CN114181996A - 一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法 - Google Patents
一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，包括以下步骤：S1、设计与合成带标签的扩增引物：引物的5’端带有标签序列，并且5’端磷酸化修饰，引物的3’端为扩增子的特异性引物，并经HPLC纯化；S2、点样仪以含有5184个微孔的芯片作为载体，根据不同通量组合，完成芯片制备，进行PCR扩增，芯片中的扩增产物混合收集至离心管；S3、扩增产物进行纯化，末端修复和加A反应等，文库上机测序。基于此方法得到测序结果显示，与常规建库方法得到的物种组成结构和丰度高度一致。本技术发明大大地简化了实验操作流程，具有基因文库构建的高通量优势，提高了建库效率，缩短了实验周期，减少了试剂耗材等成本。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法。
背景技术
16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。通过检测16S rDNA可变区的序列变异和丰度，可了解环境样品中群落多样性信息，在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起着重要的作用。近些年来，基于二代测序的16S rDNA检测大大加速了人们对微生物群落的了解。但由于二代测序的读长限制，目前微生物多样性研究仅检测16S rDNA的某段或某几段高变区，物种分类也只能精确到属水平。无法将其准确注释到物种水平。Sanger测序虽能接近全长，但通量低，且成本高，不适用群体复杂的环境微生物宏样本。随着三代SMRT测序技术的出现，PacBio全长16S rDNA测序集合了Sanger测序的读长优势和二代测序的高通量优势，具有和二代测序相媲美的准确度和重复性，可提供更准确的物种分类和更多的物种鉴定，在系统发育、群落鉴定和代谢通路预测方面都更有优势。
常规的PacBio全长16S rDNA基因的文库构建是通过带有标签序列的PCR引物扩增16S全长基因，然后每个扩增产物需采用AMPure磁珠纯化，进行Qubit浓度测定，确定PCR产物的浓度与总量。从而等量混合，混合样本再经过DNA损伤修复，末端修复加A，再与测序接头相连接，获得基于PacBio测序平台的全长扩增子文库。这种方法对于少量样本而言，操作简便，测序结果较好，价格偏低。随着微生物研究的逐渐深入以及测序价格的降低，目前出现了很多基于大量样本的微生物群落研究。常规的16S rDNA的文库构建方法对于大量样本而言，建库过程繁琐，周期长，成本相对较高。
因此，需要一种高通量、低成本、速度快、质量好的基因文库构建技术方法来解决以上问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，解决了常规的16S rDNA的文库构建方法对于大量样本而言，建库过程繁琐，周期长，成本相对较高的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，包括以下步骤：
S1、设计与合成带标签的扩增引物：每个待测样本设计并合成一对扩增子的扩增引物，其中每对引物的5’端带有标签序列，并且5’端磷酸化修饰，每对引物的3’端为扩增子的特异性引物，引物采用HPLC纯化；
S2、扩增子样本的扩增：
S2.1、配置反应液：取一个经过灭菌并烘干的384孔板，在孔内配置芯片制备的反应液；
S2.2、设置仪器：将MSDN点样仪的模式选为384×12模式，喷液体积为100nl。其中384代表384个样本，12代表12次重复，即每个384孔板的孔内试剂会喷入芯片的12个孔中，每个芯片孔反应体系为100nl；
S2.3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND点样仪特定位置，将SmartChip芯片也放入到MSND点样仪特定位置，点击开始，MSND点样仪将自动把384孔板中的文库构建所需的PCR反应体系喷入51 84孔SmartChip芯片孔内，待运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上芯片膜，2600xg离心5分钟；
S2.4、上机扩增：将SmartChip芯片放入PCR仪，盖上盖子进行PCR扩增；
S3、收集扩增产物：PCR结束之后，将芯片取出，2600xg离心5分钟后小心撕掉芯片膜，避免膜的胶残留在芯片上；组装芯片配备的收集槽，将收集槽放置到附带的离心架上；将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜；2600xg离心10分钟，结束后，将离心管取下，做好标记；
S4、用0.6倍的AMPure PB磁珠对扩增产物进行纯化；
S5、取上述纯化产物500ng进行DNA损伤修复；
S6、对步骤S5中产物进行末端修复和加A反应；
S7、对步骤S6获得的产物与测序接头进行连接反应；
S8、经0.6倍的AMPure PB磁珠纯化步骤S7得到的连接产物后，即可得到基于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库。
优选的，所述步骤S1中，引物结构从5’端到3’端分别为5nt的缓冲序列-16nt标签序列-16S特异性引物，并且5’端在合成时需要进行磷酸化修饰。
优选的，所述步骤S2.1反应液为：10ng/μL的样本DNA 1.5μL、10μM带标签的扩增引物F 0.75μL、10μM带标签的扩增引物R 0.75μL、2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix 7.5μL、灭菌超纯水4.5μL。
优选的，所述带标签的扩增引物F和到标签的扩增引物R的组合对应一种样本，不同样本使用不同组合，以便后续测序后的拆分，重复孔使用同一种组合。
优选的，所述步骤S2.2中PCR扩增反应程序为：95℃10min，25个循环×(95℃30s，57℃30s，72℃90s)，72℃5min。
优选的，所述步骤S2.4中，PCR仪热盖温度需设定为72℃。
优选的，所述步骤S5和S6中的DNA损伤修复和末端修复加A以及步骤S7中连接接头所用试剂均来源于SMRTbell Express Template Prep 2.0试剂盒。
(三)有益效果
本发明提供了一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，具备以下有益效果：
(1)、本发明通过MSND点样仪以一张含有5184个反应孔的芯片作为载体，仅需在384孔板中配制各样本的扩增反应体系，MSND点样仪即可自动完成芯片制备，同时在扩增结束后通过收集装置将各个扩增产物混合至一个离心管中进行纯化，而不需要对每个扩增产物进行纯化，浓度测定再混库。大大地简化了实验操作流程，提高了建库效率，降低了建库成本。
(2)、本发明采用自动化仪器最多可同时进行384个样本的建库，提高了样本的通量；大大提升工作效率，且可根据对每个样本扩增产物需要量的不同，灵活调整模式。即设置重复数不同。
(3)、本发明方法每个样本做12个技术重复，增加了DNA扩增的独立性，可很大程度上减少偶然因素、降低实验偏差。
(4)、本发明方法中芯片孔内反应体系仅为100nl，能减少嵌合体的产生和减少PCR偏差，提高扩增的高效性和特异性。
(5)、本发明方法中每个样本的芯片制备的体积仅为15ul，即降低了样本的起始量，也节约了试剂的使用量。
(6)、本发明方法中在芯片PCR扩增结束之后，仅需将芯片倒扣在收集装置内离心即可完成各个扩增产物的回收和混合，而常规方法需要对每一个扩增产物进行磁珠纯化、浓度测定、等量混合等繁琐步骤。因此，本方法克服了现有常规建库方法存在的耗费人力、质控步骤繁琐、通量较低等缺点。
(7)、本发明方法与常规方法的测序结果比较，根据物种组成和丰度差异分析，两种建库方法得到的物种组成和丰度高度一致，其次两种方法T检验P值和KS检验P值，均无显著差异，说明本专利建库方法与常规方法所得到的结果拥有高度一致性。
附图说明
图1为本发明的示意图；
图2为本发明的流程图；
图3为本发明中不同样本重复数对测序结果的影响图；
图4为本发明中建库方法与常规建库方法的测序结果对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
对河流6个不同的采样点进行采集水样，每个采样点分别取3个生物重复，共计18个样本在实验室提取DNA。在配制384孔板时每个样本设置1个重复、2个重复和4个重复，此案例目的在于确定不同扩增产物量对测序数据量的影响，采用PacBio SequeⅡ测序1个cell，具体实验过程如下：
S1、设计与合成带标签的扩增引物：分析土壤样本中微生物的多样性，采用扩增微生物16S全长的方法进行土壤微生物成分分析。微生物细菌的16S rDNA全长的通用引物为27F(AGRGTTYGATYMTGGCTCAG)与1492R(RGYTACCTTGTTACGACTT)，其中每条引物的5’端带有标签序列，并且5’端需要磷酸化修饰；引物采用HPLC纯化，如下表所示，16nt标签序列有8种正向引物和12种反向引物，共计8x12＝96个组合，每个组合与样本的1个重复对应，从而重复数越多，对应扩增产物越多。在测序后可通过标签序列组合类型区分出不同样本；
引物结构：
正向引物：/5Phos/GCATC-CACTCGACTCTCGCGT-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG
5’磷酸化修饰-5nt缓冲序列-16nt标签序列-16S引物序列
反向引物：/5Phos/GCATC-AGAGACTGCGACGAGA-RGYTACCTTGTTACGACTT
5’磷酸化修饰-5nt缓冲序列-16nt标签序列-16S引物序列
S2、扩增子样本的扩增：
S2.1、配置反应液：取一个经过灭菌并烘干的384孔板，在孔内配置芯片制备的反应液：(每个样本和对应的带标签的扩增引物组合加入反应孔)
| 成分 | 体积(ul) |
| 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix | 7.5 |
| F引物(10uM) | 0.75 |
| R引物(10uM) | 0.75 |
| 样本DNA(10ng/ul) | 1.5 |
| 灭菌超纯水 | 4.5 |
S2.2、设置仪器：将MSND点样仪的模式选为384×12模式，喷液体积为100nl。其中384代表384个样本，12代表12次重复，即每个384孔板的孔内试剂会喷入芯片的12个孔中，每个芯片孔反应体系为100nl；在PCR仪Smartchip cycler上设置如下扩增程序：
S2.3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND仪器特定位置，将SmartChip芯片也放入到仪器特定位置，点击开始，MSND点样仪将自动把384孔板中的文库构建所需的PCR反应体系喷入5184孔Smart Chip芯片孔内；待仪器运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上芯片膜，2600xg离心5分钟；
S2.4、上机扩增：将SmartChip芯片放入Smartchip cycler仪中，点击进行PCR扩增；
S3、收集扩增产物：PCR结束之后，将芯片取出，2600xg离心5分钟离心后，小心撕掉芯片膜，避免膜的胶残留在芯片上；装好芯片配备的收集槽(离心管一定要扣紧)，将收集槽放置到附带的离心架上；将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜；2600x g离心10分钟。结束后，将离心管取下，做好标记；
S4、用0.6倍的AMPure PB磁珠对扩增产物进行纯化；
S5、取上述纯化产物500ng进行DNA损伤修复，如下表配制，混匀瞬时离心后在37℃下孵育30分钟，然后4℃保持
| 组分 | 体积 |
| DNA Prep Buffer | 7.0μL |
| 上一步骤纯化产物(500ng) | 47.0μL |
| NAD | 1.0μL |
| DNA Damage Repair Mix v2 | 2.0μL |
S6、对步骤S5中产物进行末端修复和加A反应，如下表配制，混匀瞬时离心后在20℃下孵育30分钟，在65℃下孵育30分钟，然后4℃保持
| 组分 | 体积 |
| 上一步骤产物 | 57.0μL |
| End Prep Mix | 3.0μL |
S7、对步骤S6获得的产物与测序接头进行连接反应，如下表配制，混匀瞬时离心后在20℃下孵育60分钟，然后4℃保持
S8、经0.6倍的AMPure PB磁珠纯化后即得到基于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库。
如图3所示，根据物种丰度差异分析，实验中样本在1：2：4不同重复倍数下，得到的物种组成与丰度都高度一致；本方法可以同时进行384个样本的建库，通量高的优势突出，大大提升了文库构建的效率；并且实现了仪器操作自动化，节省了人力，每个样本的芯片制备的体积仅为15ul，即降低了样本的起始量，也节约了试剂的使用量。
将本发明文库构建的方法与常规方法的测序结果比较，图4结果说明常规建库方法和本发明方法对微生物DNA进行16S rDNA测序的结果高度一致，但本方法又兼顾通量高、成本低、周期短、DNA起始量低等优势；并且本方法在芯片制备结束之后，仅需要将芯片倒扣在收集装置中即可完成样本的回收和混合，而常规方法还需要纯化、定量、混合等繁琐步骤，因此本方法更为高效。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经展示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、设计与合成带标签的扩增引物：每个待测样本设计并合成一对扩增子的扩增引物，其中每对引物的5’端带有标签序列，并且5’端磷酸化修饰，每对引物的3’端为扩增子的特异性引物，引物采用HPLC纯化；
S2、扩增子样本的扩增：
S2.1、配置反应液：取一个经过灭菌并烘干的384孔板，在孔内配置芯片制备的反应液；
S2.2、设置仪器：将MSDN点样仪的模式选为384×12模式，喷液体积100nl。其中384代表384个样本，12代表12次重复，即每个384孔板的孔内试剂会喷入芯片的12个孔中，每个芯片孔反应体系为100nl；
S2.3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND点样仪特定位置，将SmartChip芯片也放入到MSND点样仪特定位置，点击开始，MSND点样仪将自动把384孔板中的文库构建所需的PCR反应体系喷入5184孔SmartChip芯片孔内，待运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上芯片膜，2600x g离心5分钟；
S2.4、上机扩增：将SmartChip芯片放入PCR仪，盖上盖子进行PCR扩增；
S3、收集扩增产物：PCR结束之后，将芯片取出，2600xg离心5分钟后小心撕掉芯片膜，避免膜的胶残留在芯片上；组装芯片配备的收集槽，将收集槽放置到附带的离心架上；将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜；2600xg离心10分钟，结束后，将离心管取下，做好标记；
S4、用0.6倍的AMPure PB磁珠对扩增产物进行纯化；
S5、取上述纯化产物500ng进行DNA损伤修复；
S6、对步骤S5中产物进行末端修复和加A反应；
S7、对步骤S6获得的产物与测序接头进行连接反应；
S8、经0.6倍的AMPure PB磁珠纯化步骤S7得到的连接产物后，即可得到基于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库。
2.根据权利要求1所述的一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，其特征在于：所述步骤S1中，引物结构从5’端到3’端分别为5nt的缓冲序列-16nt标签序列-16S特异性引物，并且5’端在合成时进行磷酸化修饰。
3.根据权利要求1所述的一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，其特征在于：所述步骤S2.1反应液为：10ng/μL的样本DNA 1.5μL、10μM带标签的扩增引物F 0.75μL、10μM带标签的扩增引物R 0.75μL、2X KAPAHiFi HotStart Ready Mix 7.5μL、灭菌超纯水4.5μL。
4.根据权利要求2所述的一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，其特征在于：所述带标签的扩增引物F和到标签的扩增引物R的组合对应一种样本，不同样本使用不同组合，以便后续测序后的拆分，重复孔使用同一种组合。
5.根据权利要求1所述的一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，其特征在于：所述步骤S2.2中PCR扩增反应程序为：95℃10min，25个循环×(95℃30s，57℃30s，72℃90s)，72℃5min。
6.根据权利要求1所述的一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，其特征在于：所述步骤S2.4中，PCR仪器的热盖温度需设定为72℃。
7.根据权利要求1所述的一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，其特征在于：所述步骤S5和S6中的DNA损伤修复和末端修复加A以及步骤S7中连接接头所用试剂均来源于SMRTbell Express Template Prep 2.0试剂盒。
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