CN110643606B - 能快速水解dna的ii类脱氧核酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了多个感应锌离子并能快速水解DNA的II类脱氧核酶突变体，II‑R1a，II‑R1b，II‑R1c，II‑R1d，所述突变体是基于II类脱氧核酶II‑R1的序列，设计“退化”的DNA文库，利用指数富集的配体系统进化技术，体外筛选分离获得的切割位点处碱基分别为G、A、T、C时，水解DNA活性强的II类脱氧核酶突变体。本发明的II类脱氧核酶突变体II‑R1a在50℃下切割反应速率最快，反应1小时切割效率可达80％。

Description

能快速水解DNA的II类脱氧核酶突变体
技术领域
本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及能快速水解DNA的脱氧核酶突变体，尤其涉及Zn2+依赖的II类脱氧核酶突变体。
背景技术
脱氧核酶(Deoxyribozyme)，也称为DNA酶，是一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力，可以催化包括DNA的磷酸化、腺苷化、去糖基化等多种化学反应。近年来，已有研究者筛选出了两类以Zn2+作为辅助因子、能够在特定位点水解DNA磷酸二酯键的脱氧核酶。其中，Zn2+依赖的I类脱氧核酶，带有小的催化核心，侧翼带有1或2个双链亚结构，其水解切割DNA 的速率常数可高达1.0 min-1，且通过再次筛选优化，可获得比I-R1的反应速率快10倍以上的I-R1突变体。
II类脱氧核酶水解DNA的速率常数仅为0.013 min-1，相比I类脱氧核酶，II类脱氧核酶水解切割DNA的反应速率较慢，存在较大优化空间。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，本发明对II类脱氧核酶进行重新筛选优化，从而获得能够更快水解DNA的II类脱氧核酶突变体，并开发出更多的II类脱氧核酶突变体以满足不同DNA水解反应的需求。
第一方面，本发明提供了能快速水解DNA的II类脱氧核酶突变体，所述酶的切割位点处碱基为G/A/T/C。
可选择地，紧靠切割位点磷酸二酯键的核酸序列可被任意碱基序列替换。
可选择地，所述II类脱氧核酶突变体具有通式为“P1-[底物区域]-P2-P2’-[酶区域]-P1’”，其中P1、P1’、P2、P2’为茎干区域。
可选择地，所述II类脱氧核酶突变体为II-R1a，其核苷酸序列组成为P1-GAGCATCTTAGTA（SEQ ID NO:1）P2-P2’-GATTGGGGAATAGATCTTTGGGACT（SEQ ID NO:2）-P1’。
可选择地，所述II类脱氧核酶突变体为II-R1b，其核苷酸序列为P1-AAGCATCTTAGTA（SEQ ID NO:3）P2-P2’-GATTGGGGAATAGATCTTTGGGACT（SEQ ID NO:4）-P1’。
可选择地，所述II类脱氧核酶突变体为II-R1c，其核苷酸序列为P1-TAGTATCTTTTGC（SEQ ID NO:5）P2-P2’-AGCTAGGGGAATAAATCTTTGGGTGA（SEQ ID NO:6）-P1’。
可选择地，所述II类脱氧核酶突变体为II-R1d，其核苷酸序列为P1-CAGCATCTTAGTA（SEQ ID NO:7）P2-P2’- GATTGGGGAATAGATCTTTGGGACG（SEQ ID NO:8）-P1’。
可选择地，所述茎干区域为任意的核苷酸序列，且P1和P1’的核苷酸序列互补，P2和P2’的核苷酸序列互补。
可选择地，所述P1的核苷酸序列为GGTAACGAACGTAG（SEQ ID NO:9），所述P1’的核苷酸序列为CTACGTTCGTTACC（SEQ ID NO:10），所述P2的核苷酸序列为GTACAATCCGACG（SEQID NO:11），所述P2’的核苷酸序列为CGTCGGATTGTAC（SEQ ID NO:12），所述P2’的核苷酸序列还可为CGTCGGATTGTA（SEQ ID NO:13）。
可选择地，所述的II类脱氧核酶突变体于茎干区域P2与P2’之间拆分为两条序列，即底物序列和酶序列。
在一个实施例中，所述II类脱氧核酶突变体II-R1a序列为（SEQ ID NO:14）：5′-G GTAACGAACGTAGGAGCATCTTAGTAGTACAATCCGACGCGTCGGATTGTACGATTGGGGAATAGATCTTTGGGACTCTACGTTCGTTACC-3′，下划线部分为茎干区域。
可选择地，该脱氧核酶突变体可拆分为两条序列，即底物序列和酶序列，所述底物序列为5′-GGTAACGAACGTAGGAGCATCTTAGTAGTACAATCCGACG-3′（SEQ ID NO:15），所述酶序列为5′-CGTCGGATTGTACGATTGGGGAATAGATCTTTGGGACTCTACGTTCGTTACC-3′（SEQ ID NO:16）。
在一个实施例中，所述II类脱氧核酶突变体II-R1b序列为（SEQ ID NO:17）：5′-G GTAACGAACGTAGAAGCATCTTAGTAGTACAATCCGACGCGTCGGATTGTACGATTGGGGAATAGATCTTTGGGACTCTACGTTCGTTACC-3′，下划线部分为茎干区域。
可选择地，该脱氧核酶突变体可拆分为两条序列，即底物序列和酶序列，所述底物序列为5′-GGTAACGAACGTAGAAGCATCTTAGTAGTACAATCCGACG-3′（SEQ ID NO:18），所述酶序列为5′-CGTCGGATTGTACGATTGGGGAATAGATCTTTGGGACTCTACGTTCGTTACC-3′（SEQ ID NO:19）。
在一个实施例中，所述II类脱氧核酶突变体II-R1c序列为：5′-GGTAACGAACGTAGTAGTATCTTTTGCGTACAATCCGACGCGTCGGATTGTAAGCTAGGGGAATAAATCTTTGGGTGACTACGTTCGTTA CC-3′（SEQ ID NO:20），下划线部分为茎干区域。
可选择地，该脱氧核酶突变体可拆分为两条序列，即底物序列和酶序列，所述底物序列为5′-GGTAACGAACGTAGTAGTATCTTTTGCGTACAATCCGACG-3′（SEQ ID NO:21），所述酶序列为5′-CGTCGGATTGTAAGCTAGGGGAATAAATCTTTGGGTGACTACGTTCGTTACC-3′（SEQ ID NO:22）。
在一个实施例中，所述II类脱氧核酶突变体II-R1d序列为：5′-GGTAACGAACGTAGCAGCATCTTAGTAGTACAATCCGACGCGTCGGATTGTACGATTGGGGAATAGATCTTTGGGACGCTACGTTCGTTA CC-3′（SEQ ID NO:23），下划线部分为茎干区域。
可选择地，该脱氧核酶突变体可拆分为两条序列，即底物序列和酶序列，所述底物序列为5′-GGTAACGAACGTAGCAGCATCTTAGTAGTACAATCCGACG-3′（SEQ ID NO:24），所述酶序列为5′-CGTCGGATTGTACGATTGGGGAATAGATCTTTGGGACGCTACGTTCGTTACC-3′（SEQ ID NO:25）。
本发明通过分析测序结果以及序列切割活性测试，发现II类脱氧核酶环状结构中具有80%的保守碱基；在筛选过程中还发现了若干个切割活性略低于II-R1的II类脱氧核酶突变体，其序列如下表所示，其中下划线部分为茎干区域。
Figure SMS_1
另一方面，本发明提供了所述的II类脱氧核酶突变体在切割长单链DNA中的应用。
本发明的有益效果
1）本发明提供了多个用于快速水解DNA的II类脱氧核酶突变体，且对于其茎干区域无序列依赖性，其紧靠切割位点磷酸二酯键的核酸序列可被任意替换。
2）本发明的II类脱氧核酶突变体能够快速有效的水解DNA，其中II-R1a在50℃下切割反应速率最快，反应1小时切割效率可达80%。
附图说明
图1是本发明实施例的建库及筛选流程图；
图2是II-R1和II-R1a的二级结构示意图；
图3是本发明中II-R1a，II-R1b，II-R1c，II-R1d突变体中突变位点示意图；
图4是本发明实施例2中II-R1a切割位点处碱基变换后切割测试结果图；
图5是本发明实施例2中II-R1a切割位点5’端茎干区域第一对碱基对变换后切割测试结果图；
图6是本发明实施例3中II-R1a，II-R1b，II-R1c，II-R1d切割动力学测试结果图。
具体实施方式
下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。本发明实施例中采用的实验器材或实验材料或实验用品没有特殊说明都是本领域通用或市售可购买产品。
实施例1体外筛选
本发明采用指数富集的配基系统进化技术，分为构建DNA文库、PCR扩增、成环反应、预筛、筛选、二次成环等步骤进行，具体见图1所示。在10轮筛选后进行克隆测序。具体步骤如下：
1、DNA文库的构建
DNA文库合成时在II-R1的基础上进行“退化”处理：将下划线部分的碱基进行部分随机化，其余序列保持不变，即各位点85％还保持原来的碱基，剩余的15％随机化。
库1：
5′-pGTGCTACGAACGTAGGAGCATCTTTGGCGTACAAGCGAAGCTTGTACGCTAGGGGAATAAATCT TTGGGCANCTACGTTCGCATCTGC-3′ （SEQ ID NO:34）
库2：
5′-pGTGCTACGTTCGTAGAAGCATCTTTGGCGTACAAGCGAAGCTTGTACGCTAGGGGAATAAATCT TTGGGCANCTACGAACGCATCTGC-3′（SEQ ID NO:35）
库3：
5′-pGTGCTACAGACGTAGTAGCATCTTTGGCGTACAAGCGAAGCTTGTACGCTAGGGGAATAAATCT TTGGGCANCTACGTCTGCATCTGC-3′（SEQ ID NO:36）
库4：
5′-pGTGCTAGCAACGTAGCAGCATCTTTGGCGTACAAGCGAAGCTTGTACGCTAGGGGAATAAATCT TTGGGCANCTACGTTGCCATCTGC-3′（SEQ ID NO:37）
DNA序列在IDT合成，经过10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化后，用荧光成像仪和割胶仪回收目标序列。将回收的序列进行成环反应。
第一次成环反应体系（表1）：
表1
Figure SMS_2
反应条件：60℃反应2小时。
环化产物经离心沉降后用10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，将环状DNA切胶回收。
2、筛选
回收的环状DNA在100μl筛选缓冲液中37℃下孵育30 min，筛选缓冲液体系：50 mMHEPES（pH7.5），100mM LiCl，10mMMgCl2，2mM ZnCl2。通过10%变性聚丙烯酰胺凝胶回收发生切割的线性DNA片段。
3、二次成环反应
将回收的线性DNA片段进行二次成环反应。
二次成环反应（表2）：
表2
Figure SMS_3
反应条件：60℃反应2 h。
环化产物经10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，将环状DNA切胶回收。
4、PCR扩充DNA文库
回收的环状DNA利用PCR反应进行扩增，反应体系如下表3所示，通过10%变性聚丙烯酰胺凝胶回收，进行下一轮筛选。
PCR反应体系（表3）：
表3
Figure SMS_4
引物序列为：
引物1：
正向引物：5′-pGTGCTACGAACGTAG-3′ （SEQ ID NO:38）
反向引物：5′-AAAAAAAAAAAAAAA/spacerC9/GCAGATGCGAACGTAG-3′（SEQ ID NO:39）
引物2：
正向引物：5′-pGTGCTACGTTCGTAG-3′（SEQ ID NO:40）
反向引物：5′-AAAAAAAAAAAAAAA/spacerC9/GCAGATGCGTTCGTAG-3′（SEQ ID NO:41）
引物3：
正向引物：5′-pGTGCTACAGACGTAG-3′（SEQ ID NO:42）
反向引物：5′-AAAAAAAAAAAAAAA/spacerC9/GCAGATGCAGACGTAG-3′（SEQ ID NO:43）
引物4：
正向引物：5′-pGTGCTAGCAACGTAG-3′（SEQ ID NO:44）
反向引物：5′-AAAAAAAAAAAAAAA/spacerC9/GCAGATGGCAACGTAG-3′（SEQ ID NO:45）
注：反向引物中加入spacerC9修饰，可使PCR后的两条DNA链长度不一致，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可将分离纯化出目标DNA链（无spacerC9修饰的DNA链）。
在筛选过程中为得到活性更高的脱氧核酶，需要不断施加筛选压力。从G0（第一轮筛选）到G5（第二轮筛选），筛选步骤中允许脱氧核酶反应的时间为30min；在G6（第六轮筛选）和G7（第七轮筛选）的筛选中，降低反应时间至1min；在G8（第八轮筛选）和G9（第九轮筛选）的筛选中，最终将反应时间降低至20s。最后在G9（第九轮筛选）库中分离出DNA片段，并进行克隆测序。
结果见图2及图3所示，其中图2是II-R1和II-R1a的二级结构示意图，两者碱基不同处突出显示。图3是本发明中II-R1a，II-R1b，II-R1c，II-R1d突变体中突变位点示意图。
实施例2切割位点测试
以II-R1切割位点为参考，对II类脱氧核酶突变体设计相应的参照序列（由多条相隔1个碱基的DNA条带构成），使切割下来的5’端底物切割片段可以对应参照序列中的某一条条带，以确认切割位点的具体位置。
以II-R1a为例，设计三条参照序列：
5′-GGTAACGAACGTAG-3′（SEQ ID NO:46）
5′-GGTAACGAACGTAGG-3′（SEQ ID NO:47）
5′-GGTAACGAACGTAGGA-3′（SEQ ID NO:48）
将所述酶序列（SEQ ID NO:16）和所述底物序列（SEQ ID NO:15）按比例混合（酶序列：底物序列≥1，例如酶序列用量80 pmol，底物序列40 pmol），加入缓冲液1（50 mMHEPES，100 mM LiCl，pH 7.0）混匀，90℃加热5min，缓慢降至室温，然后在37℃预热5min，加入等体积的缓冲液2（50 mM HEPES，100 mM LiCl，20 mM MgCl2，4 mM ZnCl2pH 7.0），混匀后在37℃下反应1 h。乙醇沉降并用75%乙醇洗涤后，进行20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收，测序。若切割后生成的5’端切割片段与参照序列中的5′-GGTAACGAACGTAGG-3′条带位置一致，说明生成的5’端切割片段序列即为5′-GGTAACGAACGTAGG-3′，即可确认切割位点为G/A之间。
结果如图4及图5显示，图4是II-R1a切割位点处碱基变换后切割测试结果图：当II-R1a切割位点处碱基为G/A/T/C时，在37℃下进行1 h切割反应，计算切割后生成的底物片段和总底物片段比率，并比对切割后生成的5’端切割片段与相应参照序列的条带位置，发现改变II-R1a切割位点处碱基类型，其仍具备切割活性，切割位点不发生改变。图5是II-R1a切割位点5’端茎干区域第一对碱基对变换后切割测试结果图：当II-R1a切割位点5’端茎干区域第一对碱基对为G-C/A-T/T-A/C-G时，在37℃下进行1 h切割反应。计算切割后生成的底物切割片段和总底物片段比率，并比对切割后生成的5’端切割片段与相应参照序列的条带位置，发现改变II-R1a切割位点5’端茎干区域第一对碱基对类型，其切割活性无明显变化，切割位点不发生改变。
实施例3切割动力学测试
将II-R1a、II-R1b、II-R1c、II-R1d的底物链5’端进行FAM修饰。底物序列取4pmol，酶序列取20 pmol，加入切割反应缓冲液1（50 mM HEPES，100 mM LiCl，pH 7.0），将体系补齐至100 ul。90℃加热5 min，缓慢降温至室温，然后在反应温度下预热5 min。取4 ul样品加至8 ul终止缓冲液中，记为t0，然后加入96 ul预热的切割反应缓冲液2（50 mM HEPES，100 mM LiCl，20 mM MgCl2，4 mM ZnCl2pH 7.0），并开始计时。在t＝20 s，40 s，1 min…60min时，分别取8ul样品加入8 ul终止缓冲液中。将反应进行了不同时间的样品通过20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
用Typhoon多功能激光共聚焦扫描成像系统进行成像，对凝胶条带进行定量分析。通过计算切割后生成的底物切割片段和总底物片段（切割后生成的底物切割片段加上未切割的全长底物片段）比率，从而得出相应反应时间段的切割效率。反应速率常数kobs可以用下列公式计算：切割百分比＝FCmax(1－e－kt)(其中k＝kobs，FCmax＝最大的切割百分比)。
结果如图6所示，图6是本发明II-R1a，II-R1b，II-R1c，II-R1d切割动力学测试结果图：将II-R1a，II-R1b，II-R1c，II-R1d两端茎干区域延长为20bp，在50℃下进行切割反应。当反应时间为20 s，40s，1min，2min，5min，10min，20min，40min，60min时，分别取等量样品加入终止缓冲液中，终止切割反应。将反应进行了不同时间的样品通过20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。通过计算切割后生成的底物切割片段和总底物片段（切割后生成的底物切割片段加上未切割的全长底物片段）比率，从而得出相应反应时间段的切割效率。发现当切割反应时间为1h时，II-R1a，II-R1b，II-R1c，II-R1d切割效率均可达70%以上，其中II-R1a切割反应速率最快。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属肿瘤医院
<120> 能快速水解DNA的II类脱氧核酶突变体
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<210> 16
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
cgtcggattg tacgattggg gaatagatct ttgggactct acgttcgtta cc 52
<210> 17
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
ggtaacgaac gtagaagcat cttagtagta caatccgacg cgtcggattg tacgattggg 60
gaatagatct ttgggactct acgttcgtta cc 92
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
ggtaacgaac gtagaagcat cttagtagta caatccgacg 40
<210> 19
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
cgtcggattg tacgattggg gaatagatct ttgggactct acgttcgtta cc 52
<210> 20
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
ggtaacgaac gtagtagtat cttttgcgta caatccgacg cgtcggattg taagctaggg 60
gaataaatct ttgggtgact acgttcgtta cc 92
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
ggtaacgaac gtagtagtat cttttgcgta caatccgacg 40
<210> 22
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
cgtcggattg taagctaggg gaataaatct ttgggtgact acgttcgtta cc 52
<210> 23
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
ggtaacgaac gtagcagcat cttagtagta caatccgacg cgtcggattg tacgattggg 60
gaatagatct ttgggacgct acgttcgtta cc 92
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
ggtaacgaac gtagcagcat cttagtagta caatccgacg 40
<210> 25
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
cgtcggattg tacgattggg gaatagatct ttgggacgct acgttcgtta cc 52
<210> 26
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
gtgctacgtt cgtaggaagg atcttggagt acaagcgaag cttgtgcgat aggggaataa 60
gtctttggga tactacgaac gcatctgc 88
<210> 27
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
gtgctacaga cgtagagtat ctttgtcgta caagcgaagc ttgtacgcta ggggaataag 60
tctttgggca cctacgtctg catctgc 87
<210> 28
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
gtgctacaga cgtagtagta tctttgtcgt acaagcgaag cttgtacgct aggggaatag 60
atctttgggc gactacgtct gcatctgc 88
<210> 29
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
gtgctagcaa cgtagcagca tctttggcga tacaagcgaa gcttgtaccc taggggaata 60
aatctttggg cacctacgtt gccatctgc 89
<210> 30
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
gtgctacaga cgtagagtat cttagaggta caagcgaagc ttgtaacggt aggggaataa 60
atctttgggc gactacgtct gcatctgc 88
<210> 31
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
gtgctacaga cgtagtagga tctttgtcgg acaagcgaag cttgtacgct aggggaataa 60
atctttgggt gactacgtct gcatctgc 88
<210> 32
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
gtgctacaga cgtagtagta tcttctgcgt acaagcgaag cttgtatgct tggggaataa 60
atctttgggt gactacgtct gcatctgc 88
<210> 33
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
gtgctacaga cgtagtagta tctttgtcgt acaagcgaag cttgttagct aggggaataa 60
atcttttggg tgactacgtc tgcatctgc 89
<210> 34
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> N=a或t或c或g
<400> 34
gtgctacgaa cgtaggagca tctttggcgt acaagcgaag cttgtacgct aggggaataa 60
atctttgggc anctacgttc gcatctgc 88
<210> 35
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> N=a或t或c或g
<400> 35
gtgctacgtt cgtagaagca tctttggcgt acaagcgaag cttgtacgct aggggaataa 60
atctttgggc anctacgaac gcatctgc 88
<210> 36
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> N=a或t或c或g
<400> 36
gtgctacaga cgtagtagca tctttggcgt acaagcgaag cttgtacgct aggggaataa 60
atctttgggc anctacgtct gcatctgc 88
<210> 37
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> N=a或t或c或g
<400> 37
gtgctagcaa cgtagcagca tctttggcgt acaagcgaag cttgtacgct aggggaataa 60
atctttgggc anctacgttg ccatctgc 88
<210> 38
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<400> 38
gtgctacgaa cgtag 15
<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n=spacer C9
<400> 39
aaaaaaaaaa aaaaangcag atgcgaacgt ag 32
<210> 40
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<400> 40
gtgctacgtt cgtag 15
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n=spacer C9
<400> 41
aaaaaaaaaa aaaaangcag atgcgttcgt ag 32
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<400> 42
gtgctacaga cgtag 15
<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n=spacer C9
<400> 43
aaaaaaaaaa aaaaangcag atgcagacgt ag 32
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化修饰
<400> 44
gtgctagcaa cgtag 15
<210> 45
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n=spacer C9
<400> 45
aaaaaaaaaa aaaaangcag atggcaacgt ag 32
<210> 46
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
ggtaacgaac gtag 14
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
ggtaacgaac gtagg 15
<210> 48
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
ggtaacgaac gtagga 16

Claims (2)

1.一种II类脱氧核酶突变体，其特征在于，所述II类脱氧核酶突变体为II-R1a、II-R1b、II-R1c或II-R1d，所述II-R1a的序列如SEQ ID NO:14所示，所述II-R1b的序列如SEQID NO:17所示，所述II-R1c的序列如SEQ ID NO:20所示，所述II-R1d的序列如SEQ ID NO:23所示。
2.权利要求1所述的II类脱氧核酶突变体在切割长单链DNA中的应用。
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