CN110627615A - β-榄香烯氧化物及制备方法和用途 - Google Patents

β-榄香烯氧化物及制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一类β‑榄香烯的氧化反应得到的β‑榄香烯氧化物。具体地，本发明提供了如下式所示结构的化合物、含有式(I)化合物的药物组合物及所述化合物，以及这些化合物的同位素衍生物，手性异构体，变构体，不同的盐，前药，制剂等。本发明还公开了所述β‑榄香烯氧化物的制备方法，不仅简化了制备过程，还提高了产率。本发明还公开了所述化合物的用途，所述化合物具有抑制各种肿瘤细胞株的增殖的活性，因此，有望成为抗肿瘤的药物，治疗各种榄香烯可以治疗的疾病，包括肺癌、乳腺癌或肝癌。

Description

β-榄香烯氧化物及制备方法和用途
技术领域
本发明属于β-榄香烯衍生物的制备及应用领域，具体涉及一种β-榄香烯氧化物及制备方法和用途。
背景技术
榄香稀是从温郁金中提取分离得到的倍半萜化合物，和紫杉醇、羟基喜树碱、长春碱等其它植物抗癌药相比，具有分子量最小、毒性最小、抗肿瘤作用广谱等优点，1994年国家药监局批准其为我国具有自主知识产权的抗肿瘤植物药。以榄香烯为主要成分的乳剂已于2008年被卫生部批准为国家二类抗癌新药进入二期临床研究，这种新的抗肿瘤天然产物在各种肿瘤中逐步表现出很强的临床治疗作用。目前，其在临床上主要用于恶性浆膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤、脑瘤以及其它浅表性肿瘤的化疗，对食管癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等亦有一定疗效。研究表明，榄香烯几乎不产生副作用，对肾、肝的功能都不产生药物诱导毒性，特别是对脊髓没有抑制作用(张殊佳，周鹏段，华鑫，袁韩，化学通报，2010，6：499)。此外，榄香烯和其它的靶向小分子药物联合用药，还表现出增敏增效的功效，同时还可以逆转或延缓小分子靶向药物的耐药性。近年来，科学家在榄香烯领域取得了丰硕成果，先后获得国家科技进步二等奖、何梁何利科学技术创新奖、教育部科技一等奖、吴阶平医药创新奖等多个奖项。在榄香烯的基础上开发出新一代的活性更好的抗癌新药，具有非常广阔的前景。
榄香烯中含有多种异构体，包括α-、β-、γ-、δ-等。研究表明β-榄香烯是其中的主要成分，也是抗肿瘤效果最好的异构体，β-榄香烯结构如下：
研究还表明，β-榄香烯上的三个独立的双键可能是抗肿瘤药效的主要贡献者(但没有具体的证据)，但β-榄香烯的作用机制还不清楚。
截至目前为止，针对β-榄香烯水溶性低(属挥发油)及生物利用度低等问题，多个研究组对β-榄香烯进行了化学结构的修饰，并取得了一定的进展(参考文献：(1)Liu,G.；Kong,Z.；Shen,Y.Synthesis,characterization,and in vitro antiproliferativeactivity of novel β-elemene monosubstituted derivatives[J].Med.Chem.Res.2013,22,3536-3540.(2)Sun,Y.；Liu,G.；Zhang,Y.；Zhu,H.；Ren,Y.；Shen,Y.-M.Synthesis andin vitro anti-proliferative activity of β-elemene monosubstituted derivativesin HeLa cells mediated through arrest of cell cycle at the G1 phase[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry 2009,17,1118–1124.(3)Ren,Y.；Sun,Y.；Cheng,K.；Liu,G.；Shen,Y.Synthesis and radiolabelling of Re(CO)3-β-elemene derivativesas potential therapeutic radiopharmaceuticals[J].J.Label Compd.Radiopharm2009,52,139–145.(4)Chen,J.；Wang,R.；Wang,T.et al.Antioxidant Properties ofNovel Dimers Derived from Natural β-Elemene through Inhibiting H2O2-InducedApoptosis[J].ACS Medicinal Chemistry 2017,8(4),443-448.(5)Xu,L.；Tao,S.；Wang,X.et al.The synthesis and anti-proliferative effects of β-elemene derivativeswith mTOR inhibition activity.Bioorganic&Medicinal Chemistry 2006,14,5351–5356)。但上述文献均有一个共同的特点，就是先从13-位或14-位上进行氯代反应，然后再衍生出其它的衍生物。
Huang,L.除了报道β-榄香烯的合成外，还采用mCPBA对β-榄香烯进行环氧化反应，得到非对映异构体混合物2，再利用LDA对环氧化产物进行开环得到13-榄香烯醇3，13-榄香烯醇经MnO2氧化得到榄香烯醛4(参考文献：Huang,L.Synthesis of(-)-beta-elemene,(-)-beta-elemenal,(-)-beta-elemenol,(-)-beta-elemene fluoride and theiranalogues,intermediates and composition and uses thereof[P].WO 2006/016912A2)。该方法的缺点是环氧化物2是非对映异构体，因此用LDA进行开环得到的醇含有异构体，需要多次柱层析分离才能得到纯的13-位榄香烯醇3。总的来说，从β-榄香烯到13-位榄香醛需要三步反应。
有多篇文献报道以榄香烯为原料，先用次氯酸钠和冰醋酸在烯丙位引入氯，得到3种氯代产物：13-位单氯代物(5)、14-位单氯代物(6)、和13，14-二氯代物(7)。硅胶柱层析只能将13，14-二氯代物(7)与13-位单氯代物(5)和14-位单氯代物(6)分离开，13-位单氯代物和14-位单氯代物是分不开的。然后将13-位单氯代物和14-位单氯代物混合物经取代反应(在一定的溶剂中与醋酸钠加热)和酯水解反应得到13-位榄香烯醇和14-位榄香烯醇混合物。13-位榄香烯醇(3)和14-位榄香烯醇(8)需经过高效液相色谱才能够被分离开来。此外，13，14-二氯代物(7)经取代反应(在一定的溶剂中与醋酸钠加热)和酯水解反应得到13，14-二羟基榄香烯(9)。这样的操作虽然可以得到单羟基榄香烯3和8，以及双羟基榄香烯9，但是需经过氯代、取代、酯水解三步反应，而且13-榄香烯醇(3)和14-榄香烯醇(8)的分离需经过HPLC。有关的参考文献如下：(1)中国发明专利2017,CN 107216283；(2)European Journalof Medicinal Chemistry 2017,135,414-423；(3)ACS Medicinal Chemistry Letters2017,8(4),443-448；(4)中国发明专利，2014,CN 104119221 A；(5)Bioorganic&MedicinalChemistry Letters 2014,24(15),3407-3411；(6)有机化学1991，11，608-610。
1992年Harrison,L.J.等人报道了从Liverwort Plagiochasma rupestre中分离出14-榄香醛(10)，至今没有人报道该化合物的合成(参考：Journal of ChemicalResearch,Synopses 1992,(2),74-5.)。
发明内容
本发明的目的是提供一类榄香烯的氧化产物(包括榄香烯醇、榄香烯醛、和榄香烯酸)及其制备方法和应用。
本发明的第一方面，提供了一种如下式(I)所示结构的化合物，或其光学异构体，包括消旋体、单一的对映异构体、可能的非对映异构体；或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂合物：
式(I)中：R1和R2独立地选自甲基、CH2OH、CHO、CO2H、CH2Cl；R3和R4独立地选自氢、羟基；而且，所述化合物不得为下组中的任意一种：
优选地，所述化合物的结构选自下组中的任意一种：
本发明的第二方面，提供了一种如第一方面所述的式(I)化合物，或其光学异构体，药学上可接受的盐，前药，氘代衍生物，水合物，溶剂合物的用途，包括：
(a)用于制备治疗榄香烯可治疗的各种疾病的药物；
(b)用于体外非治疗性地抑制各种肿瘤细胞株增殖。
本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：(i)有效量的如本发明第一方面所述的化合物，或其光学异构体，药学上可接受的盐，前药，氘代衍生物，水合物，溶剂合物；和(ii)药学上可接受的载体。药物组会包括但不限于：式(I)化合物和各种蛋白激酶抑制剂的组合；式(I)化合物和PD-1的组合；式(I)化合物和PDL-1的组合。
本发明的第四方面，提供了一种β-榄香烯氧化物的制备方法，所述β-榄香烯氧化物的结构如下所示：
包括：在0～5℃和搅拌条件下，向β-榄香烯溶液中依次加入过氧化叔丁醇水溶液和SeO2进行氧化反应，经后处理得到的粗品经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚体系洗脱)可以依次得到化合物8和11的混合物、化合物17和18的混合物、化合物12和14的混合物、以及化合物9四个组分；
将所述化合物8和11的混合物再次经硅胶柱层析(石油醚/丙酮v/v＝10：1)分离，得化合物8和化合物11；将所述化合物12和14的混合物再次经柱层析(二氯甲烷/丙酮v/v＝10：1)，得化合物12和化合物14；将所述化合物17和18的混合物经衍生化后(如羟基上引入保护基团)，使得两者的极性差别变得比较大，从而在柱层析上可以将两者分离开来，再将保护基团去除，这样可以间接分离得到纯的化合物17和化合物18。
所述化合物17和18的混合物分离的反应过程如下式所示:
在室温下，将化合物17和18的混合物溶于溶剂中，依次加入咪唑、4-二甲氨基吡啶和叔丁基二甲基氯硅烷进行搅拌，经后处理得到的粗品分离得到化合物25和化合物26；再分别将化合物25和26溶于溶剂中，加入四丁基氟化铵进行反应，经后处理分别得到化合物17和18。
所述β-榄香烯氧化物的结构如下式所示：
所述制备方法包括：按照上述方法制得化合物8、9、12、14，分别将其溶于溶剂中，再加入PDC，室温下搅拌后，过滤得滤液减压浓缩，再经硅胶柱层析分离后，分别对应得到化合物10、16、13、15。
所述β-榄香烯氧化物的结构如下，包括化合物21的合成：
所述制备方法包括：冰浴条件下，向化合物24溶液中依次加入二氧化硒和过氧化叔丁醇进行氧化反应，产物经过后处理得到化合物21。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供了一种如式I所示的化合物及其组合物，这类化合物具有和β-榄香烯更强的体外抑制各种肿瘤细胞株增殖的活性；本发明还提供了上述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
(2)本发明还提供了式I所示部分化合物的制备方法，该方法直接从β-榄香烯出发，只用1～2步氧化反应即可制备得到，不仅大大简化了制备工艺，还提高了产物收率，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例4制备的化合物16的1H NMR谱图。
具体实施方式
发明人经长期的研究得出了本发明的成果，就是用特定的研究方法对β-榄香烯进行氧化反应，一步得到多个β-榄香烯氧化产物。这些β-榄香烯氧化产物可以进一步被氧化，得到新的化合物如醛和酸。这些氧化产物中有多个化合物在抑制肿瘤细胞株的增殖实验中，显示出比β-榄香烯更好的抑制作用。毫无疑问，这些β-榄香烯化合物将有望在抗肿瘤的药物研发中得到应用。另一方面，这些化合物将作为有用的中间体，制备其它榄香烯衍生物。本发明对进一步β-榄香烯衍生化及抗肿瘤活性的研究，乃至研究β-榄香烯的作用机制和细胞通路，都具有非常重大的意义。
术语
除非特别说明，术语“药学上可接受的盐”指适合与对象(例如，人)的组织接触，而不会产生不适度的副作用的盐。在一些实施例中，本发明的某一化合物的药学上可接受的盐包括具有酸性基团的本发明的化合物的盐(例如，钾盐，钠盐，镁盐，钙盐)或具有碱性基团的本发明的化合物的盐(例如，硫酸盐，盐酸盐，磷酸盐，硝酸盐，碳酸盐)。
用途
本发明提供了一类式(I)化合物，或其氘代衍生物、它的盐、异构体(对映异构体或非对映异构体，如果存在的情况下)、水合物、可药用载体或赋形剂用于抑制体外肿瘤细胞株的增殖的用途。这类化合物属β-榄香烯的衍生物，在某种程度上，这类化合物在体外抑制各种肿瘤细胞株的增殖活性比榄香烯本身强。
由于本发明所述的这类化合物具有和榄香烯同等的、或更强的体外抑制各种肿瘤细胞株的活性，而榄香烯是已经获国家药品管理局批准的抗肿瘤药物，本发明所述的化合物，有望在各种癌症病人身上取得抗肿瘤的疗效，得到预防、缓解或治愈疾病。所指疾病包括肝癌、直肠癌、膀胱癌、咽喉癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、卵巢癌、头颈部鳞癌、宫颈癌、食管癌、肾癌、胰腺癌、结肠癌、皮肤癌、淋巴瘤、胃癌、多发性骨髓癌和实体瘤等等。
本发明化合物可与生物制剂如PD-1抑制剂和作为组合药物治疗各种癌症及相关疾病。
可将本发明化合物及其氘代衍生物，以及药学上可接受的盐或其异构体(如果存在的情况下)或其水合物和/或组合物与药学上可接受的赋形剂或载体配制在一起，得到的组合物可在体内给予哺乳动物，例如男人、妇女和动物，用于治疗病症、症状和疾病。组合物可以是：片剂、丸剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、胶囊、气雾剂、无菌注射液、无菌粉末等。一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包括微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘露醇、羟丙基-β-环糊精、β-环糊精(增加)、甘氨酸、崩解剂(如淀粉、交联羧甲基纤维素钠、复合硅酸盐和高分子聚乙二醇)、造粒粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶)和润滑剂(如硬脂酸镁、甘油和滑石粉)。在优选的实施方式中，所述药物组合物是适于口服的剂型，包括但不限于片剂、溶液剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、粉剂。向患者施用本发明化合物或药物组合物的量不固定，通常按药用有效量给药。同时，实际给予的化合物的量可由医师根据实际情况决定，包括治疗的病症、选择的给药途径、给予的实际化合物、患者的个体情况等。本发明化合物的剂量取决于治疗的具体用途、给药方式、患者状态、医师判断。本发明化合物在药物组合物中的比例或浓度取决于多种因素，包括剂量、理化性质、给药途径等。
化合物的通用合成方法
本发明的式I化合物可以通过以下方法制备得到：
从β-榄香烯出发，在氧化剂存在的条件下，进行烯丙位的氧化反应，得到式I化合物。
上述各式中，各基团的定义如上文中所述。各步骤的试剂和条件可以选用本领域进行该类制备方法常规的试剂或条件，在本发明的化合物结构公开后，上述选择可以由本领域技术人员根据本领域知识进行。
或者，β-榄香烯先经过烯丙位的氯代反应，然后再在氧化条件下进行另外一个烯丙位上的氧化反应，从而得到目标分子。
上述所指的氧化反应，包括但不限于：(1)单独使用SeO2作为氧化剂的反应；(2)使用SeO2和其它具有氧化能力的化学试剂(如TBHP)的组合；(3)其它可能在烯丙位上进行氧化的试剂。
更具体地，本发明通式I所示化合物可通过如下的方法制得，然而该方法的条件，例如反应物、溶剂、所用化合物的量、反应温度、反应所需时间等不限于下面的解释。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
在本发明的制备方法中，各反应通常在惰性溶剂中，反应温度通常为-10～55℃(优选0～室温下进行，各步反应时间通常为0.5～48h，较佳地为2～12h。将β-榄香烯溶解在一定的溶剂中，依次加入过氧化叔丁醇和二氧化硒，在0-55℃下搅拌30min～72h后，加入饱和硫代硫酸钠或饱和亚硫酸氢钠淬灭反应，萃取，柱层析得通式I所示结构化合物(各个基团的定义如上所述)。其中，β-榄香烯的溶液的摩尔浓度为0.1-0.5mol/L；所述中间体β-榄香烯和过氧化叔丁醇以及二氧化硒的摩尔比为1:(0-10):(0.1-4)；优选为1:(1-10):(0.5-1)。进一步，β-榄香烯/TBHP/SeO2的比例大约为1:5:0.5。进一步优选地，溶解β-榄香烯所用溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺中的一种，更进一步优选为二氯甲烷。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有与榄香烯同等的或更强的抑制各种肿瘤细胞株的增殖活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解各种榄香烯可以治疗的疾病，包括各种癌症。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-1000mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增溶剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～5000mg，优选5～2000mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
实施例1：化合物8、9、11、12、14以及化合物17和18的混合物的制备
β-榄香烯羟基和醛基氧化物的制备
在0℃和搅拌下，向β-榄香烯(500mg,2.45mmol，大连金港药业，GC纯度78％)的二氯甲烷(10mL)溶液里滴加过氧化叔丁醇(65％水溶液，1696mg，12.21mmol)。滴毕，向上述溶液里加入SeO2(270mg,2.45mmol)。混合物在0℃下搅拌6h。在0℃和搅拌下加入饱和亚硫酸氢钠水溶液(15mL)淬灭。分离出有机相，水相再用二氯甲烷萃取(10mL x 2)。合并的有机相，用饱和食盐水洗涤(10mL)，然后用无水硫酸钠干燥。干燥剂经过滤除去，滤液在减压条件下浓缩，所得的粗品经柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚体系洗脱)可以依次得到8和11的混合物(40mg，收率7.4％)、17和18的混合物(16mg，收率2.8％)、12和14的混合物(50mg，收率8.6％)、以及9(125mg，21.6％)四个组分。然后将8和11的混合物再次经硅胶柱层析(石油醚/丙酮v/v＝10：1)分离，得化合物8(30mg)和化合物11(10mg)。化合物12和14的混合物再次经柱层析(二氯甲烷/丙酮v/v＝10：1)，得化合物12(30mg)和化合物14(20mg)。
14-位榄香烯醇(化合物8)：
分子式：C15H24O；分子量：220.18；英文命名：
2-((1R,2S,5R)-2-methyl-5-(prop-1-en-2-yl)-2-vinylcyclohexyl)prop-2-en-1-ol
外观：无色油状液体
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.77(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.17(q,J＝1.5Hz,1H),4.96–4.92(m,1H),4.90(q,J＝1.3Hz,1H),4.85–4.83(m,1H),4.72(tt,J＝3.3,1.3Hz,2H),4.09–3.94(m,2H),2.07–2.00(m,1H),2.00–1.90(m,1H),1.75(t,J＝1.1Hz,3H),1.66–1.43(m,6H),1.00(s,3H).HRMS(ESI)calcd for C15H24NaO[M+Na]+:243.1719,found 243.1725。
13，14-双羟基榄香烯(化合物9)：
分子式：C15H24O2；分子量：236.18；英文命名：
2,2'-((1R,3R,4S)-4-methyl-4-vinylcyclohexane-1,3-diyl)bis(prop-2-en-1-ol)
外观：无色油状液体
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.77(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.17(q,J＝1.4Hz,1H),5.06(d,J＝1.6Hz,1H),4.94(t,J＝2.1Hz,2H),4.90(q,J＝1.4Hz,1H),4.84(s,1H),4.14(s,2H),4.10–3.93(m,2H),2.11–1.99(m,2H),1.70–1.28(m,6H),1.02(s,3H)。
化合物11
分子式：C15H24O；分子量：220.18；英文命名：
(1R,2S,5R)-2-methyl-1,5-di(prop-1-en-2-yl)-2-vinylcyclohexanol
外观：无色油状液体
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.75(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.06(m,2H),4.93–4.90(m,1H),4.88(s,1H),4.83(p,J＝1.6Hz,1H),4.61(dt,J＝1.9,0.9Hz,1H),2.06–1.85(m,3H),-1.81(t,J＝1.0Hz,3H),1.70(dd,J＝1.5,0.8Hz,3H),1.67-1.28(m,4H),1.07(s,3H)。
化合物12
分子式：C15H24O2；分子量：236.18；英文命名：
(1S,2S,5R)-1-(3-hydroxyprop-1-en-2-yl)-2-methyl-5-(prop-1-en-2-yl)-2-vinylcyclohexanol
外观：无色油状液体
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.69(dd,J＝17.7,10.5Hz,1H),5.19(q,J＝1.4Hz,1H),5.07(dd,J＝2.9,1.3Hz,2H),4.97–4.91(m,1H),4.89(d,J＝6.9Hz,2H),4.09–3.86(m,2H),2.08–1.99(m,2H),1.98–1.85(m,2H),1.81(d,J＝1.2Hz,3H),1.72(td,J＝13.8,3.9Hz,1H),1.47(td,J＝13.9,3.6Hz,1H),1.34(dt,J＝13.7,3.7Hz,1H),1.06(s,3H)。
化合物14
分子式：C15H24O2；分子量：236.18；英文命名：
(1S,3R,4S)-3-(3-hydroxyprop-1-en-2-yl)-4-methyl-1-(prop-1-en-2-yl)-4-vinylcyclohexanol
外观：无色油状液体
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ5.82(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.20(d,J＝1.5Hz,1H),5.05(s,1H),4.97–4.94(m,1H),4.94–4.90(m,1H),4.83(d,J＝1.4Hz,2H),4.10–3.95(m,2H),2.49(dd,J＝13.3,3.3Hz,1H),1.94(t,J＝13.7Hz,2H),1.90–1.85(m,1H),1.84(s,3H),1.49(ddt,J＝16.7,13.9,2.9Hz,2H),1.31–1.28(m,1H),0.99(s,3H)。
化合物17和18的混合物
分子式：C15H22O2；分子量：234.16
化合物17和18在硅胶板上用多种溶剂体系展开，都在同一个Rf值出现，核磁谱显示化合物17和18的比例约为1：1。
实施例2：化合物13的制备
在0℃和搅拌下，向化合物12(39mg,0.17mmol，制备见实施例1)的二氯甲烷(5mL)溶液里加入PDC(93mg，0.25mmol)。混合物缓慢升至室温并在室温下于搅拌12h。将不溶的固体用滤纸过滤，并用二氯甲烷洗涤多次。滤液减压浓缩，所得残余物经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚)分离得化合物13(15mg,收率38.7％)。
化合物13
分子式：C15H22O2；分子量：234.16；英文命名：
2-((1S,2S,5R)-1-hydroxy-2-methyl-5-(prop-1-en-2-yl)-2-vinylcyclohexyl)acrylaldehyde
外观：无色油状液体
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.40(s,1H),6.13(s,1H),6.06(s,1H),5.72(dd,J＝17.5,10.8Hz,1H),5.05(dd,J＝1.5,0.8Hz,1H),4.85–4.75(m,3H),3.36(dd,J＝13.6,3.4Hz,1H),2.02(td,J＝13.6,4.9Hz,2H),1.90-1.82(m,1H),1.85(dd,J＝1.4,0.7Hz,3H),1.59-1.51(m,1H),1.41–1.27(m,3H),0.93(s,3H)。
实施例3：化合物15的制备
化合物15是从化合物14制备得到的。所采用的步骤和化合物13的制备相似，产率为36％。
化合物15
分子式：C15H22O2；分子量：234.16；英文命名：
2-((1R,2S,5S)-5-hydroxy-2-methyl-5-(prop-1-en-2-yl)-2-vinylcyclohexyl)acrylaldehyde
外观：无色油状液体
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.29(s,1H),7.54(s,1H),5.88(ddd,J＝18.0,10.7,1.0Hz,1H),5.15(d,J＝1.9Hz,1H),5.13–5.10(m,1H),5.00(s,1H),4.90(t,J＝1.5Hz,1H),2.87(s,1H),2.09(dd,J＝13.3,2.7Hz,1H),1.88–1.81(m,3H),1.80(t,J＝1.0Hz,3H),1.61(dt,J＝3.9,1.9Hz,1H),1.46(ddd,J＝13.4,3.8,1.9Hz,1H),1.40-1.32(m,1H),0.85(s,3H)。
实施例4：化合物16的制备
在0℃和搅拌下，向化合物9(10mg，0.04mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液里加入PDC(47mg，0.125mmol)，混合物缓慢升至室温并在室温下搅拌12h。固体经滤纸过滤，并用二氯甲烷洗涤多次。滤液在减压条件下浓缩，残余物经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚)分离，得化合物16(8mg，收率80％)。
化合物16
分子式：C15H20O2；分子量：232.1；英文命名：
2,2'-((1R,3R,4S)-4-methyl-4-vinylcyclohexane-1,3-diyl)diacrylaldehyde
外观：无色油状液体
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.53(s,1H),9.38(s,1H),6.29(d,J＝1.0Hz,1H),6.12(s,1H),6.03(s,1H),6.00(s,1H),5.67(dd,J＝17.4,10.8Hz,1H),4.84–4.73(m,2H),2.95(dd,J＝13.1,3.3Hz,1H),2.67–2.57(m,1H),1.73–1.21(m,6H),0.97(s,3H)。
实施例5：化合物10的制备
在0℃和搅拌下，向化合物8(50mg,0.23mmol，制备见实施例1)的二氯甲烷(5mL)溶液里加入PDC(129mg，0.34mmol)。混合物缓慢升至室温并在室温下搅拌12h。将不溶的固体用滤纸过滤，并用二氯甲烷洗涤多次。滤液减压浓缩，所得残余物经硅胶柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝1：20)分离，得化合物10(20mg,收率40％)。
化合物10
分子式：C15H22O；分子量：218.34；英文命名：
2-((1R,2S,5R)-2-methyl-5-(prop-1-en-2-yl)-2-vinylcyclohexyl)acrylaldehyde
外观：无色油状液体
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.32(s,1H),6.08(s,1H),5.97(s,1H),5.59(dd,J＝17.4,10.8Hz,1H),4.70(dd,J＝36,1.4Hz,1H),4.71(t,J＝1.6Hz,1H),4.65–4.63(m,2H),2.82(dd,J＝13.0,3.4Hz,1H),2.10-0.93(m,7H),1.67(d,J＝1.2Hz,3H),0.87(s,3H)。
实施例6：化合物21的制备
冰浴冷却下，向13-氯代β-榄香烯(24，60mg,0.25mmol,从β-榄香烯和次氯酸钠制备得到)的干燥的二氯甲烷(3mL)溶液中依次加入二氧化硒(17mg,0.15mmol)和过氧化叔丁醇(55μL,5.5M的癸烷溶液,0.30mmol)。加毕，混合物逐渐升至室温搅拌3小时。向反应液中加入亚硫酸钠水溶液(1mL，10％)及饱和碳酸氢钠水溶液(2mL)淬灭反应。用乙酸乙酯萃取(3x5mL)。合并有机相用饱和食盐水洗(3mL)一次，然后用无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，滤液减压条件下浓缩，所得粗品经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7：1)分离，得到无色液体化合物21(36mg,收率56％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.77(dd,J＝17.7,10.5Hz,1H),5.21–5.14(m,2H),5.04(d,J＝1.1Hz,1H),4.97–4.90(m,2H),4.84(s,1H),4.09(d,J＝0.9Hz,2H),4.09–3.94(m,2H),2.28–2.17(m,1H),2.07(dd,J＝12.3,3.9Hz,1H),1.77–1.69(m,1H),1.69–1.57(m,1H),1.57–1.44(m,4H),1.01(s,3H)。MS 254.0[M.+H]+。
实施例7：化合物17和化合物18的制备
从实施例1中得到的17和18是混合物，通过正常的柱层析或其它手段没有能够将17和18分离开来。通过如下的反应可以制备得到纯的化合物17和化合物18。
室温下，向化合物17和18的混合物(122mg,0.52mmoL)的干燥二氯甲烷(5mL)溶液中依次加入咪唑(53mg,0.78mmol)、4-二甲氨基吡啶(3mg,0.025mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(118mg,0.78mmol)。反应液在室温搅拌8小时，向其中加入水(2mL)稀释。用乙酸乙酯(3x6mL)萃取上述混合物。合并的有机相用饱和食盐水(1x 4mL)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，滤液在减压的条件下浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝8：1)纯化，得到无色液体化合物25(21mg,收率12％)和化合物26(18mg,收率10％)。
室温下，向榄香醛衍生物26(18mg,0.052mmol)的干燥四氢呋喃(2mL)溶液中，加入四丁基氟化铵(0.52mL,1.0M的四氢呋喃溶液,0.52mmol)。加毕继续搅拌1.5小时。反应液用水(1mL)稀释。在减压的条件下蒸馏除去大部分的四氢呋喃，再用乙酸乙酯(3x 5mL)萃取。合并的有机相用饱和食盐水(3mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥。干燥剂过滤除去，滤液在减压条件下浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5：1)纯化，得无色液体化合物18(9mg,收率75％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.52(s,1H),6.29(d,J＝1.1Hz,1H),5.99(s,1H),5.78(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.17(d,J＝1.4Hz,1H),4.97–4.88(m,2H),4.82(s,1H),4.11–3.91(m,2H),2.56(dq,J＝11.8,7.2,5.8Hz,1H),2.13–2.07(m,1H),1.67–1.61(m,3H),1.61–1.55(m,2H),1.53–1.45(m,1H),1.03(s,3H).MS 234.1[M.+H]+。
室温下，向榄香醛衍生物25(21mg,0.060mmol)的干燥四氢呋喃(2mL)里加入四丁基氟化铵(0.60mL,1.0M的四氢呋喃溶液,0.60mmol)。加毕继续搅拌1.5小时。反应液用水(1mL)稀释。在减压的条件下蒸馏除去大部分的四氢呋喃，再用乙酸乙酯(3x 5mL)萃取。合并的有机相用饱和食盐水洗(3mL)，并用无水硫酸钠干燥。干燥剂过滤除去，滤液在减压的条件下浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5：1)分离，得无色液体化合物17(12mg,收率85％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.39(s,1H),6.15(s,1H),6.04(s,1H),5.65(dd,J＝17.4,10.8Hz,1H),5.07(d,J＝1.4Hz,1H),4.95(t,J＝1.2Hz,1H),4.85–4.70(m,2H),4.13(d,J＝1.2Hz,2H),2.89(dd,J＝13.1,3.3Hz,1H),2.18–2.08(m,1H),1.73–1.66(m,1H),1.66–1.55(m,2H),1.54–1.49(m,2H),1.28(m,1H),0.95(s,3H).MS234.0[M.+H]+。
实施例8：化合物对Hep3B肿瘤细胞增殖抑制试验
用DMEM培养基将Hep3B细胞悬液调整到3x 104/mL。每孔加100μL细胞悬液于96-孔细胞培养板，最终细胞浓度为3000细胞/孔。第二天，以DMSO溶解待测试化合物为50mM储存液。用储存液和DMSO制备5X系列梯度稀释液，然后用培养基各稀释1000倍。最后吸去每孔培养基，分别加入100μL相应的溶液，每个药物浓度各5个复孔。最终各化合物处理浓度分别为50μM,10μM,2μM,0.4μM，每孔DMSO终浓度为0.1％。置于37℃,5％CO2孵箱中培养24小时。药物处理24小时后，每孔加入10μL CCK-8增强型溶液，培养箱内继续培养2小时后用THERMOFISHER Multiskan FC酶标仪测定450nm吸光度。用以下公式计算存活率和抑制率
细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
抑制率＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％
As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测药物)的吸光度
Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测药物)的吸光度Ab：空白孔(不含细胞和待测药物的培养基、CCK-8)的吸光度
应用GraphPad Prism 5.0软件,使用非线性回归模型绘制S型剂量-存活率曲线并计算IC50值。
表1.化合物对Hep3B细胞株增殖的抑制活性测定
化合物编码 IC<sub>50</sub>(μM)
1 250
9 248.4
13 49.35
16 2.56
17 24.48
18 5.159
实施例9：化合物对A549肿瘤细胞增殖抑制试验
细胞铺板：1)配制完全培养基，充分混匀。2)复苏细胞，传两代左右选择生长状态良好的细胞株。3)将细胞培养瓶从培养箱中取出，核对培养瓶上标记的细胞名称和培养基类型。4)贴壁细胞：吸掉培养基，用胰酶洗一遍，弃掉废液，加3mL新鲜胰酶于培养瓶消化。待细胞松动要脱离瓶壁时，加8mL完全培养基中止胰酶消化，并轻轻混匀。用移液管将细胞悬液移入离心管中，800-1000rpm的转速离心3-5分钟。悬浮细胞：吸取细胞悬液并移入离心管中，800-1000rpm的转速离心3-5分钟。5)弃上清。6)向离心管中加适当体积的培养基，轻柔吹打使细胞重悬均匀。7)使用Vi-Cell XR细胞计数仪计数。8)将细胞悬液调至合适浓度。9)将细胞悬液加入384孔板中，40μL/孔。标记细胞名称，种板密度，日期等详细信息，将培养板放置于CO2培养箱中过夜。
化合物板的配制及添加:1)待测化合物：化合物在DMSO中配制成10mM溶液，将化合物在DMSO中稀释成2mM溶液加到化合物板中，并用液体处理工作站以DMSO进行3倍梯度稀释9个点。2)Staurosporine化合物配制，在DMSO中配制0.4mM的溶液，加到化合物板中。3)化合物添加：吸取4.1μL的待测化合物板及Staurosporine化合物板中的化合物，加入含有36μL无血清培养基的中间板中混匀。从中间板中吸取2μL已混匀的培养基，根据以下化合物的布局加入相应细胞孔中。Blk对照：没有细胞,含0.5％DMSO；DMSO对照：有细胞，含0.5％DMSO；4)在二氧化碳培养箱中孵育72小时。
试剂准备及检测：1)室温融化CellTiter-Glo Buffer。将冻干CellTiter Glo底物平衡至室温。2)将CellTiter-Glo Buffer加入CellTiter Glo底物中并充分混匀。3)将细胞板取出平衡至室温。4)每孔中加入混匀后的CellTiter Glo试剂25微升，避光振荡10min，孵育10min。5)将培养板放入EnSpire读板,记录luminescence读值结果；按下列公式计算抑制率：抑制率(％)＝(1-(RLU compound-RLU blank)/(RLU DMSO–RLU blank))×100％。6)利用XLFit绘制药效抑制率曲线并计算IC50值。利用4参数模型[fit＝(A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))]，测试的结果如下表2所示：
表2.化合物对A549细胞株增殖的抑制活性测定
化合物编码 IC<sub>50</sub>(μM)
1 >200
16 8.815
实施例10：化合物对U87-MG肿瘤细胞增殖抑制试验
测试的方法和实施例9相同，测试的结果如下表3所示：
表3.化合物对U87-MG细胞株增殖的抑制活性测定
化合物编码 IC<sub>50</sub>(μM)
1 >200
16 0.589

Claims (8)

1.一种如下式(I)所示结构的化合物，或其光学异构体，包括消旋体、单一的对映异构体、可能的非对映异构体；或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂合物：
式(I)中：R1和R2独立地选自甲基、CH2OH、CHO、CO2H、CH2Cl；R3和R4独立地选自氢、羟基；
而且，所述化合物不得为下组中的任意一种：
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物的结构选自下组中的任意一种：
3.一种如权利要求1或2所述的化合物，或其光学异构体，药学上可接受的盐，前药，氘代衍生物，水合物，溶剂合物的用途，其特征在于，包括：
(a)用于制备治疗榄香烯可治疗的各种疾病的药物；
(b)用于体外非治疗性地抑制各种肿瘤细胞株增殖。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：(i)有效量的如权利要求1或2所述的式I化合物，或其光学异构体，药学上可接受的盐，前药，氘代衍生物，水合物，溶剂合物；和(ii)药学上可接受的载体。
5.一种β-榄香烯氧化物的制备方法，其特征在于，所述β-榄香烯氧化物的结构如下式所示：
包括：在0～5℃和搅拌条件下，向β-榄香烯溶液中依次加入过氧化叔丁醇水溶液和SeO2进行氧化反应，经后处理得到的粗品再经过柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚体系洗脱)，按照组分极性从小到大的顺序，可以依次得到化合物8和11的混合物、化合物17和18的混合物、化合物12和14的混合物、以及化合物9四个组分；
将所述化合物8和11的混合物再次经硅胶柱层析分离，得化合物8和化合物11；将所述化合物12和14的混合物再次经柱层析，得化合物12和化合物14；将所述化合物17和18的混合物分离得到化合物17和化合物18。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述化合物17和18的混合物分离的反应过程如下式所示:
在室温下，将化合物17和18的混合物溶于溶剂中，依次加入咪唑、4-二甲氨基吡啶和叔丁基二甲基氯硅烷进行搅拌，经后处理得到的粗品分离得到化合物25和化合物26；再分别将化合物25和26溶于溶剂中，加入四丁基氟化铵进行反应，经后处理分别得到化合物17和18。
7.一种β-榄香烯氧化物的制备方法，其特征在于，所述β-榄香烯氧化物的结构如下式所示：
包括：按照权利要求3所述方法制得化合物8、9、12、14，再分别制得对应的化合物10、16、13、15。
8.一种β-榄香烯氧化物的制备方法，其特征在于，所述β-榄香烯氧化物的结构如下式21所示：
包括：冰浴条件下，向化合物24溶液中依次加入二氧化硒和过氧化叔丁醇进行氧化反应，产物经过后处理得到化合物21。
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