CN110664804B - 化合物ag-041r在制备抵抗免疫细胞焦亡药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学生物学领域，涉及AG‑041R在制备抵抗免疫细胞焦亡药物中的应用。本发明公开了化合物AG‑041R作为直接抑制GSDMD蛋白活性在制备抵抗免疫细胞焦亡药物中的应用。具体可以药物是以AG‑041R为活性成分，加入医药上常规的助剂制备成的粉剂、片剂或注射剂。本发明药物中的活性成分合成简单，其对免疫细胞焦亡具有较好的抑制作用，最适抑制浓度为10μM，可以作为感染性疾病、神经退行性疾病等的治疗药物，治疗效果显著。

Description

化合物AG-041R在制备抵抗免疫细胞焦亡药物中的应用
技术领域
本发明属于化学生物学领域，具体涉及化合物AG-041R作为直接抑制GSDMD蛋白活性在制备抵抗免疫细胞焦亡药物中的应用。
背景技术
细胞焦亡(Pyroptosis)是近年来发现的一种新型程序性细胞死亡形式。其具体表现在外源微生物进入在巨噬细胞等免疫细胞后，激活胞内受体引起细胞快速死亡，并伴有大量促炎症因子的释放。各项研究表明，细胞焦亡在感染性疾病、神经退行性疾病、艾滋病感染过程以及动脉粥样硬化性等中均有重要作用。对细胞焦亡的调控研究，对于相关疾病的发展认识以及治疗均具有重要作用。
近年的研究发现，在微生物侵入等引起的免疫细胞焦亡过程，主要由细胞内的模式识别受体(pattern recognition receptors)识别，并且招募Caspase-1并激活Caspase-1，Caspase-1剪切IL-1β和IL-18前体，产生成熟的IL-1β和IL-18。同时Caspase-1会剪切焦亡过程的执行蛋白GSDMD，产生的GSDMD的N端发生多聚并且移位至细胞膜，导致细胞破裂死亡，并将大量的成熟IL-1β和IL-18释放至细胞外，导致严重的炎症。主要的模式识别受体包括NLRP3、NLRC4和AIM等，识别不同的感染信号。因此干扰GSDMD的激活和功能，进而抑制细胞死亡，对于抑制焦亡所产生的剧烈炎症具有重要作用。
AG-041R结构如下式(II)所示，是Gastrin/CCK2 Receptor拮抗剂，有报道称其在抑制胃肠道肿瘤细胞系生长、促进软骨生成的作用，目前并没有在临床上的应用。目前尚未关于AG-041R及其衍生物在抑制免疫细胞焦亡的报道，并且目前临床也并没有专门针对细胞焦亡的药物使用。
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发明内容
本发明的目的在于克服现有干预细胞焦亡小分子药物空白，提供了AG-041R在医学上的一种新用途。
本发明公开了AG-041R在制备抵抗免疫细胞焦亡药物中的应用。
本发明中的药物以式(II)所示的化合物为活性成分，加入医药上常用的助剂可制备成粉剂、片剂或注射剂等。
本发明通过AG-041R处理巨噬细胞系J774A.1，发现10uM AG-041R可明显抑制3mMATP所诱导的细胞死亡。检测ATP诱导细胞焦亡的主要效应蛋白，发现与LPS处理组相比，无论是激活形式的Caspase-1还是剪切形式的GSDMD均呈现浓度依赖性的显著上调。为了进一步验证AG-041R作用于GSDMD下游，构建了Tet-on诱导表达GSDMD激活形式的293T表达体系。诱导GSDMD激活形式表达将导致293T细胞死亡，而加入10uM AG-041R可以显著抑制GSDMD激活形式表达所导致293T细胞死亡。在小鼠模型中，10mg/kg腹腔注射AG-041R可以显著抑制16mg/kg腹腔注射LPS所导致的体温下降，并且抑制血液中的IL-1β和IL-18的含量。在生物机体遭受病原微生物感染时，机体通过启动免疫防御抵抗微生物的入侵，其中免疫细胞焦亡便是帮助机体清除病菌的关键一环。免疫反应是一把“双刃剑”，强大的免疫防御功能可以保护机体免于病菌侵扰，但过度的免疫反应也会损伤机体本身的各大器官与组织。由致病菌感染导致的脓毒症便是其中的一个典型，脓毒症引起的“炎症风暴”会对机体造成不可逆的损伤。因此抑制免疫细胞的焦亡能够帮助减轻炎症反应。根据以上结果，AG-041R具有通过抑制GSDMD激活形式功能进而抑制免疫细胞焦亡的功能，并且在LPS腹腔注射所构建的炎症模型中具有抑制炎症的作用。
本发明的有益效果是：本发明药物中的活性成分合成简单，其对免疫细胞焦亡具有较好的抑制作用，最适抑制浓度为10μM，可以作为感染性疾病、神经退行性疾病等的治疗药物，治疗效果显著。
附图说明
图1为不同浓度的AG-041R对于3mM ATP诱导的J774A.1焦亡具有抑制作用的细胞照片；
图2为流式检测PI染色测定不同浓度的AG-041R对于3mM ATP诱导的J774A.1死亡情况；
图3为LDH release assay测定不同浓度的AG-041R对于3mM ATP诱导的J774A.1死亡情况；
图4为AG-041R介导的焦亡抵抗已知靶点Gastrin/CCK2 Receptor并无关系；
图5为AG-041R介导的焦亡抵抗并不干扰Caspase-1的激活和GSDMD的剪切；
图6为不同浓度的AG-041R可以直接抑制GSDMD激活形式表达诱导293T细胞死亡的细胞照片；
图7为LDH release assay测定不同浓度的AG-041R可以抑制GSDMD激活形式表达诱导的293T细胞死亡；
图8为10mg/kg腹腔注射AG041R显著抑制16mg/kg腹腔注射LPS所导致的小鼠体温下降；
图9为10mg/kg抑制16mg/kg腹腔注射LPS小鼠血液中的IL-1β的含量；
图10为10mg/kg抑制16mg/kg腹腔注射LPS小鼠血液中的IL-18的含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本发明所使用J774A.1细胞采购自武汉大学生命科学学院中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，所用培养基为HyClone RPMI培养基，添加10％胎牛血清和双抗。本发明所使用293T细胞采购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)，所用培养基为HyClone High GlucoseDMEM培养基，添加10％胎牛血清和双抗。所使用培养基，血清以及双抗均为商购来源，按照生产厂家所提供的使用说明使用。细胞常规培养于37℃，5％CO2培养箱，细胞呈贴壁生长。
本发明所使用AG-041R药物以及YM220均购买自美国CaymanChemical公司。高效液相检测纯度＞98％，涉及的其他材料也均为商购来源，按照生产厂家所提供的使用说明使用。
本发明所使用LPS药物购买自德国sigma公司，货号L4391。
实施例一：AG-041R对ATP诱导的焦亡具有抵抗作用
待J774A.1细胞生长至80％～90％时将细胞铺至六孔板中，培养基2ml。首先加入LPS预处理4h后，加入终浓度为3mM ATP。AG-041R处理组加入AG-041R的工作浓度分别为5uM、10uM和20uM，对照组加入等量DMSO。加入3mM ATP一小时后，采集图像，随后收取细胞进行PI染色进行流式分析细胞死亡情况，同时收取上清进行LDH release Assay。实验结果显示AG-041R对3mM ATP诱导的巨噬细胞焦亡呈现浓度依赖性抵抗作用。在图1中可见阴性对照组(图1A)的细胞生存状态良好，使用3mM ATP诱导焦亡的组(图1B)中局势细胞呈现焦亡的特殊形态学特征。加入梯度浓度的AG-041R处理后(5uM,10uM和20uM)，J774A.1细胞对3mMATP诱导的细胞焦亡具有明显抵抗作用(图1C,图1D和图1E)。除了对细胞形态的检测之外，采取流式细胞术对细胞的死亡情况进行定量分析。如图2所示，使用10uM和20uM AG-041R处理后，细胞死亡比例相较于ATP处理组呈现明显下降的趋势。如图3，将收取的上清进行LDHrelease Assay，可见梯度AG-041R处理后上清中LDH活性明显低于ATP处理的阳性对照组。实验结果显示AG-041R对ATP诱导的细胞焦亡具有抵抗作用。
实施例二：AG-041R介导的对细胞焦亡的抵抗作用并不是通过AG-041R已知靶点Gastrin/CCK2 Receptor发挥作用
使用Gastrin作为Gastrin/CCK2 Receptor激动剂，YM220作为Gastrin/CCK2Receptor的拮抗剂，将J774A.1细胞铺至六孔板中，培养基2ml。首先加入LPS处理4h后，加入终浓度为3mM ATP。如图4，实验分为4组，对照组加入等量DMSO，AG-041R组加入10uMAG041R，激动剂组加入1uM和10uM Gastrin，抑制剂组加入Gastrin/CCK2 Receptor拮抗剂10uM和20uM YM220。加入3mM ATP 1h后，收取上清进行LDH release Assay，可见AG-041R处理后上清中LDH活性检测明显低于ATP处理的阳性对照组，但是激动剂组(Gastrin)和拮抗剂组(YM220)与对照并无显著性差异。实验结果显示AG-041R介导的细胞焦亡抵抗作用与AG-041R已知靶点Gastrin/CCK2 Receptor并无关系。
实施例三：AG-041R介导的焦亡抵抗并不干扰Caspase-1的激活和GSDMD的剪切
将J774A.1细胞铺至六孔板中，培养基2ml。首先加入LPS处理4h后，加入终浓度为3mM ATP。AG-041R处理组加入AG-041R的终浓度分别为5uM、10uM和20uM，对照组加入等量DMSO。加入3mM ATP1h后，提取细胞中蛋白，进行western blot检测。所用抗体为Caspase-1和GSDMD检测Caspase-1和GSDMD的剪切激活情况。如图5，结果显示Caspase-1和GSDMD剪切条带均呈现上升趋势，说明AG-041R介导的焦亡抵抗并不干扰Caspase-1和GSDMD的剪切激活情况。由于细胞并没有死亡，细胞内焦亡信号通路一直激活，导致其剪切进一步上调。
实施例四：AG-041R可以直接抑制GSDMD激活形式表达所诱导的293T细胞死亡
构建Tet-on GSDMD N端慢病毒，感染293T细胞，并通过慢病毒所携带的puromycin抗性进行筛选，得到Tet-on GSDMD N端293T细胞系。将所得到Tet-on GSDMD N端293T细胞系分盘至六孔板中，并加入终浓度为1.3ug/L doxorubicin诱导GSDMD N端表达。对照组加入等量DMSO，实验组加入终浓度10uM AG-041R。结果如图6所示，通过对细胞形态的检测发现加入doxorubicin诱导GSDMD N端表达的细胞出现大量死亡，而加入5uM和10uM AG-041R的细胞生存状态较好。进一步通过对细胞培养液中LDH活性的检测证明AG-041R使293T细胞的死亡受到显著抑制(图7)。结果说明AG-041R可以直接抑制GSDMD激活形式表达所诱导的293T细胞死亡。
实施例五：
小鼠腹腔注射AG-041R干预LPS腹腔注射脓毒症模型
实验动物：本实施案例所使用8周龄的C57BL/6J雄性小鼠饲养于南京大学模式动物研究所。所有实验小鼠相关饲养、实验程序严格按照南京大学模式动物研究所实验动物守则中规定进行，包括饲养于SPF环境，温度控制在23～25℃，湿度制在55±5％，间隔12h光照等。
本实验所用药物LPS,AG-041R具体信息同上所述，不再赘述。
实验方法与结果：8周龄C57BL/6J小鼠分为对照组和实验组，每组六只。按照16mg/kg腹腔注射LPS诱导脓毒症，对照组注射响应体积PBS，实验组按10mg/kg注射AG-041R。在注射2h后，测量各组小鼠体温，如图8，对照组体温下降较快，而是实验组体温明显高于对照组。注射后3h对各组小鼠眼眶采血，提取血清，通过Elisa方法测定小鼠血清中IL-1β和IL-18含量，实验组小鼠血清中IL-1β(图9)和IL-18(图10)含量显著低于对照组。结果说明AG-041R对于LPS脓毒症小鼠具有保护功能。

Claims (2)

1.AG-041R在制备治疗由免疫细胞焦亡引发的疾病的药物中的应用，所述由免疫细胞焦亡引发的疾病为脓毒症。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是以AG-041R为活性成分，加入医药上常规的助剂制备成的粉剂、片剂或注射剂。
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