CN110607357B - 人pcdh10基因甲基化检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人PCDH10基因甲基化检测试剂盒及其使用方法，包括针对PCDH10基因的两个CGI1岛和CGI2岛设计的引物及探针，所述引物和探针的组成为，针对CGI1岛的SEQ ID NO.1‑3，针对CGI2岛的SEQ ID NO.4‑6、SEQ ID NO.7‑9和SEQ ID NO.10‑12。本发明所述检测试剂盒具有很好的特异性和准确性，检测效果好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA甲基化检测试剂盒，具体是涉及到一种基于荧光PCR法的人PCDH10基因甲基化检测试剂盒。
技术背景
表观遗传学的改变尤其是DNA分子的异常甲基化在多种实体肿瘤的发生发展中起着重要作用。原钙粘蛋白10(Protocadherin 10，PCDH10)是原钙粘蛋白细胞粘附分子家族的成员之一，是一种重要的抑癌基因，定位于染色体4q28.3，由5个外显子组成，长约42.26kb(Kim SY et al.,Cell Adhesion&Migration,2011,5,97-105)，其异常甲基化已被证实在多种实体瘤和血液系统肿瘤的发生发展中均有着重要意义(Ying J et al.,Oncogene,2006,25,1070-1080；Ying J et al.,Brit J Haematol,2007,136,829-832)。
在宫颈癌研究中发现，PCDH10启动子甲基化在正常宫颈组织、意义未明的非典型鳞状细胞、轻度鳞状上皮内瘤变、高度鳞状上皮内瘤变、侵袭性宫颈癌组织中的检出率分别为0％、5.7％、13.1％、46.0％和90.9％(Narayan G et al.,Genes,Chromosomes andCancer,2009,48,983-992.)，提示PCDH10启动子甲基化可能与宫颈癌发生发展密切相关。
在胃癌研究中发现，PCDH10广泛表达于正常的胃腺上皮细胞和基质细胞，但在大多数胃癌细胞株和癌组织中因PCDH10基因启动子甲基化而导致表达下调或沉默，且PCDH10基因启动子高甲基化的患者预后不良(Yu J et al.,Gastroenterology,2009,136,640-651；Hou YC etal.,Cancer Biomarkers,2015,15,567-573)。
在肝癌研究中发现，PCDH10表达在69.2％的肝癌细胞株中出现下调，其表达下调与PCDH10启动子甲基化状态密切相关，PCDH10甲基化在肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织中的检出率分别为76％、40％、0％，且PCDH1甲基化状态与肿瘤大小、血清AFP水平、转移情况和TNM分期密切相关(Fang S et al.,Clin Exp Med,2013,13,127-134.)。
在结直肠癌研究中发现，PCDH10在邻近正常结直肠组织均未发生甲基化，但在85％的原发结直肠肿瘤中高甲基化，PCDH10异常甲基化与PCDH10表达下调或沉默密切相关(Zhong X et al.,J Cancer Res Clin Oncol,2013,139,485-490)；PCDH10表达下调或沉默与肿瘤的进展和远处转移密切相关(Jao TM et al.,Int J Cancer,2014,135,2593-2603)。
在肺癌研究中发现，与癌旁组织相比，非小细胞肺癌(NSCLC)组织中PCDH10表达下调，PCDH10启动子甲基化可在50％的NSCLC组织中检测到，但在癌旁或正常组织中未检测到，且PCDH10启动子甲基化与吸烟有关(Tang X et al.,Cancer Biomarkers,2013,12,11-19)。在接受根治性切除术的病理I期NSCLC患者中，PCDH10甲基化的患者相比PCDH10未甲基化的患者无复发生存期、总生存期、疾病特异性生存期更差，PCDH10预示着预后不良(Harada H et al.,.Cancer Medicine,2015,4,1536-1546)。
在血液系统肿瘤研究中发现，PCDH10启动子超甲基化在B细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病、骨髓性白血病的大多数亚型和慢性髓性白血病中的检出率分别为81.9％、80％、25.9％和2.2％，在原发性急性淋巴细胞白血病样本和白血病细胞株中PCDH10表达通过其启动子超甲基化下调，携带甲基化介导PCDH10失活的急性淋巴细胞白血病细胞株对常用的白血病特异性药物不太敏感提示PCDH10甲基化可能是急性淋巴细胞白血病化疗反应的生物标志物(Narayan G et al.,Genes,Chromosomes and Cancer,2011,50,1043-1053)。
鉴于PCDH10启动子甲基化与肿瘤的密切关系，促使我们开发一种人PCDH10基因甲基化检测试剂盒，该试剂盒将有助于进一步深入研究PCDH10启动子甲基化在各种系统肿瘤发生、发展及预后方面的临床意义。
目前DNA甲基化检测方法很多，根据对目标DNA的预处理手段的不同，可以分为三类：①基于甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)的DNA甲基化检测技术；②基于亲和富集的DNA甲基化检测技术；③基于亚硫酸氢盐转化的DNA甲基化检测技术。其中，以基于亚硫酸氢盐转化的DNA甲基化检测技术应用最为广泛。常用的基于亚硫酸氢盐转化的DNA甲基化检测技术主要有亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性PCR法、荧光PCR法等。
亚硫酸氢盐测序法是DNA甲基化检测的金标准。该方法首先利用亚硫酸氢盐对DNA进行处理，然后设计引物对目的片段进行扩增，通过测序区分甲基化胞嘧啶和其它碱基，得到甲基化胞嘧啶位点信息。此方法检测结果准确，精确度高，能检测到目的片段每一个CpG位点的甲基化状态，但样品准备过程较为繁琐，需要大量的克隆测序，费用也较高。
甲基化特异性PCR法是设计两对引物，分别与亚硫酸氢盐处理后的甲基化DNA链和非甲基化DNA链互补配对，利用此两对引物对经亚硫酸氢盐处理后的DNA样本进行引物特异性PCR，电泳检测PCR扩增产物以判断甲基化状态。该方法是最为经济实用的DNA甲基化检测方法，无需特殊仪器，有极高的成本效益比，但引物设计至关重要，设计不好容易出现假阳性结果，且需电泳分离检测，容易污染。此外，该方法只能用于定性研究。
荧光PCR法是针对经亚硫酸氢盐处理后的待测DNA片段，设计特异性引物和荧光探针，利用此特异性引物和荧光探针对经亚硫酸氢盐处理后的DNA样本进行荧光PCR，根据检测荧光信号以判断甲基化状态。该方法灵敏度高、特异性强，具备可重复、所需样本量少、不需要电泳分离的特点，还适用于定量研究。该方法是目前DNA甲基化相关的临床检验学研究中广泛采用的方法之一。但是，该方法测定每个位点都需要两端标有荧光素的探针，且对非均质的DNA甲基化检测结果不可靠，而且，对引物和探针的设计要求比较高。经亚硫酸氢盐转化后的DNA样本的未甲基化的胞嘧啶最终转化为胸腺嘧啶，降低了DNA序列的复杂性，而这就增加了引物和探针设计的难度及对引物和探针设计的要求，因为如若对引物和探针的设计要求不高，将增加非特异性扩增和非特异性结合的可能性。此外，由于检测体系内可能存在多对引物和多条探针，这将导致引物二聚体及非特异性扩增概率增加，进而影响扩增的灵敏度及特异性。可见，对引物和探针的设计的难点在于：①针对复杂性低的DNA序列设计高特异性、高灵敏度的引物及探针；②需避免检测体系内多组引物及探针之间非特异性结合，降低引物二聚体及非特异性扩增发生概率。
发明内容
基于此，本发明的目的之一提供一种人PCDH10基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)，该试剂盒具有提高PCR扩增的灵敏度和特异性，从而提高检测结果的准确性的优点。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
人PCDH10基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)，包括针对PCDH10基因的CGI1岛和CGI2岛设计的引物及荧光探针，所述引物和荧光探针的碱基组成为，针对CGI1岛的SEQ IDNO.1-3，针对CGI2岛的SEQ ID NO.4-6、SEQ ID NO.7-9和SEQ ID NO.10-12。
所述引物及荧光探针包含针对PCDH10基因两个CpG岛(CGI1和CGI2)设计的四组甲基化检测特异性引物及探针和一组内标基因引物及探针。其中，四组PCDH10基因甲基化检测特异性引物及探针对应检测靶区分别具体为：转录起始位点－1805～－931bp、+905～+1101bp、+1294～+1438bp、+1726～+1826bp，除转录起始位点－1805～－931bp这一靶区属于CGI1外，其余三个靶区均属于CGI2。
在其中一些实施例中，还包括内标基因引物及探针，优选地，其组成为SEQ IDNO.13-15。
在其中一些实施例中，所述引物的5’端添加有标签序列。优选地，所述标签序列的组成为SEQ ID NO.16。
在其中一些实施例中，所述探针在合适的CpG位点有LNA修饰碱基。
在其中一些实施例中，具有LNA修饰的探针为CGTTTCGTTCGGTTGTCGCGTGAC、
TTAACGTCGTGTTTGCGTATTG、GAACGATAACGCGTCGCGTT、CGTCGTGGACGCGGACGACGGC，斜体表示的碱基为LNA修饰碱基。
在其中一些实施例中，所述试剂盒中还包括用于对转化后DNA进行纯化的磁珠混合液，优选地，所述磁珠混合液为含浓度为50±1mg/ml纳米磁性颗粒的水溶液。
在其中一些实施例中，还包括所述洗涤液为含2.5M盐酸胍、50％无水乙醇的水溶液，pH值在5.0～7.0。
在其中一些实施例中，所述洗脱液为含10mM Tris-HCl的水溶液，pH值在7.5～8.5。
在其中一些实施例中，所述试剂盒中还包括所述转化溶液为含75％的亚硫酸氢铵、0.1％的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)和0.1g/ml无水亚硫酸钠的水溶液，pH值在5.3～5.5。使用该转化剂的转化过程只需在80℃反应1个小时，而不需要98℃高温处理转化过夜，这在大大缩短了转化操作时间的同时有效地降低了DNA的降解，保证了转化后DNA的质量。所述转化剂包含有0.1％的EDTA-2Na作为稳定剂，可延长转化溶液的使用期限，大大提升转化溶液的稳定性和可利用性。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，优选地，每个反应所述阴性质控品由0.1μg牛血清蛋白和1ng的PCDH10基因非甲基化的人基因组DNA组成；所述阳性质控品由0.1μg牛血清蛋白、0.9ng的PCDH10基因非甲基化的人基因组DNA和0.1ng的PCDH10基因甲基化的人基因组DNA组成。
本发明的另一目的是提供上述试剂盒的使用方法。
所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)获得待检测的DNA；
(2)荧光PCR反应：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性30秒，58℃退火30秒，45个循环；40℃降温30s。
本发明还提供了获得待检测的DNA的方法，包括有DNA转化：取需要检测的DNA溶液，向其中加入转化溶液和DNA保护液，混匀，置于80±3℃反应1±0.1小时，获得转化后DNA溶液，所述DNA保护液为维生素E的四氢呋喃溶液，四氢呋喃作为溶剂，维生素E浓度为0.125±0.01g/ml；
所述获得待检测的DNA，还包括有DNA纯化：获得的转化后DNA溶液冷却至室温，向其中加入结合液与磁珠混合液，混匀，室温放置；待磁珠分离后，弃去上清液；加入洗涤液洗涤1-3次，待磁珠干燥后加入洗脱液进行洗脱，待磁珠分离后，转移上清液至于新的无DNase和RNase酶离心管中，即获得转化纯化后DNA。
本发明具有以下优点：
(1)通过对选择的检测靶区设计相应的合适的四组引物和探针，对于检测的准确性得到了很好的保证，在此基础上，进一步配合带有标签序列得到独特设计的引物。四组引物的每条引物的5’端都连接一段序列相同的标签序列，这种设计得到的引物可减少引物二聚体的发生，可消除同一体系中不同模板初始浓度不同造成的干扰，提高PCR扩增的灵敏度和特异性，从而提高检测结果的准确性，相应地，还配合所设计的探针均在合适的位置进行LNA修饰，这种LNA修饰的TaqMan探针在降低探针长度的同时，还能保持探针和DNA模板形成的杂交体保持较高的Tm值，可有效增强探针的特异性，从而提高检测结果的准确性。上述引物和探针的设计，给本发明所述检测试剂盒带来了很好的检测效果。
(2)本发明所述检测试剂盒通过采用五重荧光PCR反应，能够单管内一次反应检测出PCDH10基因两个CpG岛(CGI1和CGI2)共四个区域的甲基化状态，不仅极大地节省了试剂耗材，缩短了检测时间，而且能较全面地检测PCDH10基因甲基化状态。
(3)进一步地，本发明设计有阴性质控品和阳性质控品，能更好地防止假阳性结果和假阴性结果的产生，从而确保检测结果准确可靠。
(4)进一步地，本发明结合磁珠法对转化后DNA进行纯化，利用高盐低pH值进行DNA的分离纯化，再使用低盐高pH值进行洗脱，具有高纯度、高回收效率的特点，且整个纯化过程不使用目前市场上常采用的氢氧化钠去磺化处理，操作更简便，更能节省整个纯化操作时间。
附图说明
图1为4种带标签序列的特异性引物与不带标签序列的特异性引物检测PCDH10基因非甲基化人类基因组DNA的荧光PCR扩增曲线图。其中，使用4种带标签序列的特异性引物的检测结果中，在FAM、VIC、ROX和CY5通道均无扩增曲线升起(曲线7，基线重叠)，在TAMARA通道检出S型扩增曲线，TAMARA通道对应Ct值分别为28-29.5之间(曲线3，带B1标签序列的特异性引物)、31-32.5之间(曲线4，带B2标签序列的特异性引物)、32-33之间(曲线1，带B3标签序列的特异性引物)、30-31.6之间(曲线2，带B1标签序列的特异性引物)，基线平直而无上扬；使用不带标签序列的特异性引物检测结果图中FAM、VIC、ROX和CY5通道均无扩增曲线升起，在TAMARA通道检出S型扩增曲线，TAMARA通道对应Ct值为32-33.5之间(曲线5)，基线有些上扬(曲线6)。
图2为4种带标签序列的特异性引物与不带标签序列的特异性引物检测PCDH10基因甲基化人类基因组DNA的荧光PCR扩增曲线图。其中2-(a)带B1标签序列的特异性引物，FAM、VIC、ROX和CY5通道的Ct值均在27-29之间(分别为曲线2-5)，TAMARA通道Ct值为26-27.5之间(曲线1)，基线平直而无上扬(曲线6)；2-(b)带B2标签序列的特异性引物，FAM、VIC、ROX和CY5通道(分别为曲线2-5)，TAMARA通道(曲线1)，基线平直而无上扬(曲线6)；2-(c)带B3标签序列的特异性引物，FAM、VIC、ROX和CY5通道(分别为曲线2-5)，TAMARA通道(曲线1)，基线平直而无上扬(曲线6)；2-(d)带B1标签序列的特异性引物，AM、VIC、ROX和CY5通道(分别为曲线2-5)，TAMARA通道(曲线1)，基线平直而无上扬(曲线6)；2-(e)不带标签序列的特异性引物，FAM、VIC、ROX和CY5通道(分别为曲线1,3-5)，TAMARA通道(曲线2)，基线有些上扬(曲线6)。
图3为本发明LNA修饰探针与未经LNA修饰的普通探针检测PCDH10基因非甲基化人类基因组DNA的荧光PCR扩增曲线图；(a)本发明LNA修饰探针；(b)未经LNA修饰的普通探针。
图4为本发明LNA修饰探针与未经LNA修饰的普通探针检测PCDH10基因甲基化人类基因组DNA的荧光PCR扩增曲线图。(a)本发明LNA修饰探针；(b)未经LNA修饰的普通探针。
图5为本发明纯化试剂与Qiagen试剂盒纯化PCDH10基因非甲基化人类基因组DNA的荧光PCR扩增曲线图。
图6为本发明纯化试剂与Qiagen试剂盒纯化PCDH10基因甲基化人类基因组DNA的荧光PCR扩增曲线图；(a)本发明纯化试剂，其中FAM、VIC、ROX和CY5通道(曲线1-2，曲线4-5)，TAMARA通道(曲线4)，曲线6为基线；(b)Qiagen试剂盒，其中，FAM、VIC、ROX和CY5通道(曲线2-5)，TAMARA通道(曲线1)，曲线6为基线。
图7为本发明PCDH10基因甲基化阴性的DNA样本的荧光PCR扩增曲线图，FAM、VIC、ROX和CY5通道无曲线，TAMARA通道曲线1。
图8为本发明PCDH10基因甲基化阳性的DNA样本的荧光PCR扩增曲线图，FAM、VIC、ROX和CY5通道曲线2-5，TAMARA通道曲线1。
图9为本发明阴性质控品的荧光PCR扩增曲线图，FAM、VIC、ROX和CY5通道无曲线，TAMARA通道曲线1。
图10为本发明阳性质控品的荧光PCR扩增曲线图，FAM、VIC、ROX和CY5通道曲线2-5，TAMARA通道曲线1。
具体实施方式
除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下面将结合实施例对本发明进行进一步说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
实施例1：
制备本发明的人PCDH10基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光法)
人PCDH10基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)，包括DNA转化及纯化试剂组分和甲基化检测试剂组分；其中，DNA转化试剂为转化溶液，及纯化试剂组分包含、DNA保护液、结合液、磁珠混合液、洗涤液和洗脱液，甲基化检测试剂组分包含荧光PCR反应液、阴性质控品和阳性质控品。试剂盒的制备包括以下步骤：
(1)DNA转化及纯化试剂组分的配制：按需求配制转化溶液、DNA保护液、结合液、磁珠混合液、洗涤液和洗脱液。其中，转化溶液为含75％的亚硫酸氢铵、0.1％的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)和0.1g/ml无水亚硫酸钠的水溶液，pH值为5.3；DNA保护液为维生素E和四氢呋喃的混合液，维生素E浓度为0.125g/ml；结合液为含3.5M异硫氰酸胍、0.5M碘化钠、100mM Tris-HCl、30％异丙醇的水溶液，pH值为5.0；磁珠混合液为含浓度为50mg/ml纳米磁性颗粒的水溶液，具体为超顺四氧化三铁颗粒，且外表由修饰有羟基或羧基的二氧化硅包被，购自羧菲生物医药(货号FE10001)；洗涤液为含2.5M盐酸胍、50％无水乙醇的水溶液，pH值为7.0；洗脱液为含10mM Tris-HCl的水溶液，pH值为8.5。
(2)PCDH10基因引物和探针的设计及制备：针对PCDH10基因CGI1的一个区域和CGI2的三个区域分别设计若干组甲基化检测的特异性引物和荧光探针，将各引物和探针进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终优选出用于PCDH10基因甲基化检测的四组带标签序列的特异性引物和LNA修饰探针，具体如SEQ ID 1至SEQ ID 12。优选的引物和探针以100μM的母液储存，根据需求制备成20μM的工作液备用。所述荧光探针是指5’端修饰有荧光报告基团例如FAM、VIC、ROX、CY5或TAMARA，3’端连接有MGB修饰基团。
(3)内标基因引物和探针的设计和制备：针对ACTB基因设计带标签序列的引物和LNA探针，具体如SEQ ID 13至SEQ ID 15。将该内标基因引物和探针分别配制成100μM的母液储存，根据需求稀释成20μM的工作液备用。
所述试剂盒的引物和探针序列具体如下表所示：
上述序列中斜体表示的碱基为LNA修饰碱基。
所述试剂盒检测的靶区具体如下表：
| 基因片段 | CpG岛 | 定位 | 对应引物和探针 |
| PCDH10_1 | CGI1 | 转录起始位点－1805～－931bp | SEQ ID 1、2、3 |
| PCDH10_2 | CGI2 | 转录起始位点+905～+1101bp | SEQ ID 4、5、6 |
| PCDH10_3 | CGI2 | 转录起始位点+1294～+1438bp | SEQ ID 7、8、9 |
| PCDH10_4 | CGI2 | 转录起始位点+1726～+1826bp | SEQ ID 10、11、12 |
(4)引物探针混合液的配制：按照以下引物探针混合液的配制方案配制引物探针混合液，保存备用。
| 试剂名称 | 每反应(μl) |
| 引物(20μM) | 每条加入0.3μl |
| 探针(20μM) | 每条加入0.3μl |
| 总体积 | 4.5μl |
(5)荧光PCR反应液的配制：按照以下荧光PCR反应液配制荧光PCR反应液，保存。
所述PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、无核酸酶的水均为普通市售产品。
所述荧光PCR反应液配制方案如下：
上述配制体系仅为本实施例的举例，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该体系体积及其中各组分含量。
(6)1个反应的阴性质控品和阳性质控品的配制：以0.1μg牛血清蛋白和1ng的PCDH10基因非甲基化的人基因组DNA配制成阴性质控品，以0.1μg牛血清蛋白、0.9ng的PCDH10基因非甲基化的人基因组DNA和0.1ng的PCDH10基因甲基化的人基因组DNA配制成阳性质控品。
(7)试剂盒的分装与组装：试剂盒规格为24人份/盒，分装与组装方案如下：
所述检测全过程包括以下步骤：
(1)取待检DNA溶液100μl加入离心管中，再向其中加入190μl转化溶液和30μl DNA保护液，混匀，置于80℃恒温金属浴中反应1小时，获得的转化后DNA若不立即进行下一步操作，可放置于室温(20℃左右)保存20小时而不影响后续检测结果。
(2)步骤(1)获得的转化后DNA溶液冷却至室温，向其中加入500μl结合液与20μl磁珠混合液，混匀，室温放置15分钟；
(3)将离心管置于磁力架上5分钟，待磁珠分离后，弃去上清液；
(4)加入1ml洗涤液，充分混匀磁珠，再置于磁力架上5分钟，弃去上清液；
(5)在磁力架上静置5分钟，用移液枪尽量去除残余液体；
(6)将离心管再次置于磁力架上静置5分钟，待磁珠干燥后加入40-100μl洗脱液，充分混匀后，置于56℃恒温振荡器中1000rpm震荡5分钟；
(7)将离心管置于磁力架上5分钟，待磁珠分离后，转移上清液至于新的无DNase和RNase酶离心管中，即获得转化纯化后DNA，于－20℃保存备用；
(8)以步骤(7)获得的转化纯化后DNA作为模板，按照下表配制荧光PCR反应体系：
| 试剂名称 | 每反应(μl) |
| 荧光PCR反应液 | 18 |
| 模板 | 2 |
| 总体积 | 20 |
(9)荧光PCR反应体系配制好后，放入荧光PCR仪，设置荧光PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性30秒，58℃退火30秒，45个循环；40℃降温30s。荧光PCR仪荧光通道选择FAM、VIC、ROX、CY5和TAMARA通道，进行扩增反应。
(10)根据荧光PCR仪检测到的FAM、VIC、ROX、CY5和TAMARA荧光信号来判读检测结果。以TAMARA达到设定的阈值时表示DNA上样量在允许范围内，FAM、VIC、ROX、CY5信号结果可靠；以FAM、VIC、ROX、CY5达到设定阈值时所需要的Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或大于等于45：阴性；Ct值小于45：阳性。具体的PCDH10基因甲基化检测结果判断表如下：
实施例2：
本发明带标签序列的特异性引物筛选实验
(1)实验目的
本实施例中通过对比带不同标签序列的特异性引物的荧光PCR检测结果，并以不带标签序列的特异性引物的荧光PCR检测结果作为对照，筛选出检测效果最佳的带标签序列的特异性引物。
(2)实验方法
本实施例中选择PCDH10基因非甲基化人类基因组DNA(N)、PCDH10基因甲基化人类基因组DNA(P)作为待测样本，使用本发明试剂盒中的转化及纯化试剂根据实施例1中的检测步骤进行亚硫酸氢盐转化及纯化操作。转化纯化后的DNA分别使用带不同标签序列的特异性引物和不带标签序列的特异性引物(除不带标签序列外，其他组成与实施例的引物相同)进行荧光PCR反应，DNA上样量为2μl各3孔。荧光PCR反应条件与实施例1中所述的荧光PCR反应条件相同。
各带标签序列的特异性引物的标签序列如下：
| 编号 | 标签序列 | 备注 |
| B1 | CAAGAAGGTGGTGAA | SEQ ID NO.16 |
| B2 | CCTGATCCAGTGTAT | SEQ ID NO.17 |
| B3 | GTTGTTGGTGGTGAC | SEQ ID NO.18 |
| B4 | TTCACCACCTTCTTG | SEQ ID NO.19 |
荧光PCR反应体系如下：
| 试剂名称 | 每反应(μl) |
| PCR缓冲液 | 4 |
| dNTP(10mM) | 2 |
| 各组引物(20μM) | 每条加入0.3μl(10条引物共3μl) |
| 探针(20μM) | 每条加入0.3μl(5条探针共1.5μl) |
| DNA聚合酶 | 0.2 |
| 无核酸酶的水 | 7.3 |
| 模板 | 2 |
| 总体积 | 20 |
(3)实验结果与分析
检测结果如图1、图2及下表所示。
/>
从检测结果可知，本发明带不同标签序列的特异性引物的荧光PCR检测结果与不带标签序列的特异性引物的荧光PCR检测结果一致，所有PCDH10基因非甲基化人类基因组DNA样本的检测结果皆为PCDH10甲基化阴性，所有PCDH10基因甲基化人类基因组DNA样本的检测结果皆为PCDH10甲基化阳性，证明了各组引物检测结果的准确性。从图1可见，4种带标签序列的特异性引物和不带标签序列的特异性引物检测PCDH10基因非甲基化人类基因组DNA均仅在TAMARA通道检出S型扩增曲线，FAM、VIC、ROX和CY5通道均无扩增曲线升起；从图2可见，4种带标签序列的特异性引物和不带标签序列的特异性引物检测PCDH10基因甲基化人类基因组DNA在FAM、VIC、ROX、CY5和TAMARA通道均有扩增信号，且都呈S型扩增曲线；但是，4种带标签序列的特异性引物的荧光PCR扩增曲线图的基线平而无上扬现象，不带标签序列的特异性引物的荧光PCR扩增曲线图的基线有些微上扬。在荧光PCR扩增曲线图中，基线是指在PCR的最初几个循环中(一般为3-15个循环)的信号水平，相当于反应的背景或噪声；标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。而本实施例中4种带标签序列的特异性引物的扩增曲线基线相较于不带标签序列的特异性引物的扩增曲线基线要更为平直而无上扬，说明4种带标签序列的特异性引物的荧光PCR反应的背景或噪声相较于不带标签序列的特异性引物更低；也就是说，与不带标签序列的特异性引物相比，4种带标签序列的特异性引物的检测效果更佳。
从图1、图2及上表显示的Ct值来看，带B1标签序列的特异性引物检出的Ct值水平最小，Ct值在26～29之间，带B2标签序列的特异性引物检出的Ct值水平在30～34之间，带B3标签序列的特异性引物检出的Ct值水平在30～35之间，带B4标签序列的特异性引物检出的Ct值水平在29～32之间，不带标签序列的特异性引物检出的Ct值水平最大，Ct值在31～36之间。Ct值指的是PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环数；Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小；当模板起始拷贝数相同时，Ct值越小，则扩增效率更高。在本实施例中带B1标签序列的特异性引物检出的Ct值相较于其它引物检出的Ct值更小，说明带B1标签序列的特异性引物的扩增效率更佳。总之，以上结果说明带B1标签序列的特异性引物的扩增效率更佳，检测效果佳，检测结果准确。
实施例3：
本发明带标签序列的特异性引物检测效果验证实验
(1)实验目的
本实施例中通过与不带标签序列的特异性引物的荧光PCR检测结果进行对比，验证本发明带标签序列的特异性引物的检测效果。
(2)实验方法
本实施例中选择PCDH10基因非甲基化人类基因组DNA(N)、PCDH10基因甲基化人类基因组DNA(P)作为待测样本，使用本发明试剂盒中的转化及纯化试剂根据实施例1中的检测步骤进行亚硫酸氢盐转化及纯化操作。转化纯化后的DNA分别使用本发明试剂盒中的甲基化检测试剂组份(其引物带标签序列)和不带标签序列的特异性引物(除不带标签序列外，其他组成与实施例的引物相同)进行荧光PCR反应，DNA上样量为2μl各6孔。本发明试剂盒荧光PCR检测根据实施例1的检测步骤进行，不带标签序列的特异性引物的荧光PCR反应条件与本发明试剂盒相同，其荧光PCR反应体系如下：
| 试剂名称 | 每反应(μl) |
| PCR缓冲液 | 4 |
| dNTP(10mM) | 2 |
| 不带标签序列的引物(20μM) | 每条加入0.3μl(10条引物共3μl) |
| 探针(20μM) | 每条加入0.3μl(5条探针共1.5μl) |
| DNA聚合酶 | 0.2 |
| 无核酸酶的水 | 7.3 |
| 模板 | 2 |
| 总体积 | 20 |
(3)实验结果与分析
检测结果如下表所示。
/>
从上表检测结果可知，本发明带标签序列的特异性引物的荧光PCR检测结果与不带标签的特异性引物的荧光PCR检测结果一致，所有PCDH10基因非甲基化人类基因组DNA样本的检测结果皆为PCDH10甲基化阴性，所有PCDH10基因甲基化人类基因组DNA样本的检测结果皆为PCDH10甲基化阳性；说明各组引物检测结果的准确性。但是，本发明带标签序列的特异性引物检出的Ct值较不带标签序列的特异性引物的Ct值低。当起始模板浓度相同时，Ct值越低，说明扩增效果更佳；因此，以上检测结果进一步验证了本发明带标签序列的特异性引物的检测效果更佳。
实施例4：LNA修饰探针检测效果验证实验
(1)实验目的
本实施例中通过与未经LNA修饰的普通探针的荧光PCR检测结果进行对比，验证本发明LNA修饰探针的检测效果。
(2)实验方法
本实施例中选择PCDH10基因非甲基化人类基因组DNA(N)、PCDH10基因甲基化人类基因组DNA(P)作为待测样本，使用实施例1所述试剂盒中的转化及纯化试剂根据实施例1中的检测步骤进行亚硫酸氢盐转化及纯化操作。转化纯化后的DNA分别使用本发明试剂盒中的甲基化检测试剂组份(其探针为LNA修饰探针)和组成与实施例1的荧光探针相同但未经LNA修饰的普通探针进行荧光PCR反应，DNA上样量为2μl各6孔。本发明实施例1所述试剂盒荧光PCR检测根据实施例1的检测步骤进行，未经LNA修饰的普通探针的荧光PCR反应条件与本发明试剂盒相同。
(3)实验结果与分析
检测结果如图3、图4及下表所示。
/>
从检测结果可知，本发明的实施例1所述LNA修饰探针的荧光PCR检测结果与未经LNA修饰的普通探针的荧光PCR检测结果一致，所有PCDH10基因非甲基化人类基因组DNA样本的检测结果皆为PCDH10甲基化阴性，所有PCDH10基因甲基化人类基因组DNA样本的检测结果皆为PCDH10甲基化阳性；证明了各组探针检测结果的准确性。但是，从图3和图4可知，图3a中FAM、VIC、ROX和CY5通道均无扩增曲线升起，在TAMARA通道检出S型扩增曲线，TAMARA通道对应Ct值28-29之间(曲线1)，未见非特异性扩增信号；图3b中FAM、VIC、ROX和CY5通道均无扩增曲线升起，在TAMARA通道检出S型扩增曲线，TAMARA通道(曲线1)，可见少许非特异性扩增信号(曲线2)。图4a中FAM、VIC、ROX和CY5通道Ct值均在28-30之间(曲线2-5)，TAMARA通道Ct值在26-28之间(曲线1)，未见非特异性扩增信号；图4b中FAM、VIC、ROX和CY5通道Ct值均在34-36之间(曲线2-5)，TAMARA通道Ct值在33-34之间(曲线1)，可见少许非特异性扩增信号(曲线6)。
即LNA修饰探针的荧光PCR扩增曲线图中未见非特异性反应，而未经LNA修饰的普通探针的荧光PCR扩增曲线图中可见少许非特异性荧光信号，说明LNA修饰探针相比未经LNA修饰的普通探针特异性更佳，可有效预防探针与扩增产物的非特异性结合，避免产生非特异性荧光信号，从而保证检测结果的判读不受非特异性荧光信号的影响。从图3、图4及上表显示的Ct值来看，LNA修饰探针检出的Ct值较未经LNA修饰的普通探针的Ct值低；在模板起始浓度、扩增引物、扩增条件相同的情况下，Ct值可能反映荧光探针检测效果，Ct值低，则荧光探针检测效果更佳；因此，以上结果说明在相同的浓度起始模板、扩增引物及扩增条件的情况下，LNA修饰探针用于荧光PCR反应时相较于未经LNA修饰的普通探针表现出更佳的检测效果；也就是说，LNA修饰探针的检测效果更佳。总之，以上结果说明LNA修饰探针检测效果更佳，可有效预防非特异性荧光信号的产生，保证检测结果的准确可靠。
实施例5：纯化试剂纯化效果验证实验
(1)实验目的
本实施例中通过与Qiagen公司的EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits(货号59824)进行对比，验证本发明实施例1所述试剂盒中纯化试剂的纯化效果。
(2)实验方法
本实施例中选择非甲基化人类基因组DNA、甲基化人类基因组DNA各6份作为待测样本，每份待测样本DNA总量保持一致，使用本发明试剂盒中的转化试剂进行亚硫酸氢盐转化，然后分别进行纯化操作，具体为：非甲基化人类基因组DNA和甲基化人类基因组DNA各3份分别使用本发明实施例1试剂盒中的纯化试剂和Qiagen试剂盒进行纯化，纯化时洗脱液使用量保持一致。本发明试剂盒纯化操作根据实施例1中的检测步骤进行操作，Qiagen试剂盒严格按照试剂盒说明书进行纯化操作。纯化后DNA使用本发明的甲基化检测试剂组分根据实施例1中的检测步骤进行荧光PCR检测，DNA上样量2μl各2孔。
(3)实验结果与分析
检测结果如图5、图6和下表所示。
/>
从图5和图6可知，本发明纯化试剂和Qiagen试剂盒纯化的非甲基化人类基因组DNA均仅在TAMARA通道检出S型扩增曲线，FAM、VIC、ROX和CY5通道均无扩增曲线升起，检测结果皆为PCDH10甲基化阴性，而本发明纯化试剂和Qiagen试剂盒纯化的甲基化人类基因组DNA在FAM、VIC、ROX、CY5和TAMARA通道均有扩增信号，且都呈S型扩增曲线，检测结果皆为PCDH10甲基化阳性；从上表展示的本发明纯化试剂和Qiagen试剂盒纯化的DNA样本检测Ct值来看，两组Ct值无显著差异；以上说明本发明纯化试剂的纯化效果与Qiagen试剂盒相当，也就是说，本发明纯化试剂的纯化效果好。此外，本发明的纯化试剂涉及的纯化过程无需采用氢氧化钠进行去磺化步骤，也不需要carrier RNA，只需进行一次洗涤过程，操作更简便，更能节省整个纯化操作时间，因此更具优势。
实施例6：同类产品比较实验
(1)实验目的
本实施例中通过与甲基化检测“金标准”重亚硫酸盐测序法的检测结果进行对比，验证本发明试剂盒的准确性。
(2)实验方法
本实施例中收集DNA样本共100例作为待测样本，其中，8例来自健康者，21例来自经确诊的良性病变或癌前病变，其余71例来自经确诊的恶性肿瘤患者。上述收集的100例DNA样本取适量分别使用本发明试剂盒和重亚硫酸盐测序法进行检测。本发明试剂盒检测过程根据实施例1中的检测步骤进行。重亚硫酸盐测序法委托美吉生物完成。
(3)实验结果与分析
检测结果如下表所示。
从上表检测结果可知，本发明试剂盒的检测结果与重亚硫酸盐测序法检测结果的符合率为100％，证明了本发明的检测准确性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 人PCDH10基因甲基化检测试剂盒
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caagaaggtg gtgaaggtat tgtttttagt tagcgtttcg 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caagaaggtg gtgaataccg ataattaacc aaactaaccg 40
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtttcgttc ggttgtcgcg tgac 24
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagaaggtg gtgaagattt tcgtcgcgta ttggt 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caagaaggtg gtgaacaccg cttccttcac gatac 35
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttaacgtcgt gtttgcgtat tg 22
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caagaaggtg gtgaaattgt agtggttcgg gatcg 35
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caagaaggtg gtgaacgcca aacacgttat tttca 35
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaacgataac gcgtcgcgtt 20
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagaaggtg gtgaagcgtt tttattaggg cgtaac 36
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagaaggtg gtgaacgata ctataaataa accgaacgtt 40
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgtcgtggac gcggacgacg gc 22
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caagaaggtg gtgaagttgt tacaggaagt cccttgc 37
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caagaaggtg gtgaaaagca atgctatcac ctcccctg 38
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acttctctct aaggagaatg gccc 24
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caagaaggtg gtgaa 15
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cctgatccag tgtat 15
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttgttggtg gtgac 15
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttcaccacct tcttg 15
Claims (9)
1.人PCDH10基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括针对PCDH10基因的CGI1岛和CGI2岛设计的引物和荧光探针，所述引物和荧光探针的序列如下表所示：
针对CGI1岛的引物和荧光探针为SEQ ID NO.1-3，针对CGI2岛的引物和荧光探针为SEQID NO.4-6、SEQ ID NO.7-9和SEQ ID NO.10-12；
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、和SEQ ID NO.12所示的荧光探针具有LNA修饰碱基，上表序列中斜体加粗的碱基为LNA修饰碱基；
SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.4-5、SEQ ID NO.7-8和SEQ ID NO.10-11所示的引物的5’端添加的为标签序列CAAGAAGGTGGTGAA。
2.根据权利要求1所述人PCDH10基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括内标基因引物及探针，其序列如下：
SEQ ID NO.15所示的荧光探针具有LNA修饰碱基，上表序列中斜体加粗的碱基为LNA修饰碱基；
SEQ ID NO.13-14所示的引物的5’端添加的为标签序列CAAGAAGGTGGTGAA。
3.根据权利要求1所述人PCDH10基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于对转化后DNA进行纯化的磁珠混合液。
4.根据权利要求3所述人PCDH10基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠混合液为含浓度为50±1mg/ml纳米磁性颗粒的水溶液。
5.根据权利要求1所述人PCDH10基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括洗涤液和洗脱液，所述洗涤液为含2.5M盐酸胍、50％无水乙醇的水溶液，pH值在5.0～7.0；所述洗脱液为含10mM Tris-HCl的水溶液，pH值在7.5～8.5。
6.根据权利要求1所述人PCDH10基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括转化溶液，所述转化溶液为含75％的亚硫酸氢铵、0.1％的乙二胺四乙酸二钠和0.1g/ml无水亚硫酸钠的水溶液，pH值为5.3～5.5。
7.根据权利要求1所述人PCDH10基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
8.根据权利要求7所述人PCDH10基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品由牛血清蛋白和PCDH10基因非甲基化的人基因组DNA组成；所述阳性质控品由牛血清蛋白、PCDH10基因非甲基化的人基因组DNA和PCDH10基因甲基化的人基因组DNA组成。
9.根据权利要求8所述人PCDH10基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品由0.1μg牛血清蛋白和1ng的PCDH10基因非甲基化的人基因组DNA组成；所述阳性质控品由0.1μg牛血清蛋白、0.9ng的PCDH10基因非甲基化的人基因组DNA和0.1ng的PCDH10基因甲基化的人基因组DNA组成。
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| CN110607357A (zh) | 2019-12-24 |
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