CN110664819A - 供吸入的齐墩果酸制剂及其制备方法与医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及齐墩果酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物或共晶或酯在制备预防和治疗呼吸系统疾病药物方面的用途。本发明还提供一种可吸入的预防和治疗呼吸系统疾病的含齐墩果酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物的药物制剂以及药物组合物。本发明制剂适用的呼吸系统疾病包括哮喘、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、肺心病、肺动脉高压、肺结核、过敏性鼻炎、慢性鼻炎和鼻窦炎。

Description

供吸入的齐墩果酸制剂及其制备方法与医药用途
技术领域
本发明属于医药技术，特别是涉及一种供吸入的齐墩果酸制剂及其制备方法，以及在制备预防和治疗呼吸系统疾病药物方面的用途。
背景技术
哮喘、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、囊性纤维化(CF)肺病和鼻炎等呼吸系统疾病的主要病理特征是炎症，而现有的针对呼吸系统疾病的抗炎药物主要是吸入型的糖皮质激素类药物(如布地奈德和丙酸氟替卡松)，这些激素类药物可导致骨质疏松、急性肺炎和口腔念珠菌感染等副作用。因此，现有的呼吸系统疾病抗炎药物远远不能满足临床需求，尤其是新型吸入型抗炎药物非常有限。
A20(TNFAIP3)是一种内源性的NF-κB信号通路抑制剂(FEBS Lett.1999,442,147)，具有抗炎和抗纤维化作用。研究表明，在COPD患者支气管上皮细胞中Α20的表达是下降的，这提示增加Α20表达的药物有可能用于防治COPD(JCI Insight 2017,2(7):e90443)。此外，Α20表达的下降也是囊性纤维化(CF)的重要病理特征，促进Α20表达的药物有可能用于防治囊性纤维化肺病(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2016,113(26):E3725-34)。尽管Α20在抑制机体炎症反应方面至关重要，然而，迄今发现的能够上调Α20表达的药物非常有限。
齐墩果酸是一种非处方保肝药，其在预防和治疗呼吸系统疾病(特别是COPD)的功效未经验证。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术，本申请提供了一种供吸入的齐墩果酸制剂及其制备方法，以及上述制剂在预防或制备呼吸系统疾病中的医药用途。
技术方案：本发明公开了齐墩果酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物或酯或共晶在制备预防或治疗呼吸系统疾病药物中的用途。
其中，所述呼吸系统疾病包括哮喘、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、囊性纤维化(CF)肺病、肺心病、肺动脉高压、肺结核、过敏性鼻炎、慢性鼻炎和鼻窦炎等。
本发明还公开了一种用于预防和治疗呼吸系统疾病的吸入剂，以齐墩果酸、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其共晶或其酯作为活性成分，并含有药学上可接受的辅料。
作为优选的技术方案，所述吸入剂为干粉制剂，包括活性成分、赋形剂和载体。
在本发明中，齐墩果酸可采用其晶体、不定形物、盐、水合物或其溶剂合物。用于本发明的赋形剂包括乳糖、葡萄糖、白糖、海藻糖、蔗糖等糖类；赤藓糖醇、甘露醇、山梨醇等糖醇类；淀粉类；结晶纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钙、羟丙基甲基纤维素、羧甲醚纤维素钠、支链淀粉、糊精、阿拉伯胶、琼脂、明胶、黄蓍胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等大分子聚合物；硬脂酸等脂肪酸或其盐；蜡类；硫酸钙；碳酸钙；滑石粉；氧化铁；以及轻质无水硅酸。可采用选自上述赋形剂中的一种或多种的组合。
优选的赋形剂选自糖、糖醇、大分子聚合物和碳酸钙中的一种或多种。糖类赋形剂优选乳糖或蔗糖；糖醇类赋形剂优选赤藓糖醇、山梨醇或甘露醇；大分子聚合物类赋形剂优选羧甲基纤维素钙、支链淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或甲基纤维素。特别优选的赋形剂是乳糖或赤藓糖醇。
用于本发明的载体包括乳糖、葡萄糖、果糖、蔗、麦芽糖、葡聚糖、赤藓糖醇、山梨醇、甘露醇、硫酸钙、碳酸钙、滑石或氧化铁。优选的载体是乳糖或赤藓糖醇，特别优选乳糖。
当本发明制剂采用吸入器给予患者的形式时，载体是具有空气动力学上允许的粒径的载体。具体说来，载体平均粒径的范围为10～200μm。
其中，所述活性成分和赋形剂混合形成微粉化颗粒，所述微粉化颗粒粒径为平均粒径20μm或更小，优选10μm或更小，更优选1～9μm和最优选3～8μm。这些范围内的直径使微粉化颗粒能抵达目标，诸如支气管和肺部分。
进一步的，上述微粉化颗粒和载体的平均粒径之比优选在1:1～1:50范围内，更优选1:5～1:20。
进一步的，所述有效成分和赋形剂的重量比为1:5000～10:1，优选为1:100～5:1，更优选1:10～2:1。
所述微粉化颗粒和载体的重量比在1:100～10:1，优选1:50～1:1，更优选1:20～1:5。
在赋形剂的共同存在下，齐墩果酸经研磨机诸如气流粉碎机研磨，得到具有能经空气动力学抵达肺的直径的微粉化颗粒，随后，使得到的微粉化颗粒与载体充分混合，载体与所得到的微粉化颗粒具有良好的一致性并具有能经空气动力学抵达呼吸系统的直径，从而成功得到具有极高的含量均匀度的制剂以完成本发明。综上，上述可吸入的干粉制剂的制备为：将含有活性成分和赋形剂的具有平均粒径20μm或更小的微粉化颗粒与具有10～200μm粒径的载体混合得到，其中，齐墩果酸和赋形剂混合并通过气流粉碎机微粉化混合物，制备微粉化颗粒。其中的微粉化颗粒和载体在尼龙或聚乙烯制成的容器中混合。
上述干粉制剂可容易地使齐墩果酸呈烟雾状散开，通过特定地经过肺或鼻传递药物，能明显治疗炎症性肺病、肺纤维化等呼吸系统疾病。当采用吸入给药给予患者上述步骤中得到的粉末制剂时，可通过粘膜给药诸如经肺给药、经鼻给药等向受治者给药。当给药途径是经肺给药时，可通过采用本领域通常采用的任何干粉吸入器为患者给药。所采用的经肺吸入装置包括但不限于：自旋吸入器(Spinhaler)、E-吸入器(E-haler)、Flow-Caps、喷射吸入器(Jet haler)、盘式吸入器(Disk haler)、转子吸入器(Rotor haler)、Inspirerease、Inhalation eight等和定量喷雾器等。
作为另一种优选的技术方案，所述吸入剂为雾化吸入混悬液。雾化吸入疗法是利用雾化装置将药物分散成微小雾滴，使其悬浮于气体中，并吸入呼吸道及肺内，从而达到洁净湿化气道、局部治疗和全身治疗的目的。本发明人发现，吸入用齐墩果酸的混悬液具有强效抗炎作用，能有效抑制气道中免疫细胞活性，减少炎性介质释放，降低气道高反应性，减少腺体分泌。本发明的雾化吸入混悬液的制备方法包括以下步骤：
(1)干热灭菌：取活性成分加入容器中，充氮完全后密封，采用高温干热灭菌制得无菌原料；
(2)制备混悬液：将步骤(1)的无菌原料分散在灭菌的辅料溶液中，得到混悬液；
(3)高压均质化：将步骤(2)的混悬液通过高压均质机湿微粉化，采用注射用水定容得到雾化吸入混悬液，灌封至安瓿瓶即可。
步骤(1)中，所述高温干热灭菌是指采用160～170度及以上灭菌。
步骤(2)中，所述无菌原料和辅料溶液的固液比(质量比)范围是1：100～1:2000。
步骤(2)中，所述辅料溶液包括可药用添加剂，所述可药用添加剂包括pH调节剂、表面活性剂、等渗调节剂中的一种或任意两种以上的混合。
其中，所述pH调节剂优选为缓冲盐，更优选为pH＝3～7的缓冲盐。
所述表面活性剂选自聚山梨酯80、脱水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯、天然卵磷脂、油酰聚氧乙烯(2)醚、硬脂酰聚氧乙烯(2)醚、月桂酰聚氧乙烯(4)醚、氧化乙烯和氧化丙烯嵌段共聚物、合成卵磷脂、二甘醇二油酸酯、油酸四氢糠酯、油酸乙酯、甘油单油酸酯、聚乙二醇400和甘油单月桂酸酯、聚山梨酯类、聚氧乙烯蓖麻油类、磷脂类、泊洛沙姆中的一种或任意两种以上的混合。
所述等渗调节剂包括氯化钠、葡萄糖、甘油中的一种或任意两种以上的混合。
步骤(2)中，所述分散的转速为2000～20000rpm。
步骤(3)中，所述高压均质化的压力为100bar～1500bar，微粉化至粒径分布d(v,0.5)＝1～3μm，d(v,0.9)<5μm。
步骤(3)中，灌装所述安瓿瓶优选为1ml～5ml安瓿瓶。
上述吸入剂在预防和治疗哮喘、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、囊性纤维化(CF)肺病、肺心病、肺动脉高压、肺结核、过敏性鼻炎、慢性鼻炎和鼻窦炎等呼吸系统疾病中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种预防和治疗呼吸系统疾病的可吸入的药物组合物，其中以治疗有效量的齐墩果酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物或酯或共晶作为活性成份，并含有药学上可接受的辅料。可任意混合的辅料根据吸入剂型的不同可以改变。辅料的例子包括赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂和甜味剂等。所述药物组合物可以是吸入气雾剂、吸入粉雾剂或供雾化器用的液体制剂等制剂学上常规的吸入制剂。
如果需要，可吸入的齐墩果酸药物组合物可与一种或多种其他类型的预防或治疗呼吸系统疾病的药物联合使用。所述的其他类型预防或治疗呼吸系统疾病的药物优选自抗炎药、支气管扩张药、抗组胺药、解充血药、镇咳药和呼吸道润滑祛痰药，这些药物适合通过吸入给药。所述的其他类型预防或治疗呼吸系统疾病的药物最优选自β2-肾上腺素受体激动剂、抗毒蕈碱剂、甾体抗炎药、PDE4抑制剂、A2a激动剂、钙阻断剂和呼吸道润滑祛痰药。
适宜的β2-肾上腺素受体激动剂包括沙丁胺醇(舒喘灵)、奥西那林、特布他林、沙美特罗、非诺特罗、茚达特罗、丙卡特罗、福莫特罗、卡莫特罗、维兰特罗、TA-2005、GSK159797及其可药用盐等。
适宜的支气管扩张药包括抗胆碱能药或抗毒蕈碱剂，特别是异丙托溴铵、氧托溴铵、噻托溴铵、阿地溴铵、格隆溴铵等。
适宜的甾体抗炎药包括糖皮质激素，例如布地奈德、倍氯米松、丙酸氟替卡松、环索奈德或莫米松。
适宜的PDE4抑制剂包括西洛司特和罗氟司特等。
适宜的钙通道阻滞剂包括地尔硫卓、维拉帕米、氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、拉西地平、乐卡地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平和尼索地平。
适宜的呼吸道润滑祛痰药包括氨溴索等。
在优选的实施方案中，所述的其他类型预防或治疗呼吸系统疾病的药物选自噻托溴铵、阿地溴铵、格隆溴铵、沙丁胺醇、福莫特罗、沙美特罗、茚达特罗、维兰特罗、罗氟司特、莫米松、布地奈德、丙酸氟替卡松和氨溴索。
关于给药剂量：本发明的预防或治疗呼吸系统疾病的可吸入药物中，齐墩果酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物或酯或共晶等活性成分的量可根据患者年龄、体重、症状和给药途径等而适当改变。当给成人(约60kg)吸入给药时，齐墩果酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物或酯或共晶的给药剂量是0.01mg～100mg/次，更优选0.1mg～50mg/次，最优选1mg～20mg/次，每天给药1～4次。也可根据疾病程度的不同和剂型的不同而偏离此剂量范围。
本发明所述的齐墩果酸可作为药用盐使用。该盐可以是齐墩果酸与金属(包括但不限于：钠、钾、钙等)离子或药学上可接受的胺(包括但不限于：乙二胺、氨丁三醇等)或铵离子形成的盐。
本发明所述的齐墩果酸也可作为齐墩果酸与其他化合物形成的共晶使用，例如，齐墩果酸与胆碱形成的共晶(中国专利申请：201510014403.6)。
有益效果：本发明人创新性地发现，齐墩果酸可显著上调内源性抗炎/抗纤维化因子A20的表达，进而对呼吸系统疾病具有显著疗效。尽管齐墩果酸口服给药并未显示治疗呼吸系统疾病的疗效，然而当采用吸入剂给药时，齐墩果酸对各种呼吸系统疾病均产生了显著疗效。所述呼吸系统疾病包括哮喘、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、囊性纤维化(CF)肺病、肺心病、肺动脉高压、肺结核、过敏性鼻炎、慢性鼻炎或鼻窦炎。因此，齐墩果酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物或共晶可用于制备预防或治疗呼吸系统疾病的药物，具有临床应用前景。
附图说明
图1是齐墩果酸可吸入粉末制剂对哮喘和慢性阻塞性肺病模型(OVA诱导)大鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的总细胞数量的影响图(n＝6，与OVA组相比***p<0.001)；
图2是齐墩果酸可吸入粉末制剂对哮喘和慢性阻塞性肺病模型(OVA诱导)大鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的TNF-α含量的影响图(n＝6，与OVA组相比**p<0.01)；
图3是齐墩果酸可吸入粉末制剂对哮喘和慢性阻塞性肺病模型(OVA诱导)大鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IL-6含量的影响图(n＝6，与OVA组相比*p<0.05)；
图4是齐墩果酸可吸入粉末制剂对哮喘和慢性阻塞性肺病模型(OVA诱导)大鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞的生物标记物(MPO)的影响图(n＝6，与OVA组相比***p<0.001)；
图5是齐墩果酸的雾化吸入剂对LPS联合烟草烟雾暴露所致COPD模型大鼠BALF中炎症因子IL-1β表达的影响图(n＝12，与CS组相比*p<0.05，***p<0.001)；
图6是齐墩果酸的雾化吸入剂对LPS联合烟草烟雾暴露所致COPD模型大鼠BALF中炎症因子IL-6表达的影响图(n＝12，与CS组相比**p<0.01，***p<0.001)；
图7是齐墩果酸的雾化吸入剂对LPS联合烟草烟雾暴露所致COPD模型大鼠功能残气量(FRC)的影响图(n＝12，与CS组相比*p<0.05，**p<0.01)；
图8是齐墩果酸(OA)对巨噬细胞Raw264.7中A20蛋白表达的影响图；
图9是齐墩果酸(OA)对巨噬细胞Raw264.7中A20mRNA表达的影响图；
图10是齐墩果酸(OA)对大鼠支气管上皮细胞中A20蛋白表达的影响图。
具体实施方式
下面通过具体实施例说明本发明的内容。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1
齐墩果酸的可吸入粉末制剂的制备
药品及试剂：齐墩果酸购自西安博联特化工有限公司；其他辅料购自SIGMA公司。
(1)用于可呼吸粉末制剂的微粉化颗粒制备
在使齐墩果酸(60mg)与各种赋形剂(40mg)混合后，用气流粉碎机进行微粉化，制备微粉化颗粒。采用作为赋形剂的赤藓糖醇、乳糖、羧甲基纤维素钠、支链淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、山梨醇、碳酸钙或绵白糖。
研磨条件：
采用的机械:AO型气流粉碎机
进料方式:自动进料器
补充气压:6.0kg/cm2G
研磨气压:6.5kg/cm2G
粉末收集方法:出口井(聚乙烯)
各得率分别如下。
微粉化颗粒1(赋形剂:赤藓糖醇)76.1％
微粉化颗粒2(赋形剂:乳糖)63.0％
粉化颗粒3(赋形剂:羧甲基纤维素钠)60.9％
微粉化颗粒4(赋形剂:支链淀粉)75.2％
微粉化颗粒5(赋形剂:聚乙烯吡咯烷酮)69.0％
微粉化颗粒6(赋形剂:甲基纤维素)72.4％
微粉化颗粒7(赋形剂:山梨醇)87.9％
微粉化颗粒8(赋形剂:甘露醇)68.4％
微粉化颗粒9(赋形剂:碳酸钙)73.1％
微粉化颗粒10(赋形剂:绵白糖)62.8％
(2)可吸入粉末制剂的制备
将(1)中得到的微粉化颗粒与载体(按照1：10的重量比)一起放入由聚乙烯制成的STAT-3S抗静电袋，充气后密封，用于摇动约3分钟混合内容物，然后得到表1中所示的制剂1～20。混合后任意从五处取样，经UPLC/ESI-MS测定含药量，从而确定含量的均匀性。此时，将赤藓糖醇(平均粒径:20-30μm)或乳糖(平均粒径:50-60μm)用作载体。
表1.制剂1～20中的微粉化颗粒的平均粒径
赋形剂 载体 微粉化颗粒的平均粒径(μm)
制剂1 赤藓糖醇 乳糖 7.0
制剂2 乳糖 乳糖 5.7
制剂3 羧甲基纤维素钠 乳糖 7.2
制剂4 支链淀粉 乳糖 6.3
制剂5 聚乙烯吡咯烷酮 乳糖 6.4
制剂6 甲基纤维素 乳糖 7.3
制剂7 山梨醇 乳糖 4.1
制剂8 甘露醇 乳糖 6.5
制剂9 碳酸钙 乳糖 7.7
制剂10 蔗糖 乳糖 3.8
制剂11 赤藓糖醇 赤藓糖醇 4.6
制剂12 乳糖 赤藓糖醇 5.3
制剂13 羧甲基纤维素钠 赤藓糖醇 7.8
制剂14 羧甲基纤维素钠 赤藓糖醇 5.7
制剂15 聚乙烯吡咯烷酮 赤藓糖醇 4.4
制剂16 甲基纤维素 赤藓糖醇 3.7
制剂17 甲基纤维素 赤藓糖醇 7.6
制剂18 甘露醇 赤藓糖醇 4.8
制剂19 碳酸钙 赤藓糖醇 6.1
制剂20 蔗糖 赤藓糖醇 3.5
(3)可吸入粉末制剂的粒度分布的测定
经采用干型激光衍射装置(LMS-300，Seishin Enterprise)评价微粉化颗粒和载体的混合物，在0.2MPa压力下容易地进行任何制剂的烟雾化。实验结果表明，含有微粉化颗粒1和乳糖载体的混合物(制剂1)的粒度分布主要显示出两个主峰，具有平均粒径7μm的峰出现在微粉化颗粒中，和具有平均粒径60μm的峰出现在载体中。至于其它制剂，平均微粉化颗粒的平均粒径的范围为3.0～8.0μm，认为吸入时载体保留在呼吸道和吸入时微粉化颗粒可抵达支气管或肺。表1显示经分析得到的制剂1～20中的微粉化颗粒的平均粒径。
实施例2
齐墩果酸雾化吸入用混悬液的制备
雾化吸入用齐墩果酸混悬液的单支组分及其配量如表2所示。
表2雾化吸入用齐墩果酸混悬液的单支组分及其配量表
单支组分 配量
齐墩果酸无菌原料 10mg
乙二胺四乙酸二钠 0.2mg
氯化钠 16mg
聚山梨酯80 0.5mg
无水柠檬酸 0.5mg
柠檬酸钠 1mg
注射用水 加水至3mL
吸入用齐墩果酸混悬液的具体制备步骤如下：
步骤1、干热灭菌步骤：将齐墩果酸原料加入玻璃容器或其它容器中，充氮完全后密封，采用160～170度干热灭菌，灭菌时间为120min，制得齐墩果酸的无菌原料。
步骤2、制备混悬液：将上述齐墩果酸无菌原料采用转速5000rpm分散在灭菌的辅料溶液中，分散时间5min，得到含有齐墩果酸的混悬液。
步骤3、高压均质化：将步骤2的含有齐墩果酸的混悬液通过高压均质机湿微粉化，高压均质化的压力为500bar，得到微粉粒径分布d(v,0.5)＝1～3μm，d(v,0.9)<5μm，采用注射用水定容得到齐墩果酸混悬液。
步骤4、灌封：将步骤3得到的齐墩果酸混悬液灌封至3ml安瓿瓶，制得到吸入用齐墩果酸混悬液。
将步骤4得到的含齐墩果酸的雾化吸入用混悬液填装到雾化杯中，开启雾化吸入机，即可用于雾化吸入治疗。
实施例3
齐墩果酸可吸入粉末制剂对哮喘和慢性阻塞性肺病模型(OVA诱导)大鼠疗效验证
经蛋清源卵白蛋白(OVA)-敏感的动物模型是典型的哮喘和慢性阻塞性肺病模型。采用该模型评价可吸入制剂1(参照实施例1的方法制备)的治疗效果。通过对被起抗原作用的OVA敏化的动物气道给予OVA可吸入粉末制剂使该模型在呼吸器官产生局部炎症，抗原在肺中产生中性白细胞炎症和嗜酸性白细胞增多。
动物：Sprague-Dawley大鼠(8～11周龄)，购于北京维通利华。所有动物保持12小时交替的昼夜节律，自由饮食。
试剂：蛋清源卵白蛋白(SIGMA)和氢氧化铝凝胶(SIGMA)
气道药物治疗工具：DP-4(Ina Research,Inc.)
通过第0、7和14天腹膜内注射OVA溶液(OVA：0.33mg/kg含16.6mg明矾)敏化动物。最后OVA敏化后24h时气管内给予它们OVA可吸入粉末制剂(100μg作为OVA量)。在经戊巴比妥钠麻醉后，经在气道中插入DP-4发送压缩空气进行气管内给药。
对对照组采用经使用乳糖制备的可吸入粉末制剂。
在OVA可呼吸入粉末制剂药物处理前1小时进行制剂1(l mg/kg)的预先用药治疗(表3)。
表3.给药治疗方案
药物预处理 最终敏化后24小时
OAV组 乳糖-干粉吸入剂 OAV-干粉吸入剂
对照组 乳糖-干粉吸入剂 乳糖-干粉吸入剂
制剂1组 制剂1-干粉吸入剂 OAV-干粉吸入剂
众所周知，支气管肺泡灌洗液(BALF)可用于呼吸疾病的诊断。在本实施例中，通过对BALF中的总细胞(主要由单核细胞和中性白细胞组成)计数评价炎症和组织损伤。在OVA激发后24h，在耐波他麻醉下从腹主动脉除血后，通过将套管插入气道用5mL PBS洗涤气道，收集BALF。收集的BALF经集中并离心5min，然后除去上清液，用1mL PBS使细胞再悬浮。采用手工血球计在显微镜下对BALF中的细胞的总数量计数，采用ELISA试剂盒测定BALF中炎症因子(TNF-α和IL-6)的含量。
实验结果(图1)表明，在OVA组中，于最后敏化后的24小时，BALF中的总细胞数增加至与对照组相比的约5倍。另一方面，在制剂1组中，与OVA组相比，BALF中的总细胞数下降约60％。实验结果(图2和图3)表明，相较于对照组，OVA组BALF中的TNF-α和IL-6含量显著增加。另一方面，在制剂1组中，与OVA组相比，BALF中的TNF-a和IL-6含量分别减少约40％和35％。也就是说，通过用制剂1(1mg/kg)预处理，由OVA敏化导致的炎症反应显著降低。
为了进一步检测制剂1的药理学作用，本发明人测定了BALF中的各种肺炎损伤生物标记。其中，选择髓过氧化物酶(MPO)作为中性白细胞炎症的生物标记。在气道炎症和纤维化中，从中性白细胞/巨噬细胞中分泌出的MPO起促炎介质的作用。因此，MPO的酶活性起中性白细胞的生物标记的作用。MPO活性的测定结果如图4所示。与对照组比，最终敏化后24小时，OVA组中的MPO活性显著增加。另一方面，在制剂1组中，最后敏化后24小时，与OVA组比，制剂1组药物治疗使MPO活性减少约55％。因此，认为制剂1能有效抑制中性粒细胞炎症和伴随其的酶系统的失调。
以上数据表明，齐墩果酸可吸入粉末制剂对在慢性阻塞性肺病、哮喘和肺纤维化等呼吸系统疾病中观察到的肺局部炎症的治疗具有可行性。
实施例4
齐墩果酸的雾化吸入剂对LPS联合烟草烟雾暴露所致慢性阻塞性肺病动物模型的疗效验证
实验方案
采用雄性Sprague-Dawley大鼠(7～8周龄，200-250g)，饲养温度与湿度：20～26℃，40～70％，采用12h:12h昼夜间断照明；自由进食饮水。设立空白对照组(CTL)、模型对照组(CS)、阳性对照组(布地奈德作为阳性对照)(BUD)、齐墩果酸低剂量组(Low)、齐墩果酸中剂量组(Mid)和齐墩果酸高剂量组(High)，共6个组(每组12只大鼠)。模型组大鼠按照3ml/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛溶液，待大鼠麻醉后固定，从气道滴入LPS溶液(0.2ml,1mg/ml)。在实验第1天和第14天给予大鼠气道滴入LPS(0.2ml，1mg/ml)，除第1天和第14天外，给予烟草烟雾暴露。香烟暴露频率为6天/周，每天上下午分别暴露1小时，中间休息20分钟，上下午间隔至少4小时，香烟支数从6支/次逐步增加，每天增加1支至10支/次，6天/周。空白组不进行任何操作，其余各组在模型建立第61天开始给药(给药剂量参照表4)，采用雾化吸入剂每天给药1次，共计给药30天，然后取材并检测各项指标。布地奈德雾化吸入剂的制备参照中国专利申请201711378009.6的方法。齐墩果酸雾化吸入剂的制备参照实施例2的方法。
表4给药剂量表
Figure BDA0002030460210000121
实验结果
空白对照组大鼠无死亡，毛发光泽，呼吸均匀，活动正常；COPD模型组大鼠毛发呈黄色，无光泽，熏烟及给药时聚集出汗，与空白对照组比较，模型组体重下降。
如图5和图6所示，与空白对照组(CTL)比较，模型对照组(CS)BALF中炎症因子IL-1β和IL-6的表达显著升高；经过布地奈德(BUD)(0.1mg/kg)雾化吸入给药后BALF中的IL-1β和IL-6的表达显著下降；雾化吸入齐墩果酸各剂量组BALF中IL-1β和IL-6表达下降，其中，中剂量(0.1mg/kg)和高剂量(0.5mg/kg)的齐墩果酸对IL-1β和IL-6表达的降低效应均优于布地奈德(BUD)(0.1mg/kg)。以上结果表明，齐墩果酸可显著降低COPD症状中炎性因子IL-1β和IL-6的表达。
如图7所示，与空白对照组比较，模型对照组功能残气量(FRC)增加，提示慢性阻塞性通气障碍。与模型组对照组比较，雾化吸入布地奈德(BUD)及齐墩果酸均导致FRC下降，这提示雾化吸入齐墩果酸可改善COPD症状下的肺功能。
以上结果表明，雾化吸入齐墩果酸可显著抑制COPD动物模型中气道的炎症反应，并改善肺功能。
实施例5
齐墩果酸(OA)对巨噬细胞Raw264.7中A20表达的影响
1、细胞培养
DMEM完全培养基(含10％胎牛血清和1％streptomycin/penicillin)在5％CO2的37℃培养箱中培养。
2、Western Blot实验
取活细胞比例90％以上的细胞进行实验。倒掉培养基，使用细胞刮刀将细胞从培养皿表面刮下来，注意不要太用力，不要损伤细胞。加培养基，1000rpm/5min离心，倒去上清液。将沉淀重悬后用细胞计数；然后6孔板每孔铺40-60万个细胞，将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜，细胞贴壁。给药浓度为0.1μM到10μM，给药时间为6h，后续提取蛋白进行Western Blot实验检测。
3、qPCR实验
RNA提取：a.将六孔板放置在冰上，用pH 7.4的PBS洗细胞两次，吸尽PBS；b.6孔板每个孔中加入1mL Trizol，覆盖细胞表面，放置在冰上5min，此时取1.5mL的无RNA酶的EP管编号；c.用1mL的枪吹打几次，移出细胞裂解物于1.5mL EP管，冰上放置5min，充分解离细胞；d.加入200μL氯仿，颠倒混匀15秒。冰上放置10min后离心(离心条件:4℃，12000rpm，15min)；e.仔细缓慢取上层清液(约为所加Trizol的50％)转入新的1.5mL EP管，勿吸到下层蛋白；f.加入500μL异丙醇，颠倒混匀，冰上放置10min后离心(离心条件:4℃,12000rpm,10min)；离心之后可见管底有胶状片状沉淀为RNA，小心倾倒上清；g.再加入75％乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤RNA后，离心(离心条件:4℃,12000rpm,5min)；h.倒掉上清液,小心防止RNA沉淀丢失，将离心管倒扣于纸上风干。
逆转录成cDNA：a.根据所得到的RNA量的多少，用DEPC水溶解RNA(6孔板每孔一般约20μL)；b.使用ThermoNanoDrop Lite测定RNA浓度。其中A260/280的比值在1.8-2.0之间证明RNA纯度合格；c.依据RNA浓度及后续实验所需要的cDNA的量来确定逆转录体系(一般选用20μL体系)及需要加的试剂的量,每20μL体系最大容纳1000ng RNA；d.于PCR小管中加入RNA及混合试剂，顺序依表；
Mix 4μL
总RNA VRNA＝1000ng/RNA浓度
ddH2O 20-4-VRNA
e.将混合好的试剂和RNA离心后，放置于PCR仪。逆转录得到cDNA。逆转录条件：37℃5min,85℃5sec,4℃∞；
定量聚合酶链式反应(qPCR)：
a.配制PCR混合液配制标准如下表：
b.PCR 96孔板每孔中加入18μL混合PCR工作液和2μL cDNA，每孔20μL体系。注意冰上操作并且避光；
c.封膜，观察并离心除去气泡；
d.q-PCR扩增反应条件：
Figure BDA0002030460210000142
数据处理
采用2^(-ΔΔCT)法计算RNA的相对量，然后用GraphPad Prism 6作图。
4、实验结果
Western Blot实验结果(图8)显示，在0.1μM到10μM浓度下，OA能够剂量依赖性地上调巨噬细胞A20蛋白的表达。q-PCR结果(图9)显示，在90分钟时A20mRNA的水平随OA剂量依赖性增加。总之，OA能够在巨噬细胞上增加A20的蛋白水平，并同时上调A20基因转录水平。
以上结果表明，齐墩果酸可通过显著上调内源性抗炎/抗纤维化因子A20的表达，进而对呼吸系统疾病发挥疗效。
实施例6
齐墩果酸(OA)对大鼠支气管上皮细胞中A20表达的影响
细胞培养基Western Blot实验参照实施例5的方法进行。Western Blot实验结果(图10)表明，在10nM到10μM浓度下，OA能够剂量依赖性地上调大鼠支气管上皮细胞中A20蛋白的表达。
以上结果表明，齐墩果酸可通过上调支气管上皮细胞中A20的表达，进而发挥对呼吸道细胞的保护作用。

Claims (10)

1.齐墩果酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物或酯或共晶在制备预防或治疗呼吸系统疾病药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述呼吸系统疾病包括哮喘、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述呼吸系统疾病还包括肺心病、肺动脉高压、肺结核、过敏性鼻炎、慢性鼻炎和鼻窦炎。
4.一种用于预防和治疗呼吸系统疾病的吸入剂，其特征在于，以齐墩果酸、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其共晶或其酯作为活性成分，并含有药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的吸入剂，其特征在于，所述吸入剂为干粉制剂，包括活性成分、赋形剂和载体，其中，所述赋形剂选自糖、糖醇、大分子聚合物和碳酸钙中的一种或多种，所述载体选自乳糖、葡萄糖、果糖、蔗、麦芽糖、葡聚糖、赤藓糖醇、山梨醇、甘露醇、硫酸钙、碳酸钙、滑石或氧化铁。
6.根据权利要求5所述的吸入剂，其特征在于，所述活性成分和赋形剂混合形成微粉化颗粒，所述微粉化颗粒粒径为20μm以下，所述载体粒径为10～200μm。
7.根据权利要求6所述的吸入剂，其特征在于，所述有效成分和赋形剂的重量比为1:5000～10:1；所述微粉化颗粒和载体的重量比在1:100～10:1。
8.根据权利要求4所述的吸入剂，其特征在于，所述吸入剂为雾化吸入混悬液，其制备方法包括以下步骤：
(1)干热灭菌：取活性成分加入容器中，充氮完全后密封，采用高温干热灭菌制得无菌原料；
(2)制备混悬液：将步骤(1)的无菌原料分散在灭菌的辅料溶液中，得到混悬液；
(3)高压均质化：将步骤(2)的混悬液通过高压均质机湿微粉化，采用注射用水定容得到雾化吸入混悬液，灌封至安瓿瓶即可。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述齐墩果酸的共晶是齐墩果酸与胆碱形成的共晶。
10.权利要求4、5或8所述吸入剂在制备预防和治疗哮喘、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、囊性纤维化肺病、肺心病、肺动脉高压、肺结核、过敏性鼻炎、慢性鼻炎和鼻窦炎等呼吸系统疾病的药物中的应用。
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