CN110678169A - Chk1-抑制剂与weel-抑制剂的组合 - Google Patents

Chk1-抑制剂与weel-抑制剂的组合 Download PDF

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Abstract

一方面，本发明提供了一种预防或治疗受试者中的癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括施用治疗有效量的Chk1抑制剂化合物1。在其他实施方案中，该方法还包括施用治疗有效量的Wee1抑制剂。本文还提供了药物组合物和试剂盒。

Description

CHK1-抑制剂与WEEL-抑制剂的组合
相关申请的交叉引用
本申请要求享有美国临时申请No.62/480,101(提交于2017年3月31日)的权益。出于所有目的，该申请通过引用整体并入。
技术领域
本发明涉及与癌症治疗有关的组合物，方法和用途。各个方面和实施方案通常涉及Chk1抑制剂(例如，它们与Wee1抑制剂的组合)，以及在癌症的治疗中制备或使用此类化合物和组合的方法。
背景技术
在美国和全世界，癌症是造成大量的医疗保健负担并严重影响社会的疾病。仅在美国，据估计2016年有超过160万人被诊断为新的癌症病例，并且约有60万人死于癌症。癌症是一种极为异质的疾病，肿瘤几乎由人体中的每一种细胞类型产生，并且与多种环境和遗传风险因素有关。此外，癌症爆发于所有年龄段的人以及所有种族、文化和社会经济群体中的人。
Chk1是丝氨酸/苏氨酸激酶，其响应于DNA损伤和复制应激而参与细胞周期检查点的诱导。Chk1抑制废除了内-S(intra-S)和G2/M检查点，并且已被证明可选择性地使肿瘤细胞对众所周知的DNA损伤剂敏感。(参见，例如，McNeely,S.et al.Pharmacology&Therapeutics 2014(dx.doi.org/10.1016/j.pharmthera.2013.10.005))。
对化疗和放疗的耐药性，是常规疗法的临床问题，其与涉及Chk1的DNA损伤应答的激活有关(Nature 2006；444(7):756-760)，Chk1的抑制使得肺癌脑转移瘤对放疗敏感(Biochem.Biophys.Res.Commun.2011；406(1):53-8)。
举例来说，Chk1抑制剂，无论是作为单一药剂还是作为组合，都可用于治疗肿瘤细胞，在该肿瘤细胞中DNA损伤和检查点途径的组成型激活导致基因组的不稳定性。已经进行了各种尝试来开发Chk1激酶的抑制剂。例如，已经进行了各种尝试以开发Chk1激酶的抑制剂。例如，PCT申请公开No.WO 2003/010444和WO 2005/072733公开了作为Chk1激酶抑制剂的芳基/杂芳基脲化合物。美国专利申请公开No.US 2005/0215556公开了作为激酶抑制剂的大环脲。PCT申请公开No.WO 2002/070494、WO 2006/014359和WO 2006/021002公开了作为Chk1抑制剂的芳基脲和杂芳基脲。PCT申请公开No.WO 2011/141716和WO 2013/072502均公开了作为Chk1激酶抑制剂的取代的吡嗪基-苯基脲。PCT申请公开No.WO 2005/009435和WO 2010/077758公开了作为Chk1激酶抑制剂的氨基吡唑。
尽管作出了上述努力，但是仍然需要可以用作治疗剂以使癌细胞更容易遭受DNA损伤和细胞凋亡途径的激活，并使癌细胞不太可能变得对其他化疗或放疗治疗具有抗性的细胞周期检查点抑制剂。本发明满足了这种需求并且还提供了相关的益处。
发明内容
在一些方面，本发明提供了一种用于预防或治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的化合物1和治疗有效量的Wee1抑制剂。在一些实施方案中，Wee1抑制剂是adavosertib(即，AZD-1775)。
在一些实施方案中，所述癌症选自急性髓细胞性白血病、食道癌、胃癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和中枢神经系统癌。在其他实施方案中，癌症是转移性癌症。在一些其他实施方案中，癌症是多重耐药性癌症。
在一些实施方案中，化合物1的剂量为每千克受试者体重约1mg至100mg。在一些实施方案中，化合物1的剂量为每千克受试者体重约12.5mg。在其他实施方案中，化合物1的剂量为每千克受试者体重约25mg。在另一些实施方案中，化合物1的剂量为每千克受试者体重约50mg。在其他实施方案中，AZD-1775的剂量为每千克受试者体重约30mg。在特定的实施方案中，化合物1的剂量为每千克受试者体重约25mg，AZD-1775的剂量为每千克受试者体重约30mg。
在一些实施方案中，联合施用化合物1和Wee1抑制剂。在其他实施方案中，同时或顺序地联合施用化合物1和Wee1抑制剂。在特定的实施方案中，化合物1或Wee1抑制剂经口、静脉内、肌内、皮下或肿瘤内施用。
在一些实施方案中，治疗受试者导致肿瘤体积减小。在其他实施方案中，治疗受试者导致减少或消除癌症的一种或多种体征或症状。在一些其他实施方案中，治疗受试者导致增加的生存时间。在特定的实施方案中，所述施用用于预防并且受试者不患有癌症。
在其他方面，本发明提供了包含化合物1和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含Wee1抑制剂。在一些实施方案中，Wee1抑制剂是AZD-1775。
在一些实施方案中，化合物1以约0.1nM至2,000nM的浓度存在。在一些实施方案中，Wee1抑制剂(例如AZD-1775)以约0.1nM至1,000nM的浓度存在。
在其他方面，本发明提供了一种用于预防或治疗受试者中的癌症的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含一种或多种试剂。
根据以下详细描述和附图，本发明的其他目的、特征和优点对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
图1示出了癌症中的DNA损伤应答和细胞周期控制轴。
图2示出了化合物1的各种药物特性。
图3A-3D显示化合物1是Chk1的强效选择性抑制剂。图3A示出了不同的激酶家族。图3B示出了化合物1的酶选择性。“TBD”表示数值待确定。图3C示出了化合物1的酶促效力。图3D示出了化合物1的细胞效力。
图4显示化合物1在衍生自多种组织学起源的癌细胞系中是有活性的。水平轴在整个癌症群体的中位IC50值处相交。相对于癌症组的中值IC50绘制IC50值。
图5A-5D显示化合物1在非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植模型中是有活性的。数据代表组平均值+/-S.E.M。图5A示出了在SK-MES NSCLC肿瘤模型中化合物1对肿瘤体积的影响。图5B示出了在NCI-H727 NSCLC肿瘤模型中化合物1对肿瘤体积的影响。图5C示出了在SK-MES NSCLC肿瘤模型中化合物1对体重的影响。图5D示出了在NCI-H727 NSCLC肿瘤模型中化合物1对体重的影响。
图6A-C显示化合物1和AZD-1775具有协同作用，并且作为单一药剂表现出独特的细胞活性模式。数据代表组平均值+/-S.E.M。黑色箭头代表与起始细胞数(抑制细胞生长的极限)相对应的信号。图6A示出了在SK-MES NSCLC肿瘤模型中化合物1与AZD-1775的各种组合对细胞活力的影响。图6B示出了在NCI-H727 NSCLC肿瘤模型中化合物1与AZD-1775的各种组合对细胞活力的影响。图6C显示了对化合物1和AZD-1775的比较，示出了在各种癌细胞系中的IC50值。
图7A和7B显示化合物1和AZD-1775在NCI-H727 NSCLC异种移植肿瘤模型中是有活性的。数据代表组平均值+/-S.E.M。图7A示出了化合物1和AZD-1775单独和联合施用时对肿瘤体积的影响。图7B示出了化合物1和AZD-1775单独和联合施用时对体重的影响。
图8示出了筛选造血细胞系对化合物1的敏感性的结果。
图9A和9B显示化合物1在套细胞淋巴瘤细胞系中显示出单药抗增殖活性。图9A示出了增殖测定的结果。图9B示出了图9A中示出的细胞系的IC50值。
图10A-10D显示化合物1在套细胞淋巴瘤肿瘤异种移植模型中作为单一药剂是有活性的并且是良好耐受的。图10A示出了化合物1对Jeko-1肿瘤生长的影响。图10B示出了在Jeko-1肿瘤模型中化合物1对体重的影响。图10C示出了化合物1对Maver-1肿瘤生长的影响。图10D示出了在Maver-1肿瘤模型中化合物1对体重的影响。
图11A-11D显示化合物1与Wee1抑制剂联用在套细胞淋巴瘤细胞系中显示出协同的抗增殖作用。图11A示出了化合物1和AZD-1775对Jeko-1细胞的影响。图11B示出了化合物1和AZD-1775对Maver-1细胞的影响。图11C示出了化合物1和AZD-1775对Z-138细胞的影响。图11D示出了Jeko-1、Z-138和Maver-1细胞的联合指数。
图12示出了Jeko-1、Z-138和Maver-1细胞中的磷酸化-H2A.X测定的结果。
图13A-13C显示在套细胞淋巴瘤细胞系中化合物1的细胞凋亡诱导伴随着同时发生的Wee1抑制而增加。图13A示出了在Jeko-1细胞中caspase-3/7测定的结果。图13B示出了在Maver-1细胞中caspase-3/7测定的结果。图13C示出了在Z-138细胞中caspase-3/7测定的结果。
图14A和14B显示在Jeko-1套细胞淋巴瘤肿瘤模型中，当与Wee1抑制剂组合时，化合物1的抗肿瘤活性增强。图14A示出了化合物1和AZD-1775对肿瘤生长的影响。图14B示出了化合物1和AZD-1775对体重的影响。
图15A-15C显示在AML细胞系中化合物1表现出抗增殖活性并诱导DNA损伤。图15A示出了在多个细胞系中增殖测定的结果。图15B示出了在图15A中示出的细胞系中化合物1的IC50值。图15C示出了磷酸化-H2A.X(S139)测定的结果。
图16A和16B显示化合物1在MV-411AML肿瘤异种移植模型中作为单一药剂是有活性的并且是良好耐受的。图16A示出了化合物1对MV-411肿瘤生长的影响。图16B示出了在MV-411肿瘤模型中化合物1对体重的影响。
具体实施方式
I.引言
检查点激酶1(Chk1)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其响应于遗传毒性应激通过使细胞周期进程停滞于S&G2期来调节细胞分裂。Chk1的药理抑制靶向具有增加的DNA复制应激的肿瘤细胞，导致DNA复制检查点功能的解偶联以及DNA损伤和细胞死亡的诱导。这些特性使Chk1抑制在具有高复制应激的癌症中成为一种新的治疗方法(作为单一药物)，所述高复制应激由致癌信号传导和同时发生的(parallel)DNA损伤应答途径功能的丧失导致。
靶向细胞周期调控和DNA损伤应答(DDR)信号传导是一种经过临床验证的癌症治疗方法。如图1所示，Chk1是细胞分裂周期以及细胞DDR信号传导的关键调节剂。Chk1响应于DNA损伤和DNA复制应激调节细胞分裂周期。此外，Chk1与其他DDR和细胞周期调控途径(其中的许多途径在癌细胞中是失调的)并行地发挥功能。在癌症中，DDR的丧失和细胞周期调控增加了对Chk1抑制的敏感性。
细胞分裂周期25(Cdc25)是一种磷酸酶，其激活细胞周期蛋白并导致细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)活性增加。Chk1抑制剂通过破坏Chk1对Cdc25的控制来阻断细胞周期检查点激活，从而导致细胞周期蛋白和Cdk活性增加。另外，如图1所示，Wee1与Chk1并行地发挥功能以调节细胞周期蛋白激活和Cdk活性。
本发明部分基于以下发现：Chk1抑制剂化合物1在对应于许多不同癌症的广范围的癌细胞系中抑制肿瘤生长和细胞活力。本发明还部分地基于以下发现：当与Wee1抑制剂(作为细胞周期检查点调节剂起作用的另一种蛋白)联用时，化合物1表现出协同作用。化合物1和Wee1抑制剂的联合处理可导致小于1的Chou-Talalay联合指数(CI)。Chou-Talalay是一种广泛使用的方法，其为药物联用的累加效应(CI＝1)、协同作用(CI<1)和拮抗作用(CI>1)提供量化定义。参见例如Chou,T.C.,Cancer Res.2010,70(2),440-6。
II.定义
除非另有特别说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。另外，与本文描述的方法或材料相似或等同的任何方法或材料都可以用于本发明的实践中。为了本发明的目的，定义以下术语。
本文所使用的术语“一个(a)”，“一种(an)”或“所述(the)”不仅包括具有一个成员的方面，而且还包括具多于一个成员的方面。例如，单数形式的“一个(a)”，“一种(an)”和“所述(the)”包括复数个所指对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括多个这样的细胞，而对“所述药剂”的提及包括本领域技术人员已知的一种或多种药剂，等等。
如本文所用，术语“约”和“大约”应通常表示在考虑到给定测量的性质或精度的情况下对于所测量的量的可接受的误差程度。典型的示例性的误差程度在给定值或值范围的20百分比(％)之内，优选在10％之内，更优选在5％之内。对“约X”的任何提及均具体地至少表示值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X。因此，“约X”旨在教导和提供对例如“0.98X”的权利要求限定的书面描述支持。
或者，在生物系统中，术语“约”和“大约”可以表示在给定值的数量级内的值，优选地在给定值的5倍之内，更优选地在2倍之内的值。除非另有说明，否则本文给出的数值是近似的，这意味着当没有明确说明时，可以推断出术语“约”或“大约”。
当将“约”应用于数值范围的开头时，它应用于该范围的两端。因此，“约5％至20％”等同于“约5％至约20％”。当将“约”应用于一组值的第一值时，它应用于该组中的所有值。因此，“约7、9或11mg/kg”等同于“约7mg/kg”、约9mg/kg”或约11mg/kg”。
如本文所用，术语“或”通常应以非排他性的方式解释。例如，主张“包含A或B的组合物”通常会描述同时包含A和B的组合物的方面。但是，“或”应解释为排除那些在没有矛盾的情况下不能组合的方面，例如组合物的pH值为9-10或7-8。
组“A或B”通常等同于“从由A和B组成的组中选择”的组。
如本文所用，术语“包括”通常应解释为不排除其他成分。例如，主张“包含A的组合物”将涵盖包含A和B；A，B和C；A，B，C和D；A，B，C，D和E；等等的组合物。
如本文所用，术语“受试者”，“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠科动物、大鼠、猿猴、人类、农畜、运动动物和宠物。还包括体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如本文所用，术语“治疗有效量”包括足以针对所指示的疾病(disorder)、病症或精神状态产生期望的结果的剂量。期望的结果可以包括剂量接受者的主观或客观改善。例如，有效量的Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合包括足以减轻癌症(例如急性髓细胞性白血病、食道癌、胃癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌或中枢神经系统癌)的体征、症状或病因的量。作为另一个实例，有效量的Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或者Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合包括足以减轻转移性癌症或多重耐药性癌症的体征、症状或病因的量。作为另一个实例，有效量的Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或者Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合包括足以防止癌症发展的量。
因此，治疗有效量可以是减慢、逆转或阻止肿瘤生长，增加生存时间或抑制肿瘤进展或转移的量。另外，例如，有效量的Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合包括在施用于患有癌症的受试者时在所述受试者中足以引起实质性改善的量。有效量可以随所治疗的癌症的类型和阶段、施用的一种或多种组合物(例如，包含Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)的类型和浓度，以及施用的其他药物的量而变化。
为了本文的目的，治疗有效量由本领域已知的考虑因素确定。该量必须在患有癌症的受试者中有效地实现期望的治疗效果。治疗有效量尤其取决于要治疗的疾病的类型和严重程度以及治疗方案。通常在适当设计的临床试验(例如剂量范围研究)中确定治疗有效量，并且本领域技术人员将知道如何恰当地进行此类试验以确定治疗有效量。众所周知，治疗有效量取决于多种因素，包括治疗剂(例如，Chk1抑制剂，如化合物1；Wee1抑制剂，如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)和组合物在体内的分布特征，各种药理参数(例如，体内半衰期)与不良副作用之间的关系以及其他因素，例如年龄和性别等。
术语“生存期”或“存活时间”是指在诊断出疾病或开始或完成疾病(例如癌症)的特定治疗过程之后的时间长度。术语“总生存期”包括描述在诊断出疾病或治疗疾病(例如癌症)之后患者存活的的一段定义的时间的临床终点。术语“无病生存期”包括在治疗特定疾病(例如癌症)后患者在没有该疾病的体征(例如，没有已知的复发)情况下生存的时间长度。在某些实施方案中，无病生存期是用于评估特定疗法的效力的临床参数，其通常以1年或5年为单位进行测量。术语“无进展生存期”包括在治疗特定疾病(例如癌症)期间和之后患者在患有该疾病但没有该疾病的另外的症状的情况下生存的时间长度。在一些实施方案中，生存期表示为中值或平均值。
如本文所用，术语“治疗”包括但不限于使接受者的健康状况(例如，患者的癌症状况)发生有益的改变的方法和操作。所述改变可以是主观的或客观的，并且可以与诸如所治疗的癌症的症状或体征等特征有关。例如，如果患者注意到疼痛减轻，则已经成功地治疗了疼痛。例如，如果已经发生了肿胀程度的降低，那么对炎症的有益治疗已经发生。类似地，如果临床医生注意到客观的变化，例如减少癌细胞的数量、癌细胞的生长、癌症肿瘤的尺寸或癌细胞对另一种癌症药物的耐药性，那么对癌症的治疗也已经是有益的了。该术语还包括阻止接受者状态的恶化。本文所用的治疗还包括将Chk1抑制剂(例如化合物1)和Wee1抑制剂(例如AZD-1775)；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合施用给患有癌症(例如急性髓细胞性白血病、食道癌、胃癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌或中枢神经系统癌)的患者。
术语“施用”和“给药”包括口服施用，局部接触，作为栓剂施用，静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、肿瘤内、鞘内、鼻内(例如，吸入，鼻腔喷雾剂或滴剂)或皮下施用，或将缓释装置(例如微型渗透泵)植入受试者。施用可以通过任何途径进行，包括肠胃外施用和经粘膜(例如颊、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮)施用。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其他递送方式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等。本领域技术人员将知道根据本发明的方法施用治疗有效量的Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合以预防或缓解与癌症有关的一种或多种症状的其他方法。
如本文所用，术语“联合施用”包括两种或更多种结构上不同的化合物的顺序或同时施用。例如，可以通过施用包含两种或更多种结构不同的有活性的药物活性化合物的、适于口服施用的药物组合物来联合施用两种或更多种结构不同的药物活性化合物。作为另一个实例，可以通过施用一种化合物然后施用另一种化合物来联合施用两种或更多种结构上不同的化合物。所述两种或更多种结构上不同的化合物可以由Chk1抑制剂(例如化合物1)和Wee1抑制剂(例如AZD-1775)组成。在一些实施方案中，联合施用的化合物通过相同的途径施用。在其他实施方案中，联合施用的化合物通过不同的途径施用。例如，一种化合物可以口服施用，而另一种化合物可以例如通过静脉内、肌内、皮下或腹膜内注射顺序或同时施用。可以施用所述同时或顺序施用的化合物或组合物，使得Chk1抑制剂和Wee1抑制剂以有效浓度同时存在于受试者或细胞中。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指有助于向细胞、生物体或受试者施用活性剂的物质。“药学上可接受的载体”是指可以包含在本发明的组合物中并且不会对受试者造成明显不利的毒理学作用的载体或赋形剂。药学上可接受的载体的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、生理蔗糖、生理葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂和色素、脂质体、分散介质、微胶囊、阳离子脂质载体、等渗和吸收延迟剂等。载体也可以是用于为制剂提供稳定性、无菌性和等渗性的物质(例如，抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂)，用于防止微生物作用的物质(例如，抗微生物剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)或用于为制剂提供食用香精等的物质。在一些实施方案中，载体是促进肽或寡核苷酸递送至靶细胞或组织的物质。本领域技术人员将认识到其他药物载体可用于本发明。
如本文所用，术语“癌症”旨在包括特征在于异常细胞的不受控制的生长的一类疾病的成员。该术语包括所有阶段和级别的癌症，包括晚期癌症、复发癌症、转移前癌症和转移后癌症。耐药性癌症和多重耐药性癌症也包括在内。适于根据本发明方法治疗的癌症包括胃癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、神经系统癌(例如中枢神经系统癌)、肾上腺癌、膀胱癌、血癌(例如，白血病、急性髓细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、B细胞急性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性早幼粒细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病)、骨癌、宫颈癌、食道癌、眼癌、肾癌、头颈癌、肝癌、肌肉癌、鼻癌、胰腺癌、咽癌、胎盘癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织癌、颌下腺癌、甲状腺癌、舌癌和子宫癌。如本文所用，“肿瘤”包括一种或多种癌细胞。该术语不排除癌症的组合。
在癌症的背景下，术语“阶段”是指癌症程度的分类。对癌症进行分期时考虑的因素包括但不限于肿瘤尺寸、肿瘤对附近组织的侵袭以及肿瘤是否转移到其他部位。用于将一个阶段与另一个阶段区分开的具体标准和参数可根据癌症类型而有所不同。例如，使用癌症分期来帮助确定预后或确定最合适的一个或多个治疗选项。
癌症分期系统的一个非限制性实例被称为“TNM”系统。在TNM系统中，“T”是指主要肿瘤的尺寸和程度，“N”是指癌已扩散到的附近淋巴结的数量，“M”是指癌是否已转移。“TX”表示不能测量到主要肿瘤，“T0”表示不能找到主要肿瘤，“T1”、“T2”、“T3”和“T4”表示主要肿瘤的尺寸或程度，其中更大的数字对应于更大的肿瘤或已经生长至附近组织中的肿瘤。“NX”表示无法测量到附近淋巴结中的癌症，“N0”表示在附近淋巴结中没有癌症，“N1”、“N2”、“N3”和“N4”表示癌症已经扩散到的淋巴结的数量和位置，其中更大的数字对应于更大量的包含癌症的淋巴结。“MX”表示无法测量到转移，“M0”表示未发生转移，“M1”表示癌症已转移到身体的其他部位。
作为癌症分期系统的另一个非限制性实例，癌症被分类或分级为具有以下五个阶段之一：“0期”、“I期”、“II期”、“III期”或“IV期”。0期表示存在异常细胞，但尚未扩散到附近组织。这通常也称为原位癌(CIS)。CIS不是癌症，但可能随后发展成癌症。I期、II期和III期表示存在癌症。较高的数字对应于较大的肿瘤尺寸或已扩散到附近组织的肿瘤。四期表明癌症已经转移。本领域技术人员将熟悉不同的癌症分期系统，并能够容易地应用或解释它们。
术语“化合物1”是指5-((5-(4-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-2-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基)氨基)吡嗪-2-甲腈，其作为Chk1的抑制剂发挥作用。
术语“AZD-1775”，也称为“AZD1775”，“MK-1775”和“MK1775”，是指2-烯丙基-1-(6-(2-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2H)-酮，其具有以下结构：
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AZD-1775是高选择性的、ATP竞争性的Weel小分子抑制剂，酶IC50约为5.18nM。在体外，AZD-1775在基于细胞的测定中抑制Wee1活性并诱导DNA损伤以及G2检查点逃逸，EC50约为80nM。当与DNA损伤剂(如吉西他滨、顺铂、卡铂和托泊替康)联合使用时，AZD-1775在p53缺陷型细胞系中会增加细胞毒性。
术语“检查点激酶1”或“Chk1”是指在人中由CHEK1基因编码的丝氨酸/苏氨酸激酶，也称为“CHEK1”。Chk1协调DNA损伤应答(DDR)和细胞周期检查点应答。Chk1的激活导致细胞周期检查点激活、细胞周期停滞、DNA修复和细胞死亡。Chk1响应于通过ATR的磷酸化而被激活，通过ATR的磷酸化可以通过检测到单链DNA来触发，单链DNA可由UV诱导的损伤、DNA复制应激和链间交联引起。其他蛋白，例如复制蛋白A、Claspin、Tim-Tipin复合物、Rad 17和DNA拓扑异构酶2结合蛋白1(TopBP1)也参与Chk激活。此外，诸如激酶PKB/AKT、MAPKAPK和p90/RSK的蛋白也参与了Chk1的ART非依赖性激活。
Chk1的主要靶标之一是磷酸酶Cdc25，它被Chk1抑制，导致细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)活性的失活，细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)活性是细胞周期的关键驱动者。因此，Chk1抑制促进细胞周期蛋白和Cdk活性的激活，并最终促进整个细胞周期的进展。
人Chk1 mRNA序列的非限制性实例在以下GenBank参考编号下列出NM_001114121→NP_001107593、NM_001114122→NP_001107594、NM_001244846→NP_001231775、NM_001274→NP_001265以及NM_001330427→NP_001317356。
术语“Chk1抑制剂”是指降低或消除Chk1活性的任何化合物(例如，药物活性化合物)。例如，Chk1抑制剂可通过一种或多种信号分子、蛋白或其他化合物导致Chk1激活的降低或消除(例如，Chk1抑制剂可响应于通过ATR的磷酸化而降低或消除Chk1激活)，或可以通过所有信号分子、蛋白或其他化合物导致Chk1激活的减少或消除。该术语还包括通过Chk1减少或消除一种或多种蛋白或细胞信号转导成分的激活或失活的化合物(例如，Chk1抑制剂可以减少或消除对Cdc25磷酸酶活性的Chk1依赖性抑制)。Chk1抑制剂还包括抑制Chk1表达的化合物(例如，抑制Chk1转录或翻译的化合物)。
术语“Wee1”是指在人中由WEE1基因编码的核丝氨酸/苏氨酸激酶。Wee1也被称为“Wee1 G2检查点激酶”和“Wee1A激酶”。Wee1通过磷酸化激活细胞周期检查点，从而抑制细胞周期蛋白和Cdk活性。Wee1在G2/M检查点、细胞大小检查点和DNA损伤检查点的调节中发挥作用。在高级真核生物中，Wee1通过磷酸化和降解失活。SCF蛋白复合物(E3泛素连接酶)通过泛素化调节Wee1。此外，SCF对Wee1的识别是由polio-样激酶1(Plk1)和Cdc2对Wee1的磷酸化介导的。Wee1也受Kruppel-样因子2(Klf2)负调节。人Wee1 mRNA序列的非限制性实例在GenBank参考编号NM_003390→NP_003381下列出。
术语“Wee1抑制剂”是指降低或消除Wee1活性的任何化合物(例如，药物活性化合物)。例如，Wee1抑制剂可通过一种或多种信号分子、蛋白或其他化合物导致Wee1激活，或可以通过所有信号分子、蛋白或其他化合物导致Wee1激活的减少或消除。该术语还包括通过Wee1减少或消除一种或多种蛋白或细胞信号转导成分的激活或失活的化合物(例如，Wee1抑制剂可以减少或消除对细胞周期蛋白和Cdk活性的Wee1依赖性抑制)。Wee1抑制剂还包括抑制Wee1表达的化合物(例如，抑制Wee1转录或翻译的化合物)。
除了AZD-1775以外，Weel抑制剂的其他实例描述于，例如，美国专利No.7,834,019；7,935,708；8,288,396；8,436,004；8,710,065；8,716,297；8,791,125；8,796,289；9,051,327；9,181,239；9,714,244；9,718,821；和9,850,247；美国专利申请公开No.US 2010/0113445和2016/0222459；以及国际申请公开No.WO 2002/090360，2015/019037，2017/013436，2017/216559，2018/011569和2018/011570。这些专利和公开的公开内容通过引用并入本文。
III.对实施方案的描述
A.预防和治疗癌症的方法
在一个方面，本发明提供了一种预防或治疗受试者中的癌症(例如，急性髓细胞性白血病、食道癌、胃癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌或中枢神经系统癌)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的检查点激酶1(Chk1)抑制剂。
适于根据本发明的方法预防或治疗癌症的Chk1抑制剂公开于PCT申请公开No.WO2015/120390中，其通过引用整体并入本文以用于所有目的。在特定的实施方案中，Chk1抑制剂是化合物1或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的Wee1抑制剂。在一些实施方案中，Wee1抑制剂选自：吡唑并嘧啶衍生物、吡啶并嘧啶、4-(2-氯苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3-(2H,6H)-二酮(也称为“Wee1抑制剂”或“Chk1抑制剂V”(CAS No.622855-37-2))、6-丁基-4-(2-氯苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3-(2H,6H)-二酮(也称为“Wee1抑制剂II”(CAS No.62285550-9))、4-(2-苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3-(2H,6H)-二酮(也称为“Wee1抑制剂III”或“Chk1抑制剂IV”(CASNo.1177150-89-8))、抗Wee1抗体和抗Wee1小干扰RNA(siRNA)分子。在一些实施方案中，吡啶并嘧啶为吡啶并[2,3-d]嘧啶(也称为PD0166285或6-(2,6-二氯苯基)-2-[4-[2-(二乙基氨基)乙氧基]苯胺基]-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮)。在一些实施方案中，吡唑并嘧啶衍生物是AZD-1775。在一些实施方案中，吡唑并嘧啶是4-(4-((2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)苯基)哌嗪-1-甲酸甲酯(即，CJM061)。在一些实施方案中，吡唑并嘧啶是具有不同氨基甲酸酯基团(例如，乙基)的类似化合物。
本发明的方法适于预防或治疗许多种癌症。在一些实施方案中，预防或治疗的癌症类型选自胃癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、神经系统癌(例如中枢神经系统癌)、肾上腺癌、膀胱癌、血癌(例如，白血病、急性髓细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、B细胞急性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性早幼粒细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病)、骨癌、宫颈癌、食道癌、眼癌、肾癌、肝癌、肌肉癌、鼻癌、胰腺癌、咽癌、胎盘癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织癌、颌下腺癌、甲状腺癌、舌癌和子宫癌。在特定的实施方案中，预防或治疗的癌症选自急性髓细胞性白血病、胃癌、食道癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和中枢神经系统癌。在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，癌症是晚期癌症。在一些实施方案中，癌症是耐药性癌症。在一些实施方案中，癌症是多重耐药性癌症。在一些实施方案中，癌症是晚期的、转移性的或耐药的。在一些实施方案中，癌症是套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是套细胞淋巴瘤，并且受试者在t(11；14)(q13；q32)处具有染色体易位。在特定的实施方案中，癌症是乳腺癌或转移性乳腺癌。
在一些实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)的治疗有效量为每千克受试者体重约0.1mg至10mg(例如每千克受试者体重约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg)。在其他实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)的治疗有效量为每千克受试者体重约10mg至100mg(例如每千克受试者体重约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg)。在一些实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)的治疗有效量为每千克受试者体重至少约100mg至500mg(例如，每千克受试者体重至少约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500mg)。在一些实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)的治疗有效量为每千克受试者体重约1mg至50mg(例如每千克受试者体重约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mg)。在一些实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)的治疗有效量为每千克受试者体重约7.5mg。在一些实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)的治疗有效量为每千克受试者体重约12.5mg。在一些其他实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)的治疗有效量为每千克受试者体重约20mg。在其他实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)的治疗有效量为每千克受试者体重约25mg。在一些实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)的治疗有效量为每千克受试者体重约50mg。
在一些实施方案中，一个剂量的Chk1抑制剂(例如化合物1)包含约1mg至100mg(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg)的Chk1抑制剂。在其他实施方案中，一个剂量的Chk1抑制剂(例如化合物1)包括约100mg至1,000mg(例如约100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1,000mg)的Chk1抑制剂。
在一些实施方案中，一个剂量的Chk1抑制剂(例如化合物1)为至少约1,000mg至10,000mg(例如，至少约1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800，1,900，2,000，2,100，2,200，2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000mg或更多)的Chk1抑制剂。
在一些实施方案中，一个剂量的Chk1抑制剂(例如化合物1)包括治疗有效量的Chk1抑制剂。在其他实施方案中，如果在没有Wee1抑制剂的情况下施用，则一个剂量的Chk1抑制剂(例如化合物1)包含少于治疗有效量的Chk1抑制剂。
在一些实施方案中，Wee1抑制剂(例如AZD-1775)的治疗有效量为每千克受试者体重约0.1mg至10mg(例如每千克受试者体重约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg)。在其他实施方案中，Wee1抑制剂(例如AZD-1775)的治疗有效量为每千克受试者体重约10mg至100mg(例如每千克受试者体重约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg)。在一些实施方案中，Wee1抑制剂的治疗有效量(例如AZD-1775，尽管优选为至多60mg/kg，每天两次，或120mg/kg)为每千克受试者体重至少约100mg至500mg(例如，每千克受试者体重至少约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500mg或更多)。在一些实施方案中，Wee1抑制剂(例如AZD-1775)的治疗有效量为每千克受试者体重约4mg。在一些实施方案中，Wee1抑制剂(例如AZD-1775)的治疗有效量为每千克受试者体重约15mg。在一些其他实施方案中，Wee1抑制剂(例如AZD-1775)的治疗有效量为每千克受试者体重约30mg。
在一些实施方案中，一个剂量的Wee1抑制剂(例如AZD-1775)包含约1mg至100mg(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg)的Wee1抑制剂。在其他实施方案中，一个剂量的Wee1抑制剂(例如AZD-1775)包含约100mg至1,000mg(例如约100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1,000mg)的Wee1抑制剂。
在特定的实施方案中，一个剂量的Wee1抑制剂(例如AZD-1775)包含约100mg至400mg(例如约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或400mg)的Wee1抑制剂。在一些实施方案中，一个剂量的Wee1抑制剂包含约225mg的Wee1抑制剂。
在一些实施方案中，一个剂量的Wee1抑制剂(例如AZD-1775)为至少约1,000mg至10,000mg(例如至少约1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000mg或更多)的Wee1抑制剂。
在一些实施方案中，一个剂量的Wee1抑制剂(例如AZD-1775)含有治疗有效量的Wee1抑制剂。在其他实施方案中，如果在没有Chk1抑制剂的情况下施用Wee1抑制剂，则一个剂量的Wee1抑制剂(例如AZD-1775)包含少于治疗有效量的Wee1抑制剂。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的第三DNA损伤剂以增加Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的效力。在一些实施方案中，DNA损伤剂是抗代谢剂(例如卡培他滨，5-氟尿嘧啶，吉西他滨或培美曲塞)、拓扑异构酶毒物或抑制剂(例如喜树碱或依托泊苷)、烷化剂(例如氮芥，亚硝基脲，替莫唑胺或S23906)或交联药物(例如顺铂，卡铂，奥沙利铂或丝裂霉素C)。
在一些实施方案中，DNA损伤剂的治疗有效量为每千克受试者体重约0.1mg至10mg(例如，每千克受试者体重约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg)。在其他实施方案中，DNA损伤剂的治疗有效量为每千克受试者体重约10mg至100mg(例如，每千克受试者体重约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg)。在一些实施方案中，DNA损伤剂的治疗有效量为每千克受试者体重至少约100mg至500mg(例如，每千克受试者体重至少约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500mg或更多)。
在一些实施方案中，一剂DNA损伤剂包含约1mg至100mg(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg)的Wee1抑制剂。在其他实施方案中，一剂DNA损伤剂包含约100mg至1,000mg(例如，约100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1,000mg)的DNA损伤剂。
在特定的实施方案中，一剂DNA损伤剂包含约100mg至400mg(例如，约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或400mg)的第三DNA损伤剂。
在一些实施方案中，一剂DNA损伤剂为至少约1,000mg至10,000mg(例如，至少约1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000mg或更多)的Wee1抑制剂。
在一些实施方案中，一剂DNA损伤剂包含治疗有效量的DNA破坏剂。在其他实施方案中，如果在没有Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的情况下施用DNA损伤剂，则一剂DNA损伤剂包含少于治疗有效量的DNA损伤剂。
从例如动物研究(例如，啮齿动物和猴)获得的数据可用于制定用于人的剂量范围。本发明化合物的剂量优选在包括几乎无毒性或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以根据所采用的剂型和施用途径在该范围内变化。对于用于本发明方法的任何组合物(例如，包含Chk1抑制剂，如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)，可最初根据细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中制定剂量，以达到包括细胞培养中确定的IC50(实现症状的半数最大抑制的试验化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这类信息可用于更准确地确定在人中可用的剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱法(HPLC)测量。
还应理解，组合物(例如，包含Chk1抑制剂，如化合物1；Wee1抑制剂，如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)的适当剂量取决于相对于所要达到的效果的组合物的效力。当将这些组合物中的一种或多种施用于哺乳动物时，医师、兽医或研究人员可例如首先开出相对低的剂量，随后增加剂量直至获得适当的反应。另外，应当理解，用于任何特定哺乳动物受试者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的具体组合物的活性；受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；排泄速率和方式；任何药物组合的影响；以及要调节的表达或活性的程度。
在某些实施方案中，将Chk1抑制剂(例如化合物1)和Wee1抑制剂(例如AZD-1775)的组合施用给受试者。当将Chk1抑制剂(例如化合物1)和Wee1抑制剂(例如AZD-1775)联合施用给受试者时，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂可以同时或顺序地施用。
在某些实施方案中，DNA损伤剂也被施用给受试者。当将DNA损伤剂联合施用给受试者时，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂也可以与DNA损伤剂同时或顺序施用。
在一些实施方案中，同时施用Chk1抑制剂(例如化合物1)和Wee1抑制剂(例如AZD-1775)。在其他实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)和Wee1抑制剂(例如AZD-1775)不同时施用，而是每天以相同次数或每周以相同次数或每月以相同次数施用(例如，每天一次、每天两次、每周一次、每周两次依此类推施用两者)。在一些其他实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)和Wee1抑制剂(例如AZD-1775)以不同的给药方案给予。作为非限制性实例，Chk1抑制剂每天施用一次，Wee1抑制剂每天施用两次，反之亦然。作为另一个非限制性实例，Chk1抑制剂每天施用一次，Wee1抑制剂则是每2、3、4、5、6或更多天施用一次，反之亦然。技术人员还将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或恶性病症的严重程度、先前的治疗、受试者的总体健康状况或年龄以及存在其他疾病。此外，用治疗有效量的组合物(例如，包含Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)治疗受试者可以包括单一治疗，或者优选地，可以包括一系列的治疗。
根据本发明的方法施用的组合物(例如，包含Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)的最佳剂量、毒性和治疗效力可以根据所施用的组合物的相对效力而变化，并且可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学方法来确定，例如通过确定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(有效治疗群体的50％的剂量)来确定。毒性效果和治疗效果之间的剂量比为治疗指数，可以表示为比例LD50/ED50。优选表现出大的治疗指数的药物。尽管可以使用表现出毒副作用的药物，但应小心地设计一种使这些药物靶向至受影响的组织的部位的递送系统，以使对正常细胞的潜在损害最小化并由此减少副作用。
最佳给药方案可以根据受试者体内活性成分累积的测量结果来计算。通常，剂量为每千克体重约1ng至约1,000mg，可以每天、每周、每月或每年一次或多次施用。本领域普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复频率。本领域技术人员将能够按照本领域已知的已确立的方法和本文的公开内容确定向人施用Chk1抑制剂或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合的最佳给药。
无论是同时还是顺序施用Chk1抑制剂(例如化合物1)和Wee1抑制剂(例如AZD-1775)，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的剂量可以是本文所述的任何剂量。在一些实施方案中，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的剂量是治疗有效量。在其他实施方案中，Chk1抑制剂的剂量是治疗有效量，Wee1抑制剂的剂量小于治疗有效量(即，为了获得要递送给受试者的治疗有效量，随后施用一个剂量或多个剂量的Wee1抑制剂)。在一些其他实施方案中，Wee1抑制剂的剂量是治疗有效量，Chk1抑制剂的剂量小于治疗有效量(即，为了获得要递送给受试者的治疗有效量，随后施用一个剂量或多个剂量的Chk1抑制剂)。在一些实施方案中，化合物1的剂量为每千克受试者体重约7.5mg、12.5mg、20mg、25mg或50mg，AZD-1775的剂量为每千克受试者体重约15mg或30mg。
当将Chk1抑制剂(例如化合物1)和Wee1抑制剂(例如AZD-1775)同时联合施用给受试者时，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂可以通过相同途径或不同途径给药。作为非限制性实例，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂可以同时口服施用。作为另一个非限制性实例，Chk1抑制剂可以口服施用，而Wee1抑制剂可以通过另一种途径同时施用(例如，静脉内、肌内、皮下、肿瘤内或腹膜内)。或者，Wee1抑制剂可以口服施用，而Chk1抑制剂可以通过另一途径同时施用(例如，静脉内、肌内、皮下、肿瘤内或腹膜内)。
对于顺序联合施用，可以在Wee1抑制剂(例如AZD-1775)之前施用Chk1抑制剂(例如化合物1)，反之亦然。在一些实施方案中，通过相同途径施用Chk1抑制剂和Wee1抑制剂，但是Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的施用相隔一定时间。在其他实施方案中，通过不同途径施用Chk1抑制剂和Wee1抑制剂，并且Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的施用相隔一定时间。作为非限制性实例，Chk1抑制剂口服施用，在一段时间之后，Wee1抑制剂随后口服施用，反之亦然。作为另一个非限制性实例，Chk1抑制剂口服施用，在一段时间之后，Wee1抑制剂随后通过另一种途径(例如，静脉内、肌内、皮下、肿瘤内或腹膜内)施用，反之亦然。
对于顺序的联合施用，本领域技术人员将能够容易地确定在施用Chk1抑制剂(例如化合物1)和Wee1抑制剂(例如AZD-1775)之间的适当的时间量。在一些实施方案中，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的施用相隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分钟或更长时间。在其他实施方案中，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的施用相隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或更长时间。在一些其他实施方案中，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的施用相隔约1、2、3、4、5、6、7天或更长时间。在其他实施方案中，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的施用相隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更长时间。在一些实施方案中，Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的施用相隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月或更长时间。
在一些实施方案中，Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂与Wee1抑制剂的组合每天施用1、2、3、4、5或更多次。在其他实施方案中，Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂与Wee1抑制剂的组合每周施用1、2、3、4、5、6、7或更多次。在一些其他实施方案中，Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂与Wee1抑制剂的组合每月施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多次。
在一些实施方案中，约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天施用Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂与Wee1抑制剂的组合。在其他实施方案中，约每1、2、3、4或更多周施用Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂与Wee1抑制剂的组合。在一些其他实施方案中，约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月施用Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂与Wee1抑制剂的组合。
在成功治疗之后，可能期望使受试者经历维持疗法以预防癌症(例如，急性髓细胞性白血病、食道癌、胃癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌或中枢神经系统癌)的复发。
有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。通常，通过首先施用低剂量或少量的组合物(例如，包含Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)，然后逐渐增加所施用的剂量直到在治疗的受试者中观察到所期望的效果而几乎没有或没有毒性副作用来确定所述组合物的有效的量或有效量。
根据患者所需的且耐受的剂量和频率，施用组合物(例如，包含Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)的一次或多次给药。无论如何，组合物应提供足够量的组合物以有效治疗患者。通常，剂量足以预防、治疗或减轻疾病的症状或体征，而不会对患者产生不可接受的毒性。
在一些实施方案中，治疗受试者包括抑制癌症(例如，急性髓细胞性白血病、食道癌、胃癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌或中枢神经系统癌)细胞生长，抑制癌细胞增殖，抑制癌细胞迁移，抑制癌细胞侵袭，减少或消除癌症的一种或多种体征或症状，减小癌肿瘤的尺寸(例如体积)，减少癌肿瘤的数量，减少癌细胞的数量，诱导癌细胞坏死、焦亡、胀亡、凋亡、自噬或其他细胞死亡，延长受试者的生存时间或增强另一种药物或疗法的治疗效果。在特定的实施方案中，受试者不患有癌症。
B.药物组合物
在另一方面，本发明提供了包含Chk1抑制剂和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，Chk1抑制剂为在PCT申请公开No.WO2015/120390中公开的一种Chk1抑制剂。在一些实施方案中，Chk1抑制剂是化合物1。
在一些实施方案中，药物组合物还包含Wee1抑制剂。在特定的实施方案中，Wee1抑制剂选自：吡唑并嘧啶衍生物、吡啶并嘧啶、4-(2-氯苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3-(2H,6H)-二酮、6-丁基-4-(2-氯苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3-(2H,6H)-二酮、4-(2-苯基)-9-羟基吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3-(2H,6H)-二酮、抗Wee1抗体和抗Wee1小干扰RNA
(siRNA)分子。在一些实施方案中，吡啶并嘧啶是吡啶并[2,3-d]嘧啶。在特定的实施方案中，吡唑并嘧啶衍生物是AZD-1775。
在一些实施方案中，Chk1抑制剂(例如化合物1)以约0.1nM至10nM的浓度存在(例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10nM)。在其他实施方案中，Chk1抑制剂以约10nM至100nM的浓度存在(例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75，80、85、90、95或100nM)。在一些其他实施方案中，Chk1抑制剂以约100nM至1,000nM的浓度存在(例如，约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000nM)。在其他实施方式中，Chk1抑制剂以至少约1,000nM至10,000nM的浓度存在(例如，至少约1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000nM或更高)。
在一些实施方案中，Wee1抑制剂(例如AZD-1775)以约0.1nM至10nM的浓度存在(例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10nM)。在其他实施方案中，Wee1抑制剂以约10nM至100nM的浓度存在(例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100nM)。在一些其他实施方案中，Wee1抑制剂以约100nM至1,000nM的浓度存在(例如，约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000nM)。在其他实施方案中，Wee1抑制剂以至少约1,000nM至10,000nM的浓度存在(例如，至少约1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000nM或更高)。
在一些实施方案中，DNA损伤剂以约0.1nM至10nM的浓度存在(例如，约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10nM)。在其他实施方案中，DNA损伤剂以约10nM至100nM的浓度存在(例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100nM)。在一些其他实施方案中，DNA损伤剂以约100nM至1,000nM的浓度存在(例如，约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000nM)。在其他实施方案中，DNA损伤剂以至少约1,000nM至10,000nM的浓度存在(例如，至少约1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、6,100、6,200、6,300、6,400、6,500、6,600、6,700、6,800、6,900、7,000、7,100、7,200、7,300、7,400、7,500、7,600、7,700、7,800、7,900、8,000、8,100、8,200、8,300、8,400、8,500、8,600、8,700、8,800、8,900、9,000、9,100、9,200、9,300、9,400、9,500、9,600、9,700、9,800、9,900、10,000nM或更高)。
本发明的药物组合物可以通过药学领域公知的任何方法制备。适用于本发明的药学上可接受的载体包括任何标准药物载体、缓冲剂和赋形剂，包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂(例如油/水或水/油乳剂)，以及各种类型润湿剂或佐剂。合适的药物载体及其制剂描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.,Easton,第19版,1995)。优选的药物载体取决于活性剂的预期施用方式。
本发明的药物组合物可以包含作为活性成分的Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合或它们的任何药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。药物组合物可以任选地包含其他治疗成分。
根据常规药物混合技术，可将所述成分(例如，Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)作为活性成分与合适的药物载体或赋形剂紧密混合。预期适用于施用所需的制剂形式的任何载体或赋形剂均可与本文公开的化合物一起使用。
药物组合物包括适合于经口、局部、肠胃外、肺、鼻或直肠施用的那些。在任何给定情况下最合适的途径将部分取决于癌症状况的性质和严重程度，还任选地取决于癌症的阶段。
其他药物组合物包括适用于全身(例如肠内或肠胃外)施用的那些。全身施用包括经口、直肠、舌下或阴唇下施用。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内施用。其他递送方式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等。在特定实施方案中，本发明的药物组合物可以肿瘤内施用。
用于肺部施用的组合物包括但不限于由本文所述化合物(例如，Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)或其盐的粉末和合适的载体或润滑剂的粉末组成的干粉组合物。可以从本领域技术人员已知的任何合适的干粉吸入器装置中吸入用于肺部施用的组合物。
用于全身施用的组合物包括但不限于由本文所述的组合物(例如，Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)，以及合适载体或赋形剂的粉末组成的干粉组合物。用于全身施用的组合物可以由以下代表但并不限此：片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂和混悬剂。
在一些实施方案中，组合物(例如，Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)进一步包括药用表面活性剂。在其他实施方案中，组合物还包含冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂选自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、谷氨酸钠、PVP、HPβCD、CD、甘油、麦芽糖、甘露醇和蔗糖。
用于本发明的药物组合物或药物可以使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂通过标准技术配制。合适的药物载体描述于本文和The Science and Practice ofPharmacy，第21版，费城科学大学，LippencottWilliams&Wilkins(2005)。
所述组合物(例如，Chk1抑制剂，例如化合物1；Wee1抑制剂，例如AZD-1775；或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)的控释肠胃外制剂可以制成植入物、油性注射剂或作为微粒系统。对于递送系统的广泛概述，参见Banga,A.J.,THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS:FORMULATION,PROCESSING,AND DELIVERY SYSTEMS,Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,PA,(1995)，其通过引用并入本文。微粒系统包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。
聚合物可用于离子控制释放本发明的组合物。用于受控的药物递送的各种可降解和不可降解的聚合物基质是本领域已知的(Langer R.,Accounts Chem.Res.,26:537-542(1993))。例如，嵌段共聚物泊洛沙姆407在低温下以粘性但可流动的液体形式存在，但在体温下形成半固体凝胶。它已经被证明是用于配制和持续递送重组白介素2和脲酶的有效载体(Johnston et al.,Pharm.Res.,9:425-434(1992)；and Pec et al.,J.Parent.Sci.Tech.,44(2):58 65(1990))。或者，羟基磷灰石已被用作微载体以控制蛋白的释放(Ijntema et al.,Int.J.Pharm.,112:215-224(1994)。在另一个方面，脂质体被用于脂质包封的药物的控释以及药物靶向(Betageri et al.,LIPOSOME DRUG DELIVERYSYSTEMS,Technomic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,PA(1993))。用于治疗性蛋白的受控递送的许多其他系统是已知的。参见，例如美国专利No.5,055,303，5,188,837，4,235,871，4,501,728，4,837,028，4,957,735，5,019,369，5,055,303；5,514,670；5,413,797；5,268,164；5,004,697；4,902,505；5,506,206，5,271,961；5,254,342和5,534,496，它们各自通过引用并入本文。
对于口服施用Chk1抑制剂(例如化合物1)，Wee1抑制剂(例如AZD-1775)或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合，药物组合物或药物可以采取以下形式：例如通过常规方法用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊剂。本发明提供了片剂和明胶胶囊剂，所述片剂和明胶胶囊剂包含Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合，或这些药物的干燥固体粉末，以及(a)稀释剂或填充剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素(例如乙基纤维素、微晶纤维素)、甘氨酸、果胶、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙、硫酸钙；(b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、镁盐或钙盐、金属硬脂酸盐、胶体二氧化硅、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、乙酸钠或聚乙二醇；对于片剂，它们还包括(c)粘合剂，例如硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素；如果需要，可包含(d)崩解剂，例如淀粉(例如马铃薯淀粉或淀粉钠)、乙醇酸盐、琼脂、藻酸或其钠盐、或泡腾混合物；(e)润湿剂，例如十二烷基硫酸钠；或(f)吸收剂，着色剂，调味剂和甜味剂。
片剂可以根据本领域已知的方法进行薄膜包衣或肠溶包衣。用于口服的液体制剂可以采取以下形式：例如溶液剂、糖浆剂或混悬剂，或者它们可以以干燥产品的形式存在用于在使用前用水或其他合适的载体配制。这种液体制剂可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂制备，例如，助悬剂，例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂或阿拉伯胶；非水溶媒，例如杏仁油、油性酯，乙醇或分馏植物油；和防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸。所述制剂还可适当地包含缓冲盐、调味剂、着色剂或甜味剂。如果需要，可以适当地配制用于口服施用的制剂以获得一种或多种活性化合物的控制释放。
用于局部施用Chk1抑制剂、Wee1抑制剂或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合的典型制剂包括乳剂、软膏剂、喷雾剂、洗剂和贴剂。然而，可以将药物组合物配制为用于任何类型的施用，例如使用注射器或其他装置进行的皮内、皮下、静脉内、肌内、鼻内、脑内、气管内、动脉内、腹膜内、膀胱内、胸膜内、冠状动脉内或肿瘤内注射。还考虑了通过吸入施用(例如气雾剂)或口服或直肠施用的制剂。
用于透皮施用的合适制剂包括有效量的一种或多种本文所述的化合物，任选地包括载体。优选的载体包括可吸收的药理学上可接受的溶剂以帮助透过宿主皮肤。例如，透皮装置为绷带形式，所述绷带包括背衬构件、包含化合物以及任选的载体的容器、任选的速率控制屏障(其在延长的时间内以受控和预定速率将化合物递送至宿主的皮肤)、以及将装置固定在皮肤上的工具。也可以使用基质透皮制剂。
本文所述的组合物和制剂(例如，包括Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)可以配制成用于通过注射(例如通过推注或连续输注)肠胃外施用。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中，并添加有防腐剂。可注射的组合物优选为等渗水性溶液或混悬剂，栓剂优选由脂肪乳液或混悬液制备。组合物可以被灭菌或包含佐剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐或缓冲液。或者，一种或多种活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用适当的溶媒(例如无菌无热原水)配制。此外，它们还可以包含其他在治疗上有价值的物质。分别根据常规的混合、制粒、或包衣方法制备组合物。
对于通过吸入施用，组合物(例如，包括Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)可以使用合适的推进剂从加压包装或喷雾器中以气雾剂喷雾形式方便地递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀门以输送经计量的量从而确定剂量单位。可以将用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(例如明胶的胶囊和药筒)配制成包含一种或多种化合物与合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
组合物(例如，包括Chk1抑制剂，Wee1抑制剂或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合)也可以配制成直肠用组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如包含常规栓剂基质(例如，可可脂或其他甘油酯)。
此外，可以将一种或多种活性成分配制为储库制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，可以将一种或多种本文所述的化合物与合适的高分子材料或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或者配制成难溶的衍生物(例如，配制成难溶盐)。
C.试剂盒
在另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗受试者中的癌症的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的药物组合物(例如，包含Chk1抑制剂(如本文描述的化合物1或另一种Chk1抑制剂)的药物组合物)、本文描述的Wee1抑制剂或包含Chk1抑制剂和Wee1抑制剂(例如本文描述的AZD-1775或本文描述的另一种Wee1抑制剂)的药物组合物。
试剂盒适合于预防或治疗许多种癌症。在一些实施方案中，所预防或治疗的癌症类型选自胃癌、头颈癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、神经系统癌(例如中枢神经系统癌)、肾上腺癌、膀胱癌、血癌(例如，白血病、急性髓细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性早幼粒细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病)、骨癌、宫颈癌、食道癌、眼癌、肾癌、肝癌、肌肉癌、鼻癌、胰腺癌、咽癌、胎盘癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织癌、颌下腺癌、甲状腺癌、舌癌和子宫癌。在特定的实施方案中，所预防或治疗的癌症选自急性髓细胞性白血病、食道癌、胃癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和中枢神经系统癌。在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在其他实施方案中，癌症是晚期癌症。在一些其他实施方案中，癌症是耐药性癌症。在一些实施方案中，癌症是多重耐药性癌症。在一些实施方案中，癌症是晚期的、转移性的或耐药的。在一些实施方案中，癌症是套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是套细胞淋巴瘤，并且受试者在t(11；14)(q13；q32)处具有染色体易位。在特定的实施方案中，癌症是乳腺癌或转移性乳腺癌。
可以在试剂盒中提供用以实施本发明的各种方法的材料和试剂，从而有利于所述方法的执行。如本文所用，术语“试剂盒”包括促进过程、测定、分析或操作的制品的组合。特别地，本发明的试剂盒可用于广泛的用途，包括例如诊断、预后、治疗等。
试剂盒可以包括化学试剂以及其他组分。另外，本发明的试剂盒可包括但不限于给试剂盒使用者的说明书、用于施用Chk1抑制剂(例如化合物1)、Wee1抑制剂(例如AZD-1775)或其药物组合物，或Chk1抑制剂和Wee1抑制剂的组合或其药物组合物的装置和试剂，样品管，支架，托盘，架子，皿，板，溶液，缓冲液或其他化学试剂。本发明的试剂盒也可以包装以方便储存和安全运输，例如，包装在具有盖的盒子中。
IV.实施例
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例仅用于说明性目的，并不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到可以被改变或修改以产生基本相同结果的各种非关键参数。
本文提供的实施例突显了口服生物可利用的、选择性的小分子Chk1抑制剂化合物1在源自实体瘤和血液肿瘤的细胞系中的活性。化合物1是Chk1的亚-纳摩尔酶抑制剂，其对一组蛋白激酶的脱靶活性有限。当在大的细胞系组中进行体外评估时，化合物1作为单一药剂在源自实体瘤和血液肿瘤的细胞系中表现出宽的效力范围，IC50值范围为30nM至大于50μM。
几种实体瘤类型(包括胃癌、非小细胞肺癌和卵巢癌)在体外表现出对化合物1的增强的敏感性。用化合物1处理敏感细胞系导致DNA损伤的诱导(用磷酸化的组蛋白H2AX测量)和细胞死亡的诱导。化合物1作为单一药剂在体内SK-MES-1和NCI-H727 NSCLC肿瘤异种移植模型中具有活性，对所治疗的小鼠的体重影响最小。除了化合物1的强效单药活性外，与Wee1抑制剂AZD-1775的组合在多种实体瘤细胞系中具有很高的体外协同作用，并且在NSCLC肿瘤异种移植模型中，该组合比单独的任一种药剂更有效。
另外，几种血液肿瘤类型在体外和体内表现出对化合物1的增强的敏感性。化合物1在体外和体内表现出对套细胞淋巴瘤(MCL)和急性髓细胞性白血病(AML)细胞系令人信服的单药活性，包括在Jeko-1异种移植模型中使肿瘤完全消退。此外，化合物1在AML衍生的细胞系中显示出强大的抗增殖活性和DNA损伤的诱导作用，在MV-411肿瘤异种移植模型中也表现出单药活性。
这些实施例中给出的实验结果证明了化合物1是高效且选择性的Chk1抑制剂。特别地，化合物1显示出对Chk1的亚纳摩尔级效力，具有有限的脱靶激酶活性(即，对Chk1的选择性是对Chk2的选择性的1,000x还多)。此外，化合物1表现出有吸引力的药物特性，例如口服生物利用度和低外排率(允许灵活的剂量方案以及多重耐药性癌和CNS转移癌的治疗)，良好的代谢稳定性，无CYP抑制作用，优异的hERG抑制指数和较低的心脏毒性风险(基于食蟹猴安全药理研究结果)。另外，化合物1不仅在多种肿瘤模型中表现出作为单一药剂的强效活性，而且与Wee1抑制剂组合时会观察到协同活性。在诱导DNA损伤、凋亡和肿瘤控制方面观察到了协同作用。这些数据表明化合物1具有用于治疗实体瘤和血液肿瘤疾病的临床实用性。
实施例1：化合物1的药物特性，化合物1是一种新型的、口服可用的检查点激酶1抑制剂
化合物1是Chk1抑制剂，其表现出许多优异的药物特性，其中一些示于图2中。特别地，化合物1表现出对Chk1的亚-纳摩尔级效力，并具有有限的脱靶活性。此外，化合物1显示出良好的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)特性，药代动力学和口服生物利用度。已经在小鼠、大鼠和食蟹猴中完成了7天重复剂量耐受性研究，并且在食蟹猴GLP心血管安全性研究(包括校正的QT(QTc)间隔，左心室压力(LVP)和收缩力终点)中并没有什么发现。化合物1作为单一药剂具有活性，而且与化学治疗剂和Wee1抑制剂联用时也具有活性。
实施例2：化合物1的选择性和效力
化合物1的酶选择性
使用1μM的ATP浓度，用具有120种激酶的组(包括图3A中示出的那些)筛选化合物1。所有抑制超过80％的激酶和Chk2显示在图3B。每种激酶在ATP Km处测得的IC50值相对于Chk1示出在图3B中。细胞的IC50值是从在相关细胞系中使用磷酸化-表位特异性抗体的信号转导测定中得出的。
化合物1的酶促效力和细胞效力
使用10μM[γ-33P]-ATP和从Response Biology Corp.获得的20μM肽底物KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR(SEQ ID NO：1)进行酶促测定。如图3C所示，IC50为0.124nM。
通过使用兔抗Chk1丝氨酸296磷酸化-表位抗体(获自Cell SignalingTechnology Inc.)的免疫印迹，在18小时的测定中使用HT-29结肠癌细胞测定细胞Chk1。该测定的结果示于图3D中。IC50为0.5109nM。
实施例3：体外筛选
用多种癌细胞系进行广泛筛选，以鉴定表现出对作为单一药剂的化合物1的敏感性的肿瘤类型。使用化合物1或顺铂的稀释液，在高通量增殖试验中筛选具有232种癌衍生细胞系的组。以30μM的起始浓度，用化合物1或顺铂的半对数连续稀释液处理细胞系以达到9种剂量水平，然后在72小时后使用CellTiter-Assay(Promega)测定增殖。通过使用非线性回归模型拟合剂量反应数据来计算IC50(EC50)值。
图4显示化合物1在抑制衍生自多种组织学起源的癌细胞系的生长方面是有效的。此外，当将化合物1与顺铂进行比较时，观察到独特的活性模式。对化合物1特别敏感的肿瘤类型包括食道癌、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌和白血病。
实施例4：NSCLC异种移植模型中的体内筛选
为了评估化合物1的体内效力，使用了两种不同的NSCLC异种移植模型。将SK-MES-1或NCI-H727肿瘤细胞皮下接种于无胸腺裸鼠的腹侧。一旦肿瘤达到约200mm3的体积，将小鼠随机分为研究组(每组n＝10)。每天一次以12.5、25或50mg/kg的剂量用化合物1通过口服管饲法处理小鼠。还包括阴性对照组，其中仅对动物施用溶媒。
对SK-MES-1肿瘤的效果显示在图5A和5C中，对NCI-H727肿瘤的效果显示在图5B和5D中。如图5A-5D所示，化合物1在两种异种移植模型中以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长。
实施例5：化合物1与Wee1抑制剂的组合的细胞筛选和表征
除了检查化合物1作为单一药剂的效力外，还测试了化合物1与Wee1抑制剂AZD-1775的组合。用化合物1或Wee-1抑制剂AZD-1775的滴定单独或组合处理SK-MES-1和NCI-H727肿瘤细胞。加入药物后72小时，使用CellTiter-
Figure BDA0002273913280000362
Assay(Promega)测定细胞增殖。如图6A-6C所示，化合物1和AZD-1775的组合表现出协同作用。此外，当将药物作为单一药剂进行测试时，观察到了独特的活性模式。
图6A示出了使用化合物1和AZD-1775的各种组合抑制SK-MESNSCLC癌细胞进行的细胞活力测定的结果。细胞活力以剂量依赖性的方式被抑制。类似地，当用NCI-H727 NSCLC细胞测试化合物1和AZD-1775的各种组合时，观察到剂量依赖性的活力抑制(图6B)。在多种细胞系中测试了两种药物的IC50值，在图6C中进行了比较。
实施例6：化合物1与Wee1抑制剂的组合的体内活性
使用NCI-H727 NSCLC肿瘤异种移植模型，单独和组合测试化合物1(每天一次，25mg/kg)和AZD-11775(每天一次，30mg/kg)抑制肿瘤尺寸的能力(图7A和7B)。将NCI-H727肿瘤细胞皮下接种在无胸腺裸鼠的腹侧。一旦肿瘤的体积达到约200mm3，将小鼠随机分为研究组(每组n＝10)。通过口服管饲法施用化合物1和AZD-1775。当两种药物组合时观察到显著的协同作用。
实施例7：衍生自血液肿瘤的细胞系的高通量体外筛选
在72小时增殖测定(CrownBio Omnipanel)中，筛选了具有约70种造血细胞系的组对化合物1的敏感性。筛选的细胞系包括代表以下的那些细胞系：间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、急性髓细胞性白血病(AML)、B细胞急性淋巴细胞性白血病(B-ALL)、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、急性早幼粒细胞白血病(PML)和T细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)。如图8所示，对由化合物1引起的抑制特别敏感的衍生自血液肿瘤的细胞系的子集包括MCL和AML细胞系。
实施例8：MCL细胞系中的抗增殖活性
套细胞淋巴瘤(MCL)是一种罕见且通常为侵袭性形式的非霍奇金淋巴瘤，在美国影响约15,000名患者。大多数MCL患者在t(11；14)(q13；q32)处具有染色体易位，该易位导致细胞周期蛋白D1的过表达。由于Chk1激酶和Wee1激酶是Cdk/细胞周期蛋白活性的调节剂，因此可以使MCL独一无二地对单独的Chk1抑制剂或与Wee1抑制剂组合的Chk1抑制剂敏感。
为了评估化合物1抑制MCL细胞增殖的能力，用化合物1的连续半对数稀释液在96孔板中处理MCL细胞系，并在72小时后使用CellTiter-
Figure BDA0002273913280000371
Assay(Promega)进行测定(图9A)。Z-138、Jeko-1、Maver-1、Granta-519和REC-1细胞系的IC50值示出在图9B中。这些数据表明，化合物1在多种MCL细胞系中显示出强效的单药抗增殖活性。
实施例9：在MCL异种移植模型中作为单一药剂的化合物1
在两种不同的套细胞淋巴瘤(MCL)异种移植模型中评估了化合物1的作用。将Jeko-1和/或Maver-1细胞皮下接种于CB17.SCID(对于Jeko-1细胞)或无胸腺裸鼠(对于Maver-1细胞)的腹侧。一旦肿瘤达到约200mm3的体积，将小鼠随机分为研究组(每组n＝10)。通过口服管饲法用化合物1处理小鼠，或仅用溶媒处理小鼠作为阴性对照。在一个处理组中，化合物1每天施用一次，持续21天。在另一个处理组中，化合物1每天两次施用，持续三个周期，其中每个周期由连续三天的处理以及随后连续四天不进行处理构成。
如图10A和10C所示，两种处理方案分别地在Jeko-1和Maver-1模型中均显著抑制肿瘤生长。此外，图10B和10D显示化合物1是良好耐受的。
实施例10：化合物1和Wee1抑制剂在MCL细胞系中的协同作用
实施体外测定以检查化合物1和Wee1抑制剂的组合对几种套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系的影响。用Wee1抑制剂AZD-1775与浓度增加的化合物1的组合的滴定处理MCL细胞。在72小时测量增殖。在Jeko-1(图11A)、Maver-1(图11B)和Z-138(图11C)细胞系的测定中观察到抑制作用。
另外，用等效比例的化合物1和AZD-1775处理MCL细胞，并使用Chou-Talalay方法和CalcuSyn软件计算联合指数(CI)值(Caner Res.2020Jan 15；70(2):440-6)。Jeko-1、Z-138和Maver-1细胞的CI值示出在图11D中。这些数据表明，化合物1与Wee1抑制剂的组合在MCL细胞系中表现出协同的抗增殖作用。
实施例11：MCL细胞系中的DNA损伤和细胞凋亡诱导
为了评估化合物1诱导DNA损伤的能力，通过单独的或与Wee1抑制剂AZD-1775组合的化合物1的滴定处理套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系18小时。裂解细胞，磷酸化-H2A.X(S139)水平通过免疫印迹测定并在LI-COR Odyssey成像仪上进行检测。如图12所示，化合物1在多种MCL细胞系(Jeko-1、Z-138和Maver-1细胞)中诱导DNA损伤，并且当同时抑制Wee1时，DNA损伤诱导被增强。
通过用单独的或与AZD-1775组合的化合物1的滴定处理MCL细胞18小时来研究细胞凋亡的诱导。处理之后，使用Caspase-3/7测定(Promega)评估caspase-3/7诱导。测试的三种MCL细胞系是Jeko-1(图13A)、Maver-1(图13B)和Z-138(图13C)。这些数据表明，通过同时抑制Wee1，化合物1在多种MCL细胞系中诱导凋亡的能力得到了增强。
实施例12：化合物1和Wee1抑制剂的组合的体内研究
使用Jeko-1套细胞淋巴瘤(MCL)肿瘤异种移植模型来研究使用化合物1的Chk1抑制与Wee1抑制剂的联合作用。将Jeko-1细胞皮下接种于CB17.SCID小鼠的腹侧。一旦肿瘤达到约200mm3的体积，将小鼠随机分为研究组(每组n＝10)。通过口服管饲法每天一次用化合物1(7.5mg/kg)、AZD-1775(15mg/kg)或两者处理小鼠，持续三个周期(每个周期包括连续三天的处理以及随后连续四天不进行处理)。包括阴性对照组，其中仅用溶媒处理小鼠。
如图14A所示，单独的两种药剂均抑制Jeko-1肿瘤的生长，并且当施用两种药剂时，肿瘤生长的抑制显著增强。图14B显示化合物1和AZD-1775单独和组合使用时都被研究动物很好地耐受。这些结果表明在MCL肿瘤模型中Wee1抑制剂增强了化合物1的抗肿瘤活性。
实施例13：在AML细胞系中化合物1活性的体外研究
为了检查化合物1对急性髓细胞性白血病(AML)细胞的作用，用化合物1的连续半对数稀释液在96孔板中处理几种AML细胞系，并在72小时后使用CellTiter-
Figure BDA0002273913280000391
测定(Promega)分析增殖。如图15A和15B所示，化合物1在多种AML细胞系中显示出抗增殖活性。
另外，测定了化合物1在THP-1AML细胞中诱导DNA损伤的能力。对于这些实验，将THP-1细胞用化合物1处理18小时，使用Luminex测定(Millipore)测量磷酸化-H2A.X。如图15C所示，化合物1能够以剂量依赖性的方式诱导THP-1细胞中的DNA损伤。
实施例14：在AML细胞中化合物1活性的体内研究
MV-411肿瘤异种移植模型用于测试化合物1在体内抑制AML肿瘤生长的能力。将MV-411细胞与基质胶(Matrigel)以1：1的比例混合，然后皮下注射至雌性NOD.SCID小鼠的右腹侧中。一旦肿瘤达到约100至200mm3的体积，将小鼠随机分为研究组(每组n＝10)，并通过口服管饲法给药化合物1。
图16A显示化合物1以剂量依赖性的方式抑制MV-411肿瘤生长。图16B示出了化合物1对研究动物体重的影响。总之，这些结果表明，化合物1作为单一药剂在MV-411异种移植肿瘤模型中具有活性并是良好耐受的。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术技术人员将提出鉴于它们的各种修改或改变，所述修改或改变被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利、专利申请和序列登录号通过引用整体并入本文用于所有目的。
非正式序列表

Claims (28)

1.一种用于预防或治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的(i)化合物1或其药学上可接受的盐；和(ii)Wee1抑制剂或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述Wee1抑制剂为AZD-1775。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症选自急性髓细胞性白血病、食道癌、胃癌、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和中枢神经系统癌。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述癌症是多重耐药性癌症。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中化合物1的剂量为每千克受试者体重约1mg至100mg。
7.根据权利要求6所述的方法，其中化合物1的剂量为每千克受试者体重约12.5mg。
8.根据权利要求6所述的方法，其中化合物1的剂量为每千克受试者体重约25mg。
9.根据权利要求6所述的方法，其中化合物1的剂量为每千克受试者体重约50mg。
10.根据权利要求2-9中任一项所述的方法，其中，AZD-1775的剂量为每千克受试者体重约30mg。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的方法，其中化合物1的剂量为每千克受试者体重约25mg，AZD-1775的剂量为每千克受试者体重约30mg。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中联合施用化合物1和所述Wee1抑制剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中同时或顺序地联合施用化合物1和所述Wee1抑制剂。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中化合物1或所述Wee1抑制剂口服、静脉内、肌内、皮下或肿瘤内施用。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中治疗所述受试者导致肿瘤体积减小。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中治疗所述受试者导致减少或消除癌症的一种或多种体征或症状。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中治疗所述受试者导致生存时间增加。
18.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述受试者不患有癌症。
19.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括施用DNA损伤剂。
20.一种药物组合物，包含：
(i)化合物1或其药学上可接受的盐；
(ii)Wee1抑制剂或其药学上可接受的盐；和
(iii)药学上可接受的载体。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述Wee1抑制剂为AZD-1775。
22.根据权利要求20或21所述的药物组合物，其中化合物1以约0.1nM至2,000nM的浓度存在。
23.根据权利要求21或22所述的药物组合物，其中AZD-1775以约0.1nM至1,000nM的浓度存在。
24.根据权利要求19-22中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含DNA损伤剂。
25.一种用于预防或治疗受试者中的癌症的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求20-23中任一项所述的药物组合物。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其进一步包括使用说明书。
27.根据权利要求25或26所述的试剂盒，其还包括一种或多种试剂。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物包含DNA损伤剂。
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