CN110628897A

CN110628897A - 一种kfs致病基因新突变及其应用

Info

Publication number: CN110628897A
Application number: CN201911012812.7A
Authority: CN
Inventors: 李子全; 赵森; 蔡思逸; 吴南; 吴志宏; 王以朋
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2039-10-23
Also published as: CN110628897B

Abstract

本发明公开了与KFS相关的VANGL1基因的SNP突变位点，并提供一种检测VANGL1易感SNP位点基因型的试剂。进一步，本发明公开了一种KFS辅助诊断的试剂盒。本发明筛选了KFS相关的易感基因的SNP位点并提供其在KFS诊断中的应用，阐述SNP对于KFS进展的影响，揭示其在诊断、治疗中价值。因此，本发明可开发出利用SNP基因型对KFS的诊断进行检测的试剂盒和生物制剂，不仅能够快速有效的做到早期诊断，其精确度大大提高，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

一种KFS致病基因新突变及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种KFS致病基因新突变及其应用。

背景技术

先天性颈椎融合畸形(Klippel-Feil Syndrome，KFS)是一种先天性的颈椎椎体发育畸形，发病率约为1/40000-1/42000，其临床典型特点为：颈部短粗、后发际低、颈部活动受限；但只有不到50％的患者同时具有三项表现。

KFS多合并多种先天性疾病和其他系统畸形，患者的神经压迫症状从神经根病到四肢麻痹、死亡等均可出现，还可造成严重的身心问题，给家庭和社会造成极大负担。

目前，因缺乏早期预测手段，KFS患者多在出现颈椎严重畸形时才被发现，治疗方法仅能通过支具或手术矫形来控制颈椎畸形的进展，但对其他系统畸形病变无法改善。因此，探索早期预测、诊断方法和病因治疗靶点是当前KFS的研究热点。但目前KFS病因未明，近年的研究表明KFS的病因可能与基因突变、环境因素以及发育异常相关，其中尤以基因突变最为密切。基因突变在KFS的发生、发展过程中起着非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的是针对解决上述技术问题，提出一种与KFS疾病相关的基因易感SNP位点及其在制备检测或治疗KFS疾病产品中的应用。

本发明的第二目的是提供一种检测VANGL1易感SNP位点基因型的试剂。

本发明的第三个目的是提供一种KFS辅助诊断的试剂盒。

发明人收集KFS患者血液样本通过全外显子水平寻找基因的致病性突变，并通过小量样本进行基因型验证，进一步证实新突变是有害的，可以作为KFS诊断标志物，为预测疾病发展和指导临床早期干预提供理论依据，早日实现KFS的个体化早期诊断和治疗。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

首先，本发明提供了一种VANGL1易感SNP位点，所述SNP位点为：

人类第1号染色体第116227985位碱基由C到G的SNP位点突变，所述位点突变具体信息为NM_001172412.1:c.1151C>G(p.Pro384Arg)。

进一步地，本发明提供一种检测VANGL1易感SNP位点基因型的试剂，所述试剂包括用于扩增所述SNP位点的引物对，或是包括用于扩增所述SNP 位点的引物对和限制性内切酶，所述SNP位点为：

优选的，扩增所述SNP位点的引物对具有SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。

优选的，所述引物对扩增的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

更进一步地，本发明提供一种KFS辅助诊断的试剂盒，其包括检测 VANGL1:NM_001172412.1:c.1151C>G的SNP位点基因型的试剂。

优选的，包括用于扩增所述SNP位点的引物对，或是包括用于扩增所述SNP位点的引物对和限制性内切酶。

优选的，所述引物对具有SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。

优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

有益效果

本发明通过对患者血液DNA进行全外显子测序筛选了VANGL1基因的易感SNP位点并提供了其在KFS早期诊断中的应用，阐述SNP对于KFS 进展的影响，揭示其在早期诊断中的价值。因此，本发明通过检测SNP基因型来诊断KFS是否发生，并进一步开发KFS的诊断试剂盒和生物制剂，能够快速有效的做到早期诊断、为患者争取最好的早期干预时间。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明的技术方案具体包括：采集符合标准的血液样本，提取DNA；基因型检测：选择KFS病例、与KFS病例年龄匹配的健康对照，利用外显子测序，找出与KFS相关的SNP；进一步采用基因分型进行检测，验证其应用于临床诊断的可重复性；KFS检测试剂盒的研制：根据KFS病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发KFS早期检测试剂盒。

数据分析中各数值表示如下：

1、ljb23_sift：SIFT分值(version 2.3)，表示该变异对蛋白序列的影响，包含三个值，一是SIFT初始分值，二是转换后的值(1-SIFT)，三是T或者D。当该变异同时影响多个蛋白序列时，对每条蛋白序列有一个SIFT值，取最小值。SIFT分值越小越“有害”，表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大；D:Deleterious(sift<＝0.05)；T:tolerated(sift>0.05)；

2、ljb23_pp2hvar：利用PolyPhen2基于HumanVar数据库预测该变异对蛋白序列的影响，用于单基因遗传病。该列包含两个值，第一个是PolyPhen 2分值，数值越大越“有害”，表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大；第二个是D或P或B(D:Probably damaging(>＝0.909),P:possibly damaging(0.447<＝pp2_hvar<＝0.909)；B:benign(pp2_hvar<＝0.446))；

3、ljb23_pp2hdiv：利用PolyPhen2基于HumanDiv数据库预测该变异对蛋白序列的影响，用于复杂疾病。该列包含两个值，第一个是PolyPhen 2 分值，数值越大越“有害”，表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大；第二个是D或P或B(D:Probably damaging(>＝0.957)，P:possibly damaging(0.453<＝pp2_hdiv<＝0.956)；B:benign(pp2_hdiv<＝0.452))；

4、ljb23_mt：Mutation Taster分值(version 2.3)，表示该变异对蛋白序列的影响，包含三个值，一是Mutation Taster初始分值，二是转换后的值，三是A、D、N或者P。第二个值越大越“有害”，表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大，其中"A"("diseasecausing automatic")；"D"("disease causing")；"N"("polymorphism")；"P"("polymorphism automatic")。

实施例1外周血DNA的提取和纯化

1、样品收集

收集了2016年1月到2019年3月北京协和医院骨科收治的散发KFS 患者血液样本，共38例，KFS患者中男20例，女18例，诊断时最大年龄 45岁，最小年龄6岁，平均14.7岁。所有KFS患者均经过X线颈椎正侧位，颈部CT或MRI平扫确定诊断，其共同特征是颈椎椎体形成障碍或者分节不良导致的融合畸形。

2、DNA的提取

在上述符合条件的38例KFS患者和15例健康对照，两组年龄均衡可比。

具体步骤为：

(1)向储存于2mL冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694) 20mL混合后，用TrisHcl溶液定容至2000mL，下同)，颠倒混匀后完全转入。

(2)去除红细胞：用溶血试剂将5mL离心管补至4mL，颠倒混匀， 4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4mL溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

(3)抽提DNA：向沉淀中加1mL抽提液(每300mL中含有 122.5mL0.2M氯化钠，14.4mL0.5M乙二胺四乙酸，15mL10％十二烷基硫酸钠，148.1mL双蒸水，下同)和8μL蛋白酶K，振荡器上充分振荡混匀，37℃水浴过夜。

(4)去除蛋白质：加1mL饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm 离心10分钟，取上清转入新的5mL离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24:1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5mL的离心管)。

(5)DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μL，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm 离心10min。

(6)DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1mL，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

(7)测量浓度：通常能得到20-50ng/μLDNA，纯度(紫外2600D：2800D) 在1.8-2.0。

实施例2全外显子测序

将实施例1中两组人群经全外显子芯片检测获得相关结果。

1、文库构建

北京诺禾致源科技股份有限公司采用Agilent的液相芯片捕获系统，对人的全外显子区域DNA进行高效富集，然后在Illumina Hiseq平台上进行高通量、高深度测序。建库和捕获实验采用Agilent SureSelect Human All ExonV5试剂盒，严格使用说明书推荐的试剂和耗材，并参照最新的经过优化的实验流程进行操作。

实验基本流程：将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为 180-280bp的片段，经末端修复和加A尾后在片段两端分别连接上接头制备 DNA文库。带有特异index的文库pooling后与多达543,872个生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将20,965个基因的334,378个外显子捕获下来，经PCR线性扩增后进行文库质检，合格即可进行上机测序。

2、库检

文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μL，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nM)，以保证文库质量。

3、上机测序

库检合格，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行Illumina Hiseq平台测序。

4、数据分析与处理

经过数据筛选、深度加工和生物信息学序列比对，最终确定“KFS病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的13个SNP位点为优选敏感级位点。

其中，位于VANGL1基因的SNP突变：

所述位点变异对蛋白影响值如表1所示：

表1VANGL1基因SNP突变位点变异对蛋白影响值

SNP突变	ljb23_sift	ljb23_pp2hvar	ljb23_pp2hdiv	ljb23_mt
					c.1151C>G	0.01,D	0.93,D	0.991,D	1,D

所述位点经过生物信息学分析，可以确认为KFS候选标志物。

实施例3利用危险度评分方法进一步分析SNP与KFS的发病风险

本发明人通过对2组样品(“KFS病例组”和“健康对照组”)基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全外显子扫描样本中单个SNP 回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评价诊断的灵敏性和特异性，进而诊断这些SNP对KFS发病的判断能力。对SNP标志物的分析发现，位于VANGL1基因的SNP突变，其灵敏度和特异度都达到65％以上。

因此，本发明人证明了所述位点标志物能够很好地将健康对照和KFS 患者区分。

实施例4单个SNP的基因分型

1、取6例KFS患者和6例健康对照DNA样本同实施例1；

2、PCR扩增

利用NCBI网站提供的在线引物设计软件 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHo meAd对VANGL1基因的易感SNP设计特异性扩增引物如表2所示。

表2引物序列

PCR反应体系如表3所示。PCR扩增程序为：95℃预变性10min，94℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸30min，于4℃保存，过夜需放置-20℃冷冻。

表3反应体系

组分	加入量
		2×mix	25μL
上游引物(10uM)	3.0μL
		下游引物(10uM)	3.0μL
模板	5μL
		加入灭菌蒸馏水	至50μL

3、测序

PCR扩增结束后，取5μL扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳，电泳30min，染色20min，然后将凝胶块置于凝胶成像仪中观察，根据比对Marker的片段大小情况，初步判断扩增片段是否正确。进而对符合要求的扩增产物进行纯化：采用Mag-BindOligonucleotidePurificationKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作。上样测序：采用ABI公司BigDye3.1SequencingKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作；用ABI公司3730型测序仪进行测序。

4、结果分析

通过Chromas序列分析软件，将测序结果与标准序列进行比对，寻找 SNP位点，通过分析SNP位点处碱基的类型，就可以得到SNP位点的基因型。ANGL1基因结果显示：6例KFS患者测序得到132bp的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在第81位碱基为GC、GG；而6例健康对照测序得到132bp的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其在第81位碱基为CC；证实了该位点为GC、GG基因型时判断为KFS的易感基因型，该位点为CC基因型时判断为KFS的非易感基因型。从而进一步确认所述 ANGL1：NM_001172412.1:c.1151C>G(p.Pro384Arg)的SNP位点可用于KFS 的检测、治疗、诊断等辅助诊断。

实施例5用于KFS辅助诊断SNP试剂盒的制作

基于实施例4得到的引物组，组装本发明所述的用于KFS的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增所述SNP位点的特异性引物，所述试剂盒还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl₂，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其他组织样品，通过最精简和特异的引物对检测SNP，再通过SNP 谱辅助判断KFS，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> 一种KFS致病基因新突变及其应用

<130> P190312

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaagcaagg ctggtggttg cagtggaaga ggccttcatc cacattcagc gtctccaggc 60

tgaggagcag cagaaagccc gaggggaggt gatggaccct agggaggccg cccaggccat 120

tttcccctcc at 132

<210> 2

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaagcaagg ctggtggttg cagtggaaga ggccttcatc cacattcagc gtctccaggc 60

tgaggagcag cagaaagccc caggggaggt gatggaccct agggaggccg cccaggccat 120

tttcccctcc at 132

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaagcaagg ctggtggttg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggagggga aaatggcctg 20

Claims

1.一种VANGL1易感SNP位点，其特征在于，所述SNP位点为：

2.一种检测VANGL1易感SNP位点基因型的试剂，其特征在于，所述试剂包括用于扩增所述SNP位点的引物对，或是包括用于扩增所述SNP位点的引物对和限制性内切酶，所述SNP位点为：

3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于，扩增所述SNP位点的引物对具有SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述引物对扩增的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

5.一种KFS辅助诊断的试剂盒，其特征在于，其包括检测VANGL1:NM_001172412.1:c.1151C>G的SNP位点基因型的试剂。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包括用于扩增所述SNP位点的引物对，或是包括用于扩增所述SNP位点的引物对和限制性内切酶。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对具有SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。