CN110585419A - Pkm2调控剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Pkm2调控剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PKM2调控剂及其制备方法和应用，PKM2调控剂包括蜂毒素，其制备方法为将蜂毒素溶于PBS溶液中，超声处理获得PKM2调控剂。本申请的PKM2调控剂蜂毒素通过靶向抑制PKM2介导的Warburg效应，从而减轻炎症反应，延缓肝损伤程度，起到肝保护的药理作用；可用于制备治疗急性肝损伤的药物、制备延缓肝损伤程度的药物、制备用于治疗肝巨噬细胞增殖引起的炎症反应的药物。

Description

PKM2调控剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，尤其涉及一种PKM2调控剂及其制备方法和应用。
背景技术
急性肝衰竭(Acute Liver Failure,ALF)是短时间内由于多种原因引起的肝细胞大量坏死及严重的肝功能受损，并引起肝性脑病、凝血功能障碍、黄疸和腹水等并发症的一组临床综合征。ALF的主要病因为：药物、肝炎病毒和自身免疫性等因素。令人遗憾的是，迄今为止尚无任何药物可逆转ALF的自然病程进展。ALF如不及时进行肝移植，死亡率将超过70％，且仅有14％的ALF患者从现有的医学治疗方法中康复。尽管肝移植是目前最有效的治疗方法，但肝源奇缺、费用昂贵和排斥反应的矛盾仍非常突出，这限制了其实际应用及推广。因此，针对急性肝衰竭的治疗成为了当今全世界最棘手的医学难题之一。
由于在药物毒性、肝炎病毒或自身免疫性因素的作用下，病原体或毒素入侵肝脏，直接损伤肝细胞，导致急性肝衰竭后肝细胞短时间内广泛性坏死，肝功能严重障碍，并出现黄疸和凝血性疾病；同时，肝脏无法清除血液循环中有毒物质，对内毒素清除能力下降，造成进入体内的大量内毒素未经肝脏解毒作用而进入体循环，促发肝性脑病和内毒素血症；更重要的是，上述因素进一步引起肝脏细胞内环境失衡，细胞信号级联反应被激活，放大体内免疫炎症反应，导致炎症介质的瀑布效应，过量细胞因子加速肝细胞的凋亡及坏死。以上过程加速了ALF的疾病进展，引起多脏器功能衰竭，预后不良，病死率极高。针对急性肝衰竭的治疗，包括营养支持、内科药物治疗和人工肝治疗等，其主要目的是尽最大限度地促进肝细胞再生，从而有助于患者肝功能的恢复，并为肝移植创造时间条件。但是，ALF后，肝细胞在短时间内便出现大量坏死，导致目前防治肝细胞死亡的治疗手段远赶不上ALF肝细胞死亡的速度，使得国内外靶向肝细胞再生的潜在治疗方法的效果杯水车薪，疗效并不令人满意。因此，深挖ALF病理生理学机制，探索有利于肝脏保护作用的关键分子及其调控模式，以寻找新型防治药物，成为ALF治疗领域亟待解决的关键科学问题。近年来，临床学家和研究学者逐步聚焦并提出：靶向肝巨噬细胞治疗ALF。
根据ALF的病理学发展进程可知：系统性免疫炎症反应失调是造成患者死亡的最主要原因，它是ALF发生发展的核心环节，减轻其发生发展程度将明显改善ALF患者的生存率。在ALF发生发展中，免疫反应启动后，动员各类免疫细胞，随后产生大量的炎性细胞因子，启动炎症介质的“级联瀑布式激活”，造成全身炎症反应综合征，进一步引起肝内微环境紊乱和肠道内毒素介导的继发性肝损伤。在上述ALF炎症反应过程中，肝巨噬细胞是炎症反应的主要效应细胞。肝巨噬细胞增殖并促发炎症反应对ALF炎症过程起到关键性作用，其主导ALF发生发展，在决定临床结局发挥着中心作用，成为造成高死亡率的重要原因。抑制肝巨噬细胞激活反应程度将有助于改善ALF患者的预后。
基于以上国内外研究背景，国家级教学名师、中南大学湘雅名医范学工教授带领课题组长期从事针对ALF治疗药物筛选的科研工作。近来，课题组将关注重点锚定在巨噬细胞在ALF进程中所发挥的作用及药物干预效应的研究方面。我们认识到：ALF早期，即出现肝脏巨噬细胞被激活并大量增殖，其触发M1型巨噬细胞极化，进一步促进致炎前因子和炎症介质过量表达，引起肝脏免疫炎症反应的放大效应，从而加重肝脏及肝外器官的损伤。结合既往学术界研究进展，课题组试图探索靶向巨噬细胞治疗ALF的候选药物。在药物筛选的研究过程中，我们受到中医基本思想的启发：与基于“单成分-单靶点”模式的西药相比，中医药以其“多成分-多靶点”药理作用显示出治疗疾病的满意疗效，逐渐成为药理学家和临床科学家研发新药的热点来源。因此，我们期望从中医药的伟大宝库中，寻找有效治疗ALF的候选靶向中药，以改善患者预后，为接受肝移植创造条件，并降低该疾病的死亡率。
中医中药因其“多靶点-多作用模式”的优势，对改善ALF病情，延缓疾病进展，延长生存时间，提高患者接受外科手术机会等方面显示出较理想的疗效。因而，寻找有效疾病治疗的中医药物一直是医学研究的热点和难点，也逐渐成为新药成分研发的重要来源。急性肝衰竭归属于中医“急黄”、“瘟黄”及“肝厥”范畴。针对ALF的中医发病机理，其中最主要的基本病机之一是邪毒内蕴。梳理历代医家的相关文献：隋代巢元方《诸病源候论》曰：“因为热毒所加，故卒然发黄，心满气喘，命在倾刻，故云急黄也”。清朝沈金鳌《沈氏尊生书》谓：“天行疫疠以至发黄者，俗谓之瘟黄，杀人最急”。《医宗金鉴》也有类似论述：“天行疫疠发黄，名曰瘟黄，死人最暴”。可见，毒邪既是启动因素，又是加速疾病发生发展的重要推手，成为ALF中医病机的关键[37]。所以，从毒邪论治ALF，攻毒扶正，既可截断病源，又可防止其造成的继发性损伤，对扭转病势有重要意义。
中医基础理论认为：毒邪具备猛烈和顽固的特性，非攻不克，可借助部分有毒中药“以毒攻毒”的药性以攻克顽疾。运用有毒中药针对起病迅猛、发展快速和随时致死的重症疾病进行治疗，是目前“以毒攻毒”现代研究的具体科学内涵。临床上常运用“以毒攻毒”的中医动物和矿物药，既可借助其药物毒性和偏性纠正机体毒邪偏盛的态势，又可引药入经，攻克顽邪，取得疗效。例如：我国上海交通大学王振义院士和陈竺院士基于中医“以毒攻毒”思想，将中药砒霜(三氧化二砷，As2O3)用于治疗早幼粒细胞白血病的原创性成果，已被美国国立综合癌症网络列入临床治疗早幼粒细胞白血病指南中；美国科学家发现：蜂毒因其显著抑制艾滋病病毒基因的表达及复制，可明显减少病毒的产生，目前已成为临床针对治疗艾滋病有前景的潜在创新药物。针对ALF主要关键病机，中医“以毒攻毒”有望成为治疗ALF的一个重要治疗法则。
中药动物药蜂毒素是来源于蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌出的具有芳香气味的透明毒液，其贮存在工蜂毒囊中，蜇刺时从蜇针排出，是蜜蜂在自然界进行自卫的武器，化学成分的生物活性十分活跃。蜂毒素由26个氨基酸组成，相对分子量为2840道尔顿，是一种具有水溶性、带正电荷的双亲性多肽类物质。其“以毒攻毒”已应用于癌症、特异反应性皮炎、风湿免疫性疾病和细菌感染性疾病等多种疾病的临床与基础治疗研究中。
急性肝衰竭后，肝巨噬细胞增殖是炎症过程的重要表现，其大量增殖并促发炎症反应，在ALF的炎症过程中起到关键性作用。我们知道：在能量代谢过程中，正常细胞体内的葡萄糖维持一种平衡状态；当细胞处于缺氧状态时，葡萄糖会转变为丙酮酸，进而转变为乳酸；当氧含量充足时，丙酮酸将进入线粒体基质实现三羧酸循环(tricarboxylicacidcycle,TCA)。而巨噬细胞、红细胞和肿瘤细胞为满足自身增殖的需要，即使在有氧情况下也不利用线粒体氧化磷酸化产能，转而利用有氧糖酵解，即瓦博格效应(Warburg effect)，目前被解读为细胞的代谢重编程(Metabolic Reprogramming)。在ALF疾病进程中，巨噬细胞从静息状态转为疾病增殖状态，需要从有氧氧化转向有氧糖酵解，启动并加强糖酵解过程，从而通过这一能量代谢过程所产生的物质与能量，以满足自身迅速增殖的需要：葡萄糖转变为丙酮酸，其进入线粒体基质中的三羧酸循环进程受阻，在糖酵解限速酶的作用下转化为大量乳酸，最终加速和扩大炎症反应效应，此过程不可避免发生Warburg效应。阻止巨噬细胞增殖而发生的有氧糖酵解进程则成为减轻炎症反应和促进阻止修复的重要治疗策略。
来自德国生物化学家Warburg最早于1920年通过研究发现：肝癌细胞糖酵解活性较正常肝细胞更为增强，以此提出：在氧气供应充足的情况下，肿瘤细胞糖酵解十分活跃，这种有氧糖酵解的代谢特征称为Warburg效应，其标志性表现是：葡萄糖摄取率显著增加，糖酵解能力增强，代谢产物乳酸水平提高[58]。ALF后，乳酸大量生成，作为代谢重编程标志性物质证据，乳酸先将葡萄糖分解为丙酮酸，必需借助3种限速酶：磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK，其中PKM2表达于增殖细胞)和己糖激酶。此后，丙酮酸有两条代谢出路：(1)通过乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase-A，LDHA)还原为乳酸；(2)进入线粒体，经丙酮酸脱氢酶转化为乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)，从而进入三羧酸循环，而进行有氧代谢。但是，丙酮酸脱氢酶激酶可通过自身磷酸化而使丙酮酸脱氢酶失活，阻断丙酮酸进入TCA。所以，乳酸的堆积是Warburg效应-从有氧磷酸化转向有氧糖酵解的标志性证据，其过程包括：(1)有氧磷酸化进程被抑制：丙酮酸脱氢酶激酶失活丙酮酸脱氢酶，阻断丙酮酸进入线粒体TCA进程；(2)有氧糖酵解能力增强，大量乳酸生成：丙酮酸水平增高，超出线粒体的处理能力；LDHA活性增强，最终促进丙酮酸向乳酸转化。
急性肝衰竭后，肝巨噬细胞发生Warburg效应的代谢分子基础是mTOR/PKM2(丙酮酸激酶同工酶2，Pyruvate Kinase M2)/HIF-1α(缺氧诱导因子-1α，hypoxia induciblefactor-1α)分子信号轴。在常氧状态下，ALF启动肝巨噬细胞的能量信号，活化PI3K，磷酸化3,4-二磷酸脂酰肌醇(PIP2)，生成3,4,5-三磷酸脂酰肌醇(PIP3)，募集下游分子Akt至细胞膜，促使Akt激活，从而直接激活mTOR，促进HIF-1α表达增加。在此过程中，作为Warburg效应过程的重要限速酶，PKM2是一种磷酸化酪氨酸绑定蛋白质，其高表达可明显促进有氧糖酵解水平，扮演着重要的中心枢纽作用：随着巨噬细胞的大量增殖，mTOR信号通路被激活，促进PKM2的高表达，进一步维持HIF-1α的活化稳定，保证其作为转录因子直接结合到细胞核内炎症基因编码区，促使炎症因子的大量表达释放。由此可见，PKM2是通过活化HIF-1α促进巨噬细胞激活的决定因素，成为激发炎症过度反应的关键推手。HIF-1α活化并过表达后，一方面促进Warburg效应调节能量代谢因子的表达(有氧磷酸化抑制：丙酮酸脱氢酶激酶-1；糖酵解增强：葡萄糖转运体1(glucose transporters-1，GLUT-1，控制葡萄糖摄取)、己糖激酶-1和2、PKM2、LDHA、单羧酸转运蛋白1和4)；另一方面，HIF-1α同时与PKM2共同发挥作用，调节肝巨噬细胞代谢，促进TNF-α和IL-1β等炎症介质的大量产生。急性肝衰竭的过程明显包含肝巨噬细胞增殖促发炎症反应的过程，属于炎症反应性疾病范畴。靶向调控ALF肝脏巨噬细胞的Warburg效应途径，则可抑制IL-1β和TNF-α等炎症因子爆发，从而减轻炎症反应，保护肝脏细胞，延缓肝细胞损伤速度。由此可见，mTOR/PKM2/HIF-1α分子信号轴是调节代谢重编程的核心，乳酸则是Warburg效应驱动炎症过度反应的执行者。所以，可从调控巨噬细胞PKM2介导上述信号轴调节乳酸生成和炎症反应的角度切入，阐释ALF肝巨噬细胞代谢重编程调节炎症反应的机制，靶向Warburg效应可作为研究蜂毒素调控炎症反应的一个新的干预靶点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种PKM2调控剂：蜂毒素能通过靶向抑制PKM2介导的Warburg效应，从而减轻炎症反应，延缓肝损伤程度，起到肝保护的药理作用，其制备方法简单可控，可应用制备治疗急性肝损伤的药物、制备延缓肝损伤程度的药物、制备用于治疗肝巨噬细胞增殖引起的炎症反应的药物，效果显著。
为了实现上述目的，本发明提供了一种PKM2调控剂，包括蜂毒素。
上述PKM2调控剂，进一步的，还包括药学上接受的辅料。
上述的PKM2调控剂，进一步的，所述药学上接受的辅料为PBS溶液。
上述的PKM2调控剂，进一步的，所述PKM2调控剂中蜂毒素的浓度为1μg/ml～2ug/ml。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述PKM2调控剂的制备方法，所述制备方法为：将蜂毒素溶于PBS溶液中，超声处理获得PKM2调控剂。
上述的制备方法，进一步的，所述超声处理过程中，频率为40KHz、超声时间为1～2min。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种PKM2调控剂在制备治疗急性肝损伤的药物中的应用。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种PKM2调控剂在制备延缓肝损伤程度的药物中的应用。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种PKM2调控剂在制备用于治疗肝巨噬细胞增殖引起的炎症反应的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种PKM2调控剂，急性肝衰竭后Warburg效应可能通路及蜂毒素干预可能效应：在肝脏能量代谢过程中，葡萄糖转化为丙酮酸；ALF后，肝巨噬细胞被激活并大量增殖，发生巨噬细胞的有氧糖酵解，称为Warburg效应(代谢重编程)：葡萄糖摄取率增高，其通过丙酮酸脱氢酶激酶的自身磷酸化，使丙酮酸脱氢酶失活，阻断丙酮酸向Acetyl-CoA转化，进入线粒体进行TCA；增加的葡萄糖在LDHA活性增强情况下，大量生成乳酸，进而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进PKM2高表达，从而活化并促使转录因子HIF-1α的过量表达，使其入核结合细胞核内炎症基因编码区，促进致炎前因子IL-1β和TNF-α的大量表达，促发炎症反应。中药动物药蜂毒素则可能通过靶向抑制PKM2介导的Warburg效应，从而减轻炎症反应，延缓肝损伤程度，起到肝保护的药理作用。
(2)本发明提供了一种PKM2调控剂的制备方法，将蜂毒素溶于PBS溶液中，通过超声处理将蜂毒素溶解，获得PKM2调控剂，其制备方法简单可控、可应用于工业化生产。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中蜂毒素调控原理图。
图2为本发明实施例2中蜂毒素对RAW264.7小鼠巨噬细胞系的MTT检测结果。
图3为本发明实施例3中氧化应激指标SOD、MDA、CAT和GSH的检测结果。
图4为本发明实施例4中蜂毒素对RAW264.7细胞系能量代谢的影响结果。
图5为本发明实施例5中基于化学发光法的乙酰辅酶A、LDH和乳酸检测结果。
图6为本发明实施例5中GLUT-1和LDHA的Western Blot典型的检测代表性条带.
图7为本发明实施例6中考察蜂毒素对RAW264.7巨噬细胞系炎症模型Warburg效应关键信号通路的干预作用结果，其中图7A为采用Western Blot方法检测PKM2、HIF-1α、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR和β-actin的蛋白表达水平结果；图7B为免疫荧光检测结果。
图8为本发明实施例7中蜂毒素抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞系炎症反应结果。
图9为本发明实施例8中蜂毒素与PKM2蛋白的分子对接结果。
图10为本发明实施例9中蜂毒素靶向PKM2调控LPS诱导RAW264.7巨噬细胞系炎症模型Warburg效应结果。
图11为本发明实施例9中化学发光检测结果。
图12为本发明实施例10中蜂毒素靶向PKM2减轻LPS诱导RAW264.7巨噬细胞系的炎症反应水平的结果。
图13为本发明实施例11中Western Blot检测结果。
具体实施方式
以下结合具体说明书附图以及优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种本发明的PKM2调控剂：包括2μg/ml蜂毒素和PBS溶液。
其调控原理如图1所示：在肝脏能量代谢过程中，葡萄糖转化为丙酮酸；ALF后，肝巨噬细胞被激活并大量增殖，发生巨噬细胞的有氧糖酵解，称为Warburg效应(代谢重编程)：葡萄糖摄取率增高，其通过丙酮酸脱氢酶激酶的自身磷酸化，使丙酮酸脱氢酶失活，阻断丙酮酸向Acetyl-CoA转化，进入线粒体进行TCA；增加的葡萄糖在LDHA活性增强情况下，大量生成乳酸，进而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进PKM2高表达，从而活化并促使转录因子HIF-1α的过量表达，使其入核结合细胞核内炎症基因编码区，促进致炎前因子IL-1β和TNF-α的大量表达，促发炎症反应。中药动物药蜂毒素则可能通过靶向抑制PKM2介导的Warburg效应，从而减轻炎症反应，延缓肝损伤程度，起到肝保护的药理作用。
本实施例中PKM2调控剂的制备方法为：将蜂毒素溶于PBS溶液中，超声用数控超声波清洗器在40Hz下超声1-2分钟后制备成浓度为2μg/ml的蜂毒素溶液。
实施例2
考察实施例1的PKM2调控剂对RAW264.7细胞系细胞活力的影响：
(1)RAW264.7小鼠巨噬细胞系炎症模型制备：
RAW264.7细胞系购买于中国科学院上海细胞库。复苏后，于DMEM(Dulbecco'smodification of Eagle’s medium Dulbecco，改良Eagle培养基，含10％的胎牛血清和1％的双抗)中进行培养。试验时，取RAW264.7细胞系接种于96孔板中(密度：1×105cells/cm2)，加入完全培养基，轻轻摇晃，使细胞均匀分布。放置于37℃、5％CO2、适宜的饱和湿度的细胞培养箱，待细胞达70％以上的汇合度。目前LPS引起的细胞损伤及炎症模型是国内外公认的肝脏失功能和衰竭的经典模型，因此，我们随后加入100ng/ml的LPS制备RAW264.7小鼠巨噬细胞系炎症模型，再加药，孵育24小时后，提取总蛋白，待测。
(2)细胞实验随机分组
RAW264.7细胞系随机分为6组：
2.1、正常对照组：不予任何处理；
2.2、模型组：给予100ng/ml的LPS处理；
2.3、蜂毒素剂量1处理组(给予100ng/ml的LPS+1μg/ml的蜂毒素处理)；
2.4、蜂毒素剂量2处理组(给予100ng/ml的LPS+2μg/ml的蜂毒素处理)；
2.5、蜂毒素剂量3处理组(给予100ng/ml的LPS+4μg/ml的蜂毒素处理)；
2.6、蜂毒素剂量4处理组(给予100ng/ml的LPS+8μg/ml的蜂毒素处理)。
(3)细胞活力检测：
采用MTT法检测蜂毒素对RAW264.7细胞系细胞活力的影响。检测方法按照试剂盒说明书执行，具体为：
3.1、溶液配制：用5ml的MTT溶剂溶解25mg的MTT，配制成5mg/ml的MTT溶液；
3.2、每孔加入100微升5000个细胞；
3.3、每孔加入10μl的MTT溶液，于细胞培养箱中，进行孵育4小时；
3.4、每孔加入100μl的Formazan溶解液，适当混匀，继续孵育，在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解；
3.5、采用酶标仪于570nm下测定吸光度。
(4)实验结果：
图2为蜂毒素对RAW264.7小鼠巨噬细胞系的MTT检测结果，*p＜0.05，**p＜0.01。。MTT检测结果显示：与正常对照组比较，100ng/ml的LPS未明显影响RAW264.7小鼠巨噬细胞系的活力(p＞0.05)；与LPS处理组比较，1μg/ml和2μg/ml的蜂毒素对细胞活力无显著性影响(p＞0.05)，而4μg/ml和8μg/ml的蜂毒素明显降低了细胞系的活力，有统计学差异(p＜0.01)。因此，根据药物对细胞活力影响的检测试验，后续细胞实验选择2μg/ml作为蜂毒素的处理剂量。
实施例3
考察实施例1的PKM2调控剂对RAW264.7巨噬细胞细胞系炎症模型的氧化应激水平：
(1)RAW264.7小鼠巨噬细胞系炎症模型制备：同实施例2。
(2)分组：将RAW264.7细胞系随机分为3组：
2.1、正常对照组(Control)：不予任何处理；
2.2、模型组(LPS)：给予100ng/ml的LPS处理；
2.3、蜂毒素治疗组(Melittin)：给予100ng/ml的LPS+2μg/ml的蜂毒素进行处理。
(3)化学发光法检测实验：提取细胞裂解液，通过化学发光法检测SOD(superoxidedismutase，超氧化物歧化酶)、MDA(malondialdehyde，丙二醛)、CAT(catalase，过氧化氢酶)和GSH(谷胱甘肽，glutathione)。根据南京建成生物工程研究LDH、SOD、MDA、CAT和GSH测试盒说明书进行操作：
3.1、配制标准液等相关试剂；
3.2、设定空白孔、对照孔等分组；
3.3、混匀，指定温度下温浴规定时间；
3.4、酶标仪在规定波长下测定吸光度；
3.5、根据计算公式计算各指标浓度或含量。
(4)检测结果：
图3A为氧化应激指标SOD的检测结果、图3B为MDA的检测结果、图3C为CAT的检测结果，图3D为GSH的检测结果。*p＜0.05，**p＜0.01。
从氧化应激指标检测结果显示：与正常对照组比较，LPS处理后，SOD、CAT和GSH水平均明显下降，MDA水平明显上升；与LPS处理组比较，蜂毒素(2μg/ml)增加了SOD、CAT和GSH的表达水平，同时降低了MDA水平，结果有统计学差异。说明蜂毒素可改善LPS诱导RAW264.7巨噬细胞细胞系炎症模型的氧化应激水平。
实施例4
考察蜂毒素对RAW264.7巨噬细胞系炎症模型能量代谢的影响：
(1)RAW264.7小鼠巨噬细胞系炎症模型制备；同实施例2。
(2)试验分组：同实施例3。
(3)ELISA实验：提取细胞上清，检测TNF-α和IL-1β水平，根据武汉华美生物公司TNF-α和IL-1β的ELISA试剂盒说明书进行操作，具体为：
3.1、将各种试剂移至室温(18～25℃)平衡至少30分钟，按前述方法配置试剂，备用；
3.2、加样：分别设标准孔和待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μl，轻轻晃动混匀，覆上板贴，置37℃温育2小时；
3.3、弃去液体，甩干，不洗涤；
3.4、每孔加生物素标记抗体工作液100μl，覆上新板贴，37℃温育1小时；
3.5、弃去孔内液体，甩干，洗板三次，每次每孔200μl浸泡2分钟，甩干；
3.6、加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，覆上新板贴，37℃温育1小时；
3.7、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次每孔200μl浸泡2分钟后甩干；
3.8、依序每孔加底物溶液90μl，37℃下避光显色15～30分钟；
3.9、加入终止液50μl，终止反应；
3.10、采用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。
(4)ELISA实验结果：
如图4为蜂毒素对RAW264.7细胞系能量代谢的影响结果；图4A的OCR检测结果提示蜂毒素显著逆转了LPS处理细胞所导致的耗氧率下降的情况。图4B的ECAR检测结果提示蜂毒素明显逆转了LPS处理细胞所导致的产酸率上升的趋势。从细胞能量代谢分析结果可知：与正常对照组比较，LPS处理组细胞耗氧率显著降低，产酸率则显著增加，提示细胞常氧状态下的有氧糖酵解能力明显增强；与LPS处理组比较，蜂毒素提高了LPS刺激后细胞的耗氧率，同时减少了产酸率水平，结果有统计学差异，说明蜂毒素逆转了LPS刺激后巨噬细胞的有氧糖酵解进程。
实施例5
考察蜂毒素对RAW264.7巨噬细胞系炎症模型Warburg效应指标的影响：
(1)RAW264.7小鼠巨噬细胞系炎症模型制备；同实施例2。
(2)试验分组：同实施例3。
(3)化学发光法检测实验：
提取细胞裂解液，通过化学发光法检测乳酸、LDH、Acetyl-CoA。根据南京建成生物工程研究所乳酸、LDH、Acetyl-CoA测试盒说明书进行操作：
3.1、配制标准液等相关试剂；
3.2、设定空白孔、对照孔等分组；
3.3、混匀，指定温度下温浴规定时间；
3.4、酶标仪在规定波长下测定吸光度；
3.5、根据计算公式计算各指标浓度或含量。
(4)化学发光法检测结果：
参见图5，图5A为基于化学发光法的乙酰辅酶A检测结果；图5B基于化学发光法的LDH检测结果；图5C基于化学发光法的乳酸检测结果。从图5分析可知：与正常对照组比较，LPS导致RAW264.7巨噬细胞系乙酰辅酶A水平的降低，促进LDH和乳酸水平的增加；蜂毒素干预后，乙酰辅酶A水平明显上升，LDH和乳酸水平显著下降，有统计学差异。
(5)Western Blot检测实验
提取RAW264.7细胞系总蛋白，采用Western Blot方法检测Glut-1、LDHA和β-actin的蛋白表达水平，具体操作步骤如下：
5.1、冰预冷PBS洗涤细胞1次，3000rpm离心2分钟，吸走上清，并加入200μl的RIPA裂解液，反复吹打混匀；
5.2、于冰上进行蛋白裂解10分钟；
5.3、4℃下12000rpm离心15分钟，将离心后的上清分装转移倒0.5ml离心管中；
5.4、蛋白浓度检测：按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制BCA工作液，充分混匀，将标准品加入96孔板的标准品孔中，加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加入200μl BCA工作液，酶标仪测定蛋白浓度；
5.5、电泳：配制分离胶，加入TEMED，立即进行摇匀、灌胶，灌胶后，用异丙醇封胶，每个样品总蛋白上50μg-100μg计算各个样品所需取样量，并与5×loading buffer混匀，沸水煮5分钟，放入冰盒中速冷，根据蛋白的定量结果，第1孔加入marker，其它每孔进行上样20μl已变性的蛋白，开始电泳，待溴酚蓝电泳至胶底部，终止电泳；
5.6、转膜：切胶，备6张与胶同样大小的滤纸和1张阴性对照膜，阴性对膜先在转膜缓冲液中浸湿，与滤纸一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透，盖上仪器，接通电源，转膜，转膜完成后，丽春红染膜，检测蛋白转膜的效率；
5.7、封闭：1×TBST配制5％脱脂奶粉，将膜浸入，室温放置1.5小时；
5.8、孵育一抗：1×TBST将一抗按比例进行稀释，使膜与一抗同时孵育，4℃过夜，孵育完成后，1×TBST洗涤3次，每次15分钟；
5.9、孵育二抗：用1×TBST稀释HRP标记的二抗，将稀释后的二抗与膜共同孵育90分钟，孵育完成后，1×TBST洗涤3次，每次15分钟；
5.10、显色及曝光：用ECL化学发光液与膜孵育3分钟，用吸水纸吸尽液体，保鲜膜将膜包裹杂交膜，于暗盒内与X胶片曝光、显影和冲洗。
(6)Western Blot检测结果：
图6为GLUT-1和LDHA的Western Blot典型的检测代表性条带。从图中可以看出：与正常对照组比较，LPS促进RAW264.7巨噬细胞系GLUT-1和LDHA的高表达；与LPS处理组比较，蜂毒素显著减少了巨噬细胞炎症模型GLUT-1和LDHA的表达水平。
实施例6
考察蜂毒素对RAW264.7巨噬细胞系炎症模型Warburg效应关键信号通路的干预作用：
(1)RAW264.7小鼠巨噬细胞系炎症模型制备：同实施例2。
(2)试验分组：同实施例3。
(3)Western Blot检测：mTOR/PKM2/HIF-1α分子信号轴是调节Warburg效应(代谢重编程)的核心。因此，我们对此信号轴的关键分子进行Western Blot检测，提取RAW264.7细胞系总蛋白，采用Western Blot方法检测PKM2、HIF-1α、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR和β-actin的蛋白表达水平，具体的实验过程与实施例5相同。
实验结果：图7A为Western Blot检测结果，从图中可知：与正常对照组比较，LPS干预后，p-Akt、p-mTOR、PKM2和HIF-1α的表达水平明显增高，Akt和mTOR水平无显著性变化；蜂毒素干预后，p-Akt、p-mTOR、PKM2和HIF-1α的表达水平被抑制，Akt和mTOR水平无显著性变化。证明LPS诱导了RAW264.7巨噬细胞系磷酸化Akt和mTOR的激活，同时促进了PKM2和HIF-1α的高表达；与LPS处理组比较，蜂毒素抑制了LPS引起的Akt和mTOR的磷酸化水平，也减少了PKM2和HIF-1α的表达水平。
(4)免疫荧光检测：免疫荧光法检测RAW264.7巨噬细胞系PKM2的表达情况，具体过程为：
4.1、将石蜡切片常规脱蜡水化；
4.2、常规进行抗原修复30分钟，正常羊血清封闭60分钟；
4.3、滴加一抗，复温冲洗；
4.4、加入荧光素标记的二抗，荧光显色；
4.5、切片经梯度酒精脱水、透明、封片；
4.6、置于荧光显微镜下进行观察、拍片。
实验结果：图7B为免疫荧光检测结果，从图中可知：与正常对照组比较，LPS处理组细胞PKM2荧光强度显著增强；蜂毒素减轻了LPS导致的细胞PKM2荧光强度，同时促进了PKM2的入核(见白色箭头所示)；蓝色荧光染色代表细胞核，红色荧光染色代表PKM2的表达。证明LPS既增强了巨噬细胞的PKM2荧光强度，又促进了胞浆PKM2向核内转移(见白色箭头所示)。
实施例7
考察蜂毒素对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞系炎症反应的干预效应：
(1)RAW264.7小鼠巨噬细胞系炎症模型制备：同实施例2。
(2)试验分组：同实施例3。
(3)Western Blot检测：提取RAW264.7细胞系总蛋白，采用Western Blot方法检测IL-1β、TNF-α、和β-actin的蛋白表达水平的蛋白表达水平，具体检测过程同实施例5。
(4)免疫荧光检测：免疫荧光法检测RAW264.7巨噬细胞系IL-1β、TNF-α的表达情况，具体过程同实施例6。
(5)ELISA检测：提取细胞上清，检测TNF-α和IL-1β水平，根据武汉华美生物公司TNF-α和IL-1β的ELISA试剂盒说明书进行操作。
(6)RT-qPCR检测：实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RT-qPCR法检测小鼠肝组织TNF-α和IL-1β水平的表达情况，具体步骤为：
6.1、Trizol提取细胞总RNA；
6.2、RNA琼脂糖凝胶电泳，进行RNA反转录；
6.3、以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA：涡旋振荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；
6.4、42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟；
6.5、反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却；
6.6、逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应；
6.7、在NCBI上搜索目的基因的序列，运用primer 5软件设计引物，以cDNA为模板加入靶基因上下游引物，进行PCR扩增。
TNF-α的引物序列：
上游引物F：5’TGAGGACCAAGGAGGAAAGTATGT 3’；
下游引物R：5’CAGCAGGTGTCGTTGTTCAGG 3’。
IL-1β的引物序列：
上游引物F：5’CGTTCCCATTAGACAACTGCA 3’；
下游引物R：5’GGTATAGATTCTTTCCTTTGAGGC 3’。
(7)实验结果：图8为蜂毒素抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞系炎症反应结果：图8A为Western Blot检测结果，图中显示：与正常对照组比较，LPS干预后，TNF-α和IL-1β表达水平明显增高；蜂毒素干预后，TNF-α和IL-1β表达水平明显降低。图8B为免疫荧光检测结果，图中显示：与正常对照组比较，LPS干预后，TNF-α和IL-1β荧光表达水平明显增强；蜂毒素干预后，TNF-α和IL-1β荧光表达水平明显减弱；蓝色荧光染色代表细胞核，红色荧光染色代表TNF-α(上排图片)或IL-1β(下排图片)的表达。图8C、图8D为ELISA结果，图中表明：与正常对照组比较，LPS干预后，细胞上清TNF-α和IL-1β表达水平明显增高；蜂毒素干预后，细胞上清TNF-α和IL-1β表达水平明显降低。E、F.RT-qPCR检测结果提示：与正常对照组比较，LPS干预后，TNF-α和IL-1β表达水平明显增高；蜂毒素干预后，TNF-α和IL-1β表达水平明显降低。**p＜0.01。
Western Blot(图8A)和免疫荧光试验结果(图8B)显示：与正常对照组比较，LPS引起致炎前因子TNF-α和IL-1β的表达增强；与LPS处理组比较，蜂毒素处理组细胞TNF-α和IL-1β的表达明显减弱。
ELISA结果(图8C、图8D)说明：LPS处理后，细胞上清TNF-α和IL-1β释放水平显著上升(p＜0.01)；蜂毒素干预后，细胞上清TNF-α和IL-1β释放水平明显减少(p＜0.01)。
RT-qPCR检测结果(图9E、TU 9F)证明：LPS处理后，细胞TNF-α和IL-1β的转录水平显著上升(p＜0.01)；蜂毒素干预后，细胞上清TNF-α和IL-1β转录水平明显减少(p＜0.01)。
实施例8
考察蜂毒素靶向PKM2的分子对接研究结果：
采用ZDOCK(http://zdock.umassmed.edu/)研究中药动物药蜂毒素与丙酮酸激酶同工酶2(PKM2)的结合模式。蜂毒素(PDB编号：2MLT)与PKM2蛋白(PDB编号：1T5A)的三维结构均从RCSBProtein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)在线网站下载获得。除特别说明外，分子对接均采用默认的参数。选择打分排名第一的构象，使用PyMoL1.7.6软件(http://www.pymol.org/)对其结合模式进行分析。
图9为蜂毒素与PKM2蛋白的分子对接结果：图9A为分子模拟对接分析说明蜂毒素(紫色分子)与PKM2蛋白(绿色分子)存在相互作用。图9B为蜂毒素(紫色分子)与PKM2蛋白(绿色分子)相互作用的分子动态模拟分析结果。图9C为蜂毒素与PKM2蛋白的整体结合图；PKM2蛋白的a、b、c和d链分别表示为黄色、青色、绿色和蓝色表面模式；蜂毒素展示为玫红色表面模式。图9D为蜂毒素位于PKM2蛋白的结合位点；PKM2蛋白的b、c和d链分别展示为青色、绿色和蓝色表面模式；蜂毒素展示为玫红色棍状和卡通模式。E.蜂毒素和PKM2蛋白的氨基酸相互作用细节图；PKM2蛋白的b、c和d链分别展示为青色、绿色和蓝色棍状模式；蜂毒素展示为玫红色棍状模式；黄色虚线表示氢键。
从图9A和图9B中可知：分子模拟对接分析显示蜂毒素与PKM2蛋白存在相互作用和相互占位趋势。
图9C和图9D所示，蜂毒素结合至PKM2蛋白b、c和d的之间的间隙中。
图9E所示：蜂毒素的氨基酸残基Ile-2、Val-5、Leu-6、Val-8和Leu-9可以与PKM2蛋白的氨基酸残基c/Ile-40、c/Ala-42、c/Cys-423、c/Cys-424、c/Phe-502、c/Phe-503和c/Val-508形成稳定的疏水性相互作用；蜂毒素的氨基酸残基Leu-13、Pro-14、Leu-16、Ile-17、Trp-19和Ile-20可以与PKM2蛋白的氨基酸残基c/Leu-18、c/Met-22、d/Leu-401和d/Ile-404形成稳定的疏水性相互作用。通过详细分析，蜂毒素的氨基酸残基Trp-19可以与PKM2蛋白的残基c/Arg-32的侧链形成阳离子-π相互作用。此外，蜂毒素的氨基酸残基Arg-24可以与PKM2蛋白的残基b/Asp-24和c/Asp-24形成静电相互作用。蜂毒素的氨基酸残基Ile-2可以分别与PKM2蛋白的残基c/Thr-41和c/Gly-501形成长为3.3和氢键相互作用；蜂毒素的残基Gly-3可以与PKM2蛋白的残基c/Gly-501形成长为氢键作用；蜂毒素的残基Arg-24可以与PKM2蛋白的残基c/Asp-24形成长为氢键相互作用。可能正是由于这种特殊的结合模式，使PKM2蛋白与蜂毒素形成稳定的复合物。
实施例9
考察蜂毒素靶向PKM2调控LPS诱导RAW264.7巨噬细胞系炎症模型的Warburg效应：
(1)模型的建立：同实施例2。
(2)分组：于广州赛业生物科技公司制备小鼠慢病毒包装质粒的PKM2 shRNA和阴性对照shRNA。启用时，通过超速离心进行病毒富集。慢病毒感染当天，收集4-5×104个细胞进行离心，用FBS的培养基重悬，接种到96孔板上。冰上缓慢解冻病毒后，加入100μl至悬浮液中，轻轻摇匀后放入CO2培养箱中37℃进行孵育。提取蛋白，用于Western Blot检测敲减效率或进行转染后的实验。
正常对照组(Control)：不予任何处理；
阴性对照组：shRNA；
慢病毒包装质粒的PKM2 shRNA#1：序列：5’-CCCGCAACACTGGCATCATTT-3’；
慢病毒包装质粒的PKM2 shRNA#2：序列：5’-ATCATTGCCGTGACTCGAAAT-3’；
慢病毒包装质粒的PKM2 shRNA#3：序列：5’-GACATGGTGTTTGCATCTTTC-3’；
(3)Western Blot检测：将其转染至RAW264.7细胞系中，提取RAW264.7细胞系采用Western Blot方法检测Glut-1、LDHA、HIF-1α和β-actin的蛋白表达水平，具体操作步骤同实施例5。
检测结果：图10为蜂毒素靶向PKM2调控LPS诱导RAW264.7巨噬细胞系炎症模型Warburg效应结果：图10A采用Western Blot方法对PKM2 shRNA的候选序列进行筛选。图中显示：与正常对照组比较，阴性对照shRNA的PKM2无显著性变化；与正常对照组及阴性对照组比较，#1、#2和#3不同序列的shRNA干预的PKM2表达均出现敲减效应，其中#2的shRNA导致PKM2表达减少的程度最佳，故选择#2的shRNA用于后续细胞实验。
图10B为Western Blot结果，图中显示：PKM2 shRNA明显减少了GLUT-1、LDHA和HIF-1α的表达水平；蜂毒素发挥了与PKM2 shRNA同样的抑制效应；与LPS+PKM2 shRNA处理组比较，LPS+PKM2 shRNA+蜂毒素处理组减轻GLUT-1、LDHA和HIF-1α表达水平的程度未见明显增加，无统计学差异。
(4)化学发光法检测：提取细胞裂解液，通过化学发光法检测乳酸、LDH。根据南京建成生物工程研究所乳酸、LDH测试盒说明书进行操作。
图11为化学发光检测结果：化学发光法检测显示：PKM2 shRNA明显减少了乳酸和LDH的表达水平；蜂毒素发挥了与PKM2 shRNA同样的抑制效应；与LPS+PKM2 shRNA处理组比较，LPS+PKM2 shRNA+蜂毒素处理组减轻乳酸和LDH表达水平的程度未见明显增加，无统计学差异。*p＜0.05，**p＜0.01。表明：与LPS处理组比较，PKM2 shRNA明显减少了乳酸、LDH的表达水平，而阴性对照组shRNA未诱导上述指标的水平下降；同时蜂毒素发挥了与PKM2shRNA同样的抑制效应；与LPS+PKM2 shRNA处理组比较，LPS+PKM2 shRNA+蜂毒素处理组减轻乳酸、LDH表达水平的程度未见明显增加，无统计学差异。
实施例10
考察蜂毒素靶向PKM2减轻LPS诱导RAW264.7巨噬细胞系的炎症反应水平
(1)RAW264.7小鼠巨噬细胞系炎症模型制备：同实施例2。
(2)试验分组：
阴性对照组：shRNA；
PKM2 shRNA组：序列：5’-ATCATTGCCGTGACTCGAAAT-3’；
模型组：100ng/ml的LPS+PKM2 shRNA；
蜂毒素治疗组(Melittin)：给予100ng/ml的LPS+2μg/ml的蜂毒素+PKM2 shRNA。
(3)Western Blot检测：将其转染至RAW264.7细胞系中，提取RAW264.7细胞系采用Western Blot方法检测TNF-α、IL-1β和β-actin的蛋白表达水平，具体操作步骤同实施例5。
(4)ELISA检测：提取细胞上清，检测TNF-α和IL-1β水平，根据武汉华美生物公司TNF-α和IL-1β的ELISA试剂盒说明书进行操作。
(5)检测结果：图12为蜂毒素靶向PKM2减轻LPS诱导RAW264.7巨噬细胞系的炎症反应水平的结果。
图12A为Western Blot结果，从图中可知：PKM2 shRNA明显减少了细胞TNF-α和IL-1β的表达水平；而阴性对照组shRNA未诱导上述指标的水平下降；蜂毒素发挥了与PKM2shRNA同样的抑制效应；与LPS+PKM2 shRNA处理组比较，LPS+PKM2 shRNA+蜂毒素处理组减轻细胞TNF-α和IL-1β表达水平的程度未见明显增加，无统计学差异。**p＜0.01。
如图12B、C为运用ELISA方法检测RAW264.7巨噬细胞及其上清的TNF-α和IL-1β水平，图中显示：与LPS处理组比较，PKM2 shRNA明显减少了细胞及上清的TNF-α和IL-1β表达水平，同时蜂毒素发挥了与PKM2 shRNA同样的抑制效应；与LPS+PKM2 shRNA处理组比较，LPS+PKM2 shRNA+蜂毒素处理组减轻细胞及上清的TNF-α和IL-1β表达水平的程度未见明显增加，无统计学差异。
实施例11
考察蜂毒素通过调控Warburg效应，减轻急性肝衰竭小鼠模型的炎症反应水平：
(1)急性肝衰竭小鼠模型制备
清洁级雄性C57BL/6J小鼠，6-8周龄，体重18-22克，购于上海斯莱克实验动物有限公司，放置于中南大学实验动物中心动物饲养房中进行标准化喂养，恒温恒湿。提供专用饲料喂养，并自由饮水。参考国内外经典小鼠急性肝衰竭模型(脂多糖/D-氨基半乳糖腹腔注射模型)的造模方法：于实验前24小时禁食不进水，正式实验前进行称重，ALF模型组小鼠给予腹腔注射脂多糖(LPS，100μg/kg)和D-氨基半乳糖(D-GalN，700mg/kg)；正常小鼠给予腹腔注射PBS作为对照组。
(2)分组：C57BL/6J小鼠随机分成3组(每组6只)：
2.1、正常对照组(腹腔注射PBS缓冲液)；
2.2、模型组(腹腔注射LPS/D-GalN)；
2.3、蜂毒素治疗组(腹腔注射LPS/D-GalN+4mg/kg的蜂毒素)。
(3)Western Blot检测：提取C57BL/6J小鼠肝组织总蛋白，采用Western Blot方法检测IL-1β、TNF-α和β-actin的蛋白表达水平，具体操作步骤同实施例5。
(4)实验结果：图13为Western Blot检测结果，从图13A检测结果显示：与正常对照组比较，ALF模型小鼠肝组织的Akt和mTOR的磷酸化水平显著增高，也促进了PKM2和HIF-1α的高表达；与模型组比较，蜂毒素抑制了ALF模型小鼠肝组织Akt和mTOR的磷酸化水平，也减少了PKM2和HIF-1α的表达水平。
同时运用Western Blot方法对致炎前因子TNF-α和IL-1β检测结果(图13B)表明：ALF导致小鼠肝组织致炎前因子TNF-α和IL-1β的表达水平显著增强；蜂毒素治疗后，TNF-α和IL-1β的表达水平明显降低。
综合上述系列研究结果，可知：急性肝衰竭后，巨噬细胞被激活，大量增殖，同时发生增殖引起的Warburg效应(代谢重编程)；这使得丙酮酸进入三羧酸循环进程受阻，在LDHA作用下，产生大量乳酸，大量乳酸激活Akt/mTOR信号通路，并活化PKM2介导的转录因子HIF-1α，进一步入核促进致炎前因子TNF-α和IL-1β的大量表达，从而加重ALF炎症反应程度；蜂毒素通过靶向关键枢纽分子PKM2，既减轻巨噬细胞的Warburg效应，又抑制HIF-1α活化，明显减轻TNF-α和IL-1β的转录表达，从而减轻ALF炎症反应进程，发挥抗炎肝保护作用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效(变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (9)

1.一种PKM2调控剂，其特征在于，包括蜂毒素。
2.根据权利要求1所述PKM2调控剂，其特征在于，还包括药学上接受的辅料。
3.根据权利要求2所述PKM2调控剂，其特征在于，所述药学上接受的辅料为PBS溶液。
4.根据权利要求1所述PKM2调控剂，其特征在于，所述PKM2调控剂中蜂毒素的浓度为1μg/ml～2μg/ml。
5.一种权利要求1至4中任一项所述PKM2调控剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法为将蜂毒素溶于PBS溶液中，超声处理获得PKM2调控剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理过程中，频率为40KHz、超声时间为1～2min。
7.一种权利要求1至4中任一项所述PKM2调控剂在制备治疗急性肝损伤的药物中的应用。
8.一种权利要求1至4中任一项所述PKM2调控剂在制备延缓肝损伤程度的药物中的应用。
9.一种权利要求1至4中任一项所述PKM2调控剂在制备用于治疗肝巨噬细胞增殖引起的炎症反应的药物中的应用。
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