CN110632186A - 一种upcc法测定维生素d2注射液中维生素d2含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速测定维生素D2注射液中维生素D2含量的色谱方法，运用超高效合相色谱法，通过对色谱条件的巧妙优化，最终达到快速而准确地对复杂组分样品中维生素D2含量的测定。该色谱方法包括以下步骤：(1)系统适用性溶液的制备；(2)对照品溶液的制备；(3)供试品溶液的制备。并利用维生素D2的标准曲线来计算维生素D2注射液中维生素D2的含量。本发明能在15min内快速分离并准确测定维生素D2的含量，方法具有良好的专属性和线性关系、准确度高、检测速度快、灵敏度高、再现性好、环保等优点。

Description

一种UPCC法测定维生素D2注射液中维生素D2含量的方法
技术领域
本发明涉及一种运用超高效合相色谱法(UPCC)测定维生素D2注射液中维生素D2含量的方法，运用超临界CO2作为流动相并对色谱条件进行巧妙优化，最终快速而准确地测定维生素D2注射液中维生素D2的含量。
背景技术
维生素D2注射液临床上用于维生素D缺乏症的预防和治疗、慢性低钙血症、低磷血症、佝偻病及伴有慢性肾功能不全的骨软化症、家族性低磷血症及甲状旁腺功能低下的治疗和用于治疗急慢性及潜在手术后手足搐搦症及特发性手足搐搦症。
对维生素D2注射液中维生素D2含量的测定方法，现为2015版中国药典四部通则0722维生素D测定法第一法，该法采用正相色谱，系统适用性试验、对照品的制备、混合对照品的制备过程十分繁琐，均需要经过水浴加热和通氮等处理，且计算过程复杂、结果误差大、重现性差、流动相采用大量有机溶剂对环境造成污染，浪费大量的人力、物力和时间。
超高效合相色谱仪突破了液相色谱和气相色谱分离的局限，主要的流动相为超临界CO2，与液体流动相或载气相比，降低了成本和毒性，并具有溶剂载量少、分离度高、峰形窄、选择性高、分离快速等优点。与现行法定标准的正相色谱法相比，大大减少了有毒有害有机试剂的使用，并节约了成本，体现了绿色检验和检验经济学的理念。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定维生素D2注射液中维生素D2含量的方法，是直接采用超高效合相色谱法测定维生素D2的含量，结果专属性和线性良好，本发明简便、准确和快捷，安全且环保。
本发明的技术解决方案是：在确保系统适用性通过的前提下，先使待测样品溶解，令待测样品中维生素D2的浓度能达到检测线性范围，然后用超高效合相色谱法测定维生素D2注射液中维生素D2的含量，包括以下步骤：
(1)将维生素D2和维生素D3对照品分别用正己烷溶解，并分别配制成浓度均为0.25mg/ml的溶液，制成维生素D2和维生素D3对照品标准储备溶液待用；
(2)将维生素D2注射液用正己烷溶解，配制成浓度为25μg/ml的溶液，过滤，制成供试品溶液待用；
(3)分别取步骤(1)配制的维生素D2、维生素D3对照品标准储备溶液，加正己烷稀释制成维生素D2和维生素D3浓度均为25μg/ml的混合对照品标准溶液，作为系统适用性溶液；使用超高效合相色谱仪分析，并得到维生素D2与维生素D3的分离度；
(4)取步骤(1)的维生素D2对照品标准储备溶液，配制成梯度浓度的标准溶液；使用超高效合相色谱仪分析，并根据得到的色谱绘制维生素D2峰面积与浓度的标准曲线；
(5)在步骤(4)的相同液相色谱条件下检测步骤(2)制得的供试品溶液，再利用步骤(4)得到的维生素D2峰面积与浓度的标准曲线来计算维生素D2的含量。
其中，步骤(3)系统适用性溶液得到的色谱图中，维生素D2与维生素D3的分离度大于1.5。
在步骤(3)(4)(5)的色谱系统中，所述的流动相为超临界CO2，改性剂为四氢呋喃。
优选地，超临界CO2与四氢呋喃的体积比为95∶5。
在步骤(3)(4)(5)的色谱系统中，流速为0.3～1.5ml/min，柱温为不大于50℃，进样量为5μl，背压为2700psi。
优选地，所述的检测波长为254nm，所述的流速为1.0ml/min，所述的柱温为45℃。
在步骤(3)(4)(5)的色谱系统中，色谱柱以亚乙基桥杂化颗粒(BEH)为填充剂。
为了提高检测结果的准确性，重复步骤(5)一次以上，取平均值进行计算维生素D2注射液中维生素D2的含量。
与现有的技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明利用超高效合相色谱，配合PDA检测器，对维生素D2注射液中维生素D2含量进行分析，缓解了现有技术对维生素D2含量测定检测过程繁琐、检测时间长、选择性差、有机溶剂使用量大等问题。
2、本发明采用超高效合相色谱，建立系统适用性试验，使维生素D2与维生素D3得到良好分离，能准确检测维生素D2注射液中维生素D2的含量，结果专属性和线性良好、精密度、准确度高，可有效的节约检测成本和时间，并且安全环保。
附图说明
图1为本发明含量测定——系统适用性溶液色图谱；
图2为本发明含量测定——对照品溶液色谱图；
图3为本发明含量测定——维生素D2线性标准曲线；
图4为本发明含量测定——供试品溶液色图谱。
具体实施方式
下面通过实施例对发明作进一步详细的说明。
实施例一
通过本实施例测定维生素D2注射液中维生素D2含量，并验证其专属性。
1、检测条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPC2TMBEH，1.7μm，3.0×100mm；
流动相：超临界CO2和四氢呋喃(95∶5)；
背压：2700psi；
检测波长：254nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：45℃；
进样量：5μl。
2、各溶液配制如下：
(1)标准储备溶液：精密称取12.5mg维生素D2对照品置50ml棕色量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度，此溶液浓度约为0.25mg/ml。精密称取12.5mg维生素D3对照品置50ml棕色量瓶中，立即用正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，此溶液浓度约为0.25mg/ml。
(2)系统适用性溶液：精密量取上述标准储备溶液各1ml，置10ml棕色量瓶中，立即用正己烷稀释至刻度，摇匀，此溶液分别约含维生素D2和维生素D3各25μg/ml。
(3)对照品溶液：精密量取维生素D2标准储备溶液1ml置10ml量瓶中，立即加正己烷稀释至刻度，摇匀，此溶液浓度约为25μg/ml。
(4)供试品溶液：精密量取供试品溶液0.5ml，置100ml棕色量瓶中，立即加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，此溶液浓度约为25μg/ml。
3、测定方法为：精密量取系统适用性试验溶液5μl，注入合相色谱仪，按前述色谱条件进行测定，记录色谱图。量取供试品溶液和对照品溶液各5μl，同法测定；按外标法以峰面积计算维生素D2注射液中维生素D2的含量。
4、专属性考察
分别精密量取维生素D2对照品溶液与维生素D2注射液供试品溶液各5μl，注入合相色谱仪，记录色谱图。对照品溶液的色谱图见图2，供试品溶液的色谱图见图4，通过比较对照品溶液和供试品溶液的色谱图，维生素D2的保留时间一致(均为10.3min)，说明本法专属性良好。
实施例二
采用实施例一中的检测条件、对照品溶液和测定方法，进行线性关系考察。
分别精密量取维生素D2标准储备溶液，加正己烷稀释制成分别含维生素D2 12.5、20、25、37.5、50、100μg/ml的对照品溶液，按含量测定项下色谱条件进行测定，以峰面积(A)对浓度(C)进行回归分析，如表1、图3所示。
表1维生素D2线性关系结果
Figure BSA0000165755650000041
可见，维生素D2浓度在13.019～104.148μg/ml范围内，有良好的线性关系，相关系数R2＝0.9999。
实施例三
采用实施例一中的检测条件、对照品溶液和测定方法，在实施例一、实施例二的基础上考察准确度和精密度。
1、准确度考察
加样回收率试验：精密量取已知各成分含量供试品溶液9份，每3份为一组，每组均按照低、中、高三个浓度分别加入维生素D2标准储备溶液0.8ml、1.0ml、1.2ml，加正己烷稀释至刻度，摇匀，精密量取5μl分别注入合相色谱仪，记录色谱图，计算维生素D2的加样回收率和RSD，维生素D2的平均回收率为98.76％，RSD为1.86％，说明本发明准确度高。
2、精密度考察
精密量取维生素D2对照品溶液5μl，注入合相色谱仪，记录色谱图，重复6次，以测得的峰面积计算RSD，结果得RSD为0.38％，符合精密度要求，说明本发明精密度良好。
实施例四
采用实施例一中的检测条件、对照品溶液和测定方法对样品进行测定。
市售维生素D2注射液(江西赣南海欣药业股份有限公司)
以市售维生素D2注射液为供试品，其标示量为每1ml中含维生素D2 4.5～5.5mg。
供试品溶液制备：精密量取供试品溶液0.5ml，置100ml棕色量瓶中，立即加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
按前述含量测定方法测定该维生素D2注射液中维生素D2含量，结果见图4，由图4可知，该注射液中含有维生素D2，未检出维生素D3，其标示含量为每1ml中含维生素D24.63mg。

Claims (10)

1.一种超高效合相色谱法快速测定维生素D2注射液中维生素D2含量的色谱方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，将维生素D2和维生素D3对照品分别用正己烷溶解，并分别配制成浓度均约为0.25mg/ml的溶液，作为维生素D2和维生素D3对照品标准储备溶液待用；
步骤(2)，将维生素D2注射液用正己烷溶解，配制成浓度约为25μg/ml的溶液，过滤，制成供试品溶液待用；
步骤(3)，分别取步骤(1)的维生素D2、维生素D3对照品标准储备溶液，加正己烷稀释制成维生素D2和维生素D3浓度均约为25μg/ml的混合对照品标准溶液，作为系统适用性试验溶液；使用超高效合相色谱仪分析，并得到维生素D2与维生素D3的分离度；
步骤(4)，取步骤(1)的维生素D2对照品标准储备溶液，配制成梯度浓度的标准溶液；使用超高效合相色谱仪分析，并根据得到的色谱绘制维生素D2峰面积与浓度的标准曲线；
步骤(5)，在步骤(4)的相同液相色谱条件下检测步骤(2)制得的供试品溶液，再利用步骤(4)得到的维生素D2峰面积与浓度的标准曲线来计算维生素D2的含量。
2.根据权利要求1所述的测定维生素D2注射液中生素D2含量的分析方法，其特征在于，步骤(3)系统适用性溶液得到的色谱图中，维生素D2与维生素D3的分离度大于1.5。
3.根据权利要求1所述的测定维生素D2注射液中维生素D2含量的分析方法，其特征在于，在步骤(3)(4)(5)的色谱系统中，流动相为超临界CO2，改性剂为四氢呋喃。
4.根据权利要求3所述的测定维生素D2注射液中维生素D2含量的分析方法，其特征在于，超临界CO2与四氢呋喃的体积比为95∶5。
5.根据权利要求1所述的测定维生素D2注射液中维生素D2含量的分析方法，其特征在于，在步骤(3)(4)(5)的色谱系统中，流速为0.3～1.5ml/min，柱温为不大于50℃，进样量为5μl，背压为2700psi。
6.根据权利要求5所述的测定维生素D2注射液中维生素D2含量的分析方法，其特征在于，检测波长为254nm。
7.根据权利要求5所述的测定维生素D2注射液中维生素D2含量的分析方法，其特征在于，所述的流速为1.0ml/min。
8.根据权利要求5所述的测定维生素D2注射液中维生素D2含量的分析方法，其特征在于，所述的柱温为45℃。
9.根据权利要求1所述的测定维生素D2注射液中维生素D2含量的分析方法，其特征在于，在步骤(3)(4)(5)的色谱系统中，色谱柱以亚乙基桥杂化颗粒(BEH)为填充剂。
10.根据权利要求1所述的测定维生素D2注射液中维生素D2含量的分析方法，其特征在于，重复步骤(5)一次以上，取平均值进行计算维生素D2注射液中维生素D2的含量。
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