CN110637934A - 茶籽粕多糖复合物及其在饲料和治疗猪蓝耳病中的应用 - Google Patents

茶籽粕多糖复合物及其在饲料和治疗猪蓝耳病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种茶籽粕多糖复合物，原料中各组分的重量配比如下：茶籽粕多糖提取物10‑15份、维生素c 2份、花青素1‑2份、dl‑α‑生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇5‑8份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。本发明还提供了一种茶籽粕多糖提取物，选用了黑曲霉发酵茶籽粕，加入川芎提取液，对发酵过程进行优化，诱导产生生物活性极高的混合多糖，同时含有微生物胞外多糖以及植物多糖，经测试，对猪蓝耳病毒有很好的效果。此外，对畜禽免疫功能、生产性能有促进作用。

Description

茶籽粕多糖复合物及其在饲料和治疗猪蓝耳病中的应用
技术领域
本发明属于中药制剂领域，涉及一种多糖复合物，尤其涉及一种茶籽粕多糖复合物，其对猪蓝耳病毒感染具有很好的治疗效果。
背景技术
多糖是由醛糖或酮糖之间通过糖苷键相连接的一类天然大分子聚合物。多糖在自然界来源广泛，特别是在高等植物、动物、微生物、海藻中含量丰富。多糖在细胞识别、控制细胞的分裂和分化等方面起着极其重要的决定作用。活性多糖可直接激活免疫细胞，增强动物免疫细胞的吞噬、杀伤作用、激活补体系统，促进抗体的产生、细胞因子的合成与分泌等作用。
本申请人的在先申请公开过一种茶籽粕多糖复合物，原料中各组分的重量配比如下：黄芪多糖50-70份、刺五加多糖25-35份、甘草多糖10-20份、苜蓿多糖1-5份、维生素c 2-5份、dl-α-生育酚乙酸酯0.5-2.5份、新橙皮苷二氢查耳酮10-20份、甘露糖醇3-8份、二氧化硅0.5-1.5份、硅铝酸钠1-5份。该配方选用了黄芪多糖、刺五加多糖、甘草多糖、苜蓿多糖、维生素，植物多糖是中药的主要活性成分之一，维生素是维持畜禽正常生长和代谢必不可少的物质，植物多糖和维生素合用具有提高畜禽的免疫力、生长速度和生产性能的作用。该发明中的新橙皮苷二氢查耳酮、甘露糖醇、二氧化硅、硅铝酸钠联合使用可提高黄芪多糖、刺五加多糖、甘草多糖、苜蓿多糖和维生素的对畜禽免疫功能、生产性能的促进作用，使得母猪产程更短，显著减少鸡新城疫的发病率，但食用该预混料的产后母猪和仔猪的采食量却骤减，我们对采食量骤减的问题进行了探索，发现结合本发明特有的制备工艺可解决该问题，使得产后母猪和仔猪的采食量显著增加。
本申请人科研团队在此基础上进一步研究和改进，现提出一种效果更好的茶籽粕多糖复合物，充分利用了中药和微生物发酵工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种效果更好的茶籽粕多糖复合物。
川芎是江西特色中药，其为不规则结节状拳形团块，直径2～7cm。表面黄褐色，粗糙皱缩，有多数平行隆起的轮节，顶端有凹陷的类圆形茎痕，下侧及轮节上有多数小瘤状根痕。质坚实，不易折断，断面黄白色或灰黄色，散有黄棕色的油室，形成层呈波状环纹。气浓香，味苦、辛。稍有麻舌感，微回甜。
已知川芎嗪能扩张冠状动脉，增加冠状动脉血流量，改善心肌的血氧供应，并降低心肌的耗氧量；川芎嗪可扩张脑血管，降低血管阻力，显著增加脑及肢体血流量，改善微循环；能降低血小板表面活性，抑制血小板凝集，预防血栓的形成；所含阿魏酸的中性成分小剂量促进，大剂量抑制子宫平滑肌；水煎剂对动物中枢神经系统有镇静作用，并有明显而持久的降压作用；可加速骨折局部血肿的吸收，促进骨痂形成；有抗维生素E缺乏作用；能抑制多种杆菌；有抗组织胺和利胆作用。本发明首次发现川芎作用于微生物发酵可以影响多糖。
油茶与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料植物。它生长在中国南方亚热带地区的高山及丘陵地带，是中国特有的一种纯天然高级油料。主要集中在浙江、江西、河南、湖南、广西、安徽等地。油茶籽粕为油茶籽榨取茶油后的饼粕，含有30%～ 50%的糖类物质。茶籽粕中还含有茶皂素、茶籽蛋白等，它们都是化工、轻工、食品、饲料工业产品等的原料，具有很高的综合利用价值。
油茶树是江西的特产作物，江西盛产山茶油，每年有大量提取山茶油后剩余的茶籽粕废弃，直接作物饲料其适口性较差，不易消化。茶籽粕具有丰富的营养，经实验验证，不需要添加碳源即可直接作为发酵培养基。
黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。用途： 食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。
微生物胞外多糖( Extracellular Polysaccharide，EPS) 是指微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的水溶性多糖，属于微生物多糖的一种。包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。微生物胞外多糖是一种长链的大分子聚合物，具有独特的物理性质、流变学特性以及较好的安全性，在食品工业领域倍受青睐，在石油、日化、纺织、医药等领域的应用潜能日益引起人们的关注，它除具有大多数植物多糖和合成的高分子聚合物所特有的性质外，还具有低浓度下呈高黏度、假塑性、热稳定性。
多糖实际上是一种混合物，不同的结构，分子量对生物活性有着至关重要的影响，有些具有很好的生物活性，有些则几乎没有活性。
维生素C 2份、花青素1-2份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇5-8份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
维生素C，又称为抗坏血酸。维生素C可促进胶原蛋白的合成，促进胶原组织，如骨组织、软骨组织、壳和其他结缔组织，以及细胞间质的形成。维生素C还可以减轻维生素B1、维生素B9、泛酸和生物素等不足引起的缺乏症，可促进白细胞的吞噬作用以及网状内皮系统功能和促进抗体的形成，增强畜、禽、鱼类对各种应激现象的适应性并且提供免疫力。
花青素属于酚类中的类黄酮类化合物，基本结构单元为2-苯基苯并吡喃阳离子，以C6-C3-C6为基本骨架，花青素常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷，其成苷的种类、数目、位置不同，形成的花色苷的种类也不同，使得花青素的种类繁多。花青素具有很有生理活性，如抗氧化，可预防由氧化损伤所引起的心脑血管疾病，保护肝脏，抑制肿瘤细胞生长，抑制炎症过敏等。作为抗氧化剂，花青素强大的清楚体内有害自由基的能力，可阻碍核酸、蛋白质和脂肪被氧化损害，并能预防多种疾病的危害。
dl-α-生育酚乙酸酯是维生素E的一种，是非酶抗氧化系统中中药的抗氧化剂，能清楚体内的自由基并阻断其引发的链反应，保护生物膜（包括细胞膜、细胞器膜）脂蛋白众多不饱和脂肪酸、细胞骨架及其他蛋白质的巯基免受自由基和氧化剂的攻击。dl-α-生育酚乙酸酯是哺乳动物维持生育必不可少的营养物质。
新橙皮苷二氢查耳酮是一种高效、无毒、低热值甜味剂，具有风味改良和苦味抑制的作用，加入到饲料中，可促进产后母猪和仔猪的采食量。甘露糖醇也是一种甜味剂，与新橙皮苷二氢查耳酮可产生协同作用。二氧化硅、硅铝酸钠具有良好的稳定性，可以改善饲料的流动性和抗结块性能。
本发明发现在加入少量的川芎提取液，可以有效影响黑曲霉对茶籽粕的发酵作用，使得生成含有大量多糖的混合物，该混合多糖液对普通型猪蓝耳病具有良好的治疗效果。同时，适口性好，易于消化，适用于多种动物的饲料。
本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种茶籽粕多糖提取物，通过在茶籽粕发酵过程中加入川穹提取液制备，其制备方法为：
（1）取油茶籽饼粕破碎，加水混合，接种黑曲霉；
（2）在第1-3天，保持10-25摄氏度发酵；
（3）第4天，加入0.05倍油茶籽饼重量的川穹提取液，继续发酵；
（4）水提醇沉得到茶籽粕多糖提取物粉末。
优选地，其中步骤（1）取油茶籽饼粕破碎，加入1倍的水混合，接种黑曲霉，接种量为3%。
优选地，其中步骤（2）中所述发酵温度为20摄氏度。
其中步骤（3）中所述川穹提取液的制备方法为：
准确称取川芎饮片 25.00g ，丹参饮片 25.00g，剪碎川芎饮片和丹参饮片放于 500mL烧杯中加 300 mL 水浸泡24h,加热回流提取2次，每次2h，滤出溶液。
优选地，步骤（3）中川芎提取液的制备方法为：
准确称取川芎饮片 50.00g，剪碎川芎饮片放于 500mL 烧杯中加 300 mL 水浸泡24h,加热回流提取2次，每次2h，滤出溶液。
其中步骤（3）中继续发酵时间为3天，温度为32摄氏度。
优选地，所述步骤（4）具体为：
加入油茶籽饼加1倍质量的水浸泡12h，加热回流提取2次，每次2h，合并滤出溶液，浓缩，再加入体积分数为75%的乙醇溶液进行醇沉，静置6h，滤过，再进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为120℃，干燥后得到茶籽粕多糖提取物粉末。
一种茶籽粕多糖复合物，原料中各组分的重量配比如下：
茶籽粕多糖提取物10-15份、维生素c 2份、花青素1-2份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇5-8份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
其制备方法为：
（1）按重量份将茶籽粕多糖提取物与dl-α-生育酚乙酸酯混匀，备用；
（2）按重量份将新橙皮苷二氢查耳酮、甘露糖醇与二氧化硅混匀，用100W的红外灯泡垂直照射5-10分钟，备用；
（3）按重量份将花青素、维生素C与硅铝酸钠混匀，备用；
（4）将步骤（1）、（2）、（3）得到的混合物混匀即可。
普遍认为川芎提取液对细菌的生长有一定的抑制作用，本发明人发现如加入大量的川芎提取液，对黑曲霉的生长也有抑制作用，但是在低温发酵一段时间后再加入少量的川芎提取液则对黑曲霉的生长无明显的抑制作用，反而会影响多糖的产生，最后能生产生物活性极高的多糖，经测试，对猪蓝耳病的治疗有很好的效果。
本发明的优点：
本发明配方选用了黑曲霉发酵茶籽粕，同时含有微生物胞外多糖以及植物多糖，并且对发酵过程进行优化，诱导产生生物活性极高的混合多糖，经测试，对猪蓝耳病毒有很好的效果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
实施例1
一种茶籽粕多糖复合物，原料中各组分的重量配比如下：
茶籽粕多糖提取物10份、维生素c 2份、花青素1份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇5份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
其制备方法为：
（1）按重量份将茶籽粕多糖提取物与dl-α-生育酚乙酸酯混匀，备用；
（2）按重量份将新橙皮苷二氢查耳酮、甘露糖醇与二氧化硅混匀，用100W的红外灯泡垂直照射5-10分钟，备用；
（3）按重量份将花青素、维生素C与硅铝酸钠混匀，备用；
（4）将步骤（1）、（2）、（3）得到的混合物混匀即可。
其中所述茶籽粕多糖提取物的制备方法如下：
（1）取油茶籽饼粕破碎，加入1倍的水混合，接种黑曲霉，接种量为3%；
（2）在第1-3天，保持20摄氏度发酵；
（3）第4天，加入0.05倍油茶籽饼重量的川芎提取液；
其中川芎提取液的制备：准确称取川芎饮片 50.00g，剪碎川芎饮片放于 500mL 烧杯中加 300 mL 水浸泡24h,加热回流提取2次，每次2h，滤出溶液；
其中继续发酵时间为3天，温度为32摄氏度；
（4）加入油茶籽饼加1倍质量的水浸泡12h，加热回流提取2次，每次2h，合并滤出溶液，浓缩，再加入体积分数为75%的乙醇溶液进行醇沉，静置6h，滤过，再进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为120℃，干燥后得到茶籽粕多糖提取物粉末。
实施例2：
一种茶籽粕多糖复合物，原料中各组分的重量配比如下：
茶籽粕多糖提取物15份、维生素c 2份、花青素2份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇8份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
其制备方法同实施例1。
所述茶籽粕多糖提取物的制备方法如下：
（1）取油茶籽饼粕破碎，加入1倍的水混合，接种黑曲霉，接种量为3%；
（2）在第1-3天，保持20摄氏度发酵；
（3）第4天，加入0.05倍油茶籽饼重量的川芎提取液；
其中川芎提取液的制备：准确称取川芎饮片 50.00g，剪碎川芎饮片放于 500mL 烧杯中加 300 mL 水浸泡24h,加热回流提取2次，每次2h，滤出溶液；
其中继续发酵时间为3天，温度为32摄氏度；
（4）加入油茶籽饼加1倍质量的水浸泡12h，加热回流提取2次，每次2h，合并滤出溶液，浓缩，再加入体积分数为75%的乙醇溶液进行醇沉，静置6h，滤过，再进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为120℃，干燥后得到茶籽粕多糖提取物粉末。
实施例3
一种茶籽粕多糖复合物，原料中各组分的重量配比如下：
茶籽粕多糖提取物12份、维生素c 2份、花青素2份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇6份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
其制备方法同实施例1。
所述茶籽粕多糖提取物的制备方法如下：
（1）取油茶籽饼粕破碎，加入1倍的水混合，接种黑曲霉，接种量为3%；
（2）在第1-3天，保持20摄氏度发酵；
（3）第4天，加入0.05倍油茶籽饼重量的川芎提取液；
所述川芎丹参提取液的制备方法为：准确称取川芎饮片 25.00g ，丹参饮片 25.00 g，剪碎川芎饮片和丹参饮片放于 500mL 烧杯中加 300 mL 水浸泡24h,加热回流提取2次，每次2h，滤出溶液；
其中继续发酵时间为3天，温度为32摄氏度；
（4）加入油茶籽饼加1倍质量的水浸泡12h，加热回流提取2次，每次2h，合并滤出溶液，浓缩，再加入体积分数为75%的乙醇溶液进行醇沉，静置6h，滤过，再进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为120℃，干燥后得到茶籽粕多糖提取物粉末。
对比例1：
一种茶籽粕多糖复合物，原料中各组分的重量配比如下：
油茶籽饼粕多糖10份、维生素c 2份、花青素1份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇5份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
其制备方法同实施例1。
其中所述油茶籽饼粕多糖的制备方法参考“油茶籽饼粕多糖的提取工艺优化及结构鉴定”，安徽农业科学，J．Anhui Agric．Sci． 2019，47(1):167－170，189。提取条件：超声时间10 min，料液比1 ∶20，浸提温度60 ℃，浸提时间120 min 为最佳工艺条件。
对比例2：
黑曲霉固体发酵多糖提取物10份、维生素c 2份、花青素1份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇5份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
其制备方法同实施例1。
黑曲霉固体发酵条件：水稻秸秆粉6%、蛋白胨5%、聚乙二醇0.1%、初始pH值为6.5。黑曲霉接种量4%，30°C下通风搅拌培养7d,
黑曲霉多糖提取方法：加总培养物1倍质量的水浸泡12h，加热回流提取2次，每次2h，合并滤出溶液，浓缩，再加入体积分数为75%的乙醇溶液进行醇沉，静置6h，滤过，再进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为175℃，出风温度为115℃，干燥后得到黑曲霉多糖粉末，产率很低，约为2%，说明正常情况下黑曲霉产多糖量很低。
对比例3：
一种茶籽粕多糖复合物，原料中各组分的重量配比如下：
茶籽粕发酵多糖提取物10份、维生素c 2份、花青素1份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇5份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
其制备方法同实施例1。
其中茶籽粕发酵多糖提取物的制备方法如下：
（1）取油茶籽饼粕破碎，加入1倍的水混合，接种黑曲霉，接种量为3%；
（2）保持温度32摄氏度发酵7天，终止发酵；
（3）加入油茶籽饼加1倍质量的水浸泡12h，加热回流提取2次，每次2h，合并滤出溶液，浓缩，再加入体积分数为75%的乙醇溶液进行醇沉，静置6h，滤过，再进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为120℃，干燥后得到茶籽粕发酵多糖提取物粉末。
对比例4：
一种茶籽粕多糖复合物，原料中各组分的重量配比如下：
茶籽粕丹参发酵多糖提取物10份、维生素c 2份、花青素2份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇6份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
其制备方法同实施例1。
其中茶籽粕丹参发酵多糖提取物的制备方法如下：
（1）取油茶籽饼粕破碎，加入1倍的水混合，接种黑曲霉，接种量为3%；
（2）在第1-3天，保持20摄氏度发酵；
（3）第4天，加入0.05倍油茶籽饼重量的丹参提取液，保持32摄氏度继续发酵3天，一共6天，终止发酵；
其中丹参提取液的制备方法为：准确称取丹参饮片 50.00 g 剪碎丹参饮片放于500mL 烧杯中加 300 mL 水浸泡24h,加热回流提取2次，每次2h，滤出溶液。
（4）加入油茶籽饼加1倍质量的水浸泡12h，加热回流提取2次，每次2h，合并滤出溶液，浓缩，再加入体积分数为75%的乙醇溶液进行醇沉，静置6h，滤过，再进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为120℃，干燥后得到茶籽粕丹参发酵多糖提取物粉末。
对比例5：
一种茶籽粕多糖复合物，原料中各组分的重量配比如下：
茶籽粕益母草发酵多糖提取物10份、维生素c 2份、花青素2份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇6份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
其制备方法同实施例1。
其中茶籽粕益母草发酵多糖提取物的制备方法如下：
（1）取油茶籽饼粕破碎，加入1倍的水混合，接种黑曲霉，接种量为3%；
（2）在第1-3天，保持20摄氏度发酵；
（3）第4天，加入0.05倍油茶籽饼重量的益母草提取液，保持32摄氏度继续发酵3天，一共6天，终止发酵；
其中益母草提取液的制备方法为：准确称取益母草粉 50.00 g于 500mL 烧杯中加300 mL 水浸泡24h,加热回流提取2次，每次2h，滤出溶液。
（4）加入油茶籽饼加1倍质量的水浸泡12h，加热回流提取2次，每次2h，合并滤出溶液，浓缩，再加入体积分数为75%的乙醇溶液进行醇沉，静置6h，滤过，再进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为120℃，干燥后得到茶籽粕益母草发酵多糖提取物粉末。
对上述实施例和对比例所制备的多糖复合物进行猪蓝耳病毒治疗效果监测。试验地点为中成医药集团五垦养殖场，选取2018 年1月到2019 年1月感染普通型猪蓝耳病的猪250 头，将其随机分为实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、阴性对照组和阳性对照组，共10个小组，各25 头。其中实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5为实验组，阴性对照组和阳性对照组为对照组。实验组和阴性对照组猪均采用林可霉素以及口服补液进行治疗1个疗程，共10天，观察3个月时候的治愈情况。阳性对照组猪不给与治疗。阴性对照组和阳性对照组猪饲喂基础日粮，实验组分别在基础饲粮基础上添加实施例1-3和对比例1-5制得的复合物的基础日粮，添加量为400g/t。试验结束对病死猪进行无害化处理，将病死猪及其污染物集中焚烧处理。
病猪以母猪和仔猪为主，两组病猪在猪龄、患病时间以及体重上并无明显差异，P＞ 0.05，具有可比性。
本次研究所得数据均采用SPSS19.0 进行处理和分析，采用t 值和x2 检验计数资料，最终结果满足P ＜ 0.05，则对比具有统计学意义。结果见表一所示。
表一：实施例1-3和对比例1-5提高免疫力的效果
组别 治愈（头） 死亡（头） 死亡率（%）
实施例1 21 4 16<sup>*#</sup>
实施例2 21 4 16<sup>*#</sup>
实施例3 25 0 0<sup>*#</sup>
对比例1 18 7 28<sup>*#</sup>
对比例2 17 8 32<sup>#</sup>
对比例3 17 8 32<sup>#</sup>
对比例4 18 7 28<sup>*#</sup>
对比例5 17 8 32<sup>#</sup>
阴性对照组 14 11 44
阳性对照组 5 20 80
注释：与阴性对照组比较，*：P＜0.05；与阳性对照组比较，#：P＜0.05。
可见，本发明使用的多糖都具有一定的提高免疫力的效果，使用丹参和益母草作为发酵促进提取液发酵的多糖其效果和未加入提取液发酵效果无明显差别（对比例1-3 VS对比例4-5）。不加入川芎的发酵提取和不发酵的茶籽饼粕多糖相比，效果略好（对比例3 VS对比例1），加入川芎发酵得到的多糖明显具有提高的效果，复配丹参效果更是有显著的提高（实施例1-3 VS 对比例3 VS对照组）。可见，川芎的加入改变了微生物产多糖的生理过程，获得的混合多糖具有非常的提高免疫力的效果。
实施例5 黑曲霉生长试验和多糖检测
PDA液体培养基：市售。
黑曲霉平板培养基： 葡萄糖8g/L、酵母膏2g/L、蛋白胨2g/L、Mg S04 0.2 g/L、NaH2P04 0.1g/L、H2P04 0.1g/L、MnS04 0.01g/L、琼脂 1.5g/L。
平板培养活化菌种：将菌种接种于平板培养基上，在培养箱中培养，28℃，培养3天。
茶籽粕培养基：取油茶籽饼粕研磨成粉状，加入1倍的水混合。
川芎培养基：川芎饮片 50.00g，剪碎川芎饮片放于 500mL 烧杯中加 300 mL 水浸泡24h,加热回流提取2次，每次2h，滤出溶液。
实验组1：使用PDA液体培养基培养：取新鲜的平板活化菌种，在无菌操作台上用接种环刮下菌体接种于150mL摇瓶中，摇瓶中为PDA液体培养基，摇床220r/min，30℃，培养48小时。
实验组2：使用PDA液体培养基+大量川芎提取液培养：取新鲜的平板活化菌种，在无菌操作台上用接种环刮下菌体接种于150mL摇瓶中，摇瓶中为PDA液体培养基+10%质量分数的川芎提取液，摇床220r/min，30℃，培养48小时。
实验组3：使用PDA液体培养基+少量川芎提取液培养：取新鲜的平板活化菌种，在无菌操作台上用接种环刮下菌体接种于150mL摇瓶中，摇瓶中为PDA液体培养基+2.5%质量分数的川芎提取液，摇床220r/min，30℃，培养48小时。
实验组4：使用茶籽粕培养基培养 ：取新鲜的平板活化菌种，在无菌操作台上用接种环刮下菌体接种于150mL摇瓶中，摇瓶中为茶籽粕培养基，摇床220r/min，30℃，培养48小时。
实验组5：使用茶籽粕培养基+大量川芎提取液培养 ：取新鲜的平板活化菌种，在无菌操作台上用接种环刮下菌体接种于150mL摇瓶中，摇瓶中为茶籽粕培养基+10%质量分数的川芎提取液，摇床220r/min，30℃，培养48小时。
实验组6：使用茶籽粕培养基+少量川芎提取液培养：取新鲜的平板活化菌种，在无菌操作台上用接种环刮下菌体接种于150mL摇瓶中，摇瓶中为茶籽粕培养基+2.5%质量分数的川芎提取液，摇床220r/min，30℃，培养48小时。
黑曲霉生长试验：采用培养基对菌体进行培养，测定4小时、12小时、24小时、48小时黑曲霉菌量的变化情况，菌体量的测定（取 100mL 培养液，过滤，用蒸馏水洗至中性，在80℃下烘干 8 小时至恒重，冷却至室温测定其质量），试验均重复三次，测定结果如表二所示。所得数据均采用SPSS19.0 进行处理和分析，采用t 值和x2 检验计数资料，如结果满足P ＜ 0.05，则对比具有统计学意义。
表二：实验组1-6黑曲霉生长菌体量
组别 4小时 12小时 24小时 48小时
实验组1 0.5±0.1g/L<sup>*</sup> 1.3±0.2g/L<sup>*</sup> 1.8±0.3g/L<sup>*</sup> 1.9±0.5g/L<sup>*</sup>
实验组2 0.2±0.2g/L 0.3±0.0g/L 0.3±0.1g/L 0.3±0.1g/L
实验组3 0.4±0.2g/L<sup>*</sup> 1.5±0.4g/L<sup>*</sup> 1.9±0.3g/L<sup>*</sup> 2.2±0.2g/L<sup>*</sup>
实验组4 0.3±0.1g/L<sup>#</sup> 0.9±0.2g/L<sup>#</sup> 1.3±0.4g/L<sup>#</sup> 1.4±0.7g/L<sup>#</sup>
实验组5 0.1±0.0g/L 0.2±0.0g/L 0.3±0.1g/L 0.3±0.1g/L
实验组6 0.3±0.2g/L<sup>#</sup> 1.2±0.4g/L<sup>#</sup> 1.6±0.3g/L<sup>#</sup> 1.8±0.2g/L<sup>#</sup>
注释：实验组1和3与实验组2比较，*：P＜0.05；实验组4和6与实验组5比较，#：P＜0.05。
从表二可以看到，黑曲霉菌体在从平板接入培养液的最初4小时逐渐适应周围的生长环境，之后进入对数生长期，菌体量迅速增加，直到24小时后质量增长变缓。PDA液体培养基相对于茶籽粕培养基，更加适合黑曲霉的生长。无论是PDA液体培养基还是茶籽粕培养基，加入大量的川芎提取液，对黑曲霉的生长也有抑制作用，但是少量的川芎提取液则对黑曲霉的生长反而有轻微的促进作用。
多糖含量的测定: 确称取葡萄糖进行溶解,使用硫酸-葱酮法配置不同浓度的溶液，以多糖浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,得标准曲线。将第1管为空白,于490nm处测定实验组1-6的吸光值, 计算实验组1-6在48小时的多糖含量（质量分数），试验均重复三次，测定结果如表三所示。
单糖组成分析试验：将实验组1-6的培养物加1倍质量的水常温浸泡12h，加热回流提取2次，每次2h，合并滤出溶液，浓缩，再加入体积分数为75%的乙醇溶液进行醇沉，静置6h，滤过，再进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为120℃，干燥后得到实验组1-6多糖提取粉末。使用2 mol/L硫酸在100℃油浴条件下将实验组1-6多糖水解成单糖,然后采用离子色谱仪对混合单糖标准品和多糖的单糖组成进行检测分析。试验均重复三次，结果如表三所示。
表三：实验组1-6多糖含量测定和单糖组分分析
组别 多糖含量/% 甘露糖比例/% 葡萄糖比例/%
实验组1 12.2±1.4<sup>*</sup> 未测出<sup>*</sup> 94.3±1.9
实验组2 2.2±0.3 0.3±0.1 88.9±3.2
实验组3 15.3±3.7<sup>*</sup> 0.2±0.1 90.4±1.8
实验组4 10.3±5.1<sup>#</sup> 0.1±0.0<sup>#</sup> 92.6±2.0
实验组5 1.8±0.7 1.4±0.2 85.5±5.2
实验组6 13.2±4.2<sup>#</sup> 1.2±0.8 88.2±4.1
注释：实验组1和3与实验组2比较，*：P＜0.05；实验组4和6与实验组5比较，#：P＜0.05
从表三可以看出，无论是PDA液体培养基还是茶籽粕培养基，加入大量的川芎提取液，对多糖的产生都有抑制作用，但是少量的川芎提取液则对多糖的含量反而有轻微的促进作用（并且具有显著加强的免疫刺激功能）。而进行单糖组成分析可以发现，川芎能够轻微改变多糖中葡萄糖的比例，这可能和不同条件下多糖的结构有关，后续可以再采用红外光谱、甲基化方法和核磁等技术对多糖的结构进行解析。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种茶籽粕多糖提取物，其特征在于，其通过在茶籽粕发酵过程中加入川穹提取液制备，其制备方法为：
（1）取油茶籽饼粕破碎，加水混合，接种黑曲霉；
（2）在第1-3天，保持10-25摄氏度发酵；
（3）第4天，加入0.05倍油茶籽饼重量的川穹提取液，继续发酵；
（4）水提醇沉得到茶籽粕多糖提取物粉末。
2.根据权利要求1所述的茶籽粕多糖提取物，其特征在于，所述步骤（1）取油茶籽饼粕破碎，加入1倍的水混合，接种黑曲霉，接种量为3%。
3.根据权利要求1所述的茶籽粕多糖提取物，其特征在于，步骤（2）中，发酵温度为20摄氏度。
4.根据权利要求1所述的茶籽粕多糖提取物，其特征在于，步骤（3）中所述川穹提取液的制备方法为：
准确称取川芎饮片 25.00g ，丹参饮片 25.00g，剪碎川芎饮片和丹参饮片放于 500mL烧杯中加 300 mL 水浸泡24h,加热回流提取2次，每次2h，滤出溶液。
5.根据权利要求1所述的茶籽粕多糖提取物，其特征在于，步骤（3）中继续发酵时间为3天，温度为32摄氏度。
6.根据权利要求1所述的茶籽粕多糖提取物，其特征在于，步骤（3）中川芎提取液的制备方法为：
准确称取川芎饮片 50.00g，剪碎川芎饮片放于 500mL 烧杯中加 300 mL 水浸泡24h,加热回流提取2次，每次2h，滤出溶液。
7.根据权利要求1所述的茶籽粕多糖提取物，其特征在于，所述步骤（4）具体为：
加入油茶籽饼加1倍质量的水浸泡12h，加热回流提取2次，每次2h，合并滤出溶液，浓缩，再加入体积分数为75%的乙醇溶液进行醇沉，静置6h，滤过，再进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为120℃，干燥后得到茶籽粕多糖提取物粉末。
8.一种茶籽粕多糖复合物，其特征在于，原料中各组分的重量份如下：
茶籽粕多糖提取物10-15份、维生素C 2份、花青素1-2份、dl-α-生育酚乙酸酯1份、新橙皮苷二氢查耳酮5份、甘露糖醇5-8份、二氧化硅1份、硅铝酸钠1份。
9.一种制备权利要求8中茶籽粕多糖复合物的方法，包括如下步骤：
（1）按重量份将茶籽粕多糖提取物与dl-α-生育酚乙酸酯混匀，备用；
（2）按重量份将新橙皮苷二氢查耳酮、甘露糖醇与二氧化硅混匀，用100W的红外灯泡垂直照射5-10分钟，备用；
（3）按重量份将花青素、维生素C与硅铝酸钠混匀，备用；
（4）将步骤（1）、（2）、（3）得到的混合物混匀即可。
10.权利要求8所述的茶籽粕多糖复合物或权利要求9中制备的茶籽粕多糖复合物在饲料或猪蓝耳病治疗中的应用。
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