CN110650794B - 测序和高分辨率成像 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于检测和辨别来自密集封装的基底的光学信号的方法和系统。这些方法和系统广泛应用于接近或低于光学系统的衍射极限的生物分子检测，包括应用于改善多核苷酸测序应用的效率和准确度。

Description

测序和高分辨率成像
相关申请的交叉引用
该申请要求于2017年3月17号提交的美国临时申请号62/473,163的权益，该临时申请的整体公开内容通过引用而全文并入于此用于所有目的。
背景技术
降低测序成本对于实现医疗保健改善至关重要。衡量测序成本的标准是30X人类基因组(被定义为90千兆碱基对)的价格。
基因组的价格从2007年至2011年大幅度下降，那之后价格稳定在每个基因组略低于10,000美元。近期所实现的每个基因组1,000美元成为重要的里程碑。下一个重要的里程碑为每个基因组100美元，这预计将花费数年的时间。本发明讨论了在实质上缩短的时间范围内实现每个基因组10美元的方法。在这个价格点上，对每个新生儿进行测序将是经济的，并且将显著降低疾病诊断和筛查——尤其是在肿瘤学领域的成本障碍。
测序系统的主要成本构成主要是耗材，其中包括生物芯片和试剂，其次是仪器成本。
为了实现10美元30X基因组，即成本降低100倍，则需要将每单位面积的数据量增加100倍，并且需要将每个数据点的试剂量减少100倍。
在一个簇密度为每平方厘米一千万个分子的1,000美元基因组平台的实例中，每个分子平均占据10um2的芯片面积。因此，平均有效间距为3,160nm。如果少用100倍的拷贝能够获得高100倍的密度，则对于相同的芯片面积和试剂，将获得多100倍的信息，从而使成本降低100倍。如果密度高100倍，则新的间距需为320nm。用于平衡试剂使用的拷贝数为10个拷贝/分子，比1,000个拷贝/簇少了100倍。
因此，需要一种可以分辨间距为约320nm的单分子的光学信号的光学成像系统。但是，由于由λ/(2*N.A.)定义的光的衍射极限，要实现该分辨率具有挑战性，其中λ是光的波长，而N.A.是光学成像系统的数值孔径，其在基于水的体系(如用于测序和分析物检测的体系)中接近1。因此，对于检测在650nm附近发射的光学信号而言，320nm的间隔接近或低于衍射极限，这可能会妨碍对该类阵列上的各个特征的分辨。
尽管存在不受光学信号的衍射极限所限制的其他方法，如由诸如Ion Torrent(由Thermo Fisher收购)和Oxford Nanopore等公司开发的基于电气的系统，但是目前基于图像的测序系统在所有现有的测序技术中具有最低的测序成本。基于图像的系统通过高通量成像光学元件与低成本耗材的组合而实现低成本。
因此，所需要的是克服衍射极限以便于提高对紧密封装的基底上的各个特征的分辨率的光学成像方法和系统，从而可以高准确度地实现低于衍射极限的分辨率。这些方法和系统可以具体应用于高分辨率特征检测中，包括用于多核苷酸序列检测的光学成像。
发明内容
用于对固定至基底表面的单分子分析物进行亚衍射极限成像的方法和系统。基底包括用于与分析物进行结合反应的流动池等。分析物包括在表面上用于单分子分辨的离散位置处间隔开的生物分子，如个体多核苷酸或蛋白质。这些方法和系统可以用于诸如单分子合成测序等应用中的高分辨率单分子检测。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于以单分子分辨率对以高密度固定在基底表面上的多个多核苷酸进行测序的方法，其包括：提供包含表面的基底，其中所述表面包含在离散位置处固定在所述表面上的多个多核苷酸，并且其中所述表面包含用于合成测序的试剂；进行多个循环的单分子合成测序，每个循环包括：使所述多核苷酸与一组包含可检测标记的可逆终止子核苷酸接触；用光学系统对所述表面的场进行成像，以检测来自掺入所述多核苷酸中的每个核苷酸的光学信号，从而检测所述循环的所述场中的多个光学信号；根据来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中的每一个光学信号来确定峰位置；将每个光学信号的所述峰位置叠加，并将光学分布模型应用到每个光学信号簇，从而以改善的准确度来确定所述表面上的每个检测的分析物的相对位置；使用所述确定的相对位置和去卷积函数，对来自每个循环的每个场图像中的所述光学信号进行去卷积；根据所述去卷积的光学信号来识别每个场和每个循环中掺入所述多核苷酸中的所述可检测标记；以及在每个多核苷酸位置处根据所述多个循环中的所述识别的可检测标记对固定在所述基底表面上的所述多个多核苷酸进行测序。
在一些实施方案中，所述基底包含1,000个或更少、500个或更少、100个或更少、50个或更少、25个或更少、20个或更少、15个或更少或者10个或更少的包含相同序列的单分子的克隆拷贝。在一些实施方案中，所述多核苷酸为DNA多联体。
在一些实施方案中，每个循环还包括在使所述表面与所述多个可逆终止子核苷酸接触之后并且在对所述场进行成像之前，洗涤所述表面以去除未结合的核苷酸。在一些实施方案中，如果将进行另一循环，则所述循环还包括切割所述可逆终止子。在一些实施方案中，如果将进行另一循环，则所述循环还包括切割所述可检测标记。
在一些实施方案中，所述可逆终止子核苷酸组包含至少两种不同的核苷酸，每种核苷酸具有不同的可检测标记。在一些实施方案中，所述可逆终止子核苷酸组包含至少四种不同的核苷酸，每种核苷酸具有不同的可检测标记。在一些实施方案中，所诉可逆终止子核苷酸组包含腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和鸟嘌呤。在一些实施方案中，所述可逆终止子核苷酸组包含腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和鸟嘌呤。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包括脱氧核糖核酸或核糖核酸。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸的长度为约1kb至约100kb。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸的长度为约10kb至约50kb。在一些实施方案中，与所述表面结合的多核苷酸相隔至少10nm的距离。
在一些实施方案中，所述可检测标记与所述可逆终止子核苷酸的3'-OH基团结合。在一些实施方案中，并非是可检测标记的封闭基团与所述可逆终止子核苷酸的3’-OH结合。
在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸通过在离散位置与结合至所述表面的捕获探针进行结合而固定。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸与衔接子连接，所述衔接子包含与所述捕获探针的序列互补的捕获序列和与所述测序引物的序列互补的引发序列。在一些实施方案中，所述捕获序列为20至50mer。在一些实施方案中，所述引发序列为20至50mer。
在一些实施方案中，所述测序方法还包括通过比较一组具有相同序列的多核苷酸或者基于数据本身来进行先前循环回归以校正相位误差。
在一些实施方案中，所述去卷积包括使用来自所述确定的相对位置的相邻多核苷酸之间的中心距来去除来自所述相邻多核苷酸的干扰光学信号。在一些实施方案中，所述去卷积函数包括最近邻变量回归。在一些实施方案中，所述去卷积包括将来自每个循环中使用的每个独特的可检测标记的重叠波长分开。在一些实施方案中，所述去卷积函数包括串扰回归。在一些实施方案中，所述去卷积函数包括最近邻变量回归、平滑或串扰校正。
多核苷酸
在一些实施方案中，将所述多核苷酸在所述基底上间隔开，以供单分子合成测序。在一些实施方案中，将所述多核苷酸密集地封装在所述基底上，使得来自与包含待测序的不同多核苷酸序列的相邻多核苷酸结合的探针的所述可检测标记所发射的光学信号之间发生重叠。在一些实施方案中，所述固定在所述表面上的多核苷酸之间的平均间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。在一些实施方案中，至少两个固定在所述表面上的所述多核苷酸之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。在一些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的固定在所述表面上的所述多核苷酸与另一固定的多核苷酸之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。
在一些实施方案中，所述光学系统包括在0.2-2.0之间的数值孔径。在一些实施方案中，所述光学系统包括在1-1.1之间的数值孔径。在一些实施方案中，所述发射的光的波长为约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm或约650-700nm。
在一些实施方案中，所述固定的多核苷酸包含的相邻多核苷酸之间的最小中心距小于600nm、小于500nm、小于400nm、小于300nm或小于200nm。在一些实施方案中，所述多核苷酸以每平方微米约4-25个分子的平均密度固定在所述表面上。在一些实施方案中，所述多核苷酸以每平方微米超过4个、超过6个、超过8个、超过10个、超过15个或超过20个分子的平均密度固定在所述表面上。
在一些实施方案中，所述表面的成像以大于由所述光学系统的尼奎斯特极限所确定的临界采样率的分辨率进行。在一些实施方案中，所述表面的成像以至少为2X尼奎斯特采样频率的分辨率进行。在一些实施方案中，所述表面的成像沿图像场的轴以一个像素/300nm或更高的分辨率进行。在一些实施方案中，所述表面的成像沿图像场的轴以约162.5nm/像素的分辨率进行。
在一些实施方案中，所述测序方法还包括从来自每个循环的每个所述场图像生成具有更高像素密度的过采样图像。在一些实施方案中，所述过采样图像是基于所述光学信号的预期点扩散函数通过对每个场图像施加平滑而生成的。在一些实施方案中，从所述场图像或所述过采样图像生成包括来自所述图像的光学信号峰的位置的数据集。
在一些实施方案中，将所述峰位置叠加包括将多个所述循环的每个场中检测的所述光学信号峰的位置对齐，以从所述多个循环生成每个多核苷酸的光学峰位置的簇。在一些实施方案中，所述光学分布模型为高斯分布。在一些实施方案中，所述光学分布模型为点扩散函数。
在一些实施方案中，确定所述场中的多个所述多核苷酸的相对位置。在一些实施方案中，以10nm RMS内的准确度确定所述相对位置。
在一些实施方案中，所述测序方法还包括将来自不同循环的所述场的多个图像叠加，以确定相对于所述场的参考图像的相对偏移。在一些实施方案中，所述方法包括生成与所述参考场对齐的每个所述场的偏移值。在一些实施方案中，由所述偏移值确定每个场内的多核苷酸的相对位置。在一些实施方案中，所述偏移确定包括丢弃对齐在对齐阈值之外的场图像。在一些实施方案中，所述测序方法包括将来自所述场的多个图像叠加以确定相对于所述场的参考图像的相对偏移，其中以5nm RMS内的准确度确定所述相对位置。
在一些实施方案中，所述方法能够分辨来自密度为每平方微米约4-25的表面的光学信号。
在一些实施方案中，所述可检测标记发射光，并且所述多核苷酸以低于从所述可检测标记发射的光的衍射极限的平均间距固定在所述基底的表面上。
根据一些实施方案，本文还提供了一种用于准确地确定固定在密集封装的基底的表面上的分析物的相对位置的方法，所述方法包括：提供包含表面的基底，其中所述表面包含在离散位置处固定在所述表面上的多个分析物；在所述表面上进行多个循环的探针结合和信号检测(每个循环包括：使所述分析物与多个来自探针组的多个探针接触，其中所述探针包含可检测标记，其中每个所述探针与靶分析物特异性地结合；和用光学系统对所述表面的场进行成像，以检测来自与所述表面上离散位置处的所述分析物结合的各个探针的多个光学信号)；根据来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中的每一个光学信号来确定峰位置；以及将每个光学信号的所述峰位置叠加，并将光学分布模型应用到每个光学信号簇，从而以改善的准确度来确定所述表面上的每个检测的分析物的相对位置。
在一些实施方案中，所述方法还包括：使用所述确定的相对位置和去卷积函数，对来自每个循环的每个场图像中的所述光学信号进行去卷积；和根据所述去卷积的光学信号来识别每个场和每个循环中与所述固定的分析物结合的所述可检测标记。
在一些实施方案中，所述方法还包括使用在每个循环所检测的每个分析物的所述可检测标记的身份来识别所述基底上的多个所述分析物。
在一些实施方案中，所述去卷积包括使用来自相邻分析物的所述确定的相对位置的所述相邻分析物之间的中心距来去除来自所述相邻分析物的干扰光学信号。
在一些实施方案中，所述去卷积函数包括最近邻变量回归。在一些实施方案中，所述去卷积包括将来自每个循环中使用的每个独特的可检测标记的重叠波长分开。在一些实施方案中，所述去卷积函数包括串扰回归。在一些实施方案中，所述去卷积函数包括最近邻变量回归、平滑或串扰校正。
在一些实施方案中，所述分析物为单分子。在一些实施方案中，所述单分子为单生物分子。在一些实施方案中，所述单分子为多核苷酸。
在一些实施方案中，所述分析物密集地封装在所述基底上，使得来自与相邻分析物结合的探针的所述可检测标记所发射的光学信号之间发生重叠。在一些实施方案中，固定在所述表面上的所述分析物之间的平均间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。在一些实施方案中，至少两个固定在所述表面上的所述分析物之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。在一些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的固定在所述表面上的所述分析物与另一分析物之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。
在一些实施方案中，所述光学系统包括在0.2-2.0之间的数值孔径。在一些实施方案中，所述光学系统包括在1-1.1之间的数值孔径。在一些实施方案中，所述光的波长为约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm或约650-700nm。
在一些实施方案中，所述固定的分析物包括的相邻分析物之间的最小中心距小于600nm、小于500nm、小于400nm、小于300nm或小于200nm。在一些实施方案中，所述靶分析物以每平方微米约4-25个分子的平均密度固定在所述表面上。在一些实施方案中，所述靶分析物以每平方微米超过4个、超过6个、超过8个、超过10个、超过15个或超过20个分子的平均密度固定在所述表面上。
在一些实施方案中，每个循环还包括使用来自所述探针组的其他探针重复进行步骤i)和ii)。在一些实施方案中，每个循环还包括在使所述表面与所述多个探针接触之后并且在对所述场进行成像之前，从所述表面去除未结合的探针。在一些实施方案中，如果将进行另一循环，则每个循环还包括从所述表面去除结合的探针。
在一些实施方案中，进行至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个循环。在一些实施方案中，每个循环包括用所述光学系统对所述表面的多个场进行成像。
在一些实施方案中，所述表面的成像以大于由所述光学系统的尼奎斯特极限所确定的临界采样率的分辨率进行。在一些实施方案中，所述表面的成像以至少为2X尼奎斯特采样频率的分辨率进行。在一些实施方案中，所述表面的成像沿图像场的轴以一个像素/300nm或更高的分辨率进行。在一些实施方案中，所述表面的成像沿图像场的轴以约162.5nm/像素的分辨率进行。
在一些实施方案中，所述方法还包括从来自每个循环的每个所述场图像生成具有更高像素密度的过采样图像。在一些实施方案中，所述过采样图像是基于所述光学信号的预期点扩散函数通过对每个场图像施加平滑而生成的。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述场图像或所述过采样图像生成包括光学信号峰的位置的数据集。
在一些实施方案中，将所述峰位置叠加包括将多个所述循环的每个场中检测的所述光学信号峰的位置对齐，以从所述多个循环生成每个分析物的光学峰位置的簇。在一些实施方案中，所述光学分布模型为高斯分布。在一些实施方案中，所述光学分布模型为点扩散函数。
在一些实施方案中，确定所述场中的多个所述分析物的相对位置。在一些实施方案中，以10nm RMS内的准确度确定所述相对位置。
在一些实施方案中，所述方法还包括将来自不同循环的所述场的多个图像叠加，以确定相对于所述场的参考图像的相对偏移。在一些实施方案中，所述方法包括生成与所述参考场对齐的每个所述场的偏移值。在一些实施方案中，由所述偏移值确定每个场内的分析物的所述相对位置。在一些实施方案中，所述方法还包括丢弃对齐在对齐阈值之外的场图像。在一些实施方案中，所述方法还包括将来自所述场的多个图像叠加以确定相对于所述场的参考图像的相对偏移，其中以5nm RMS内的准确度确定所述相对位置。
在一些实施方案中，所述方法能够分辨来自密度为每平方微米约4-25的表面的光学信号。
在一些实施方案中，所述可检测标记发射光，并且其中结合至所述阵列的所述靶分析物包括低于从所述可检测标记发射的光的衍射极限的平均间距。
根据一些实施方案，本文还提供了一种用于识别固定在基底表面上的多个密集封装的分析物的方法，所述方法包括：提供包含表面的基底，其中所述表面包含在离散位置处固定在所述表面上的多个分析物；在所述表面上进行多个循环的探针结合和信号检测(每个循环包括：使所述分析物与来自探针组的多个探针接触，其中所述探针包含可检测标记，其中每个所述探针与靶分析物特异性地结合；和用光学系统对所述表面的场进行成像，以检测来自与所述分析物结合的各个探针的多个光学信号)；根据来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中的每一个光学信号来确定峰位置；将每个光学信号的所述峰位置叠加，并将光学分布模型应用到每个光学信号簇，从而以改善的准确度来确定所述表面上的每个检测的分析物的相对位置；使用所述确定的相对位置和去卷积函数，对来自每个循环的每个场图像中的所述光学信号进行去卷积；根据所述去卷积的光学信号来确定每个场和每个循环中的每个可检测标记的身份；以及使用在每个循环所检测的每个分析物的所述可检测标记的身份来识别所述基底上的多个所述分析物。
根据一些实施方案，本文还提供了一种用于确定多个分析物的身份的系统，所述系统包含：光学成像装置，其被配置为在与固定在基底表面上的分析物结合的探针的多个循环中，对来自所述基底的场的多个光学信号进行成像；和图像处理模块，所述模块被配置为：根据来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中的每一个光学信号来确定峰位置；通过将光学分布模型应用到来自所述多个循环的每个光学信号簇，以改善的准确度来确定所述表面上的每个检测的分析物的相对位置；以及使用所述确定的相对位置和去卷积函数，对来自每个循环的每个场图像中的所述光学信号进行去卷积。
在一些实施方案中，所述图像处理模块还被配置为使用所述去卷积的光学信号来确定固定在所述表面上的所述分析物的身份。
在一些实施方案中，所述分析物各自为多核苷酸分子，并且其中所述身份包括所述多核苷酸分子的序列。
在一些实施方案中，所述光学成像装置包括限定可扫描区域的可移动台。
在一些实施方案中，所述光学成像装置包括传感器和光学放大器，所述光学放大器被配置为在所述可扫描区域中对低于衍射极限的基底表面进行采样。
在一些实施方案中，所述光学成像系统还包括包含分析物的基底，所述分析物以低于衍射极限的中心间隔固定于基底表面。
在一些实施方案中，所述去卷积包括使用来自相邻分析物的所述确定的相对位置的所述相邻分析物之间的中心距来去除来自所述相邻分析物的干扰光学信号。在一些实施方案中，所述去卷积函数包括最近邻变量回归。在一些实施方案中，所述去卷积包括将来自每个循环中使用的每个独特的可检测标记的重叠波长分开。在一些实施方案中，所述去卷积函数包括串扰回归。在一些实施方案中，所述去卷积函数包括最近邻变量回归、平滑或串扰校正。
在一些实施方案中，所述分析物为单分子。在一些实施方案中，所述单分子为单生物分子。在一些实施方案中，所述单分子为多核苷酸。
在一些实施方案中，所述分析物密集地封装在所述基底上，使得来自与相邻分析物结合的探针的所述可检测标记所发射的光学信号之间发生重叠。在一些实施方案中，固定在所述表面上的所述分析物之间的平均间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。在一些实施方案中，至少两个固定在所述表面上的所述分析物之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。在一些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的固定在所述表面上的所述分析物与另一分析物之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。
在一些实施方案中，所述光学系统包括在0.2-2.0之间的数值孔径。在一些实施方案中，所述光学系统包括在1-1.1之间的数值孔径。在一些实施方案中，通过所述光学系统检测的所述光的波长为约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm或约650-700nm。
在一些实施方案中，所述固定的分析物包括的相邻分析物之间的最小中心距小于600nm、小于500nm、小于400nm、小于300nm或小于200nm。在一些实施方案中，所述分析物以每平方微米约4-25个分子的平均密度固定在所述表面上。在一些实施方案中，所述分析物以每平方微米超过4个、超过6个、超过8个、超过10个、超过15个或超过20个分子的平均密度固定在所述表面上。
在一些实施方案中，所述光学成像装置被配置为以大于由所述光学系统的尼奎斯特极限所确定的临界采样率的分辨率对所述基底进行成像。在一些实施方案中，所述光学成像装置被配置为以至少为2X尼奎斯特采样频率的分辨率对所述基底进行成像。在一些实施方案中，所述光学成像装置被配置为沿图像场的轴以不超过300nm/像素的分辨率对所述基底进行成像。在一些实施方案中，所述光学成像装置被配置为沿图像场的轴以约162.5nm/像素的分辨率对所述基底进行成像。
在一些实施方案中，所述图像处理模块被配置为从来自每个循环的每个所述场图像生成具有更高像素密度的过采样图像。在一些实施方案中，所述图像处理模块被配置为基于所述光学信号的预期点扩散函数向每个场图像施加平滑，以生成所述过采样图像。在一些实施方案中，所述图像处理模块被配置为生成包括来自所述成像的场的光学信号峰的位置的数据集。
在一些实施方案中，所述系统能够分辨来自密度为每平方微米约4-25的表面的光学信号。
在一些实施方案中，所述靶分析物以低于由所述光学成像装置检测的光的衍射极限的平均中心距固定在所述基底上。
附图说明
通过以下对本发明的具体实施方案的描述，前述和其他目的、特征和优点将变得显而易见，如附图中所示，附图的所有不同视图中类似的参考字符指代相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是着重于说明本发明的各种实施方案的原理。
图1示出了测序仪通量与阵列间距的关系，并概述了满足10美元基因组所需的标准的系统设计。
图2A示出了针对低成本测序所提出的高密度区域的实施方案，该高密度区域具有间距为240nm的80nm直径的结合区域(斑点)。
图2B为将所提出的基底密度与用于1000美元基因组的样品有效密度进行比较的比较结果。
图3示出了对用2X滤波器处理的600nm间距的模拟单分子的串扰计算。
图4示出了在中心距为600nm、400nm和300nm的基底上的单分子分析物检测的图像的过采样2X(左)与过采样4X以及去卷积(右)模拟。
图5示出了在使用过采样2X(左)与过采样4X以及去卷积模拟处理的单个分析物(阵列间距(nm))之间具有不同中心距时相邻斑点之间的串扰图。
图6描绘了根据本发明实施方案的以高准确度确定基底上分析物的相对位置的方法的流程图。
图7描绘了根据本发明实施方案的由从基底检测的去卷积光学信号识别各个分析物的方法的流程图。
图8描绘了根据本发明实施方案的对固定在基底上的多核苷酸进行测序的方法的流程图。
图9示出了根据本发明实施方案的对来自循环检测的光学信号检测过程中的步骤的概述。
图10A示出了根据本发明实施方案的初始原始图像分析的步骤的流程图。
图10B示出了根据本发明实施方案的从来自多个循环的光学信号峰信息来确定位置的步骤的流程图。
图10C示出了根据本发明实施方案的使用准确的相对位置信息和图像去卷积算法从图像中识别重叠的光学信号的步骤的流程图。
图11描绘了根据本发明实施方案的来自对密集封装基底的循环检测的图像的光学信号检测和去卷积处理的步骤的详细流程图。
图12A示出了来自从原始图像检测到的光学信号的四个荧光团之间的荧光强度的串扰图。
图12B示出了来自4X过采样图像的四个荧光团之间的荧光强度的串扰图。
图13A示出了来自4X过采样图像的四个荧光团之间的荧光强度的串扰图。
图13B示出了根据本发明实施方案的来自使用具有准确分析物位置信息的去卷积算法得到的4X过采样和去卷积图像的四个荧光团之间的荧光强度的串扰图。
图13B示出了相同成像区域的串扰图，但其如图11所示和本文所述地进行了去卷积和最近邻回归。
图14A示出了分析物之间的中心间隔约为315nm的场的原始图像的模拟四色复合。
图14B示出了分析物之间的中心间隔约为315nm的去卷积图像的模拟四色复合。
图15A示出了对应于EGFR基因中密码子790周围的区域的合成寡核苷酸模板的1:1混合物的测序结果，该混合物包含等量的突变型靶标和野生型(WT)靶标。
图15B描绘了来自交替的碱基掺入和切割循环的图像。
图16为固定在基底上并被包含荧光团的探针结合的单分子的图像。
图17下图示出了来自每个循环的场的过采样图像中的峰(峰簇)，其从基底上的若干分析物叠加而来。上图是下图的平滑形式，其概括了在多个循环中来自分析物的峰的高斯分布，其中高准确度的峰指示相对位置信息。
图18示出了在场中存在的多个分子中每一个的定位变化。中值定位方差为5nm，3∑定位方差小于10nm。
详细描述
在以下描述中阐述了本发明的各个实施方案的细节。通过说明书和附图并且通过权利要求，其他特征、目的和优点将变得显而易见。
定义
如本文使用的，术语中心距是指两个相邻分子之间的距离，该距离测量为基底上每个分子的平均位置之间的差。尽管术语中心距在对应于基底上分析物的密度的限制的情况下也指最小中心距，但是术语平均最小中心距具体是指安置在基底上的每个分析物的中心与其最近邻分析物的中心之间的平均距离。如本文使用的，术语“间距”或“平均有效间距”通常用于指平均最小中心距。在分析物的规则阵列的情况下，间距也可以用于确定沿着限定轴的相邻分子之间的中心距。
如本文使用的，术语“叠加”(例如，图像叠加)是指将来自不同循环的图像叠加以经过多个循环而生成来自每个分析物的检测的光学信号(例如，位置和强度或者峰位置)的分布。可以通过将图像叠加、将人工处理的图像叠加或者将包括位置信息的数据集叠加来生成检测的光学信号的这种分布。因此，如本文使用的，术语“图像叠加”包括这些机制中的任何一种，以生成多个循环中的每一个循环中来自与单个分析物结合的单个探针的光学信号的位置信息分布。
“循环”被定义为完成可检测标记从基底的一次或多次传递(pass)和剥离。可以进行每次循环一次或多次传递的后续循环。对于本文所述的方法和系统，对单个基底或样品进行多个循环。对于DNA测序，多个循环要求使用可逆终止子和来自掺入的核苷酸的可移除的可检测标记。对于蛋白质而言，多个循环要求探针移除(剥离)条件保持蛋白质折叠成它们的适当构型，或者要求所用的探针被选择成与肽序列结合，以使得结合效率与蛋白质折叠构型无关。
检测测定中的“传递”是指这样的过程，其中将包含可检测标记的多个探针引入到结合的分析物，在探针与不同的靶分析物之间发生选择性结合，并从可检测标记检测到多个信号。一次传递包括引入一组与靶分析物特异性地结合的抗体。一次传递还可以包括引入一组标记的核苷酸，用于在合成测序期间掺入到正在生长的链中。在将基底上所有可检测标记剥离之前或者在将可检测标记或可逆终止子在测序期间从掺入的核苷酸上去除之前，不同组的探针可以进行多次传递。通常，如果在一次传递中使用四个核苷酸，则一个循环将仅由标准的四核苷酸合成测序的单次传递组成。
如本文使用的，图像是指在循环期间或循环内一次传递期间拍摄的场的图像。在一些实施方案中，单个图像限于检测单色的可检测标记。
如本文使用的，术语“场”是指经成像的基底的单个区域。在典型的测定期间，每个循环中对单个场进行至少一次成像。例如，对于具有4个颜色的20个循环的测定，可以有20*4＝80张图像，所有图像都来自相同场。
“靶分析物”或“分析物”是指待识别、定量和以其他方式表征的单个分子、化合物、复合物、物质或组分。靶分析物举例来说可以包括但不限于：单个分子(任何分子大小)、单个生物分子、多肽、蛋白质(折叠或未折叠)、多核苷酸分子(RNA、cDNA或DNA)、其片段、其经修饰的分子(如经修饰的核酸)或其组合。在一个方案中，靶多核苷酸包含杂交的引物以便于合成测序。通过探针识别靶分析物，可以使用本文所述的光学检测方法将该探针用于对靶分析物进行测序、识别和定量。
如本文使用的，“探针”是指能够与其他分子(例如，合成测序期间的互补的标记核苷酸、多核苷酸、多肽或全长蛋白质等)、细胞组分或结构(脂质、细胞壁等)或用于检测或评估分子、细胞组分或结构或者细胞性质的细胞结合的分子。该探针包括与靶分析物结合的结构或组分。在一些实施方案中，多个探针可以识别相同靶分析物的不同部分。探针的实例包括但不限于标记的可逆终止子核苷酸、适体、抗体、多肽、寡核苷酸(DNA、RNA)或其任何组合。还在下文详细地描述了作为探针的抗体、适体、寡核苷酸序列及其组合。
探针可以包括用于检测该探针与靶分析物的结合的可检测标记。探针可以与靶分析物直接地或间接地结合、杂交、缀合或共价连接。
如本文使用的，术语可检测标记是指与探针结合的分子，当该探针与靶分析物结合并使用光学成像系统进行成像时能够生成可检测的光学信号。可检测标记可以与探针直接地或间接地结合、杂交、缀合或共价连接。在一些实施方案中，可检测标记是荧光分子或化学发光分子。通过可检测标记可以对探针进行光学检测。
如本文使用的，术语光学分布模型是指来自点光源的光检测的概率统计分布。这些模型包括例如高斯分布。可以将高斯分布修改成包括在检测中预期的像差，以生成作为光学分布模型的点扩散函数。
概述
本文提供了便于对与结合至基底表面的紧密封装的分析物结合的探针进行光学检测和辨别的系统和方法。部分地，本文所述的方法和系统依赖于对基底表面上的多个靶分析物的重复检测，以改善对基底上每个分析物的相对位置的识别准确度。然后，该信息可以用于针对每个循环的基底的场的每个图像进行信号去卷积，以可靠地识别来自与靶分析物结合的探针的信号。在一些实施方案中，这种类型的去卷积处理可以用于区分与靶分析物结合的在被激活光激活时具有重叠的发射光谱的不同探针。在一些实施方案中，该去卷积处理可以用于将光学信号与相邻的分析物分开。这对于具有一定密度的分析物的基底而言特别有用，其中由于光学系统的衍射极限，光学检测具有挑战性。
在一些实施方案中，本文所述的方法和系统在测序中特别有用。通过提供有助于在密集封装的基底上进行可靠的光学检测的方法和系统，与测序相关的成本(如试剂、所用的克隆分子数、处理和读取时间)均可以降低，从而极大地促进测序技术，特别是通过使用光学检测的核苷酸进行的单分子合成测序的发展。
尽管本文所述的系统和方法对促进测序技术发展具有重要意义，但是本文所述的方法和系统通常适用于结合至基底表面的分析物的光学检测，尤其是在单分子水平下。
降低测序成本
测序技术包括由诸如Illumina和Complete Genomics等公司开发的基于图像的系统，以及由诸如Ion Torrent和Oxford Nanopore等公司开发的基于电气的系统。目前，基于图像的测序系统的测序成本在所有现有测序技术中最低。基于图像的系统通过高通量成像光学器件与低成本耗材的组合而实现低成本。然而，部分地归因于光学系统的衍射极限，现有技术光学检测系统具有的相邻可分辨分子之间的最小中心间隔为约一微米。在一些实施方案中，本文所述的方法通过使用循环检测、确定分析物的精确位置以及使用位置信息来对成像信号进行高准确度去卷积以容纳在衍射极限以下运行的增加的封装密度，对使用现有生物化学方法的基于图像的测序系统实现了显著的成本降低。
本文提供了一种系统和方法，其便于对来自固定在表面上的中心间隔低于衍射极限的分析物的信号进行成像。这些系统和方法使用先进的成像系统来生成高分辨率图像，并使用循环检测以便于高准确度地确定基底上分子的位置，并使用图像去卷积来高准确度地获得密集封装的表面上每个分子的信号身份。这些方法和系统允许在密集封装的基底上进行单分子合成测序，从而以高准确度提供高效的和极高通量的多核苷酸序列确定。
测序系统的主要成本构成主要是耗材，其中包括生物芯片和试剂，其次为仪器成本。为了实现10美元30X基因组，即成本降低100倍，则需要将每单位面积的数据量增加100倍，并且需要将每个数据点的试剂量减少100倍。
图1示出了测序仪通量与阵列间距的关系，并概述了满足10美元基因组所需的标准的系统设计。基础的想法是为了实现成本降低100倍，需要将每单位面积的数据量增加100倍，并且需要将每个数据点的试剂量减少100倍。为了实现这些成本降低，本文提供了方法和系统，其便于对固定在基底表面上的低于衍射极限的密度的多核苷酸进行可靠地测序。这些高密度阵列允许更有效地使用试剂，并增加了每单位面积的数据量。此外，检测可靠性的提高允许那些必须合成用于识别和校正测序和检测中的误差的克隆拷贝数的减少，从而进一步降低了试剂成本和数据处理成本。
基底表面上分析物的高密度分布
图2A示出了所提出的高密度区域的实施方案，该高密度区域具有间距为240nm的80nm直径的结合区域(斑点)。在该实施方案中，可以使用有序阵列，其中单链DNA分子排他性地结合至芯片上的特定区域。在一些实施方案中，使用小于40kB的多联体(即包含多个拷贝的顺序连接的相同DNA序列的连续的长DNA分子)以便不会过度填充斑点。多联体的大小随着面积大致地按比例变化，这意味着较小的多联体的投影长度将为约4kB至5kB，如果使用相同的扩增方法，则将产生大约10个拷贝。也可以使用长度为4kB的DNA，并直接对单分子进行测序。另一个选择是将较短的DNA段与未测序的填充物DNA结合，以使总长度达到能产生排他性分子所需的大小。
图2B为所提出的间距与用于1000美元基因组的样品有效间距进行比较的比较结果。新阵列的密度高170倍，这满足了达到高100倍密度的标准。每单位面积每个成像斑点的拷贝数也满足了比现有平台低至少100倍的标准。这有助于确保试剂成本有比基线高出100倍的成本效益。
对密集封装的单个生物分子进行成像和衍射极限
对于成像平台而言增加分子密度的主要限制为衍射极限。光学系统的衍射极限方程为：
Figure GDA0003420975770000191
其中D为衍射极限，λ为光的波长，并且NA为光学系统的数值孔径。典型空气成像系统具有0.6至0.8的NA。使用λ＝600nm，则该衍射极限在375nm和500nm之间。对于水浸没系统，NA为约1.0，得到的衍射极限为300nm。
如果包含生物分子的阵列或其他基底表面上的特征过于靠近，则两个光学信号将几乎完全重叠以至于只能看到单个光斑(blob)，仅基于图像无法可靠地分辨该光斑。通过光学成像系统引入的误差会加剧这种情况，诸如由于运动基底的不准确跟踪所导致的模糊，或者在传感器与基底表面之间的光路径的光学变化。
从显微镜的样本平面中的点射出的透射光或荧光发射波阵面在物镜孔径的边缘处发生衍射，这使波阵面有效扩散而产生点源的图像，该点源的图像被扩大为具有有限的中心斑(但大小大于原始点)的衍射图案。因此，由于光的衍射，样本图像从未完美地表示样本中存在的真实细节，这是因为存在下限，低于该下限显微镜光学系统就无法分辨结构细节。
由于衍射极限，用显微镜难以观察亚波长结构。显微镜中的点目标(如荧光蛋白或核苷酸单分子)在中间平面生成图像，该图像由干扰作用所产生的衍射图案组成。当高度放大时，观察到点目标的衍射图案由被一系列衍射环所包围的中心斑点(衍射斑)组成。该点源衍射图案组合起来被称为艾里斑。
艾里图案的中心斑点的大小与光的波长和物镜的孔径角相关。对于显微镜物镜而言，孔径角由数值孔径(NA)来描述，其中包括术语sinθ，即物镜可以通过其从样本采集光的半角。就分辨率而言，衍射艾里斑在横向(x，y)图像平面上的半径由以下公式定义：阿贝分辨率xy＝λ/2NA，其中λ是透射光的平均照明波长或荧光的激发波长带。物镜数值孔径(NA＝n·sin(θ))由成像介质的折射率(n；通常为空气、水、甘油或油)乘以孔径角的正弦(sin(θ))来定义。这种关系的结果是，由点源产生的斑点的大小随着波长的减小和数值孔径的增加而减小，但始终保持为直径有限的斑。阿贝分辨率(即阿贝极限)在本文中也被称为衍射极限，并且限定了光学系统的分辨率极限。
如果两个艾里斑之间的距离或点扩散函数大于此值，则认为这两个点源已被分辨出(并且可以容易地区分)。否则，艾里斑会合并在一起，并被认为是无法分辨的。
因此，从波长为λ的单分子可检测标记点光源发射的光在折射率为n的介质中传播并以半角θ会聚成斑点时将形成直径为d＝λ/2*NA的衍射极限斑点。考虑到绿光为约500nm且NA(数值孔径)为1，衍射极限大致为d＝λ/2＝250nm(0.25μm)，这限制了可以通过常规成像技术成像的表面上分析物(如单分子蛋白质和核苷酸)的密度。即使在光学显微镜配备了可用的最高质量的透镜元件、完全对齐并具有最高数值孔径的情况下，在该最佳方案中分辨率仍然限制在光波长的大约一半。为了提高分辨率，可以使用较短的波长，如UV和X射线显微镜。这些技术提供了更好的分辨率但是价格昂贵，在生物样品中缺乏对比度，并且可能会损坏样品。
去卷积
去卷积是基于算法的方法，用于逆转卷积对所记录的数据的影响。去卷积的概念广泛用于信号处理和图像处理技术中。由于这些技术又广泛用于许多科学和工程学科，因此去卷积具有许多应用。
在光学和成像中，术语“去卷积”具体地用于指逆转光学显微镜、电子显微镜、望远镜或其他成像仪器中发生的光学畸变从而产生更清晰图像的过程。作为一系列显微镜图像处理技术的一部分，通常它是在数字域中通过软件算法完成的。
通常的方法是假设通过仪器的光学路径在光学上是完美的，用点扩散函数(PSF)——即根据理论点光源(或其他波)穿过仪器的路径来描述畸变的数学函数——进行卷积。通常，这样的点源为最终图像提供一小块模糊区域。如果可以确定该函数，则只需计算其反函数或余函数，并将获取的图像用该反函数或余函数进行卷积。去卷积映射到傅立叶陪域中的分支。这使得去卷积可以容易地应用于经受傅立叶变换的实验数据。一个实例是NMR光谱，其中在时间域中记录数据，但在频域中进行分析。时间域数据除以指数函数具有减小频域中洛伦兹线的宽度的效果。该结果是原始的未畸变的图像。
然而对于衍射极限的成像，即使点扩散函数是众所周知的，也需要进行去卷积来进一步改善信号，从而提高分辨率使其超出衍射极限。很难将距离小于尼奎斯特距离的两个物体可靠地分开。然而，本文描述了使用循环检测、分析物位置确定、对齐和去卷积来可靠地检测间隔距离远小于尼奎斯特距离的物体的方法和系统。
测序
光学检测成像系统是有衍射极限的，因此在通常将荧光团用于测序的情况下的理论最大分辨率为约300nm。迄今为止，最好的测序系统在其阵列上的相邻多核苷酸之间的中心间隔为约600nm，或为约2X衍射极限。需要该2X的因子来考虑强度、阵列和生物学变化，这些变化会导致位置误差。为了实现10美元基因组，需要大约200nm的中心间隔，这需要亚衍射极限的成像能力。
对于测序，本文所述的系统和方法的目的在于在中心间隔低于光学系统的衍射极限的情况下分辨在基底上测序的多核苷酸。
如本文所述，我们提供了部分地通过以高准确度(例如，10nm RMS或更小)识别每个分析物的位置来实现亚衍射极限的成像的方法和系统。相比之下，最先进的超分辨率系统(Harvard/STORM)只能以低至20nm RMS的准确度识别位置，比本系统低2X。因此，本文公开的方法和系统使得亚衍射极限成像能够识别基底上密集封装的分子，以实现较高的数据率/单位酶、数据率/单位时间以及高数据准确度，从而实现10美元基因组。这些亚衍射极限成像技术可广泛地应用于使用如本文所述的循环检测的技术。
成像和循环检测
如本文所述，每一个检测方法和系统均需要循环检测以实现亚衍射极限成像。循环检测包括与能够发射可见光光学信号的可检测标记结合的探针(如抗体或核苷酸)的结合和成像。通过使用来自不同循环的场的一系列图像的位置信息，用于分辨来自密集封装的基底的信号的去卷积可以有效地用于从光学成像的衍射极限所导致的模糊信号中识别各个光学信号。在多个循环之后，分子的精确位置将变得越来越准确。使用该信息，可以进行附加计算以辅助针对因像素离散效应而出现的在串扰矩阵中的已知不对称性的串扰校正。
在2015年11月19日公开的美国公开号2015/0330974,Digital Analysis ofMolecular Analytes Using Single Molecule Detection中描述了使用循环探针结合和光学检测的方法和系统，其全文通过引用并入本文。
在一些实施方案中，使用至少在尼奎斯特极限处的采样来获得原始图像，以便于更准确地确定过采样图像。通过进行超过尼奎斯特极限的采样(过采样)来增加用于表示图像的像素数目会增加可用于图像处理和显示的像素数据。
从理论上讲，如果以尼奎斯特速率或更高的速率进行采样，则可以完美地重建带宽受限的信号。尼奎斯特速率被限定为信号中最高频率分量的两倍。通过放宽抗混叠滤波器的性能要求，过采样改善分辨率、降低噪声，并有助于避免混叠和相位畸变。如果以尼奎斯特速率的N倍对信号进行采样，则认为是对信号进行N倍过采样。
因此，在一些实施方案中，所拍摄的每个图像的像素大小不超过所观察的光的波长的一半。在一些实施方案中，在检测中使用162.5nm x 162.5nm的像素大小，以实现在尼奎斯特极限处或超过尼奎斯特极限的采样。优选在基底的原始成像期间以至少尼奎斯特极限的频率进行采样，以优化本文所述的系统或方法的分辨率。这可以结合本文所述的去卷积方法和光学系统来完成，从而高准确度地分辨基底上低于衍射极限的特征。
处理来自不同循环的图像
本发明克服了一些障碍，从而实现了亚衍射极限成像。
像素化误差存在于原始图像中，并且由于像素化而阻止对从光学信号呈现的信息的识别。如本文所述，至少以尼奎斯特频率进行采样和生成过采样图像均有助于克服像素化误差。
各种分子的点扩散(PSF)重叠，这是因为PSF大小大于像素大小(低于尼奎斯特极限)并且还因为中心间隔太小而导致发生由空间重叠所引起的串扰。最近邻变量回归(针对中心串扰)可以用于帮助对多个重叠的光学信号进行去卷积。但是，如果我们知道基底上每个分析物的相对位置并具有良好的场图像对齐，则可以改善这种情况。
在多个循环之后，分子的精确位置将变得越来越准确。使用该信息，可以进行附加计算，以通过校正因像素离散化效应和衍射极限而出现的在光学信号的空间重叠中的已知不对称性来辅助进行去卷积。它们也可以用于校正来自不同发射光谱的发射光谱中的重叠。
可以通过将不同循环的相同场的图像叠加来获得每个分析物的高准确度的相对位置信息，从而根据与每个分析物结合的不同探针的光学信号来生成测量的峰的分布。然后该分布可以用于生成与分析物的单个相对位置相对应的峰信号。来自循环子集的图像可以用于生成每个分析物的相对位置信息。在一些实施方案中，该相对位置信息在定位文件中提供。
针对每个循环的场进行成像的特定区域可因循环而异。因此，为了改善识别每个图像的分析物位置的准确度，可以进行多个循环中的场的图像之间的对齐。通过这种对齐，可以识别与参考文件相比的偏移信息，并将其引入去卷积算法中，以进一步提高对衍射极限所导致的模糊光学信号的去卷积和信号识别的准确度。在一些实施方案中，该信息在场对齐文件中提供。
信号检测(串扰/最近邻)
一旦准确地确定了基底上分析物的相对位置信息，并且来自每个循环的场图像都与该位置信息对齐，则使用串扰和最近邻回归对每个过采样图像的分析可以用于准确地识别来自每个图像中的每个分析物的光学信号。
在一些实施方案中，针对固定在基底上并与包含可检测标记的探针结合的多个生物分子中的每一个，识别由光学系统的衍射极限所导致的多个模糊光学信号。在一些实施方案中，探针是掺入的核苷酸，并且使用一系列循环采用单分子合成测序来确定固定在阵列上的多核苷酸的序列。
应用于图像的去卷积模拟
分子密度受限于来自相邻分子的串扰。图3描绘了单分子的模拟图像。该特定图像是间距为600nm的单分子阵列的模拟，其已用2X过采样滤波器处理。向八个相邻斑点的串扰被平均为阵列间距和算法类型的函数。
图4是用多个间距和图像处理算法的两种变化处理的一系列图像，第一个是2X过采样图像，而第二个是带去卷积的4X过采样图像，如本文所述。图5是在低至200nm的间距下处理的这两种类型图像的串扰分析。在2X过采样的情况下，25％或以下的可接受的串扰水平在间距等于或大于275nm时出现。在使用光学系统的点扩散函数进行4X去卷积的情况下，25％或以下的可接受的串扰水平在间距等于或大于210nm时出现。
分子的物理大小将使斑点大致扩大结合面积的一半大小。例如，对于80nm斑点，间距将增加大致40nm。可以使用较小的斑点大小，但是这将会有一种权衡关系，即，允许更少的拷贝则需要更大的照明强度。单个拷贝提供最简单的样品制备，但需要最大的照明强度。
关于这一点所讨论的用于亚衍射极限成像的方法涉及过采样、去卷积和串扰校正的图像处理技术。本文所述的方法和系统包括使用来自分析物的多个循环的探针光学信号成像的信息来确定基底上分析物的精确相对位置。使用该信息，可以进行附加计算以辅助针对因像素离散效应而出现的在串扰矩阵中的已知不对称性的串扰校正。
方法
在一些实施方案中，如图6所示，本文提供的方法用于准确地确定固定在密集封装的基底表面上的分析物的相对位置。该方法包括首先提供包含表面的基底，其中该表面包含在离散位置处固定在表面上的多个分析物。然后，在所述表面上进行多个循环的探针结合和信号检测。每个检测的循环包括使分析物与能够与固定在基底上的靶分析物结合的探针组接触，用光学系统对所述表面的场进行成像，以检测来自与所述表面上离散位置处的所述分析物结合的各个探针的多个光学信号，以及如果将进行另一循环的检测，则去除结合的探针。从每个图像中，检测来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中每一个的峰位置。将每个分析物的峰位置叠加，生成峰簇，然后从中确定基底上每个分析物的准确相对位置。
在一些实施方案中，如图7所示，然后将基底上分析物的准确位置信息用于并入位置信息的去卷积算法(例如，用于识别基底上相邻分析物之间的中心间隔)，该算法可以应用于图像以对来自每个所述图像的重叠光学信号进行去卷积。在一些实施方案中，去卷积算法包括最近邻变量回归，用于具有重叠光学信号的相邻分析物之间的空间辨别。
在一些实施方案中，如图8所示，将分析物检测方法应用于对固定在基底上的各个多核苷酸进行测序。
在一些实施方案中，从密集封装的基底上对光学信号进行去卷积，如图11所示。步骤可以分为四个不同的部分，如图9所示：1)图像分析，其包括从每个循环的场的每个图像生成过采样图像，以及生成峰文件(即数据集)，该峰文件包括图像中每个检测的光学信号的峰位置和强度。2)生成定位文件，其包括将从每个分析物的多个循环的光学信号检测生成的多个峰对齐，以确定基底上分析物的准确相对位置。3)生成场对齐文件，其包括每个图像的偏移信息，以使来自不同检测循环的场图像相对于选定的参考图像对齐。4)提取强度，其将偏移信息和位置信息与去卷积建模结合用于确定从每个过采样图像检测到的信号的准确身份。“提取强度”步骤还可以包括其他误差校正，如用于校正合成测序处理和检测中的误差的先前循环回归。以下进一步详细地描述每个部分中进行的步骤。
在图10A和图11所示的图像分析步骤中，对来自每个循环的每个场的图像进行处理，以增加每个检测到的信号的像素数目，锐化每个信号的峰，并确定来自每个信号的峰强度。使用该信息生成每个循环的每个场的峰文件，该峰文件包括每个分析物的位置的量度(来自观察到的光学信号的峰)和来自每个信号的峰强度的强度。在一些实施方案中，首先使来自每个场的图像经历减去背景，以从图像中初步去除噪声。然后，使用平滑和去卷积对图像进行处理以生成过采样图像，该图像包括基于在每个图像中观察到的信号的建模而人工生成的像素。在一些实施方案中，该过采样图像可以从原始图像的每个像素生成4个像素、9个像素或16个像素。
然后识别来自在每个原始图像中检测到的或存在于过采样图像中的光学信号的峰，并且将每个检测的分析物的强度和位置信息放到峰文件中以供进一步处理。
在一些实施方案中，N个原始图像对应于从基底的每个循环和每个场检测到的所有图像，或者输出成每个图像场的N个过采样图像和N个峰文件。峰文件包括每个图像的每个检测的分析物的相对位置。在一些实施方案中，峰文件还包含每个检测的分析物的强度信息。在一些实施方案中，针对每个循环中的每种颜色和每个场生成一个峰文件。在一些实施方案中，每个循环还包括多次传递，使得可以针对每个循环中每次传递的每种颜色和每个场生成一个峰文件。在一些实施方案中，该峰文件指定来自单个场内的光学信号的峰位置。
在优选实施方案中，峰文件包括来自每个循环的场的每个处理的过采样图像的XY位置信息。XY位置信息包括来自过采样图像的探针的每个检测的可检测标记(如荧光团)的估测位置坐标。峰文件还可以包括来自每个单个可检测标记的信号的强度信息。
过采样图像的生成被用于克服像素化误差，以识别存在的那些由于像素化而无法提取的信息。通过平滑和去卷积对原始图像进行的初始处理有助于在峰文件中提供更准确的信息，从而可以更准确地确定每个分析物的位置，并且该信息随后可以用于提供对衍射极限成像中的模糊信号的更准确的确定。
在一些实施方案中，使用至少在尼奎斯特极限处的采样来获得原始图像，以便于更准确地确定过采样图像。通过进行超过尼奎斯特极限的采样(过采样)来增加用于表示图像的像素数目增加可用于图像处理和显示的像素数据。
从理论上讲，如果以尼奎斯特速率或更高的速率进行采样，则可以完美地重建带宽受限的信号。尼奎斯特速率被限定为信号中最高频率分量的两倍。通过放宽抗混叠滤波器的性能要求，过采样改善分辨率、降低噪声，并有助于避免混叠和相位畸变。如果以尼奎斯特速率的N倍对信号进行采样，则认为是对信号进行N倍过采样。
因此，在一些实施方案中，所拍摄的每个图像的像素大小不超过所观察的光的波长的一半。在一些实施方案中，在检测中使用162.5nm x 162.5nm的像素大小，以实现在尼奎斯特极限处或超过尼奎斯特极限的采样。
平滑使用近似函数来捕获数据中的重要图案，同时排除噪声或其他精细标度的结构/快速现象。在平滑过程中，修改信号的数据点以单个点被减弱并低于相邻点的点被增强，从而使信号更平滑。本文中使用平滑来平滑每个图像中检测到的衍射极限光学信号，以更好地从信号中识别峰和强度。
尽管每个原始图像都是衍射极限的，但本文所述的方法导致从来自不同循环的相同分析物收集多个信号。该方法的实施方案在图10B的流程图中示出。相比于使用来自每个单个图像的衍射极限信号，使用这些来自每个分析物的多个信号更准确地确定位置。这些信号可以用于以小于5nm的分辨率来识别场内的分子。然后，将该信息存储为定位文件，如图11中所示。然后，可以将该高准确度的位置信息与去卷积算法(如串扰回归和最近邻变量回归)结合使用，以极大地改善来自每个单个场图像的信号识别。
如图11所示，在生成定位文件的步骤中使用峰文件中所提供的位置信息来确定基底上一组分析物的相对位置。在一些实施方案中，每个定位文件均包含来自基底的单个成像场的一组分析物的相对位置。将定位文件与来自多个循环的位置信息结合，以生成低于衍射极限的分析物的高准确度的位置信息。
在一些实施方案中，每个分析物的相对位置信息以平均小于10nm的标准偏差(即RMS或均方根)确定。在一些实施方案中，每个分析物的相对位置信息以平均小于10nm的2X标准偏差确定。在一些实施方案中，每个分析物的相对位置信息以平均小于10nm的3X标准偏差确定。在一些实施方案中，每个分析物的相对位置信息以小于10nm的中值标准偏差确定。在一些实施方案中，每个分析物的相对位置信息以小于10nm的中值2X标准偏差确定。在一些实施方案中，每个分析物的相对位置信息以小于10nm的中值3X标准偏差确定。
从来自不同循环的场的峰文件的子集中生成定位文件，以确定阵列上分析物的位置。如图11所示，在一些实施方案中，首先使用点扩散函数对峰文件进行标准化，以解决光学系统中的像差。基于峰文件中提供的位置和强度信息，标准化峰文件可以用于生成人工标准化图像。然后将每个图像对齐。在一些实施方案中，可以通过关联每个图像对并进行精细拟合来进行对齐。一旦对齐，就可以将来自每个循环的每个分析物的位置信息叠加，以提供基底上位置测量值的分布。该分布用于确定单个峰位置，该峰位置提供了基底上分析物的高准确度的相对位置。在一些实施方案中，将泊松分布应用于每个分析物的叠加位置，以确定单个峰。
然后将由来自循环的位置信息的至少一个子集所确定的峰记录在定位文件中，该文件包括每个检测的分析物的相对位置的量度，其准确度低于衍射极限。如所述的，仅需要来自循环子集的图像即可确定该信息。
如图11所示，来自每个循环和颜色的每个场的标准化峰文件以及标准化的定位文件可以用于生成来自场的每个图像相对于该场的参考图像的偏移信息。该偏移信息可以用于改善对每个原始图像中分析物的相对位置确定的准确度，以进一步改善从密集封装的基底和衍射极限图像的识别信号。在一些实施方案中，将该偏移信息存储为场对齐文件。在一些实施方案中，来自组合的定位文件和场对齐文件中的场中的每个分析物的位置信息小于10nm RMS、小于5nm RMS或小于2nm RMS。
在一些实施方案中，通过确定相对于来自场的主文件的偏移信息来将来自单个场的图像对齐，从而生成场对齐文件。每个场生成一个场对齐文件。该文件由来自所有循环的场的所有图像生成，并且包括该场的所有图像相对于该场的参考图像的偏移信息。
在一些实施方案中，在对齐之前，用点扩散函数对每个峰文件进行标准化，然后从该标准化峰文件生成人工图像，并对该人工图像进行傅里叶变换。然后将标准化峰文件的人工图像的傅立叶变换与来自相应场的标准化定位文件的人工图像的傅立叶变换的复共轭进行卷积。针对每个循环的每个峰文件进行该操作。然后，使得到的文件经历傅立叶逆变换以重新生成图像文件，并将该图像文件相对于场的参考文件进行对齐，以生成每个图像文件的偏移信息。在一些实施方案中，该对齐包括相对于参考文件的精细拟合。
因此，场对齐文件包含每个过采样图像的偏移信息，并且可以与相应场的定位文件结合用于生成每个分析物的高度准确的相对位置，以供在后续“提取强度”步骤中使用。
作为一个示例，对场进行20次循环，并针对待检测的4种颜色中的每一种生成一个图像，如此生成80个场图像，针对对该场拍摄的所有80个图像(20次循环*4种颜色)生成一个场对齐文件。在一些实施方案中，该场对齐文件的内容包括：场、在每个图像观察到的颜色、在循环检测中的步骤类型(例如，结合或剥离)和相对于参考图像的图像偏移坐标。
在一些实施方案中，在对齐过程中，计算出对齐2张图像所需的XY“位移”或“残差”，并对剩余图像重复该过程，计算出适用于所有图像的最佳拟合残差。
在一些实施方案中，排除超过阈值的残差，并重新计算最佳拟合。重复该过程，直到所有个体残差均在阈值内。
然后，使用来自定位文件的准确位置信息和来自场对齐文件的偏移信息对每个过采样图像进行去卷积。强度提取步骤的一个实施方案在图10C和图11中示出。各种分子的点扩散函数(PSF)重叠，这是因为中心间隔太小以至于来自相邻分析物的信号的点扩散函数发生重叠。最近邻变量回归结合准确的分析物位置信息和/或偏移信息可以用于对来自相邻分析物(其中心距使得分辨率因衍射极限而被抑制)的信号进行去卷积。使用每个分析物的准确的相对位置信息有助于对来自衍射极限以下的相邻分析物的光学信号进行空间去卷积。在一些实施方案中，使用相邻分析物的相对位置确定相邻分析物之间的准确的中心距，该中心距可以与光学系统的点扩散函数结合使用来估算相邻分析物之间的空间串扰，以用于对来自每个单个图像的信号进行去卷积。这使得能够将具有低于衍射极限的分析物密度的基底用于光学检测技术，如多核苷酸测序。
在某些实施方案中，发射光谱在不同信号之间重叠(即，“串扰”)。例如，在合成测序过程中，测序过程中所使用的四种染料通常在发射光谱中具有一些重叠。
在具体的实施方案中，当在不同颜色通道之间发生串扰并且当不同图像组的串扰不同时，关于向针对循环所获得的图像组中的不同特征分配颜色(例如，碱基判定)的问题，可以通过串扰回归结合每个过采样图像的定位和场对齐文件以从来自所使用的每个不同可检测标记的光学信号中去除重叠发射光谱来解决。这进一步提高了识别与基底上每个分析物结合的每个探针的可检测标记身份的准确度。
因此，在一些实施方案中，如本文公开的从来自循环的场的单个图像中识别信号和/或其强度使用以下特征：1)过采样图像-提供限定位置的强度和信号。2)准确的相对位置-定位文件(通过至少一个循环子集的信息来提供位置信息)和场对齐文件(提供场中所有图像的偏移/对齐信息)。3)图像处理-使用场中每个分析物的准确相对位置信息进行最近邻变量回归(空间去卷积)和串扰回归(发射光谱去卷积)。准确地识别每种分析物的探针(例如，用于检测的抗体或用于测序的互补核苷酸)。
图像处理模拟
在图12A、图12B、图13A和图13B所示的模拟串扰图中示出了本文公开的方法和系统的效果。对于这些图中的每一个，示出了显示出在10um X 10um区域中与每个检测的分析物处的四个荧光团之一相关联的发射光谱的强度的串扰图。对应于四个荧光团之一的每个轴延伸到该图的每个角。因此，位于图的中心的斑点将会对所有四个荧光团的强度具有相等的贡献。在成像循环中从单个荧光团检测到的发射强度被指定为使斑点朝X，Y；X，-Y；-X，Y或-X，-Y中的任一个方向移动。因此，斑点群体沿这四个轴的分离表明来自分析物位置处的荧光团的清晰的去卷积信号。每次模拟均基于在10.075um x 10.075um区域中对1024个分子的检测，这表明密度为10.088个分子/平方微米，或者在分子之间的平均中心距为约315nm。这与像素大小为162.5nm x 162.5nm的约62x62个像素的成像区域相关。
图12A示出了来自从原始图像中检测到的光学信号的四个荧光团之间的荧光强度的串扰图。图12B和图13A各自示出了通过生成4X过采样图像而实现的四个荧光团之间的分离，这表明实现了对每个分析物处的串扰的一些去除。图13B示出了相同成像区域的串扰图，但其如图11所示和本文所述地进行了去卷积和最近邻回归。与图13A和图12A相比，检测的每个分析物均显示出其光学信号与其他荧光团的清晰的分离，这表明对每个分析物的荧光团识别均高度准确。
图14A和图14B示出了如上述模拟的每个检测的10.075μm x 10.075μm区域的模拟四色复合。这在视觉上表示形成原始图像(图14A)和如本文所述处理的图像(图14B)的分析物之间的清晰度。
测序
以上和图11中所述的方法还通过使用掺入到包含密集封装的多核苷酸的基底上的生长中的互补链中的互补可逆终止子的光学检测来便于用合成测序进行测序。因此，使用本文所述的方法和光学检测系统可以可靠地检测到与中心距低于衍射极限的相邻多核苷酸的序列相关的信号。测序期间的图像处理还可以包括基于在基底上重复的克隆序列或基于数据本身的先前循环回归，以校正测序反应或检测中的误差。在一些实施方案中，用于测序的固定在基底上的多核苷酸为多联体。多联体可以包含待测序的多核苷酸的多个相同拷贝。因此，通过本文所述的方法和系统所识别的每个光学信号可以指来自掺入的核苷酸中的单个可检测标记(例如，荧光团)，或可以指结合到单个多联体上的多个位置的多个可检测标记，使得信号是来自多个位置的信号的平均值。必须存在的分辨率并非是在各个可检测标记之间，而是在固定至基底的不同多联体之间。
在一些实施方案中，待测序的分子(单拷贝或多拷贝)将使用共价键、通过杂交来捕获表面上的寡核苷酸或通过其他非共价结合方式结合至表面。结合的分子将在表面上保留数百个循环，并且可以在剥离初始测序引物后用不同的引物组重新询问，以确认存在特定变体。
在一个实施方案中，可以使用化学反应去除荧光团和封闭基团。
在另一个实施方案中，可以使用UV光去除荧光团和封闭基团。
在一个实施方案中，待测序的分子可以固定在直径为50-100nM的反应性表面上，并且这些区域将以150-300nM的间距被间隔开。这些分子可以具有附接在其上的用于靶向去卷积的条形码和用于启动测序的测序引物结合区域。缓冲液将包含适当量的DNA聚合酶，以进行延伸反应。这些位点可以包含待测序的靶标的10-100个拷贝——通过任何可用的基因扩增方法(PCR、全基因组扩增等)生成。
在另一个实施方案中，用条形码和引物退火位点标记的单个靶分子将以60-150nM间距的间隔被固定在直径为20-50nM的反应性表面上。将对分子进行单独测序。
在一个实施方案中，引物与靶标结合，并且一次使用一个带有单个或多个荧光团的dNTP来延伸；对表面成像，去除荧光团并洗涤，并重复该过程，以生成第二次延伸。相同dNTP上存在的多个荧光团能够限定基因组的某些区域(2至5个或更多)中存在的重复核苷酸的数目。
在不同的实施方案中，在引物退火后，将所有四种带有荧光团和封闭3’羟基基团的dNTP用于聚合酶延伸反应，对表面成像并且去除荧光团和封闭基团，并且将该过程重复多个循环。
在另一个实施方案中，可以基于在给定位置上存在的特异性核苷酸，基于使所连接的特异性探针退火的连接反应对序列进行推断。
可以使用随机阵列，该随机阵列将使用以上概述的技术，从而具有相比于现有技术随机阵列改善的密度，然而随机阵列通常具有面密度降低4X至10X的有序阵列。随机阵列的优点包括具有均匀的无图案的芯片表面和使用较短核酸链，这是因为不需要依赖较长链的排他性质。
等同物和范围
本领域技术人员将认识到或仅通过常规实验便能够确定本文所述的根据本发明的具体实施方案的许多等同方案。本发明的范围不旨在限于以上描述，如在所附权利要求书中阐述。
在权利要求书中，诸如“一个”、“一种”和“该”等冠词可以意指一个或多于一个，除非有相反表示或从上下文中显而易见。如果一个、超过一个或所有组成员在给定的产品或方法中出现、使用或以其他方式与之相关，则在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求书或说明书将被认为是满足条件的，除非有相反表示或从上下文中显而易见。本发明包括这样的实施方案，其中组中的正好一个成员在给定的产品或方法中出现、使用或与之相关。本发明包括这样的实施方案，其中组中的超过一个或所有组成员在给定产的品或方法中出现、使用或与之相关。
还应主意，术语“包括”旨在是开放性的，并且允许但不要求包括附加的元件或步骤。当在本文中使用术语“包括”时，由此也涵盖和公开了术语“由...组成”。
在给出范围时，包括端点。此外，应当理解，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在本发明的不同实施方案中，表示为范围的值可以取所规定范围内的任何特定值或子范围，直至该范围下限的单位的十分之一，除非上下文中另有明确说明。
所有引用的来源，例如本文引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术，即使在引用中没有明确说明，也均通过引用并入本申请。如果所引用的来源的陈述与本申请存在冲突，则以本申请中的陈述为准。
章节标题和表格标题并非旨在进行限制。
实施例
以下是用于实施本发明的具体实施方案的实施例。提供这些实施例仅出于说明性目的，而非旨在以任何方式限制本发明的范围。已经尽力确保所使用的数字(例如，量、温度等)的准确度，但是，当然应该允许一些实验误差和偏差。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。在文献中对这些技术进行了充分的说明。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,currentaddition)；Sambrook,等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan著,Academic Press,Inc.)；Remington’sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg,Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A和B卷(1992)。
实施例1：密集阵列
以下方法将描述如何利用间距在200nm至333nm之间的方形有序阵列。将描述允许更小的间距的其他方法。在2018年3月2日提交的国际申请PCT/US2018/020737(通过引用并入本文)中描述了一种成像系统，其将用作能够进行亚衍射极限成像的参考系统。该光学系统可以包括多个2,048x 2,048像素的相机，其运行速度高达100Hz帧频(fps)，场大小为332.8um x 332.8um。该系统能够以90fps或高于90fps测量小至单个荧光团。在85fps下以1-10个拷贝(或1-10个荧光团)/秒使用该系统实现了在15分钟内成像63毫米x 63毫米载玻片的必要通量。通过使用两个芯片或通过将单个芯片划分为至少两个区域，可以连续地且同时地进行生物化学循环和成像。
实施例2：使用合成测序的单分子测序
在Apton系统上评估使用合成测序方法的单分子测序。为了测试该方法，首先通过EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)化学法，将具有5’磷酸基团的单链DNA模板附接到流动池的具有碳酰肼活化的硅表面的芯片上。测序引物与固定在表面上的靶标退火。我们初步研究所使用的测序模板包括含有EGFR L858R、EGFR T790M和BRAF V600E突变的合成寡核苷酸，以及从ERCC 00013和ERCC 00171对照RNA转录物逆转录的两个cDNA样品。在DNA模板固定并且引物退火后，将流动池加载到Apton仪器上进行测序反应，该反应涉及酶促单核苷酸掺入反应，用于检测荧光染料的成像以及随后的化学切割的多个循环。来自NEB的Therminator IX DNA聚合酶用于单碱基延伸反应，这是一种9°NTM DNA聚合酶变体，具有增强的掺入修饰的双脱氧核苷酸的能力。反应中使用的四种dNTP用4种不同的可切割荧光染料标记，并在3’-OH基团处被可切割部分(来自MyChem的dCTP-AF488、dATP-AFCy3、dTTP-TexRed和dGTP-Cy5)封闭。在每个测序反应循环中，由于dNTP上的3’-封闭基团，掺入单个标记的dNTP并且反应终止。掺入dNTP后，通过洗涤将未掺入的核苷酸从流动池中去除，并对掺入的荧光染料标记的核苷酸进行成像以识别碱基。捕获图像后，使用100mM的TCEP((三(2-羧乙基)膦)，pH 9.0)从掺入的核苷酸上切割荧光染料和封闭部分，允许在下一个循环中后续添加下一个互补核苷酸。然后重复该延伸、检测和切割循环，以增加读取长度。
图15A示出了对应于EGFR基因中密码子790周围的区域的合成寡核苷酸模板的1:1混合物的测序结果，该混合物包含等量的突变型靶标和野生型(WT)靶标。来自染料标记的核苷酸的掺入的图像被用于对对应于密码790附近的EGFR基因区域的合成模板进行测序，其中在引物后的第一个碱基处有一个突变(WT中掺入C，而突变体中掺入T)。图15A中的拼接图描绘了来自交替的碱基掺入和切割循环的图像。该数据展示了系统检测10个碱基掺入循环的能力。箭头表示观察到的碱基变化。
所使用的合成寡核苷酸长约60个核苷酸。使用具有在密码子790中的突变之前的一个碱基终止的序列的引物来实现延伸反应。在通过DNA聚合酶掺入核苷酸后并用TCEP进行切割反应后，对表面进行成像。黄色圆表示模板分子的位置，通过使用来自10个连续的染料掺入循环的数据来对该位置进行对齐。用已知颜色的掺入序列识别分子，然后通过费力的目视检查来识别实际的碱基掺入。
使用染料标记的核苷酸对从RNA模板生成的cDNA进行测序。通过T7转录从克隆的ERCC对照质粒生成所使用的RNA。图15B描绘了来自交替的碱基掺入和切割循环的图像。该数据展示了系统检测10个碱基掺入循环的能力。观察到的序列是正确的。黄色箭头表示切割循环。
具体地，对与通过T7转录从ERCC(外部RNA对照联盟，External RNA ControlsConsortium)对照质粒生成的转录物相对应的cDNA模板进行测序。所生成的cDNA分子的长度>350个核苷酸。在通过DNA聚合酶掺入核苷酸后并用TCEP进行切割反应后，对表面进行成像。图15B中的黄色圆表示模板分子的位置，通过使用来自10个连续的染料掺入循环的数据对该位置进行对齐。数据表明通过人工查看图像来人工检测10个核苷酸掺入循环的能力。
实施例3：单分子变体的相对位置确定
图16是固定在基底上并被包含荧光团的探针结合的单分子的图像。该分子是与来自细胞裂解物的ERK蛋白结合的抗ERK抗体，该ERK蛋白已经共价附接至固体支持物。将该抗体用每分子3-5个荧光团进行标记。例如在合成测序期间，用单荧光团的核酸靶标可获得相类似的图像。
为了改善检测的准确度，使分子经历探针结合和剥离的连续循环(在这种情况下为30个循环)。在每一轮中，对图像进行处理以确定分子的位置。将图像减去背景，过采样2倍，然后识别出峰。多层循环在20nm的网格上叠加。定位方差为标准偏差或半径除以测量次数的平方根。图17下图中示出了来自叠加的每个循环的每个峰。上图是下图的平滑形式。每个亮斑点代表分子。分子间距低于200nm时，分子位置是可分辨的。图18示出了在场中存在的多个分子中的每一个的定位方差。中值定位方差为5nm，并且3∑定位方差小于10nm。
其他实施方式
应当理解，所使用的词语是描述性的而非限制性的，并且可以在所附权利要求书的范围内进行改变，而在其更广泛的方面不背离本发明的真实范围和精神。
尽管已经以一定的篇幅描述了本发明，并特别地描述了几个实施方案，但并不旨在将本发明限制于任何这样的特定描述或实施方案或者任何特定的实施方案，而是应参考所附权利要求书来理解，以便考虑现有技术来提供对这些权利要求的尽可能宽泛的解释，从而有效地涵盖本发明预期的范围。
本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本文。在有冲突的情况下，以包含定义的本说明书为准。此外，章节标题、材料、方法和实例仅是说明性的，而非旨在限制性的。

Claims (134)

1.一种用于对以高密度固定在基底表面上的多个多核苷酸进行测序的方法，其包括：
a.提供包含表面的基底，其中所述表面包含在离散位置处固定在所述表面上的多个多核苷酸；
b.进行多个循环的单分子合成测序，每个循环包括：
i.使所述多核苷酸与一组包含可检测标记的探针核苷酸接触；
ii.用光学系统对所述表面的场进行成像，以检测来自掺入所述多核苷酸中的每个核苷酸的光学信号，从而检测所述循环的所述场中的多个光学信号，其中至少两个固定在所述表面上的所述多核苷酸之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限，并且其中所述表面包含用于合成测序的试剂；
c.根据来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中的每一个光学信号来确定峰位置；
d.将每个光学信号的所述峰位置叠加，并将光学分布模型应用到每个光学信号簇，从而以改善的准确度来确定所述表面上的每个检测的掺入核苷酸的相对位置；
e.使用所述确定的相对位置和去卷积函数，对来自每个循环的每个场图像中的所述光学信号进行去卷积；
f.根据所述去卷积的光学信号来识别每个场和每个循环中的掺入所述多核苷酸中的所述可检测标记；以及
g.在每个多核苷酸位置处根据所述多个循环中的所述识别的可检测标记对固定在所述基底表面上的所述多个多核苷酸进行测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基底包含1,000个或更少、500个或更少、100个或更少、50个或更少、25个或更少、20个或更少、15个或更少或者10个或更少的包含相同序列的多核苷酸的克隆拷贝。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸为DNA多联体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中每个循环还包括在使所述表面与多个所述探针核苷酸接触之后并且在对所述场进行成像之前，洗涤所述表面以去除未结合的核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中如果将进行另一循环，则所述循环还包括切割所述探针。
6.根据权利要求1所述的方法，其中如果将进行另一循环，则所述循环还包括切割所述可检测标记。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针核苷酸组包含至少两种不同的核苷酸，每种核苷酸具有不同的可检测标记。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针核苷酸组包含至少四种不同的核苷酸，每种核苷酸具有不同的可检测标记。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针核苷酸组包含腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和鸟嘌呤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针核苷酸组包含腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和鸟嘌呤。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸包括脱氧核糖核酸或核糖核酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个多核苷酸的长度为1kb至100kb。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个多核苷酸的长度为10kb至50kb。
14.根据权利要求1所述的方法，与所述表面结合的所述多核苷酸相隔至少10nm的距离。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测标记与所述探针核苷酸的3’-OH基团结合。
16.根据权利要求1所述的方法，其中并非是可检测标记的封闭基团与所述探针核苷酸的3’-OH结合。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个多核苷酸通过在离散位置与结合至所述表面的捕获探针进行结合而固定。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个多核苷酸与衔接子连接，所述衔接子包含与所述捕获探针的序列互补的捕获序列和与所述测序的引物的序列互补的引发序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述捕获序列为20至50mer。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述引发序列为20至50mer。
21.根据权利要求1所述的方法，其还包括通过比较一组具有相同序列的多核苷酸或者基于数据本身来进行先前循环回归以校正相位误差。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述去卷积包括使用来自所述确定的相对位置的相邻多核苷酸之间的中心距来去除来自所述相邻多核苷酸的干扰光学信号。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述去卷积函数包括最近邻变量回归。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述去卷积包括将来自每个循环中使用的每个独特的可检测标记的重叠波长分开。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述去卷积函数包括串扰回归。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述去卷积函数包括最近邻变量回归、平滑或串扰校正。
27.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多核苷酸在所述基底上间隔开，以供单分子合成测序。
28.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多核苷酸密集地封装在所述基底上，使得来自与包含待测序的不同多核苷酸序列的相邻多核苷酸结合的探针的所述可检测标记所发射的光学信号之间发生重叠。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定在所述表面上的多核苷酸之间的平均间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。
30.根据权利要求1所述的方法，其中至少两个固定在所述表面上的所述多核苷酸之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。
31.根据权利要求1所述的方法，其中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的固定在所述表面上的所述多核苷酸与另一固定的多核苷酸之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述光学系统包括在0.2-2.0之间的数值孔径。
33.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述光学系统包括在1-1.1之间的数值孔径。
34.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述发射的光的波长为400-450nm、450-500nm、500-550nm、550-600nm、600-650nm或650-700nm。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定的多核苷酸包含的相邻多核苷酸之间的最小中心距小于600nm、小于500nm、小于400nm、小于300nm或小于200nm。
36.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸以每平方微米4-25个分子的平均密度固定在所述表面上。
37.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸以每平方微米超过4个、超过6个、超过8个、超过10个、超过15个或超过20个分子的平均密度固定在所述表面上。
38.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面的所述成像以大于由所述光学系统的尼奎斯特极限所确定的临界采样率的分辨率进行。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面的所述成像以至少为2X尼奎斯特采样频率的分辨率进行。
40.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面的所述成像沿图像场的轴以一个像素/300nm或更高的分辨率进行。
41.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面的所述成像沿图像场的轴以162.5nm/像素的分辨率进行。
42.根据权利要求1所述的方法，其还包括从来自每个循环的每个所述场图像生成具有更高像素密度的过采样图像。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述过采样图像是基于所述光学信号的预期点扩散函数通过对每个场图像施加平滑而生成的。
44.根据权利要求1或42所述的方法，其还包括从所述场图像或所述过采样图像生成包括光学信号峰的位置的数据集。
45.根据权利要求1所述的方法，其中所述将所述峰位置叠加包括将多个所述循环的每个场中检测的所述光学信号峰的位置对齐，以从所述多个循环生成每个多核苷酸的光学峰位置的簇。
46.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学分布模型为高斯分布。
47.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学分布模型为点扩散函数。
48.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述场中的多个所述多核苷酸的所述相对位置。
49.根据权利要求1所述的方法，其中以10nm RMS内的准确度确定所述相对位置。
50.根据权利要求1所述的方法，其还包括将来自不同循环的所述场的多个图像叠加，以确定相对于所述场的参考图像的相对偏移。
51.根据权利要求50所述的方法，其包括生成与所述参考图像对齐的每个所述场的偏移值。
52.根据权利要求51所述的方法，其中由所述偏移值确定每个场内的多核苷酸的所述相对位置。
53.根据权利要求52所述的方法，其还包括丢弃对齐在对齐阈值之外的场图像。
54.根据权利要求1所述的方法，其还包括将来自所述场的多个图像叠加以确定相对于所述场的参考图像的相对偏移，其中以5nm RMS内的准确度确定所述相对位置。
55.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法能够以每平方微米4-25个的密度分辨来自表面的光学信号。
56.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测标记发射光，并且其中所述多核苷酸以低于从所述可检测标记发射的光的衍射极限的平均间距固定在所述基底的表面上。
57.一种用于准确地确定固定在密集封装的基底的表面上的分析物的相对位置的方法，其包括：
a.提供包含表面的基底，其中所述表面包含在离散位置处固定在所述表面上的多个分析物；
b.在所述表面上进行多个循环的探针结合和信号检测，每个循环包括：
i.使所述分析物与来自探针组的多个探针接触，其中所述探针包含可检测标记，其中每个所述探针与靶分析物特异性地结合；和
ii.用光学系统对所述表面的场进行成像，以检测来自与所述表面上离散位置处的所述分析物结合的各个探针的多个光学信号，其中至少两个固定在所述表面上的所述分析物之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限；
c.根据来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中的每一个光学信号来确定峰位置；以及
d.将每个光学信号的所述峰位置叠加，并将光学分布模型应用到每个光学信号簇，从而以改善的准确度来确定所述表面上的每个检测的分析物的相对位置。
58.根据权利要求57所述的方法，其还包括：
a.使用所述确定的相对位置和去卷积函数，对来自每个循环的每个场图像中的所述光学信号进行去卷积；和
b.根据所述去卷积的光学信号来识别每个场和每个循环中与所述固定的分析物结合的所述可检测标记。
59.根据权利要求58所述的方法，其还包括使用在每个循环所检测的每个分析物的所述可检测标记的身份来识别所述基底上的多个所述分析物。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述去卷积包括使用来自相邻分析物的所述确定的相对位置的所述相邻分析物之间的中心距来去除来自所述相邻分析物的干扰光学信号。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述去卷积函数包括最近邻变量回归。
62.根据权利要求58所述的方法，其中所述去卷积包括将来自每个循环中使用的每个独特的可检测标记的重叠波长分开。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述去卷积函数包括串扰回归。
64.根据权利要求58所述的方法，其中所述去卷积函数包括最近邻变量回归、平滑或串扰校正。
65.根据权利要求57所述的方法，其中所述分析物为单分子。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述单分子为单生物分子。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述单分子为多核苷酸。
68.根据权利要求57所述的方法，其中所述分析物密集地封装在所述基底上，使得来自与相邻分析物结合的探针的所述可检测标记所发射的光学信号之间发生重叠。
69.根据权利要求57所述的方法，其中固定在所述表面上的所述分析物之间的平均间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。
70.根据权利要求57所述的方法，其中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的固定在所述表面上的所述分析物与另一分析物之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限。
71.根据权利要求68-70中任一项所述的方法，其中所述光学系统包括在0.2-2.0之间的数值孔径。
72.根据权利要求68-70中任一项所述的方法，其中所述光学系统包括在1-1.1之间的数值孔径。
73.根据权利要求68-70中任一项所述的方法，其中所述光的波长为400-450nm、450-500nm、500-550nm、550-600nm、600-650nm或650-700nm。
74.根据权利要求57所述的方法，所述固定的分析物包括的相邻分析物之间的最小中心距小于600nm、小于500nm、小于400nm、小于300nm或小于200nm。
75.根据权利要求57所述的方法，其中所述分析物以每平方微米4-25个分子的平均密度固定在所述表面上。
76.根据权利要求57所述的方法，其中所述分析物以每平方微米超过4个、超过6个、超过8个、超过10个、超过15个或超过20个分子的平均密度固定在所述表面上。
77.根据权利要求57所述的方法，其中每个循环还包括使用来自所述探针组的其他探针重复进行步骤i)和ii)。
78.根据权利要求57所述的方法，其中每个循环还包括在使所述表面与所述多个探针接触之后并且在对所述场进行成像之前，从所述表面去除未结合的探针。
79.根据权利要求57所述的方法，其中如果将进行另一循环，则每个循环还包括从所述表面去除结合的探针。
80.根据权利要求57所述的方法，其中进行至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个循环。
81.根据权利要求57所述的方法，其中每个循环包括用所述光学系统对所述表面的多个场进行成像。
82.根据权利要求57所述的方法，其中所述表面的所述成像以大于由所述光学系统的尼奎斯特极限所确定的临界采样率的分辨率进行。
83.根据权利要求57所述的方法，其中所述表面的所述成像以至少为2X尼奎斯特采样频率的分辨率进行。
84.根据权利要求57所述的方法，其中所述表面的所述成像沿图像场的轴以一个像素/300nm或更高的分辨率进行。
85.根据权利要求57所述的方法，其中所述表面的所述成像沿图像场的轴以162.5nm/像素的分辨率进行。
86.根据权利要求57所述的方法，其还包括从来自每个循环的每个所述场图像生成具有更高像素密度的过采样图像。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述过采样图像是基于所述光学信号的预期点扩散函数通过对每个场图像施加平滑而生成的。
88.根据权利要求57或86所述的方法，其还包括从所述场图像或所述过采样图像生成包括光学信号峰的位置的数据集。
89.根据权利要求57所述的方法，其中所述将所述峰位置叠加包括将多个所述循环的每个场中检测的所述光学信号峰的位置对齐，以从所述多个循环生成每个分析物的光学峰位置的簇。
90.根据权利要求57所述的方法，其中所述光学分布模型为高斯分布。
91.根据权利要求57所述的方法，其中所述光学分布模型为点扩散函数。
92.根据权利要求57所述的方法，其中针对所述场中的多个所述分析物来确定所述相对位置。
93.根据权利要求57所述的方法，其中以10nm RMS内的准确度确定所述相对位置。
94.根据权利要求57所述的方法，其还包括将来自不同循环的所述场的多个图像叠加，以确定相对于所述场的参考图像的相对偏移。
95.根据权利要求94所述的方法，其包括生成与所述参考图像对齐的每个所述场的偏移值。
96.根据权利要求95所述的方法，其中由所述偏移值确定每个场内的分析物的所述相对位置。
97.根据权利要求94所述的方法，其还包括丢弃对齐在对齐阈值之外的场图像。
98.根据权利要求89所述的方法，其还包括将来自所述场的多个图像叠加以确定相对于所述场的参考图像的相对偏移，其中以5nm RMS内的准确度确定所述相对位置。
99.根据权利要求57所述的方法，其中所述方法能够以每平方微米4-25个的密度分辨来自表面的光学信号。
100.根据权利要求57所述的方法，其中所述可检测标记发射光，并且其中结合至阵列的所述分析物包括低于从所述可检测标记发射的光的衍射极限的平均间距。
101.一种用于识别固定在基底表面上的多个密集封装的分析物的方法，其包括：
a.提供包含表面的基底，其中所述表面包含在离散位置处固定在所述表面上的多个分析物；
b.在所述表面上进行多个循环的探针结合和信号检测，每个循环包括：
i.使所述分析物与来自探针组的多个探针接触，其中所述探针包含可检测标记，其中每个所述探针与靶分析物特异性地结合；和
ii.用光学系统对所述表面的场进行成像，以检测来自与所述分析物结合的各个探针的多个光学信号，其中至少两个固定在所述表面上的所述分析物之间的间隔小于由所述可检测标记发射并通过所述光学系统成像的光的衍射极限；
c.根据来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中的每一个光学信号来确定峰位置；
d.将每个光学信号的所述峰位置叠加，并将光学分布模型应用到每个光学信号簇，从而以改善的准确度来确定所述表面上的每个检测的分析物的相对位置；
e.使用所述确定的相对位置和去卷积函数，对来自每个循环的每个场图像中的所述光学信号进行去卷积；
f.根据所述去卷积的光学信号来识别每个场和每个循环中结合至所述固定的分析物的所述可检测标记；以及
g.使用在每个循环所检测的每个分析物的所述可检测标记的身份，以确定所述基底上的多个所述分析物的身份。
102.一种用于确定多个分析物的身份的系统，包含：
a.光学成像装置，其被配置为在与固定在基底表面上的分析物结合的探针的多个循环中，对来自所述基底的场的多个光学信号进行成像，其中至少两个固定在所述表面上的所述分析物之间的间隔小于由与所述分析物结合的所述探针发射的光的衍射极限；和
b.图像处理模块，所述模块被配置为：
i.根据来自所述多个循环中的至少两个循环的所述场的图像的所述多个光学信号中的每一个光学信号来确定峰位置；
ii.通过将光学分布模型应用到来自所述多个循环的每个光学信号簇，以改善的准确度来确定所述表面上的每个检测的分析物的相对位置；以及
iii.使用所述确定的相对位置和去卷积函数，对来自每个循环的每个场图像中的所述光学信号进行去卷积。
103.根据权利要求102所述的系统，其中所述图像处理模块还被配置为使用所述去卷积的光学信号来确定固定在所述表面上的所述分析物的身份。
104.根据权利要求103所述的系统，其中所述分析物各自为多核苷酸分子，并且其中所述身份包括所述多核苷酸分子的序列。
105.根据权利要求102所述的系统，其中所述光学成像装置包括限定可扫描区域的可移动台。
106.根据权利要求105所述的系统，其中所述光学成像装置包括传感器和光学放大器，所述光学放大器被配置为在所述可扫描区域中对低于衍射极限的基底表面进行采样。
107.根据权利要求102所述的系统，其还包括包含分析物的基底，所述分析物以低于衍射极限的中心间隔固定于所述基底的表面。
108.根据权利要求102所述的系统，其中所述去卷积包括使用来自相邻分析物的所述确定的相对位置的所述相邻分析物之间的中心距来去除来自所述相邻分析物的干扰光学信号。
109.根据权利要求108所述的系统，其中所述去卷积函数包括最近邻变量回归。
110.根据权利要求102所述的系统，其中所述去卷积包括将来自每个循环中使用的每个独特的可检测标记的重叠波长分开。
111.根据权利要求110所述的系统，其中所述去卷积函数包括串扰回归。
112.根据权利要求102所述的系统，其中所述去卷积函数包括最近邻变量回归、平滑或串扰校正。
113.根据权利要求102所述的系统，其中所述分析物为单分子。
114.根据权利要求113所述的系统，其中所述单分子为单生物分子。
115.根据权利要求113所述的系统，其中所述单分子为多核苷酸。
116.根据权利要求102所述的系统，其中所述分析物密集地封装在所述基底上，使得来自所述与相邻分析物结合的探针所发射的光学信号之间发生重叠。
117.根据权利要求102所述的系统，其中固定在所述表面上的所述分析物之间的平均间隔小于由所述与相邻分析物结合的探针发射的光的衍射极限。
118.根据权利要求102所述的系统，其中至少两个固定在所述表面上的所述分析物之间的间隔小于由所述与相邻分析物结合的探针发射的光的衍射极限。
119.根据权利要求102所述的系统，其中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的固定在所述表面上的所述分析物与另一分析物之间的间隔小于由所述与相邻分析物结合的探针发射的光的衍射极限。
120.根据权利要求116-119中任一项所述的系统，其中所述光学系统包括在0.2-2.0之间的数值孔径。
121.根据权利要求116-119中任一项所述的系统，其中所述光学系统包括在1-1.1之间的数值孔径。
122.根据权利要求116-119中任一项所述的系统，其中所述光的波长为400-450nm、450-500nm、500-550nm、550-600nm、600-650nm或650-700nm。
123.根据权利要求102所述的系统，所述固定的分析物包括的相邻分析物之间的最小中心距小于600nm、小于500nm、小于400nm、小于300nm或小于200nm。
124.根据权利要求102所述的系统，其中所述分析物以每平方微米4-25个分子的平均密度固定在所述表面上。
125.根据权利要求102所述的系统，其中所述分析物以每平方微米超过4个、超过6个、超过8个、超过10个、超过15个或超过20个分子的平均密度固定在所述表面上。
126.根据权利要求102所述的系统，其中所述光学成像装置被配置为以大于由所述光学系统的尼奎斯特极限所确定的临界采样率的分辨率对所述基底进行成像。
127.根据权利要求102所述的系统，其中所述光学成像装置被配置为以至少为2X尼奎斯特采样频率的分辨率对所述基底进行成像。
128.根据权利要求102所述的系统，其中所述光学成像装置被配置为沿图像场的轴以不超过300nm/像素的分辨率对所述基底进行成像。
129.根据权利要求102所述的系统，其中所述光学成像装置被配置为沿图像场的轴以162.5nm/像素的分辨率对所述基底进行成像。
130.根据权利要求102所述的系统，其中所述图像处理模块被配置为从来自每个循环的每个所述场图像生成具有更高像素密度的过采样图像。
131.根据权利要求130所述的系统，其中所述图像处理模块被配置为基于所述光学信号的预期点扩散函数向每个场图像施加平滑，以生成所述过采样图像。
132.根据权利要求102或130所述的系统，其中所述图像处理模块被配置为生成包括来自所述成像的场的光学信号峰的位置的数据集。
133.根据权利要求102所述的系统，其中所述系统能够以每平方微米4-25个的密度分辨来自表面的光学信号。
134.根据权利要求102所述的系统，所述分析物以低于由所述光学成像装置检测的光的衍射极限的平均中心距固定在所述基底上。
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