CN110592682A

CN110592682A - 高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法

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Publication number: CN110592682A
Application number: CN201910826851.4A
Authority: CN
Inventors: 张鸿; 张慧; 刘诗燕
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-09-03
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2019-12-20

Abstract

本发明公开了高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，具体涉及分子生物学领域，具体步骤如下：S1、配制反应液；S2、设置仪器参数；S3、芯片制备；S4、PCR扩增；S5、离心回收；S6、琼脂糖凝胶电泳回收；S7、文库质控。本发明通过一种利用MSND自动化平台构建文库的方法，可以同时进行384个样本的建库，大大提升了芯片制备的通量和效率，实现了仪器自动化，节省了人力，提高了建库的通量、减少了实验成本、降低了样本的起始量，本方法仅需要切胶回收后的样本进行一次qPCR定量即可直接上机测序，更为高效，节约了试剂使用量并省去了繁琐的质控、pooling等步骤，仍能获得和常规建库方法一致的测序结果。

Description

高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地说，本发明涉及高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法。

背景技术

随着二代测序技术的快速发展，16S rRNA基因测序成为了细菌群落物种组成及群落多样性研究的常规方法，包括经典的16s rRNA基因高变区区域测序(基于illuminaMiseq平台)和全长测序(基于Sequel和MinION平台)。目前应用比较广泛的测序区域是16srRNA基因的V3-V4区域，通过和其它研究手段相结合，在微生物组学的研究中发挥了重要作用。

常规的16s rRNA基因的文库构建，是通过带有接头序列和index序列的PCR引物扩增其V3-V4区域，然后通过illumina平台进行测序。这种方法对于少量样本而言，操作简便，测序结果较好，价格偏低。随着微生物研究的逐渐深入以及测序价格的降低，目前出现了很多基于大量样本的群体进行分析的微生物群落研究。常规的16s rRNA基因的文库构建方法对于需要大量同时处理的样本而言，建库过程繁琐，周期长，成本相对较高。

因此，需要一种高通量、低成本、速度快、质量好的建库方案来解决以上问题。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的实施例提供高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，通过MSND平台以一张含有5184个反应孔的芯片作为载体，一次可以同时处理384个样本(每个样本12个技术重复)，另外每个反应孔的反应体系为100纳升，大大节约了试剂和样本使用量；通过使用带有接头序列的内引物选择性扩增特定区域DNA片段，再由带有barcode序列及适用于illumina平台测序的接头序列的外引物进行扩增，扩增结束后使用收集装置获得可直接用于测序的文库。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：高通量自动化的微生物宏基因组16srRNA基因文库构建的方法，具体步骤如下：

S1、配制反应液：取一个干净的384孔PCR板，在孔内配制芯片制备的反应液：

配制完反应液后，用移液器吹打混匀，然后离心备用；

S2、设置仪器参数：将MSND仪器的模式调为384×12模式，其中384代表384个样本，12代表12次重复实验；

S3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND仪器内，同时将SmartChip芯片也放入到仪器中对应的位置，点击开始自动化点样仪MSND将自动把384孔板中的文库构建所需的PCR反应体系喷液到5184孔SmartChip芯片上；待仪器运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上封口膜放到冰盒上备用；

S4、PCR扩增；

S4.1、设置PCR仪的扩增程序；

S4.2、然后将PCR程序设置为“盖子加热到105℃”；

S4.3、PCR仪设置完成之后，将SmartChip芯片放到PCR仪上，盖上盖子进行PCR扩增；

S5、离心回收；

S5.1、PCR结束之后，将芯片取出，离心后小心撕掉封口膜，避免膜的胶残留在Chip上；

S5.2、装好芯片配备的收集槽(离心管一定要扣紧)，将收集槽放置到附带的离心架上；

S5.3、将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜；

S5.4、离心结束后，将离心管取下，做好标记，存放到-20℃冰箱；

S6、琼脂糖凝胶电泳回收；

S6.1、配制2％的琼脂糖凝胶；

S6.2、将PCR产物进行电泳；

S6.3、电泳结束后，在紫外灯的照射下，将PCR产物的500-750bp的条带用刀片切下，放入干净的离心管中；

S6.4、使用QIAquick胶回收试剂盒(QIAGEN，German)对切下的条带进行回收；

S7、对切胶回收后的文库进行质控：利用qPCR检测浓度，利用Agilent2100检测片段大小。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S1中，上游引物、下游引物和dNTP浓度均为10mM，DNA聚合酶和10×buffer(with Mg2+)浓度均为5U/μL，DNA浓度为5ng/μL。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S4.1中，设置PCR仪的扩增程序包括预变性、变性、退火、延伸、再延伸、保存共6个程序。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S4.1中，预变性、变性、退火、延伸、再延伸、保存共6个程序分别对应的温度为95℃、95℃、60℃、72℃、72℃、4℃。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S4.1中，6个程序分别对应的时间为3分钟、30秒、30秒、1分钟、5分钟、∞。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S4.1中，6个程序分别对应的循环数为1cycle、35cycles、35cycles、35cycles、1cycle、1cycle。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S3中，SmartChip芯片含有5184个反应孔，每个反应孔的反应体系为100纳升。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S5.3中，贴上封槽膜后的芯片放到离心机中离心，离心速度为4000rpm，离心时间为5min。

在一个优选地实施方式中，所述步骤S6.2中，PCR产物电泳时的电压为100V，电泳时间为2小时。

本发明的技术效果和优点：

1、本发明通过MSND平台以一张含有5184个反应孔的芯片作为载体，一次可以同时处理384个样本(每个样本12个技术重复)，另外每个反应孔的反应体系为100纳升，大大节约了试剂和样本使用量；通过使用带有接头序列的内引物选择性扩增特定区域DNA片段，再由带有barcode序列及适用于illumina平台测序的接头序列的外引物进行扩增，扩增结束后使用收集装置获得可直接用于测序的文库，克服现有常规建库方法存在的耗费人力、质控步骤繁琐、较低通量等缺点，提高了样本的通量、减少了人力、降低了样本的起始量，节约了试剂使用量并省去了繁琐的质控步骤，仍能获得和常规建库方法一致的测序结果；

2、本发明方法可以同时进行384个样本的建库，大大提升了芯片制备的效率；

3、本方面方法1个样本做12个技术重复，可很大程度上减少偶然因素、降低实验偏差。

4、本方法实现了仪器自动化，节省了人力；

5、本方法中每个样本的芯片制备的体积仅为10ul，即降低了样本的起始量，也节约了试剂的使用量；

6、在芯片制备结束之后，仅需要一次琼脂糖凝胶回收即可直接上机测序，而常规方法需要对每一个文库进行文库质控、pooling、pooling后文库质控等繁琐步骤，因此本方法更为高效；

7、本方法与常规方法的测序结果比较，本专利建库方法与常规方法拥有高一致性的测序结果，根据物种丰度差异分析，两种建库方法得到的物种丰度高度一致，其次两种方法T检验P值和KS检验P值，均无显著差异，两种建库方法的结果高度一致；无论常规建库还是本方法对微生物DNA进行16s rDNA区域测序的结果高度一致，但本方法又兼顾通量高、成本低、周期短、DNA起始量低等优势。

附图说明

图1为本发明的WF-16s技术流程图。

图2为本发明的物种丰度图。

图3为本发明的两种建库方法差异统计分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

根据图1所示的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，具体步骤如下：

上游引物、下游引物和dNTP浓度均为10mM，DNA聚合酶和10×buffer(with Mg2+)浓度均为5U/μL，DNA浓度为5ng/μL；

配制完反应液后，用移液器吹打混匀，然后离心备用；

S2、设置仪器参数：将MSND仪器的模式调为384×12模式，其中384代表384个样本，12代表12次重复实验；S3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND仪器内，同时将SmartChip芯片(含有5184个反应孔，每个反应孔的反应体系为100纳升)也放入到仪器中对应的位置，点击开始即可开始芯片的制备；待仪器运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上封口膜放到冰盒上备用；

S4、PCR扩增；

S4.1、设置PCR仪的扩增程序；

具体如下表设置PCR仪的扩增程序：

S4.2、然后将PCR程序设置为“盖子加热到105℃”；

S5、离心回收；

S5.3、将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜，放到离心机中离心，离心速度为4000rpm，离心时间为5min；

S6、琼脂糖凝胶电泳回收；

S6.1、配制2％的琼脂糖凝胶；

S6.2、将PCR产物进行电泳，电泳时的电压为100V，电泳时间为2小时；

本方法可以同时进行384个样本的建库，大大提升了芯片制备的效率；并且实现了仪器自动化，节省了人力，每个样本的芯片制备的体积仅为10ul，即降低了样本的起始量，也节约了试剂的使用量。

实施例2：

将本发明文库构建的方法与常规方法的测序结果比较，本专利建库方法与常规方法拥有高一致性的测序结果；

首先根据物种丰度差异分析(见图2)，两种建库方法得到的物种丰度高度一致；

其次根据差异统计分析结果(见图3)发现两种方法T检验P值为0.999，KS检验P值为0.612，均无显著差异，两种方法相关性达到0.914，说明两种建库方法的结果高度一致；

图2和图3这两张图示结果说明无论常规建库还是本方法对微生物DNA进行16srDNA区域测序的结果高度一致，但本方法又兼顾通量高、成本低、周期短、DNA起始量低等优势；

并且本方法在芯片制备结束之后，仅需要一次琼脂糖凝胶回收即可直接上机测序，而常规方法还需要定量、pooling等繁琐步骤，因此本方法更为高效。

最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于，具体步骤如下：

配制完反应液后，用移液器吹打混匀，然后离心备用；

S4、PCR扩增；

S4.1、设置PCR仪的扩增程序；

S4.2、然后将PCR程序设置为“盖子加热到105℃”；

S5、离心回收；

S5.2、装好芯片配备的收集槽，将收集槽放置到附带的离心架上；

S5.3、将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜；

S5.4、离心结束后，将离心管取下，离心管中为完成文库构建的384个文库的混合样本，做好标记，存放到-20℃冰箱；

S6、琼脂糖凝胶电泳回收；

S6.1、配制2％的琼脂糖凝胶；

S6.2、将PCR产物进行电泳；

S6.4、使用QIAquick胶回收试剂盒对切下的条带进行回收；

S6.5、回收结束后，做好标记，存放到-20℃冰箱；

S7、对切胶回收的文库进行质控：利用qPCR检测浓度，利用Agilent2100检测片段大小。

2.根据权利要求1所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S1中，上游引物、下游引物和dNTP浓度均为10mM，DNA聚合酶和10×buffer(with Mg2+)浓度均为5U/μL，DNA浓度为5ng/μL。

3.根据权利要求1所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S4.1中，设置PCR仪的扩增程序包括预变性、变性、退火、延伸、再延伸、保存共6个程序。

4.根据权利要求3所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S4.1中，预变性、变性、退火、延伸、再延伸、保存共6个程序分别对应的温度为95℃、95℃、60℃、72℃、72℃、4℃。

5.根据权利要求3所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S4.1中，6个程序分别对应的时间为3分钟、30秒、30秒、1分钟、5分钟、∞。

6.根据权利要求3所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S4.1中，6个程序分别对应的循环数为1cycle、35cycles、35cycles、35cycles、1cycle、1cycle。

7.根据权利要求3所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S3中，SmartChip芯片含有5184个反应孔，每个反应孔的反应体系为100纳升。

8.根据权利要求1所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S5.3中，贴上封槽膜后的芯片放到离心机中离心，离心速度为4000rpm，离心时间为5min。

9.根据权利要求1所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S6.2中，PCR产物电泳时的电压为100V，电泳时间为2小时。