CN100523202C - 一种有效提高基因定点转换（突变/修复）的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞内基因操作技术，利用DNA合成阻滞剂——胸苷(thymidine)可以将传统单链寡核苷酸介导的基因定点转换(修复/突变)的效率显著提高。目前应用本发明所获得的最佳结果是将效率提高到原先传统方法的约10倍水平。本发明通过胸苷降低复制叉移动速度，使靶基因在复制叉部位长时间以单链形式存在，为单链寡核苷酸与靶序列发生互补配对进而完成靶位点的转换(修复/突变)人为地创造了条件。本发明所获得的结果可以有效提高基因定点转换技术在各个领域的应用性，包括动植物遗传育种、病毒微生物的功能转化，人类点突变遗传病的基因治疗，以及在功能基因组学研究中对单核苷酸多态性的研究方法等。本发明同时提供了一种构建用于基因定点转换研究的报告系统的方法，以及由此方法获得的一株细胞系，该系统在检测、评估基因定点转换效果方面具有优越性。

Description

一种有效提高基因定点转换(突变/修复)的新方法

技术领域

本发明涉及遗传工程领域。具体地说，本发明涉及一种体外提高细胞内基因定点转换的方法。本发明还涉及一种保藏号为CGMCC1030的细胞系以及构建该细胞系的方法。

背景技术

随着越来越广泛的了解生物基因组的信息，发明人可以有目的地改变和修饰生物体的遗传物质，从而获得发明人所期望的结果。例如，发明人可以通过修饰病毒的遗传物质制备减毒、灭活的疫苗，改变植物、农作物的遗传物质以便获得改良品种，在目前广泛进行的功能基因组SNP(单核苷酸多态性)的研究中，也不失为一种重要的技术方法。

针对生物体基因组上定点进行基因转换的方法，最早是在1996年诞生的嵌合体修复术(chimeraplasty)，它的产生亦出自对同源重组的研究。研究发现转录可促进同源重组，当参与配对的两条链中有一条含有RNA时，同源配对的效率将大为提高(Kotani H et.al.Moe GenGenet.250(5)：626-634，1996)。因此Kmiec等人设计了一种具有独特结构的RNA/DNA嵌合寡核苷酸(RNA/DNA chimeric oligonucleotide，RDO)分子，用于进行基因的定点转换。RDO分子(Fig.1)由68个碱基组成，可自身回折形成双链结构。其中一条链全部由DNA组成，另一条是由2段各10个碱基的RNA及中间5bp的DNA组成的嵌合链。这25bp的双链区与基因组中的靶序列之间除中间一个碱基对外其余均呈同源互补，为了防止RNase H对RNA/DNA杂合链的降解，RNA残基均为2-O-甲基化所修饰，并在双链的两端各引入一个由4个T碱基组成的发卡环结构以赋予RDO分子拓扑学上灵活性，3’端加入5个配对的GC桥使得双链结构更加稳定(Richardson PD et al.Curr Opin MolTher.3(4)：327-337，2001)。

嵌合体修复术的原理是利用人工合成的RDO可与基因组中的同源序列有较高配对效率的特点，当RDO与同源序列配对结合后，其间产生一个错配碱基对，这个错配碱基对能被细胞内修复机制所识别，并能以导入的RDO为模板修改基因组中的相应序列，从而获得靶位点的基因改变。

Gamper等人在研究RDO介导该反应机制时，将RDO分子的双链结构分解开来，结果意外地发现含有RNA的嵌合链只是有助于分子的结构稳定性，而不具备指导修复的功能，负责指导修复反应发生的是DNA链。把RDO同源区的DNA链单独拿来进行修复，其修复活性是初始设计的RDO修复活性的五分之一。考虑到DNA单链进入细胞后会受到核酸酶的攻击，很快降解掉，他们在DNA分子两端分别加以3-6个硫代磷酸酯键的修饰，这样的修饰提高了DNA分子的稳定性和亲和性，修复效率比RDO分子高了3-4倍(Gamper HB et al.Nucleic Acids Res.28(21)：4332-4339，2000)。

单链寡核苷酸(single strand oligonucleotide，SSO)的合成与纯化技术比较简单，质量容易控制，再加上合成的成本比RDO低得多，原先研究RDO的实验室都转而采用SSO进行相关研究。SSO的基因定点转换能力很快在酵母、哺乳动物细胞系、及ES细胞中得到证实(Parekh-Olmedo H et al.Chem Biol.9(10)：1073-1084，2002；Igoucheva O et al.Gene Ther.8(5)：391-399，2001；Pierce EA et al.Gene Ther.10(1)：24-33，2003)。

几年来，有关SSO的研究工作表明，尽管得到一些令人欣慰的结果，但是在效率方面所存在的技术瓶颈也突显出来，同时发现不同的实验体系、不同的基因、同一基因的不同位点所获得的实验结果都不稳定，同一实验的重复性也很差。所有相关实验室都因此而受到制约，找到一种有效提高SSO的功能活性的方法成为相关工作人员的首要任务。

有效提高效率的前提是阐明该过程的作用机制，可惜目前人们对于机制的了解还非常浅显。对于其分子过程，人们的认识大致如下：该过程主要分为二步，a.RDO/SSO与靶DNA形成异源二聚体(DNApairing)；b.异源二聚体中的错配位点被细胞内的监视机制所识别，激活内源修复系统，执行基因修复(DNA repairing)，其中可能有若干功能蛋白参与作用(Adersen MS et al.J Mol Med.80(12)：770-781，2002)。

WO02/08409公开了一种用于真核细胞中位点特异性多核苷酸置换的方法，其主要利用不可逆的重组区和不可逆的重组酶如噬菌体进行，其是在现有技术的基础上对传统的转基因方法进行了改进。

但本发明研究组从另一个角度选择在哺乳动物细胞水平开展相关的研究工作，它相对于细菌、酵母、植物而言属于高级复杂体系，使得研究成果更加有意义；另一方面，体外细胞系相对于整体而言，它又具有相对的单一性和稳定性，对实验研究的顺利进行给予一定的保障。在该体系中发明人的研究目的是阐明SSO作用过程的具体机制，从而找到提高效率的方法。

发明人认为SSO的作用是一个复杂的、涉及多通路的分子过程，它可能与基因转录、DNA复制以及多种功能蛋白有关。基于这种想法，发明人首次进行了基因定点转换与细胞周期相关性的研究，发现了SSO作用效率与S期的令人惊讶的密切联系，从而揭示了基因定点转换的作用机制的一个方面，获得了利用Thymidine(胸苷)抑制细胞DNA合成，从而有效提高基因定点转换效率的新方法。

发明内容

根据以上问题，本发明涉及一种体外提高细胞内基因定点转换的方法，包括：

针对靶位点设计合成转换用寡核苷酸分子；

将寡核苷酸分子与转染试剂混合，形成转染复合物；

使生长期S期的细胞与有效抑制DNA合成浓度的S期DNA合成抑制剂接触，使染色体DNA的复制叉处于阻滞状态；

将转染复合物与所述的染色体DNA的复制叉被阻滞的细胞共孵育；

进入细胞的单链寡核苷酸通过同源互补与靶序列相互作用，完成靶位点基因的定点转换。

所述的单链寡核苷酸分子在序列设计上的特征是，除分子中间一个与靶位点不匹配的碱基外，其余均与靶序列互补。

所述的单链寡核苷酸分子是长度优选为20至50个核苷酸之间的短DNA链。

所述的单链寡核苷酸分子长度优选为25个核苷酸。

所述的单链寡核苷酸分子优选是经过末端修饰的短的DNA链。

所述的单链寡核苷酸分子的末端修饰方法优选为硫代磷酸酯键修饰、锁定的核酸(LNA，locked nucleic acid)修饰或末端氨基修饰。

所述的单链寡核苷酸分子的末端修饰方法优选为硫代磷酸酯键修饰。

优选地，所述的细胞为真核细胞，甚至更优选为真核哺乳动物细胞系。

所述的DNA合成抑制剂选自于一组S期抑制剂，包括胸苷，羟基脲(hydroxyurea)，和Aphidicolin(蚜肠霉素)。优选地，所述的DNA合成抑制剂是胸苷。

所述的胸苷的工作浓度优选是2mM至4mM。

在细胞耐受的前提下，胸苷的作用时间越长，所获得的基因定点转换的效率越高。所述的胸苷与细胞接触的时间优选为12至48小时。

本发明还涉及一种用于优化上述研究的保藏号为CGMCC的细胞系。

本发明进一步涉及一种构建所述的细胞系的方法，包括以下步骤：

体外突变报告基因关键位点，灭活其基因功能，同时引入另一处标记性突变；

将突变基因通过电穿孔法转染细胞；

将所述的被转染的细胞进行抗性筛选；

挑取阳性单克隆细胞；

Southern杂交以鉴定外源基因稳定整合在宿主细胞染色体上。

对基因定点转换研究而言，经上述方法所获得的细胞株其特征在于：i.研究报告基因的定点转换可以反映宿主细胞染色体的其它基因位点；ii.报告基因表达的蛋白易于检测，便于进行效果评估；iii.标记性突变可用于排除野生型基因的污染，从而证明单链寡核苷酸对于靶位点转换的真实性。

所述的报告基因优选为EGFP(绿色荧光蛋白)基因。

所述的EGFP基因的突变位点优选为起始密码子ATG的A，即A突变为T(NCBI-U55763第613位)，该突变使EGFP基因丧失表达功能，该位点成为单链寡核苷酸进行基因定点转换作用的靶位点，回复ATG(T转换为A)，EGFP基因的表达功能方可恢复。

所述的标记性突变位点优选为靶位点上游的AgeI识别序列(ACCGGT，NCBI-U55763第600-605位)，该序列被突变为EcoRI识别序列(GAATTC)。

本发明所述的基因定点转换方法较现有技术相比，其效率提高了10倍，而且在本发明方法公开之前，现有技术中没有关于使用单链寡核苷酸与DNA合成抑制剂结合控制基因定点转换的报告。其中本发明所述的方法的一个实施方案中使用了保藏号为CGMCC1030的细胞系，该细胞系为一稳定细胞系，可以有效用于基因定点转换的研究。

生物材料的保藏

申请人已于2003年11月13日将本发明细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC1030，细胞名称为HeLa-mEGFP-F5。

附图说明

图1显示RNA/DNA嵌合寡核苷酸(RDO)的分子结构。

图2显示Southern杂交检测单细胞克隆基因组DNA上突变的EGFP基因的整合。

N：野生质粒pEGFP-C1，杂交的目的片段为1873bp；

P：突变后质粒pmEGFP，杂交的目的片段为2124bp；

1-3：不同的单细胞克隆，其杂交片段长度为2124bp，说明此3株细胞内整合的基因均为突变后的EGFP基因。

图3显示周期同步化的流式细胞仪检测结果。

1.未同步化细胞；

2.L-mimosine将细胞同步在G0/G1期，比例为87.0％；

3.胸苷将细胞同步在S期，比例为96.7％；

4.Nocodazole将细胞同步于G2/M期，比例为76.9％。

图4显示细胞周期不同时相内基因定点修复的效率。

S期修复效率最高(0.54％)，明显高于G0/G1期(0.2％)、G2/M期(0.12％)和未做同步化的细胞，P<0.05。

图5显示SSO介导的基因定点修复在不同反应时间下的效率值。图中可见，(1)在任何时间点，胸苷作用下SSO(E6)介导的修复效率都明显高于无胸苷组；(2)胸苷作用下修复效率随作用时间的延长逐步增高，而无胸苷作用组则在各时间点均呈低值，无明显时间相关性。

图6显示荧光显微镜下观察的修复后细胞。

A.胸苷(—)，SSO修复后的发荧光细胞，每个视野只有一个绿色荧光细胞(放大倍数200)；

B.胸苷(+)，SSO修复后的发荧光细胞，每个视野可见4至6个绿色荧光细胞(放大倍数200)。

图7显示流式细胞仪定量检测修复细胞比例。

A.胸苷(—)，SSO修复后的荧光细胞比例为0.17％；

B.胸苷(+)，SSO修复后的荧光细胞比例为1.67％。

图8显示

A.转染前胸苷抑制不同时间对SSO的修复效率的影响。

两组曲线分别代表转染后24小时和48小时检测组。图中可见

(1)48小时检测组在前抑制不同时间点的效率值均高于同期24小时检测组；

(2)前抑制时间从6小时到24小时，两组都呈现效率递减趋势。

B.RT-PCR检测修复相关基因Rad51和P53在胸苷抑制作用下不同时间的表达水平。

β-actin为内对照。

1&7：PCR空白对照；

2&8：抑制前正常细胞对照；

3&9：胸苷抑制12小时；

4&10：胸苷抑制24小时；

5&11：胸苷抑制36小时；

6&12：胸苷抑制48小时；

M：DNA marker，自下向上分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。

图9显示

A.流式细胞仪检测胸苷抑制不同时间点的细胞周期分布。

通过对比24小时、36小时、48小时的周期分布图，可见细胞在24小时到48小时过程中经历了从S期到M期的过程，证明胸苷作用下，细胞DNA合成速度降低，但并未停止。

B.流式细胞仪检测羟基脲抑制不同时间点的细胞周期分布。

通过对比24小时、36小时、48小时的周期分布图，可见位于G1期的细胞可以进入S期，但S期的细胞不能完成DNA复制而进入M期，说明羟基脲虽然对G1/S交界处的细胞抑制作用是不完全的，但是对于S期的细胞抑制作用是完全的。

C.流式细胞仪检测蚜肠霉素抑制不同时间点的细胞周期分布。

通过对比24小时、36小时、48小时的周期分布图，可见蚜肠霉素抑制作用下，三个时间点周期分布图几乎没有变化，说明蚜肠霉素无论对于G1/S交界处的细胞还是S期当中的细胞，其抑制都是完全的。

图10显示三种不同抑制剂作用下基因定点修复效率的比较。

胸苷作用下，各时间点的修复效率(红色曲线)明显高于另外两种抑制剂；而羟基脲(兰色曲线)和蚜肠霉素(绿色曲线)作用下的修复效率均呈低值，其中蚜肠霉素作用组的效率值最低，接近于基线水平。

图11显示胸苷剂量变化对基因定点修复效率的影响。

通过比较不同浓度(从0.3mM到5Mm)下SSO介导的基因定点修复的效率，可知获得最佳效率的浓度范围是2mM至4mM。

具体实施方式

在前述的研究背景下，本发明提供了一种有效提高基因定点转换的新方法。基于本发明，目前基因定点转换研究中的低效率问题将得到显著改善，同时为基因操作中SSO的应用提供了新途径。

本发明的产生源自发明人对传统基因定点转换机制的深入探讨。发明人认为处于细胞周期不同时相中的细胞内环境在转录组与蛋白组水平上存在着重大区别，同时伴随着细胞周期的运转，细胞内染色质的结构也发生着巨大的变化。这些对于SSO介导的基因定点转换可能有着潜在的但至关重要的影响。因此，发明人想要通过进行基因定点转换事件的细胞周期定位，以便进一步了解机制提高效率。在本发明公开之前，没有任何相关研究的报道。发明人首次观察了SSO介导的基因定点转换的发生是否与特定的细胞周期时相具有相关性。结果发明人发现了基因定点转换事件与细胞周期中的DNA合成期(S期)具有高度相关性，即当发明人采用细胞周期同步化的方法，将细胞群分别同步在细胞周期中的不同时期后，进行SSO介导的基因定点转换，在转染后一定的时间内比较不同细胞周期中所获得的效率，S期的检测值显著高于其它各期(G0/G1期，G2/M期，以及未做同步化的混合的细胞群)，该结果说明S期的细胞环境为基因定点转换事件的发生提供了便利。

在进一步探讨DNA合成期间(S期)基因定点转换频率特异性增高的原因时，发明人发现了对于产生本发明至关重要的一点，即S期所获得的高效率并非因为发明人进行细胞周期同步化增加了S期的细胞数，而是由于发明人在该过程中使用了S期的DNA合成阻滞剂胸苷(胸苷)。

胸苷是一种经典的S期DNA合成抑制剂，在本发明中，发明人利用它对DNA合成的抑制作用，有效提高了SSO发挥其基因定点转换的功能。在此发明公开之前，无论是对于胸苷的研究还是对于SSO介导的基因定点转换的研究，都没有人想到将这二者相结合，从而获得在基因操作定点转换研究方面具有重要意义的突破。

在此公开的方法中，发明人使用的胸苷的剂量是2mM，胸苷的作用时间与基因定点转换的效率具有明确的正相关性，在细胞能够耐受胸苷作用的时间段内(约48小时)，SSO介导的基因转换的效率随胸苷抑制时间的延长而增加，在发明人公开这一方法之时，所获得的最佳结果是将效率提高了10倍。

对于本方法中胸苷的剂量的研究，发明人对比了从0.3mM至5mM的应用范围内基因转换事件的发生频率，结果获得最适作用浓度为2-4mM，在此范围之外，降低或增加使用浓度，效率均会受到影响而降低。

与过去对于基因定点转换过程的认识不同，发明人并不认为功能蛋白质在本方法中对于提高效率起到主要作用，在公开的本发明中，发明人人为地创造了一种有利于SSO发挥其定点转换作用的细胞内环境，具体地讲就是利用胸苷抑制S期细胞DNA的合成，阻碍复制叉的正常行进，使得在复制叉的部位解螺旋的DNA双链长时间以单链形式暴露，当SSO作用的靶位点位于该单链区域时，SSO将很容易地与靶序列配对结合，当复制继续时，SSO恰好处于新生子链的位置，因此，SSO自然地掺入基因组当中，将替换的碱基带入了靶位点，并随着细胞分裂增殖将此信息传递给子代。

本方法涉及的是在任何有分裂增殖能力的细胞中所具有的DNA合成的过程，而且抑制剂(胸苷)的作用也没有任何细胞特异性的限制，当发明人应用该抑制药物于细胞上，就使处于S期细胞的DNA合成受到阻抑，复制叉的移动速度极度减缓，于是提供了长时间暴露的单链区域，为SSO发挥作用提供了适宜的环境。因此，对于体外培养的具有分裂增殖能力的细胞，本发明具有应用的普遍性。

实施例：

在本实施例中，为了优化研究系统，发明人自己构建了一个哺乳动物细胞体系，已经于2003年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC1030，细胞名称为HeLa-mEGFP-F5。以下实验是在该体系中进行的研究工作，其研究结果说明了本发明，但是不限制本发明的范围。

突变的绿色荧光蛋白EGFP基因的定点修复

1.建立哺乳动物细胞荧光报告系统

为获得一个稳定灵敏易于检测的研究系统，发明人研究组首先设计了一个体外的哺乳动物细胞荧光报告系统。

使用人工PCR方法体外突变质粒pEGFP-C1(商品化质粒，购自Cl0NTECH公司)，根据质粒pEGFP-C1的序列设计引物，其中上游引物含有两处突变，一处突变是将EGFP(绿色荧光蛋白)基因起始密码子ATG突变为TTG(A→T)，目的是使EGFP基因失活，不能正常翻译绿色荧光蛋白，该突变位点将成为定点转换的靶位点；另一突变位于起始密码子上游，将AgeI位点(ACCGGT)突变为EcoRI位点(GAATTC)，目的是易于与野生型质粒相区分。

引物序列如下：

P_MEGFP US：5’TCC GCT AGC GCT GAA TTC CGC CAC CTT GGT GAG CAA GGG

CGA GGA GCT 3’

P_MEGFP DS：5’CGA AGC TTG AGC TCG AGA TC3’

将突变后的EGFP基因通过电穿孔仪(Gene pulserII，Bio-Rad公司产品)转染至人HeLa细胞系，G418(Gibco，800mg/ml)药物筛选获得EGFP基因稳定整合在该细胞染色体上的单克隆。

通过Southern杂交鉴定外源基因的整合。由于靶位点的突变使原先存在的NcoI位点(CCATTG)消失，故以NcoI酶切细胞基因组DNA，可以鉴定基因组上确实整合有突变的EGFP基因(Fig.2)。

结果显示，EGFP基因起始密码子ATG突变为TTG可以有效失活EGFP基因的表达功能，该突变基因整合到HeLa细胞染色体上可以稳定存在(至今已3年整)。

由上述方法构建的细胞系在基因定点转换研究方面具有以下优势：a报告基因EGFP(绿色荧光蛋白)作为靶基因，可以利用蛋白产物绿色荧光蛋白作为检测指标，SSO作用(定点修复)后，突变的EGFP基因得到修复，能够重新合成绿色荧光蛋白，该蛋白可以使细胞在荧光显微镜下呈现绿色，以此评估SSO的作用，无需另外的复杂的检测技术；b EGFP基因稳定整合在体外培养的人细胞染色体上，可真正反应SSO对细胞基因组的定点修复功能；c该系统与流式细胞仪结合，既可定量分析SSO的工作效率，又可将作用后发光的细胞分选富集。

通过筛选获得的一株单克隆细胞(自命名HeLa-mEGFP-HELA-MEGFP-F5)在SSO的作用下，突变位点被特异地修复后，细胞可以合成绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下呈现绿色。因此，HeLa-mEGFP-F5细胞株成为进行SSO相关研究的优选体系。2.基因定点修复事件的细胞周期定位

细胞周期同步化：利用细胞周期阻断剂L-mimosine(Sigma，M0253)，胸苷(Sigma，T1895)和nocodazole(Sigma，M1404)，将HeLa-mEGFP-F5细胞分别同步在G0/G1期、S期和G2/M期(Spector DL，Goldman RD，Leinwand LA.1998.Cells.Volume 1，Culture andBiochemical Analysis of Cells.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，USA.14-15.)。流式细胞仪检测DNA含量以分析细胞在各期的百分比，相应各期的细胞数已达到74-96％之间，可以进行以下实验(fig.3)。

在上述同步化的基础上，分别使用L-mimosine、胸苷和nocodazole使已同步化的细胞持续停滞在相应各期，同时转染寡核苷酸分子E6(针对EGFP基因突变位点设计SSO，序列为：5’-CCTTGCTCACCATGGTGGCGGAATT-3’，两端各带6个硫代磷酸酯键修饰以增加分子的稳定性和亲和性，合成于生工生物工程技术服务有限公司，上海)，转染试剂选用Lipofectamin2000(INVITROGENE)，按照产品说明进行操作。转染后细胞与转染复合物持续孵育12hrs，换以普通培养液。继续培养至转染后48小时，观察荧光并用流式细胞仪分析发光细胞比例。实验结果显示，S期细胞修复效率(0.54％)比另外两时相和未同步化细胞的效率都高，分别是未同步细胞修复效率(0.17％)的3.41倍，是G0/G1期细胞(0.20％)的2.9倍，M期细胞(0.12％)的4.83倍。这表明寡核苷酸介导的基因定点修复事件的发生与S期相关(fig.4)。

3.胸苷介导的复制停滞时间与修复效率的相关性

由于S期效率升高的原因并非来自于S期细胞数的增加，而是因为DNA合成抑制剂胸苷的作用，即DNA复制停滞是提高基因定点修复效率的关键。为此，发明人采用一步抑制法探讨胸苷抑制DNA合成的时间与基因定点修复的关系。由于未同步化的细胞有约30-50％的合成期细胞，胸苷可直接作用于这个时相的细胞，而且随着时间的延长，所有的细胞都会运行到S期。

实验结果显示：在48小时内，修复效率与胸苷抑制时间呈正比。胸苷抑制最短在4小时内即可使修复效率较明显提高，之后修复效率随抑制时间的延长而继续攀升。由于胸苷抑制时间超过48小时后细胞不能耐受，未继续追踪。如fig.5示：E6在胸苷抑制细胞DNA复制48小时的条件下，获得修复效率的平均值为1.273％，最高值达1.67％。明显高于未加胸苷抑制时的修复效率(0.17％)。

4.荧光显微镜下观察胸苷对基因定点修复作用的增强效果

利用荧光显微镜观察细胞，可直接反映胸苷对于SSO定点修复的促进作用。Fig.6A为无胸苷作用的观察结果，其发荧光细胞需移动两到三个视野，才可见一个发光细胞；Fig.6B为胸苷提高效率后的情况，平均每个视野下都可见4-6个荧光细胞。

将上述两个样品利用流式细胞仪进行检测，获得绿色发光细胞的比值，进行量化的比较，可见在胸苷作用下，修复效率达到1.67％，而无胸苷的样品修复效率为0.17％(fig.7)。

5.胸苷对基因定点修复的增强作用与蛋白修复因子无明显相关性

在探讨胸苷对基因定点修复的增强作用内在机制时，发明人考虑如果胸苷介导的复制停滞时间与修复效率的提高成正比的现象是由于胸苷作用后相关功能蛋白量的变化引起，那么复制停滞就不是效率提高的必要条件。为验证这种情况，进行转染前抑制实验：首先添加胸苷抑制细胞DNA的合成而不转染寡核苷酸，这里与前面的处理方法不同，发明人先让胸苷单独作用一定的时间(0、6、12、24小时)，按照上述理论，相关的蛋白水平将发生变化，并随时间延长而具有一定的储备，再转入E6，继续持续作用12小时(另一组48小时)，换新鲜培养基，均于转染后48小时收集细胞检测发光效率。实验结果显示：两组结果均呈先增后降的趋势。6小时以内的短期前抑制具有促进修复作用，之后，随着前抑制时间的延长，修复效率呈现较大幅度的下降(Fig.8A)。显然该结果不支持修复蛋白作用的假设。

选取两个较重要的蛋白因子Rad51和P53，采用RT-PCR方法检测其复制抑制状态下的表达水平是否有较明显的改变。Rad51是一个具有促进链同源配对功能的因子，而P53不仅对细胞周期运行具有严格的监控作用，还有研究发现P53与Rad51蛋白可产生直接相互作用。发明人检测这两种具有代表性的蛋白的表达水平，再次求证修复因子的假设。结果表明，与正常细胞相比，不同时间DNA复制抑制状态下的细胞并未表现出明显的表达变化(Fig.8B)。结合前抑制实验结果，认为蛋白因子并不是导致效率增长的主要原因。

6.胸苷抑制作用下复制叉可以渗漏移行

进一步探讨胸苷作用下效率提高的机制，发明人考虑到DNA合成受到抑制时，复制叉部位双链解螺旋形成单链，前导链指导子链连续合成，滞后链以冈歧片段(Okazaki fragment)不连续合成，当靶序列处于这个阶段时，寡核苷酸很容易接近靶序列而发生同源配对，这时25nt的SSO即可作为核苷酸原料掺入到子链中。但是，复制叉的完全停止并不能有效暴露靶序列，而且也不能解释实验中发现的一个现象，即转染后尚未撤除抑制时细胞已可发光了。因此，发明人推断胸苷抑制作用下存在着极缓慢的复制，即渗漏作用(leakiness)。在渗漏作用下，复制叉极为缓慢的前进，这样，靶序列在复制叉处长时间以单链形式暴露的几率大大增加，使得单链寡核苷酸有机会与互补链结合，发挥期修复功能。另外，随着复制的继续进行，单链寡核苷酸便作为新生链掺入基因组当中。当该区域复制完成后，以新生链为模板的转录开始进行，生成修复后的mRNA，进而翻译合成绿色荧光蛋白。

为此，分别检测胸苷抑制24、36和48小时后细胞的周期时相分布，从细胞周期的变化情况看(Fig.9)，细胞在胸苷抑制作用下，复制叉渗漏的确存在，DNA复制以极其缓慢的速度进行，该结果有利地支持了上述假说。

7.复制叉渗漏是提高基因定点修复的重要条件

为充分证明这一推断，选择另外两种DNA合成抑制剂羟基脲和蚜肠霉素，通过流式细胞仪分析了这两种抑制因子对细胞S期抑制的强度，表明这两种抑制剂的作用均强于胸苷，蚜肠霉素甚至可以使DNA合成完全停止(Fig.9)。依据上述理论，复制叉完全停止就不能有效暴露靶序列，从而影响SSO的作用，修复效率不会得到提高。在胸苷，羟基脲和蚜肠霉素的作用下，转染相同剂量的E6，分别继续作用12，24，36和48小时，换液，统一于转染后48小时收集细胞检测的发光细胞比例。结果表明羟基脲、蚜肠霉素与胸苷对于寡核苷酸修复的作用的确不同，抑制作用越强(渗漏作用越小)，效率越低。。胸苷的作用明显高于其它两种DNA合成抑制剂。羟基脲的发光比例在0.15-0.32％的水平，而蚜肠霉素均在0.10％以下(Fig.10)。

另一方面，前述实验均采用经典剂量(2mM)，依据复制叉停滞寡核苷酸配对理论，胸苷浓度的过低与过高会使复制叉前进过快或停止从而不利于寡核苷酸配对，降低修复效率。实验验证，在细胞中分别添加梯度剂量的胸苷(0.3-5mM)，而后转染E6，48小时后做流式细胞仪检测。结果显示2-4mM的剂量范围内，修复水平基本稳定，过高或过低的浓度均导致效率的下降(Fig.11)。发明人认为，在1-4mM的浓度范围内，胸苷提供了修复所需的DNA合成抑制与缓慢渗漏的双重作用。过低的剂量可能不足以有效抑制DNA的合成，而过高的浓度又不能形成缓慢渗漏的状态，因此影响了修复效率。

因此，以上几个方面证实，胸苷作用下复制叉渗漏寡核苷酸掺入基因组的假说具有客观合理性。

尽管本发明根据上面的实施例中已经得到描述，但应当理解的是，多种修饰和变化都包含在本发明的精神和范围内。而限制本发明的仅仅是所附的权利要求。

Claims (12)

1.一种体外提高细胞内基因定点转换的方法，包括：

针对靶位点设计合成转换用寡核苷酸分子；

将寡核苷酸分子与转染试剂混合，形成转染复合物；

使生长期S期的细胞与有效抑制DNA合成浓度的S期DNA合成抑制剂接触，使染色体DNA的复制叉处于阻滞状态，其中所述S期DNA合成抑制剂是浓度为1mM至4mM的胸苷；

将转染复合物与所述的染色体DNA的复制叉被阻滞的细胞共孵育；

进入细胞的单链寡核苷酸通过同源互补与靶序列相互作用，完成靶位点的定点转换。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的细胞为真核细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的细胞为真核哺乳动物细胞系。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的细胞为HeLa细胞系。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的单链寡核苷酸分子在序列设计上的特征是，除分子中间一个与靶位点不匹配的碱基外，其余均与靶序列互补。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的单链寡核苷酸分子是长度选自20至50个核苷酸之间的短DNA链。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的单链寡核苷酸分子长度为25个核苷酸。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的单链寡核苷酸分子两末端经过化学修饰以增强分子的稳定性。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的单链寡核苷酸分子的末端修饰方法选自于硫代磷酸酯键修饰、LNA修饰、末端氨基修饰。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述的单链寡核苷酸分子的末端修饰方法为硫代磷酸酯键修饰。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的胸苷的工作浓度是2mM至4mM。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的胸苷与细胞接触的时间为12-48小时。

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