质粒，转化到BL21细菌中原核表达GST-EZH2蛋白，超声破碎并运用GST-Beads富集蛋白。通过3H同位素标记的S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)，把GST-PRMT1分别和GST-EZH2(1-522AA)和GST-EZH2(523-746AA)孵育反应，进行体外甲基化3H同位素标记放射自显影实验，最后通过体外甲基化放射自显影实验，检测PRMT1对EZH2蛋白的甲基化情况，并通过质谱鉴定甲基化位点。
体外甲基化3H同位素标记放射自显影实验步骤如下：
1)将混好的反应体系(酶(GST-PRMT1)5μg，底物(GST-EZH2蛋白)5μg，10x甲基化反应缓冲液3μL，20μM 3H-SAM 1.5μL，蒸馏水补至30μL)，离心，30℃水浴孵育1小时，然后加入5xloading buffer，金属浴8分钟。
2)后续实验步骤和Western blot一样，进行SDS-PAGE跑蛋白胶，80V跑浓缩胶，120V跑分离胶。
3)待分离胶跑到合适的程度，关闭电泳电源，用新配置的考马斯亮蓝染胶2分钟。
4)加入事先配好的脱色液，水平摇床洗脱3次，时间依次5分钟、5分钟、10分钟。
5)脱色完毕，会在相应的位置看到条带，加入Enhancer溶液，目的是使条带更清晰，水平摇床缓慢转动，孵育30分钟。
6)剪好一小块保鲜膜，小心将胶块放于保鲜膜上，上层在盖上一张干净的圆滤纸，最后在盖上厚滤纸，依次摆放好后用蒸馏水将滤纸浸湿。
7)干胶：打开干胶仪，将6)处理好的胶放到干胶仪中，干胶2-3小时。
8)压片：于暗室中，用医用放射胶片压片子，-80℃放置四周。
9)曝光显影：四周后进行曝光显影，提前配制好显影液和定影液，看是否有信号出现，如果有信号，说明有甲基化产生。结果见图2。
图2为GST-PRMT1分别和GST-EZH2(1-522AA)和GST-EZH2(523-746AA)反应后的体外甲基化检测结果，其中，图2C是GST-PRMT1甲基转移酶和GST、GST-EZH2(1-522AA)分段蛋白和GST-EZH2(522-746AA)分段蛋白反应后的SDS-PAGE电泳图，图2D是GST-PRMT1甲基转移酶和GST、GST-EZH2(1-522AA)分段蛋白和GST-EZH2(522-746AA)分段蛋白反应后的SDS-PAGE电泳的放射自显影照片，可以看出，只有GST-PRMT1和GST-EZH2(1-522AA)分段蛋白组有信号，说明PRMT1能够使EZH2(1-522AA)区段蛋白发生甲基化修饰。
体外甲基化放射自显影实验：
体外甲基化实验体系，用20μM SAM代替20μM 3H-SAM，其他反应所用试剂和甲基化反应体系均同上述体外甲基化3H同位素标记放射自显影实验。体外GST-PRMT1和GST-EZH2(1-522AA)分段蛋白反应后，进行甲基化修饰质谱检测，发现EZH2的R342位精氨酸发生了二甲基化修饰，这说明PRMT1介导EZH2蛋白R342位点发生非对称性二甲基化修饰。
实施例2EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰增强EZH2蛋白稳定性
实验方法：在HEK293T细胞中分别过表达EZH2野生型(Flag-EZH2-WT)和R342位点突变型(Flag-EZH2-R342K)质粒，再通过MG132(蛋白酶体降解的抑制剂)处理，通过WesternBlot检测EZH2变化。
在HEK293T细胞中分别过表达EZH2野生型(Flag-EZH2-WT)和R342位点突变型(Flag-EZH2-R342K)质粒的具体方法如下：
⑴提前24h将HEK293T细胞铺板，使转染前细胞密度达到40％左右。
⑵转染前换成无双抗的DMEM无血清培养基，质粒和转染试剂按照Vector/Flag-EZH2-WT/Flag-EZH2-R342K质粒(ug)：PEI(ul)＝8：3，根据培养细胞多少计算转染质粒的量，一般6cm板转染4μg质粒，10cm板12ug。
⑶在1.5ml dorf管中加入无双抗DMEM无血清培养基，加入质粒和PEI后，轻轻吹混匀，室温静置15min。
⑷将混合物均匀加入到细胞板中，再轻轻摇晃细胞培养皿混匀，37℃培养箱培养6h后，将培养基吸弃，换成新鲜的DMEM完全培养基。
⑸提取RNA和收蛋白，分别进行Western blot检测转染后Flag-EZH2-WT/Flag-EZH2-R342K在HEK293T细胞中过表达情况。
通过上述方法得到Flag-EZH2-WT过表达的HEK293T细胞和Flag-EZH2-R342K过表达的HEK293T细胞后，分别用MG132(蛋白酶体降解的抑制剂)处理2小时，然后Western Blot检测EZH2蛋白的表达量变化，结果见图3，可以看出Flag-EZH2-R342K在MG132处理后，EZH2蛋白的表达量明显增多。将Flag-EZH2-WT过表达的HEK293T细胞和Flag-EZH2-R342K过表达的HEK293T细胞，采用CHX(抑制蛋白合成的抑制剂)处理后，通过Western blot来检测EZH2蛋白半衰期变化，结果见图4，可以看出，与Flag-EZH2-WT相比较，Flag-EZH2-R342K的蛋白半衰期明显缩短。由图3和图4可以得出，EZH2-R342K突变后，EZH2蛋白稳定性明显降低，这说明EZH2的R342甲基化修饰对其蛋白稳定性维持有重要作用。
实施例3抗体的制备
用于检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体(meR342-EZH2抗体)的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用多肽合成技术，合成氨基酸序列如SEQ ID No.1所示抗体的多肽，使多肽纯度在85％以上，然后与血蓝蛋白KLH交联，得到抗原；
(2)将抗原与完全佐剂(CFA)或者不完全佐剂(IFA)等体积混合后注入动物体内，免疫8次，取动物全血，进行纯化后，得到meR342-EZH2抗体。
步骤(2)中，所述动物为新西兰大白兔，取两只从维通利华公司购买来的成年雄性新西兰大白兔(编号分别为RB11081和RB11082)，分别按如下方法进行免疫，所述免疫的方法：对新西兰大白兔进行阴性血采集及第一次免疫(0天)，将0.5mL,0.25mg多肽抗原与CFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第二周进行第二次免疫，将0.5mL,0.25mg多肽抗原与CFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第四周进行第三次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第五周进行第四次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第六周进行第五次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第七周进行第六次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第八周进行第七次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；第九周进行第八次免疫，将0.5mL,0.15mg多肽抗原与IFA等体积混合乳化后，注射入兔子体内(1ml/只)；最后在第十周取动物全血。
步骤(2)中，纯化方法为：
1)取抗原亲和层析柱，用缓冲液TE buffer平衡柱床；
2)将需纯化抗体按1-2ml/min的速度上样于相应的层析柱，反复上样4-5遍使能与多肽发生特异性结合的抗体吸附在柱床上；
3)上样完毕，用缓冲液TE buffer平衡柱床；
4)用洗脱液glycine buffer以1-2ml/min的速度洗脱结合在柱床上的抗体；
5)样品收集完毕，用缓冲液TE buffer平衡柱床；
6)用洗脱液glycine buffer清洗柱床；
7)再次用TE buffer平衡柱床，置于4℃保存；
8)将洗脱得到的抗体用PBS buffer透析48h后，即得纯化后的抗体。
本实施例中，免疫编号为RB11081的兔子产生的meR342-EZH2抗体记为RB11081(Me-Ab)，免疫编号为RB11082的兔子产生的meR342-EZH2抗体记为RB11082(Me-Ab)。同时，采用EZH2-R342位点没有甲基化修饰的肽段免疫编号为RB11081和RB11082的兔子，得到对照抗体RB11081(NMe-Ab)和RB11082(NMe-Ab)。
实施例4抗体的亲和力效价检测
实验方法：
采用ELISA实验验证meR342-EZH2抗体的效价。实验步骤如下：
(1)设置实验对照：取出96孔板，设置三个实验对照分别是空白对照孔，阴性对照孔，阳性对照孔。空白对照孔不加入任何实验试剂，只加入底物溶液和H2SO4溶液。阴性对照孔不加入待测样品。
(2)包被：每孔加入100ng抗原溶液，同时加入100μL包被液，放入4℃培养箱中包被过夜。
(3)洗涤：取出孔板，丢弃液体，加入300μL的0.02％的PBST，放入水平摇床，清洗5分钟，重复3次。
(4)封闭：取出平板，去除剩余液体加入300μL0.1％BSA溶液，放置37℃垂直摇床中孵育90分钟。
(5)一抗孵育：加入100μL倍比稀释的抗体溶液/血清，放置37℃垂直摇床中孵育60分钟。
(6)洗涤：去掉一抗液体加入0.02％的PBST，清洗3次，5分钟一次。
(7)酶标二抗：加入100μLHRP标记的兔二抗,放置37℃垂直摇床中孵育60分钟。
(8)洗涤：去掉一抗液体加入0.02％的PBST，清洗3次，每次5分钟。
(9)显色：向各孔中加入100μLTMB显色底物，放入37℃摄氏度培养箱中避光显色10分钟。
(10)终止：加入50μL2M的H2SO4溶液，终止反应5分钟，随后放入酶标仪中检测OD450值，结果见表1。
表1
表1中，RB11081(Me-Ab)表示免疫编号为RB11081的兔子产生的meR342-EZH2抗体；RB11082(Me-Ab)表示免疫编号为RB11082的兔子产生的meR342-EZH2抗体；RB11081(NMe-Ab)表示采用EZH2-R342位点没有甲基化修饰的肽段免疫编号为RB11081的兔子产生的抗体；RB11082(NMe-Ab)表示采用EZH2-R342位点没有甲基化修饰的肽段免疫编号为RB11081的兔子产生的抗体，由表1可以看出，免疫兔子产生的EZH2-R342甲基化抗体(NMe-Ab)和EZH2-R342非甲基化抗体(NMe-Ab)的抗原亲和力都是很强的。
实施例4抗体的特异性检测
1.实验方法：将免疫编号RB11081的大白兔和编号RB11082的大白兔中得到的meR342-EZH2抗体(即实施例3中的RB11081(Me-Ab)和RB11082(Me-Ab))和R342-EZH2非甲基化抗体(即实施例3中的RB11081(NMe-Ab)和RB11082(NMe-Ab))，分别和非甲基化肽段NMe-Pep(673361)以及甲基化肽段Me-Pep(673365)孵育，通过Dot Blot检测meR342-EZH2抗体特异性，Dot-Blot实验的具体步骤如下：
(1)点样：取硝酸纤维素膜1张，将目的抗原及实验对照倍比稀释点在膜上，风干。
(2)封闭：将风干的膜置于5％BSA封闭液中，放置于垂直摇床室温封闭1小时。
(3)一抗孵育：弃掉封闭液，将膜取出放入纯化之后用5％BSA稀释好的抗体溶液中，放置于垂直摇床室温孵育1小时。
(4)洗涤：去除一抗溶液，然后再用TBST缓冲液震荡洗涤3次,每次5分钟。
(5)二抗孵育：将膜取出放入纯化之后用5％BSA稀释好的二抗溶液中，放置于垂直摇床室温孵育1小时。
(6)洗涤：去除二抗溶液，然后再用TBST缓冲液震荡洗涤3次,每次5分钟。
(7)取出硝酸纤维素膜，用滤纸除去膜上多余溶液后，加入显示底物之后用化学发光仪曝光获取数据。
图5为meR342-EZH2抗体的Dot-Blot检测结果，图5中，NMe-Pep(673361)表示包含R342-EZH2位点的非甲基化肽段，Me-Pep(673365)表示包含R342-EZH2位点的非对称性二甲基化修饰肽段，NMe-Ab表示运用包含R342-EZH2位点的非甲基化肽段免疫兔子获得的抗体，Me-Ab表示运用包含R342-EZH2位点的非对称性二甲基化修饰肽段免疫兔子获得的抗体。由图5可以看出：meR342-EZH2甲基化抗体能够特异性识别发生非对称性二甲基化的EZH2-R342位点；非甲基化抗体不能识别发生非对称性二甲基化的EZH2-R342位点。
2.Western Blot检测meR342-EZH2抗体识别EZH2-R342位点非对称性二甲基化修饰的特异性
实验方法：在HEK293T细胞中分别过表达Flag-EZH2-WT野生型以及Flag-EZH2-R342K突变型(不能被PRMT1进行甲基化修饰)EZH2质粒，通过Flag-beads使Flag-EZH2免疫沉淀下来，运用meR342-EZH2抗体，进行Western Blot实验，检测Flag-EZH2-WT和Flag-EZH2-R342K蛋白中meR342-EZH2甲基化情况。
图6为meR342-EZH2抗体识别Flag-EZH2-WT和Flag-EZH2-R342K蛋白中meR342-EZH2甲基化的Western Blot检测结果，可以看出，meR342-EZH2甲基化抗体能够特异性识别发生非对称性二甲基化的Flag-EZH2-WT野生型蛋白；而Flag-EZH2-R342K突变体因不能被PRMT1进行甲基化修饰，meR342-EZH2甲基化抗体几乎检测不到甲基化修饰的信号。表明meR342-EZH2甲基化抗体能够在Western Blot水平特异性识别EZH2-R342位点非对称性二甲基化修饰。
3.免疫组化(IHC)检测meR342-EZH2抗体识别EZH2-R342位点非对称性二甲基化修饰的特异性
实验方法：通过免疫组化实验，运用本发明获得的meR342-EZH2抗体，检测人乳腺癌组织样本以及Babl/C鼠构建的鼠乳腺癌肺转移模型获得的鼠的乳腺癌组织样本(所使用的乳腺癌患者临床组织样本以及小鼠乳腺癌肺组织转移组织样本，来自于徐州医科大学)中的EZH2-R342位点非对称性二甲基化修饰的信号情况，免疫组化实验采用的是中杉金桥的IHC试剂盒(中杉金桥PV600)，按试剂盒说明书操作完成。
图7为meR342-EZH2抗体识别EZH2-R342位点非对称性二甲基化修饰的免疫组化检测结果，可以看出，人乳腺癌组织样本和鼠乳腺癌组织样本均能够检测到meR342-EZH2信号，表明meR342-EZH2甲基化抗体能够在免疫组化水平特异性识别体内的EZH2-R342位点非对称性二甲基化修饰。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 精氨酸甲基转移酶(Protein Arginine Methyltransferases, PRMTs)
<400> 1
Thr Ala Glu Arg Ile Lys Thr Pro Pro Lys Arg Pro Gly Gly Cys
1 5 10 15
Claims (6)
1.一种检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述检测EZH2的R342位点非对称性二甲基化修饰的抗体，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体。
3.权利要求1或2所述抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用多肽合成技术，合成氨基酸序列如SEQ ID No.1所示抗体的多肽，然后与血蓝蛋白KLH交联，得到抗原；
(2)将抗原与完全佐剂或者不完全佐剂混合后注入动物体内进行免疫，免疫8次后，取动物全血，进行纯化，得到抗体。
4.如权利要求3所述抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，抗原与完全佐剂或者不完全佐剂的体积比为1:1。
5.如权利要求3所述抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述动物为新西兰大白兔，所述免疫的方法：对新西兰大白兔进行阴性血采集及第一次免疫(0天)；第二周进行第二次免疫；第四周进行第三次免疫；第五周进行第四次免疫；第六周进行第五次免疫；第七周进行第六次免疫；第八周进行第七次免疫；第九周进行第八次免疫；最后在第十周取动物全血；第一次和第二次免疫，抗原的体积为0.5mL,抗原的质量为0.25mg；第三次到第八次免疫，抗原的体积为0.3mL,抗原的质量为0.15mg。
6.如权利要求3或4或5所述抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述纯化的方法，包括如下步骤：
1)取抗原亲和层析柱，用缓冲液TE buffer平衡柱床；
2)将需纯化抗体按1-2ml/min的速度上样于相应的层析柱，反复上样4-5遍使能与多肽发生特异性结合的抗体吸附在柱床上；
3)上样完毕，用缓冲液TE buffer平衡柱床；
4)用洗脱液glycine buffer以1-2ml/min的速度洗脱结合在柱床上的抗体；
5)样品收集完毕，用缓冲液TE buffer平衡柱床；
6)用洗脱液glycine buffer清洗柱床；
7)再次用TE buffer平衡柱床，置于4℃保存；
8)将洗脱得到的抗体用PBS buffer透析48h后，即得纯化后的抗体。
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2019
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