CN110582209A - 用于消化系统健康，控制体重，增强免疫力和改善健康的多纤维益生元组合物 - Google Patents

用于消化系统健康，控制体重，增强免疫力和改善健康的多纤维益生元组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种由低聚木糖、阿拉伯半乳聚糖、菊粉、灵芝(Ganoderma lucidum)β‑葡聚糖、不溶性酵母β(1,3/1,6)‑葡聚糖、可溶性燕麦β(1,3/1,4)‑葡聚糖和不溶性干式酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵产物组成的组合物，其具有凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)组分，用于改善或维持消化系统健康、体重和葡萄糖平衡并增强免疫力。

Description

用于消化系统健康，控制体重，增强免疫力和改善健康的多纤 维益生元组合物
背景技术
压力、饮食、生活方式选择以及抗生素和其它药物的定期使用有助于改变身体所需的微生物菌群以维持健康的消化，抵抗疾患和疾病，并确保身体获得所需的所有营养素。
益生元被定义为“允许在胃肠道菌群的组成和/或活性发生特定变化从而赋予宿主福祉和健康益处的选择性发酵成分”(Roberfroid(2007)J.Nutr.(营养学杂志)137(3增刊2):830S-7S；Gibson和Roberfroid(1995)J.Nutr.(营养学杂志)125:1401-12)。益生元天然存在于多种食品中，尤其是高纤维食品，包括某些水果、蔬菜和谷物。益生元有时被称为可发酵纤维。它们主要由低聚糖、糖分子和可溶性纤维组成。
并非所有的膳食碳水化合物都是益生元。归类为益生元的标准包括对胃酸的抵抗力，对哺乳动物酶水解的抵抗力以及对胃肠道吸收的抵抗力；肠道微生物菌群发酵；以及选择性刺激那些有助于健康和福祉的肠道细菌的生长和/或活性(Gibson和Roberfroid(1995),同上)。
膳食纤维对健康的益处现已得到公认。纤维在肠道健康中发挥着作用。较高摄入量与健康益处有关，例如降低体重，减轻炎症和降低血液胆固醇水平。当膳食纤维被肠道微生物群代谢时，产生短链脂肪酸(SCFA)，其可以抑制巨噬细胞和树突状细胞(DC)中的炎性通路，促进调节性T(Treg)细胞的发育并维持肠道完整性和健康。所产生的SCFA降低粪便和结肠的pH，为结肠细胞提供能量并调节肠道微生物群。
除了益生元膳食纤维的有益作用外，益生菌还被证明可以促进胃肠道健康(Pandey等人,(2016)J.Food.Sci.Technol.(食品科学与技术杂志)52:7577-7587；Li等人,(2016)Biotechnol.Adv.(生物技术进展)34:1210-1224)。结果，最近的研究已经检查了益生元和益生菌一起对整体健康的作用。除了产生SCFA和增加纤维摄入量的潜在直接益处外，肠道微生物组的组成也已证实被益生元调节(Pandey等人,(2016)J.Food.Sci.Technol.(食品科学与技术杂志)52:7577-7587；Li等人,(2016)Biotechnol.Adv.(生物技术进展)34:1210-1224)。乳酸杆菌(Lactobacilli)和双歧杆菌(Bifidobacteria)是生活在结肠中的两个主要优势细菌群，其被认为是益生菌并且已知对人类健康有益。最近的研究表明它们的作用不仅限于肠道和消化系统健康，还包括肠道微生物组与诸如自闭症和各种情绪障碍等神经系统疾病之间的联系(Li等人,(2016)Biotechnol.Adv.(生物技术进展)34:1210-1224)。其次，随着年龄增长，肠道中的双歧杆菌种群会减少，因此需要补充。重要的是维持足够数量的这些有益微生物水平以促进整体健康。
低聚木糖是木聚糖的可溶性低聚物，其来源于植物的半纤维素。在使用模拟结肠系统的研究中，益生元低聚木糖的存在增加了双歧杆菌的生长(Makelainen等人,(2010)Benefic.Microbes(有益微生物)1(1):81-91)。还已经发现，向人类受试者喂食低聚木糖会增加肠道中的双歧杆菌种群(Kobayashi等人,(1991)Nippon Nogeikagaku Kaishi(日本生物科学学会杂志)65:1651-1653)。当添加低聚木糖时，在粪便培养物中报道了乳酸杆菌和双歧杆菌菌落的增加(Muralikrishna等人,(2011)Eur.Food Res.Technol.(欧洲食品研究与技术)232:601-61)。这些研究表明，低聚木糖对肠道微生物组具有有益的作用。
阿拉伯半乳聚糖是一种天然的可溶性多糖，其存在于多种植物如胡萝卜、小麦、红萝卜和豌豆中。阿拉伯半乳聚糖可通过肠道微生物组发酵，并被认为是益生元膳食纤维(Robinson等人,(2001)J.Am.Coll.Nutr.(美国营养学会会刊)20:279-285；Grieshop等人,(2002)J.Nutr.(营养学杂志)132:478-482)。阿拉伯半乳聚糖已显示具有免疫调节活性。已证明它可以激活人类外周血单核细胞(PMBC)以释放刺激自然杀伤细胞活性的γ干扰素，并减少上呼吸道感染的发生率。
菊粉是存在于大量植物如菊苣、韭菜、牛蒡、菊芋和洋葱中的天然储存碳水化合物。在结肠中，菊粉被存在的微生物迅速发酵形成SCFA，SCFA对结肠健康有益。菊粉还具有益生元活性，可刺激乳酸杆菌和双歧杆菌的生长，并减少致病菌的数量。对糖尿病大鼠的研究表明，当口服施用菊粉时，菊粉可降低血脂和血糖(Byung-Sung等人,(2011)J.Anim.Vet.Adv.(畜牧兽医进展杂志)10:2501-2507)。菊粉在人类研究中还显示出抗胆固醇血症作用，并且与降低结肠癌的风险有关。还已经研究了使用益生元如菊粉和益生菌来调节肥胖症中的肠道微生物群(Backhed等人,(2011)Nat.Rev.Endocrinol.(自然综述：内分泌学)7:639-646)。
燕麦麸是一种众所周知的膳食纤维。已经测试了衍生自燕麦的β-葡聚糖的胆固醇降低能力(Othman等人,(2011)Nutr.Rev.(营养学评论)69:299-309)。燕麦麸与糖尿病、心血管疾病和免疫力的有益作用有关(Cheickna和Zhang(2012)Compre.Rev.Food Sci.FoodSafety(食品科学与食品安全综合评论)11:355-365)。
β-葡聚糖在增强免疫力方面的作用日益突出，特别是源自药用蘑菇的那些β-葡聚糖。β-葡聚糖是葡萄糖聚合物，并构成酵母和蘑菇的细胞壁。β-葡聚糖激活巨噬细胞以增强免疫力，并对其免疫刺激特性和潜在抗癌作用进行了充分研究(Huang和Ning(2010)Int.J.Biol.Macromol.(国际生物大分子杂志)47:336-341；Thyagarajan等人,(2006)Int.J.Mol.Med.(国际分子医学杂志)18:657-64；Yu等人,(2007)J.Food Sci.(食品科学杂志)72:S435-442)。据报道，三种不同的双歧杆菌物种，即婴儿双歧杆菌(B infantis)、长双歧杆菌(B.longum)和青春双歧杆菌(B adolescentis)，可在β-葡聚糖上生长并产生SCFA。在一项人类研究中，来自姬松茸(Agaricus)蘑菇的β-葡聚糖降低溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者中的炎性细胞因子水平。
面包酵母(酿酒酵母)全细胞含有许多免疫支持化合物和代谢产物。它是一种整体食品，并且各种人类试验表明，该酵母具有免疫增强特性(Moyad等人,(2010)J.Alternat.Comple.Med.(替代与补充医学杂志)16:213-218；Moyad等人,(2009)Adv.Ther.(治疗进展)26:795-804；Jensen等人,(2011)J.Medic.Food(药用食品杂志)14:1002-1010)。在大鼠免疫模型中，施用酵母发酵产物可预防和减少炎症。
凝结芽胞杆菌是另一种受到关注的益生菌有机体，并且通常存在于市售产品中。凝结芽孢杆菌的施用已显示对艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)相关疾病患者具有有益作用。
附图说明
图1描绘了本发明的多纤维制剂对嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的体外生长的影响。
图2描绘了本发明的多纤维制剂在好氧或厌氧生长条件下对凝结芽胞杆菌的体外生长的影响。
图3A、图3B和图3C描绘了在用具有凝结芽孢杆菌作为组分的本发明多纤维组合物处理的升结肠反应器(图3A)、横结肠(图3B)和降结肠(图3C)中的醋酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)和总SCFA(总计)的绝对值(上图)、比例值(中图)和归一化值(下图)。显示了在两个对照周和三个处理周中采集的三个样本的结果。
图4描绘了本发明的多纤维组合物对升结肠(AC；上图)、横结肠(TC；中图)和降结肠(DC；下图)中的醋酸盐产生的影响。左：对照周或处理周内的平均每周醋酸盐产生(n＝3)，右：对照(n＝6)和处理期(n＝9)内的平均醋酸盐产生(*表示统计学上的显著差异)。
图5描绘了本发明的多纤维组合物对升结肠(AC；上图)、横结肠(TC；中图)和降结肠(DC；下图)中的丙酸盐产生的影响。左：对照周或处理周内的平均每周丙酸盐产生(n＝3)，右：对照(n＝6)和处理期(n＝9)内的平均丙酸盐产生(*表示统计学上的显著差异)。
图6描绘了本发明的多纤维组合物对升结肠(AC；上图)、横结肠(TC；中图)和降结肠(DC；下图)中的丁酸盐产生的影响。左：对照周或处理周内的平均每周丁酸盐产生(n＝3)，右：对照(n＝6)和处理期(n＝9)内的平均丁酸盐产生(*表示统计学上的显著差异)。
图7A、图7B和图7C描绘了在用不添加凝结芽孢杆菌作为组分的本发明多纤维组合物处理的升结肠反应器(图7A)、横结肠(图7B)和降结肠(图7C)中的醋酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)和总SCFA(总计)的绝对值、比例值和归一化值。显示了在两个对照周和三个处理周中采集的三个样本的结果。
图8描绘了本发明的多纤维组合物对升结肠(AC；上图)、横结肠(TC；中图)和降结肠(DC；下图)中的支链SCFA产生的影响。左：在对照周或处理周(n＝3)内的平均每周支链SCFA产生，右：在对照(n＝6)和处理期(n＝9)内的平均支链SCFA产生(*表示统计学上的显著差异)。
图9A、图9B和图9C描绘了利用qPCR评估的本发明多纤维组合物对升结肠(AC；图9A)、横结肠(TC；图9B)和降结肠(DC；图9C)中的七个微生物种群的影响。每个条柱代表对照和处理期内的平均拷贝数。
图10描绘了SHIME收集样本对跨上皮电阻(TEER，上图)和Caco-2/THP1-Blue共培养物上的荧光黄(LY)的细胞旁转运(下图)的影响。在共培养物预处理24小时后测量TEER，并将每个24小时值归一化为其对应的0小时值，并以初始值的百分比显示。上方的虚线表示100％(初始值)。共培养48小时(预处理24小时+LY 24小时)后测量LY的转运。在两个图中描绘的下部虚线对应于实验对照CM(完全培养基)。(*)表示每种产品中C与T之间的统计学显著差异。($)表示本发明的多纤维组合物之间的统计学显著差异。C：SHIME对照样本；T：SHIME处理样本。
图11描绘了SHIME收集样本对THP1-Blue细胞的NF-κB活性的影响。首先用SHIME收集样本预处理24小时的共培养物再用LPS处理6小时后，测量NF-κB活性水平。红色虚线对应于实验对照LPS+。(*)表示每种产品中C与T之间的统计学显著差异。在本发明的两种多纤维组合物之间未发现统计学显著差异。C：SHIME对照样本；T：SHIME处理样本。
图12描绘了SHIME收集样本对IL-6(上图)和IL-10(下图)水平的影响。首先用SHIME收集样本预处理24小时的共培养物再用LPS处理6小时后，测量细胞因子水平。虚线对应于实验对照LPS+。(*)表示每种产品中C与T之间的统计学显著差异。($)表示本发明的多纤维组合物之间的统计学显著差异。C：SHIME对照样本；T：SHIME处理样本。
图13描绘了一个联合PCA/相关性双标图，其显示了观测值之间的相似性以及变量之间的相关性。该双标图将变量绘制为向量并将观测值绘制为符号。在双标图中，1)对照完全培养基(CM)和LPS+降至1.0并被描绘为一个单点(“+”，Ctrls)；2)NaB(“x”)；3)不具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物的对照期(圆形)；4)具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物的对照期(三角形)；5)不具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物的处理期(正方形)；和6)具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物的处理期(菱形)。
发明内容
本发明是一种组合物，其包含以下或基本上由以下组成：低聚木糖、阿拉伯半乳聚糖、菊粉、灵芝β-葡聚糖、不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖(例如酿酒酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖)、燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖、不溶性干式酿酒酵母发酵产物和益生菌凝结芽孢杆菌。在其它实施方案中，制剂包括至少一种赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物采用食品、膳食补充剂、可食用医疗食品、药物产品或营养产品的形式。还提供了使用所述组合物改善或维持消化系统健康、体重、葡萄糖平衡并增强免疫力的方法。
发明详述
除了由于生活方式和饮食习惯的改变而引起的消化系统健康问题外，引起的其它人类健康问题还包括免疫力下降，肥胖和高胆固醇水平以及其它代谢紊乱。低膳食纤维摄入与肥胖、心血管疾病和2型糖尿病等的风险增加相关(Cho等人,(2013)Am.J.Clin.Nutr.(美国临床营养学杂志)98:594-619；Liu等人,(2003)Am.J.Clin.Nutr.(美国临床营养学杂志)78:920-927；Trock等人,(1990)J.Natl.Cancer Inst.(美国国立癌症研究所杂志)82:650-61；Ludwig等人,(1999)JAMA 282:1539-1546)。据信，生物失调或微生物组的失衡改变了肠道细菌产生的代谢产物，继而可能使先天和适应性免疫反应失调，并最终导致炎症和/或失去对感染的保护。某些肠道细菌会产生毒素，例如氨、D-乳酸盐、内毒素(脂多糖)和外毒素(肠毒素)，这些毒素可进一步加剧肠道病变。粪便样本的全基因组测序揭示，拟杆菌门(Bacteroidetes):厚壁菌门(Firmicutes)比率随纤维消耗而变化(Holscher等人,(2015)Am.J.Clin.Nutr.(美国临床营养学杂志)101:55-64)，这表明膳食纤维对健康成年人的粪便微生物组的系统发育结构和功能能力的影响。
一些膳食纤维还具有刺激结肠中有益细菌(益生菌)生长的能力，也称为“益生元”活性。市售纤维主要配制用于消化系统健康，并包括产品如(膳食纤维补充剂；Novartis AG)，(膳食补充剂；Proctor&Gamble Co.)和(轻泻剂；Merrell Dow Pharmaceuticals,Inc.)膳食纤维(可获自GlaxoSmith Kline)。然而，这些市售产品仅由一种纤维构成。在本发明中，已经开发了多纤维(可溶性和不溶性)产品，其可用于解决各种健康问题，并且还通过作为益生元起作用来恢复肠道微生物菌群平衡。
现已发现口服制剂中益生元和益生菌组分的混合物具有有益的健康作用，包括改善和维持消化系统健康，维持健康的体重，改善葡萄糖控制和增强免疫力。更具体地说，现已鉴定出可溶性和不溶性益生元的特定组合，用于增强人类肠道天然的有益微生物(例如，乳酸杆菌和双歧杆菌物种)的生长，并提供改善健康的积极作用。鉴于肠道微生物群在人类健康中的有益作用以及在包括自身免疫疾病、结肠癌、胃溃疡、心血管疾病、慢性肾脏疾病、功能性肠病和肥胖症的疾病中的预防潜力，本发明组合物可用于维持消化系统健康、体重控制和葡萄糖平衡。另外，可溶性和不溶性益生元的组合已与益生菌凝结芽孢杆菌组合，以提供不仅用于增强人类肠道天然的有益微生物(例如，乳酸杆菌和双歧杆菌物种)的生长，而且还用于增强受试者的免疫力的组合物。本发明的组合物包含以下或由以下组成：低聚木糖、阿拉伯半乳聚糖、菊粉、灵芝β-葡聚糖、不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖、燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖、不溶性干式酿酒酵母发酵产物和凝结芽孢杆菌。
考虑到本发明的组合物既包括平衡肠道pH并去除有毒废物的可溶性纤维，又包括结合脂肪酸、降低总胆固醇并调节血糖的不溶性纤维，本发明的组合物具有多种活性，包括抗癌、抗微生物、降血脂、免疫增强和葡萄糖调节活性。此外，这种益生元组合物可以改善矿物质吸收和平衡，并刺激属于双歧杆菌和乳酸杆菌家族的细菌的生长。在药代动力学上，本发明的益生元和益生菌组分基本上完整地到达结肠。
低聚木糖或XOS是指由2至7个用β(1,4)糖苷键结合的木糖分子组成的可溶性不可消化的糖聚合物。低聚木糖存在于水果、蔬菜、竹子、蜂蜜和牛奶中，并且通过用内切木聚糖酶将富含木聚糖的食品成分(例如玉米芯、玉米糠、米糠、麦麸和车前草)酶促水解而产生。因此，本发明的低聚木糖是通过酶促消化较大的碳水化合物分子而获得的。低聚木糖也可以从商业来源(例如中国杭州)获得。
由于低聚木糖抵抗在上消化道中消化，因此它们能够在大肠中起作用以增加双歧杆菌物种的生长(JP 2003048901)，从而改善胃功能。此外，低聚木糖具有改善血糖水平和脂肪代谢，在抗生素、化学疗法或放射疗法后恢复正常肠道菌群，增加矿物质吸收和维生素B产生以及减少肠道腐化的潜力。在动物模型中，XOS还显示减少甘油三酸酯(Beylot(2005)Br.J.Nutr.(英国营养学杂志)93(增刊1)S163-8)。XOS与FOS一起证实可减少经1,2-二甲基肼处理的雄性Sprague-Dawley大鼠结肠中异常隐窝灶的数量(Hsu等人,(2004)J.Nutr.(营养学杂志)134:1523-8)。使用模拟结肠系统的研究表明，使用XOS作为益生元可能增加双歧杆菌的生长(Makelainen等人,(2010)Beneficial Microbes(有益微生物)1:81-91)。据报道，向人类受试者喂食XOS会增加结肠中的双歧杆菌种群(Okazaki等人,(1990)Bifidobacteria Microflora(双歧杆菌微生物菌群)9:77-86)。在日本男性群体中报道了类似的结果(Kobayashi等人,(1991)Nippon Nogeikagaku Kaishi(日本生物科学学会杂志)65:1651-1653)。在添加有XOS的粪便培养物中观察到乳酸杆菌和双歧杆菌水平的增加(Muralikrishna等人,(2011)Eur.Food Res.Technol.(欧洲食品研究与技术)232:601-61)。综合考虑，这些研究表明XOS暴露对有益微生物的生长具有积极影响。XOS在人类中使用的安全性已被美国食品与药物管理局(FDA)认可为公认安全(GRAS)物质。
阿拉伯半乳聚糖是由阿拉伯糖和半乳糖以1:6的比率组成的水溶性β(3,6)-D-半乳聚糖。它存在于多种植物如胡萝卜、小麦、红萝卜和豌豆中。阿拉伯半乳聚糖是一种免疫调节剂，其已证实可激活人类外周血单核细胞(PMBC)以释放促炎性细胞因子并刺激NK细胞活性(Hauer和Anderer(1993)Cancer Immunol.Immunother.(癌症免疫学与免疫疗法)36:237-44；Riede等人,(2013)Curr.Med.Res.Opin.(医学新研究和新观点)29:251-8))。已证实阿拉伯半乳聚糖以积极的方式影响免疫系统，即增强免疫力(Riede等人,(2013)Curr.Med.Res.Opin.(医学新研究和新观点)29:251-258)。
对于饮食消费，阿拉伯半乳聚糖是从落叶松树(落叶松属)的木材中分离出来的，并被美国食品与药物管理局(FDA)批准用作膳食纤维。可被肠道细菌发酵的落叶松阿拉伯半乳聚糖(Robinson等人,(2001)J.Am.Coll.Nutr.(美国营养学会会刊)20:279-85；Grieshop等人,(2002)J.Nutr.(营养学杂志)132:478-82)为具有半乳聚糖骨架的约98％阿拉伯半乳聚糖，半乳聚糖骨架特征在于具有β(1,3)键以及半乳糖β(1,6)和阿拉伯糖β(1,6和1,3)糖侧链。
阿拉伯半乳聚糖可以通过常规方法分离和/或纯化。例如，阿拉伯半乳聚糖可以用含水介质(例如纯水或具有少量溶解的化合物如有机酸或促进提取的表面活性剂的水)从分别称为西部落叶松(Larix occidentalis)和美洲落叶松(L.laricina)的西部和东部落叶松树的细胞腔中提取。参见例如US 3,509,126。阿拉伯半乳聚糖的另一种来源是心叶青牛胆(Tinospora cordifolia)，一种印度原产的无毛、多肉的攀缘灌木。或者，阿拉伯半乳聚糖可获自商业来源(例如，MAYPRO INDUSTRIES,Purchase,NY)。
菊粉是由具有末端葡萄糖分子的低聚果糖组成的水溶性膳食纤维。它是从菊芋(Jerusalem artichoke/Helianthus tuberosus)、菊苣根和龙舌兰中获得的。已经开发了几种从菊芋中提取菊粉的方法。例如，可以将菊芋块茎与热水混合(Yamazaki等人,(1994)J.Sci.Food Agri.(食品科学与农业杂志)64:461-5)，其中进行或不进行涉及沸水提取10-15分钟的预处理步骤(US 5,968,365)。菊粉也可以从商业来源例如MAYPRO INDUSTRIES(Purchase,NY)获得，它是一种由至少90％的菊粉和少于7％的果糖、少于3％的葡萄糖、少于2％的蔗糖和少于1％的其它碳水化合物组成的有机粉末。
菊粉是支持乳酸杆菌和双歧杆菌生长(Garcia-Peris等人,(2012)Nutr.Hosp.(医院营养)27:1908-15)并降低血脂和血糖(Byung-Sung等人,(2011)J.Anim.Vet.Advance(畜牧兽医进展杂志)10:2501-7)的益生元。菊粉在人类研究中也显示出抗胆固醇血症的作用(Letexier等人,(2003)Am.J.Clin.Nutr.(美国临床营养学杂志)77:559-64)，并表现出减少结肠癌的作用(Pool-Zobel等人,(2005)Br.J.Nutr.(英国营养学杂志)93:s73-s90)。
灵芝β-葡聚糖在本文中用于指衍生自灵芝菌丝体的水溶性碳水化合物聚合物。特别地，本发明的灵芝β-葡聚糖是从β(1,3)骨架脱落的短的β(1,6)分支。在某些实施方案中，β-葡聚糖具有在35000至2000000Da范围内的分子量。研究表明，这种蘑菇β-葡聚糖可通过激活前线免疫细胞来支持健康而强大的免疫反应而不会过度刺激它，从而有效地支持免疫系统。β-葡聚糖通过激活巨噬细胞来增强免疫反应，巨噬细胞消耗外来入侵者并“触发”免疫系统的其它组分，包括粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、B细胞和T细胞以及自然杀伤(NK)细胞以应对其它潜在威胁。可以通过根据已知方法在海藻糖和甘露糖中培养灵芝(参见例如US 2009/0098619)，随后通过常规方法例如沸水提取或乙醇沉淀来提取和纯化β-葡聚糖(参见例如US 2014/0031542)，可以获得β-葡聚糖。或者，可以从商业来源获得纯化的灵芝β-葡聚糖。示例性的蘑菇β-葡聚糖是可从Super Beta Glucan Inc.(加利福尼亚州尔湾)获得的IMMUNLINK MBG(含有蘑菇β-葡聚糖的碳水化合物聚合物)。
不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖在本文中用于指来自酵母的不溶性β-葡聚糖，其主要由具有经由β(1,6)键连接的周期性β(1,3)分支的β(1,3)-连接的葡萄糖分子组成，并且更正式地称为聚(1,6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1,3)-β-D-吡喃葡萄糖。不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖的来源可以来自任何酵母菌株的酵母细胞，包括例如酿酒酵母、戴氏酵母(S.delbrueckii)、罗氏酵母(S.rosei)、微球酵母(S.microellipsodes)、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、二孢酵母(S.bisporus)、发酵性酵母(S.fermentati)、鲁氏酵母(S.rouxii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、多孢克鲁维酵母(Kluyveromyces polysporus)、白色假丝酵母(Candida albicans)、阴沟假丝酵母(C.cloacae)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、温奇汉逊酵母(Hansenula wingei)、阿尼汉逊酵母(H.arni)、亨利汉逊酵母(H.henricii)、美洲汉逊酵母(H.americana)、加拿大汉逊酵母(H.canadiensis)、碎囊汉逊酵母(H.capsulata)、多形汉逊酵母(H.polymorpha)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、多形毕赤酵母(P.polymorpha)、罗丹毕赤酵母(P.rhodanensis)、奥默毕赤酵母(P ohmeri)、牛球拟酵母(Torulopsis bovin)和光滑球拟酵母(T.glabrata)。可以通过本领域已知的方法培养酵母细胞。典型的生长培养基包括例如葡萄糖、蛋白胨和酵母提取物。可以通过通常用于从液体培养基中分离生物质的方法来收集酵母细胞并将其与生长培养基分离。这些方法通常采用固液分离方法，例如过滤或离心。优选地，在生长的中晚期对数期收集细胞，以使酵母细胞中糖原和几丁质的量最小化。在这方面，不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖的葡聚糖含量大于50％葡聚糖。在某些实施方案中，其余部分可以由细胞内脂质和/或糖原组成。
不溶性酵母β-葡聚糖的制备可以包括用合适浓度的碱性水溶液处理酵母，以溶解一部分酵母并形成主要具有β(1,6)和β(1,3)键的碱金属氢氧化物不溶性β-葡聚糖制剂。通常使用的碱是碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠或氢氧化钾或等同物。在某些实施方案中，期望例如通过温和的酸处理从细胞去除基本上所有的蛋白质材料。这种去除在使得不溶性β-葡聚糖保留不到百分之一蛋白质的程度上进行。必要时或需要时，可以对不溶性β-葡聚糖进行进一步的洗涤和提取以降低蛋白质和污染物的水平。加工后，产物pH可调节至约6.0至约7.8的范围。关于提取方法，参见例如US 2006/0009419和US 5,849,720。不溶性酵母β-葡聚糖也可以从商业来源获得，例如，MAYPROβ-葡聚糖(MAYPRO INDUSTRIES，纽约州帕切斯)。在一些实施方案中，通过用酸(例如醋酸)化学处理来修饰β-葡聚糖以减少β(1,6)键的量，并因此改变所述葡聚糖的流体力学性质，如通过这些修饰葡聚糖的水溶液粘度增加所证明。
可溶性燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖是指主要由(1,3)键联的纤维三糖基和纤维四糖基单元(>90％)组成的线性多糖，其是从普通燕麦(Avena sativa)获得的。燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖已显示具有降低胆固醇的活性(Othman等人,(2011)Nutr.Rev.(营养评论)69(6):299-309)并在糖尿病、心血管疾病和免疫力中发挥有益作用(Daou和Zhang(2012)Comp.Rev.Food Sci.Food Safety(食品科学与食品安全综合评论)11:355-365)。获得燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖的提取方法是基于β-葡聚糖在热水和碱性溶液中的溶解度，通过等电沉淀法分离溶解的蛋白质，以及通过硫酸铵、2-丙醇或乙醇使β-葡聚糖沉淀(Wood等人,(1978)Cereal Chem.(谷类化学)55:1038-49)。燕麦麸的产率更高，为61％，并且分离馏分含有84％的β-葡聚糖。已经使用类似的方法来提取燕麦β-葡聚糖，随后通过透析、超滤或醇沉淀法纯化(Beer等人,(1996)Cereal Chem.(谷类化学)73:58-62)。使用上述方法可以制备β-葡聚糖含量为60％-65％的制剂。在某些实施方案中，根据本发明使用的燕麦β-葡聚糖包括20％至40％的β-葡聚糖。燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖也可以从商业来源获得，例如，OATWELL 22燕麦β-葡聚糖(DSM Nutritional Products,Inc.，荷兰海尔伦)，其由21％至23％β-葡聚糖组成。
不溶性干式酿酒酵母发酵产物是指酿酒酵母的无活性的完整酵母细胞和由酵母细胞发酵产生的天然发酵副产物。因此，干式发酵产物不仅是啤酒酵母(活性酵母)，还是分离的β-葡聚糖。干式发酵产物可以通过传统发酵获得，这需要在含有水、氮源、碳源和微量营养素的培养基中的食品级酿酒酵母菌株。在规定的发酵期后，将整个湿产物(即培养基中的酵母细胞)置于干燥器中进行脱水。在杀死酵母细胞所需的温度下进行脱水。随后，将产物研磨并用于本发明组合物中。干式酿酒酵母发酵产物也可以从商业来源获得，例如EPICOR干式酿酒酵母发酵产物(Embria Health Sciences，爱荷华州安肯尼)。
β-葡聚糖是由各种β键(例如1,3；1,4；1,6)组成并构成酵母(例如酿酒酵母)、酵母样真菌(例如金黄色葡萄球菌)和蘑菇(例如香菇(Lentinula edodes/Shiitake)、灵芝(G.lucidum/Reishi))的细胞壁的葡萄糖聚合物。它们激活补体系统并增强巨噬细胞和自然杀伤细胞，从而增强免疫力。已经评估了三种不同的双歧杆菌物种对来自例如蘑菇和大麦的β-葡聚糖的发酵作用(Zhao和Cheung(2011)J.Agric.Food.Chem.(农业与食品化学杂志)59:5986-5692)，并且发现婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和青春双歧杆菌可以在这些β-葡聚糖上生长并产生短链脂肪酸(SCFA)。此外，在人类研究中已证实酵母来源的β-葡聚糖可降低总血浆胆固醇(Nicolosi等人,(1999)Am.J.Clin.Nutr.(美国临床营养学杂志)70:208-212)。其它人类临床试验显示酵母β-葡聚糖消耗在过敏性鼻炎(Kirmaz等人,(2005)Eur.Cyto.Network(欧洲细胞因子网络)16:128-134)、乳腺癌(Demir等人,(2007)Int.Immunopharmacol.(国际免疫药理学)7:113-116)和超重人类中的IL-10水平(Kohl等人,(2009)Nutr.Res.(营养研究)29:248-254)的有益作用。
除了可溶性和不溶性纤维组分外，益生元的组成还添加了益生菌有机体凝结芽孢杆菌。大多数益生菌属于乳酸杆菌和双歧杆菌类别。这些细菌对温度敏感，并且含有这些有机体的产品或补充剂必须储存在冷藏条件下。使用重命名为凝结芽孢杆菌的、形成芽孢的乳酸杆菌可以克服这个问题。它已经过充分研究和表征，并且被认为具有“公认安全”(GRAS)的地位。人类研究表明，凝结芽孢杆菌可减少病毒感染(Baron,(2009)Postgrad.Med.(研究生医学)121:114-118)，帮助患有肠易激综合症的患者(Hun(2009)Postgrad.Med.(研究生医学)121:119-124)，并减少炎症(Jenson等人,(2010)BMCImmunol.(BMC免疫学)11:15)。凝结芽孢杆菌的组成为10亿至50亿CFU/g(Nebraskacultures，加利福尼亚州核桃溪)。
本发明的组合物可以制备为食品、膳食补充剂、可食用的医疗食品、药物产品或营养产品。出于本发明的目的，食品包括但不限于保健棒、保健饮料、酸奶、达喜(dahi)、冰淇淋、冷冻酸奶或其它冷冻食品。在某些实施方案中，益生元组合物的纤维以微粉化或粉末形式提供。所述产品的摄入对肠道提供了速溶益生元，从而增强了人类肠道天然的有益微生物(例如乳酸杆菌和双歧杆菌物种)的生长。在这方面，通过已知促进健康的肠道微环境的微生物在大肠中的定位和定植，重复摄入所述产品将对肠道微生物菌群具有高度有益的作用。
除益生元和益生菌之外，本发明的组合物还可包含各种赋形剂、填充剂、粘合剂、甜味剂、调味剂和/或添加剂。本发明组合物的任选的赋形剂包括但不限于：润滑剂，例如硬脂酸镁或硬脂酸，或滑石粉；粘合剂，例如淀粉或糖；脂肪，抗氧化剂，氨基酸，蛋白质，核酸，电解质，维生素，其衍生物或其组合。在一个实施方案中，产品的添加剂是角豆粉，例如刺槐豆胶。在另一个实施方案中，添加剂是来自双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的蘑菇提取物。在特定的实施方案中，产品含有赋形剂，例如硬脂酸镁和/或硬脂酸。
此外，为了增加本发明组合物的适口性，可能需要添加调味剂、甜味剂、粘合剂或增量剂。可以任选地添加到本发明组合物中的调味剂是本领域众所周知的。实例包括但不限于合成调味油和/或来自植物叶、花、果实等的油，并且它们的组合是有用的。调味油的实例包括但不限于留兰香油、薄荷油、肉桂油和冬青油(水杨酸甲酯)。人造的、天然的或合成的水果调味剂也是有用的，例如柑橘油，包括柠檬、橙子、葡萄、酸橙和葡萄柚，以及水果香精，包括苹果、草莓、樱桃、菠萝等。甜味剂可以选自各种材料，例如水溶性甜味剂、水溶性人造甜味剂和二肽基甜味剂，包括但不限于其盐及其混合物。
粘合剂可以选自多种材料，例如羟丙基甲基纤维素，乙基纤维素，或其它合适的纤维素衍生物，丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物，药用釉料，树胶(例如黄芪胶)，乳衍生物(例如乳清)，淀粉(例如玉米淀粉)或明胶及衍生物，以及本领域技术人员众所周知的其它常规粘合剂。增量物质的实例包括但不限于糖、乳糖、明胶、淀粉和二氧化硅。
当上述添加剂包括在本发明的产品中时，它们通常小于产品总重量的15％。在特定的实施方案中，它们小于产品总重量的5％至10％。本发明的每种组分的量在本发明组合物总重量的5％至35％的范围内。在某些实施方案中，低聚木糖、阿拉伯半乳聚糖、灵芝β-葡聚糖、不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖和不溶性干式酿酒酵母发酵产物各自以本发明组合物总重量的5％至8％的范围存在；并且菊粉和燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖各自以本发明组合物总重量的25％至32％的范围存在。本发明组合物的凝结芽孢杆菌组分可以本发明组合物总重量的2-10％(10-50亿)的范围存在。
本发明的组合物可以配制成片剂，胶囊剂，香囊剂，粉剂，丸剂，软凝胶剂，囊形片，液体剂，或者配制为食品或饮料产品，例如固体食品，如棒状食品(例如营养棒或谷物棒)、粉末饮料、乳制品、早餐谷物、麦片、糖果、糖食、曲奇饼、饼干、脆饼干、巧克力、口香糖、甜点等；或液体食品，如软饮料、果汁、运动饮料、牛奶饮料、奶昔、酸奶饮料或汤，以及宠物零食、宠物食品等。
本发明的组合物可以任选地包括常规食品添加剂，例如乳化剂、稳定剂、甜味剂、调味剂、着色剂、防腐剂、螯合剂、渗透剂、缓冲剂或用于调节pH的试剂、增稠剂、组织改良剂等。在一个实施方案中，所述组合物包含调味剂，例如橙或柑橘调味剂。
取决于产品是由成人、儿童还是动物(例如，陪伴动物或家畜)消费，产品可以以各种尺寸和具有各种成分来生产以适合于预期的接受者。此外，因为本发明的组合物通常被认为是安全的，所以它们可以每天消费一次、两次或三次或更多次。通过已知促进健康的肠道微环境的微生物在大肠中的定位和定植，重复摄入本发明的产品将对肠道微生物菌群具有高度有益的作用。
优选地，本发明的组合物的日剂量为每天一或两剂，其中每剂含有2克至4克的纤维。在某些实施方案中，所述组合物以每天两次提供的含有2克纤维的片剂形式提供。在另一个实施方案中，所述组合物以每天两次施用的粉末形式提供(每剂4克纤维)。
考虑到本发明组合物的活性，本发明还涉及一种用于改善或维持消化系统健康、体重和葡萄糖平衡的方法。所述方法包括施用有效量的本发明的产品，所述产品由低聚木糖、阿拉伯半乳聚糖、菊粉、灵芝β-葡聚糖、不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖、燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖和不溶性干式酿酒酵母发酵产物组成，从而改善或维持消化系统健康，维持或减轻体重，并且葡萄糖水平理想地维持或降低至正常范围。例如，体重正常的健康受试者的体重指数(BMI)在18.5至24.9的范围内，而超重受试者的BMI在25至29.9的范围内并且肥胖的受试者的BMI在30或30以上。此外，空腹时的正常糖水平被认为低于100mg/dL，而进食后两小时的正常糖水平被认为低于140mg/dL。但是在大多数健康人中，糖水平甚至更低。施用本发明的组合物将维持正常的BMI或将BMI降低至正常范围和/或将糖水平维持或降低至正常范围。
理想地，本发明组合物的有效量是足以实现有益或期望结果(包括临床结果)的量。因而，本发明组合物的有效量是导致由肠道微生物群介导的包括自身免疫疾病、结肠癌、胃溃疡、心血管疾病、慢性肾脏疾病、功能性肠病和肥胖症的疾病的一种或多种症状的减轻或改善的量。通过支持健康的肠功能，延迟或减慢疾病进展，或者改善或减轻疾病状态，本发明组合物的施用还可减小疾病程度，稳定化(即不恶化)疾病状态。改善也可以意味着，与未接受治疗的预期生存期相比，生存期延长。在特定的实施方案中，将本发明的组合物施用于肥胖受试者。进一步预期，本发明的组合物在接受癌症治疗的受试者中可进一步用于提供能量以及总体健康和福祉。
根据各种相关因素，包括给药目的(例如，预防、缓解或治疗)，个体受试者的年龄、性别和体重，和/或受试者症状的严重程度，确定待施用的本发明组合物的量和给药方案。在这方面，本发明的组合物可以在医学专家的指导下施用或者可以自行施用。
具体实施方式
提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。
实施例1：通过多纤维组合物(KIBOW )增强微生物生长
测试了本发明的具有7种不同成分的多纤维产品对嗜酸乳酸杆菌和长双歧杆菌的总体生长促进活性。本发明的7成分产品(称为KIBOW)支持两种有益物种的体外生长(图1)。
为了测试本发明的多纤维制剂是否能够支持另一种有益微生物凝结芽孢杆菌的生长，进行了其中在单独地可溶性纤维以及本发明的7种成分的多纤维产品(KIBOW)存在下研究凝结芽孢杆菌的体外生长的实验。在好氧和厌氧条件下均对凝结芽孢杆菌株进行评估。结果表明，在存在和不存在氧气的情况下，凝结芽孢杆菌在所有个别纤维的存在下以及在存在本发明的7种多纤维产品的情况下都能够良好生长(图2)。
实施例2：7种成分的多纤维产品(KIBOW)与商业产品的比较
理想地，多纤维产品KIBOW每天以粉末(参见样本1，表1)或片剂(参见样本2，表1)的形式消费一次或两次，其中每剂含有2克至4克纤维。因此，所述产品相对于市售的纤维补充剂(表1)提供显著优势，因为它既包含可溶性纤维又包含不溶性纤维，并且每天提供至少4克的纤维。
表1
将KIBOW的益生元活性与其它已知的膳食纤维产品((膳食纤维补充剂；Novartis AG)、可获自Glaxo Smith Kline的(轻泻剂；Merrell Dow Pharmaceuticals,Inc.)膳食纤维和(膳食补充剂；Proctor&Gamble Co.)进行比较。(膳食纤维补充剂；Novartis AG)是用于一般肠道健康的产品，其是源自小麦糊精的低聚糖，它很容易水解成糖。(膳食补充剂；Proctor&Gamble Co.)具有车前子壳，其提供饱腹感并减少热量摄入，并且添加了糖和调味剂以吸引普通消费者；可获自Glaxo Smith Kline的(轻泻剂；Merrell Dow Pharmaceuticals,Inc.)膳食纤维含有甲基纤维素(一种形成大块的纤维轻泻剂)。因此，将KIBOW FORTIS与(膳食纤维补充剂；Novartis AG)、(轻泻剂；Merrell Dow Pharmaceuticals,Inc.)和(膳食补充剂；Proctor&Gamble Co.)进行比较。益生菌嗜酸乳酸杆菌和长双歧杆菌在含有这些多纤维作为唯一生长“碳”源以代替正常来源的糖的固体琼脂培养基上生长。
不同产品之间的双歧杆菌计数相似；然而，通过菌落大小可见的生长丰度表明(膳食纤维补充剂；Novartis AG)对双歧杆菌的生长支持最少。可从GlaxoSmith Kline获得的(膳食补充剂；Proctor&Gamble Co.)和(轻泻剂；Merrell Dow Pharmaceuticals,Inc.)膳食纤维由于产品中添加糖的存在而显示出较小的菌落。糖容易被所有细菌吸收，更容易被病原有机体吸收。然而，纤维只能被益生菌如乳酸杆菌和双歧杆菌发酵或代谢。对于KIBOW产品可见最高程度的生长，所述产品是7种成分的多纤维产品，在本发明的组合物中也存在其7种多纤维成分。
实施例3：改善肥胖和增强潜在体重减轻
肥胖现在是发达国家中的一种流行病，其驱动原因是消费高热量加工食品和久坐不动的生活方式。这是一个普遍的问题，许多团体正在努力了解其原因并减少这种流行病。市场上有大量益生菌制剂可用于消化系统健康。为了有效发挥作用，主要是乳酸杆菌和双歧杆菌的益生菌需要大量食用。研究已将人类肠道微生物群分为三个不同的组/簇或肠型，它们富含拟杆菌(Bacteroides)、普雷沃氏菌(Prevotella)或鲁米诺球菌(Ruminococcus)(Arumugam等人,(2011)Nature(自然)473:174-180)。1型富含杀菌剂，并从碳水化合物和蛋白质中获取能量；肠型2富含粘蛋白降解物普雷沃氏菌，而肠型3主要是鲁米诺球菌，其降解粘蛋白和糖类以产生能量。小鼠(ob/ob小鼠)的肥胖症模型已显示出拟杆菌减少50％，而厚壁菌门成比例地增加，这表明肠道微生物群的性质在肥胖症中起着非常重要的作用(Ley等人,(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)102:11070-5)。此外，在肥胖和超重的儿童中，显示出有益细菌的缺乏和金黄色葡萄球菌(厚壁菌门)的增加(Kalliomaki等人,(2008)Am.J.Clin.Nutr.(美国临床营养学杂志)87:534-538)。此外，最近的研究表明炎症在肥胖症中起主要作用。现在的数据提供证据表明该炎症是由肠道细菌引起的，并且这些细菌也影响肥胖症的发展(Cani和Delzenne(2009)Curr.Pharm.Des.(当前药物设计)15:1546-58；Ley(2010)Curr.Opin.Gastroenterol.(胃肠病新见)26:5-11；Vrieze等人,(2010)Diabetologia(糖尿病学)53:606-13)。
益生菌已在各种临床试验中用于小鼠和大鼠的肥胖症。在大鼠中进行的大多数研究都是使用益生菌的单一菌株进行的，最大剂量为100亿CFU/天，并且可见体重减轻和脂肪细胞大小降低。当饲喂植物乳酸杆菌时，Sprague-Dawley大鼠还表现出瘦素减少。此外，布拉氏酵母菌(S.boulardii)的施用导致低度的全身性和肝脏炎症标志物如白介素-1β、IL-6、IL-4和TNF-α的减少。然而，要使益生菌有效，就必须大量(数十亿)食用它们才能与数以万亿计的肠道天然微生物竞争。
或者，可以使用益生元增强肠道微生物菌群生长。然而，从食物摄取获得的益生元通常不经消化就排出体外。另外，为了从食物中获得有效量的益生元，每天将需要消耗大量食物(25克至35克)。
现已显示，用纯纤维代替细菌生长培养基中的糖可导致乳酸杆菌和双歧杆菌的生长增加数千亿个。这表明可以通过在消费产品(例如，微粉化或粉末形式)中食用这些纯膳食纤维来恢复肠道微生物菌群。选定的可溶性和不溶性益生元膳食纤维还具有其它有益特性，包括免疫刺激，饱腹感，胆固醇降低，以及促进有益乳酸杆菌和双歧杆菌更大生长的能力。数据显示，仅在生长培养基中添加1克纤维，乳酸杆菌和双歧杆菌的计数就各自增加超过3000亿。结果表明，以益生元为碳源的益生菌物种的生长呈对数增长。人们每天食用4克至8克纯微粉化或粉末形式的纤维预期提供2.4万亿至4.8万亿的有益微生物，从而具有巨大的潜力来抵消与肥胖症有关的菌群紊乱。
为了分析本发明组合物在治疗肥胖症中的作用，使用易肥胖大鼠(OP-CD)。通过选择具有加速体重增加的未来育种，获得从Crl:CD(SD)大鼠品系开发的OP-CD大鼠。从该远系繁殖群体中产生了两个品系，即OP-CD(易肥胖)和OR-CD(抗肥胖)。当喂食高脂饮食时，OP-CD变得肥胖，消除无反应者亚群。尽管瘦素受体功能齐全，但仍会发生多基因肥胖。相比之下，OR-CD大鼠在高脂饮食喂养时不会变得肥胖(无反应者)。
以标准鼠粮随意向大鼠(n＝6)喂食可溶性和不溶性多纤维益生元(10％w/w)和凝结芽孢杆菌的制剂。向对照大鼠(n＝6)喂食不含多纤维/凝结芽孢杆菌制剂的正常鼠粮。在基线、第4周、第8周和第12周时期测量体重、BMI、血压，以及血液学(CBC)和基本代谢标志物(CRP、胆固醇和甘油三酸酯分布)。次要终点包括生化参数(瘦素、饥饿素(Ghrelin)和胎球蛋白(Fetuin))，尿液收集和粪便分析。还测试了炎性生物标志物，例如NF-κB、TNF-α、IL-6。
预期本发明的多纤维益生元组合物将调节大鼠的肠道微生物组，从而改善或治疗易肥胖大鼠中的肥胖。
实施例4：保健棒
可以通过将各种赋形剂(例如粘合剂、添加剂、调味剂、着色剂等)与本发明的益生元纤维(即低聚木糖、阿拉伯半乳聚糖、菊粉、灵芝β-葡聚糖、不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖、可溶性燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖和不溶性干式酿酒酵母发酵产物)一起组合，并混合至塑性团块稠度，来制备保健棒。然后将该团块挤出或模制以形成“糖果棒”形状，然后将其干燥或使其固化以形成最终产品。
实施例5：医疗食品
可以通过将燕麦片、脱水苹果、蜂蜜、角豆粉、肉桂粉、糖、香草精和益生元纤维(即低聚木糖、阿拉伯半乳聚糖、菊粉、灵芝β-葡聚糖、不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖、可溶性燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖和不溶性干式酿酒酵母发酵产物)组合来制备医疗食品。将这些成分按适当比例混合，成形为长约12.5厘米至15厘米、宽3厘米至4厘米且高1厘米的矩形棒，并置于无菌真空烘箱中持续12小时至24小时，以获得所需稠度的可食用食品。
实施例6：群体感应抑制(QSI)
已经显示出许多乳酸杆菌产生抗微生物化合物，其可以干扰肠道病原体如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、志贺氏菌(Shigella)等的毒力或致病特性(Servin(2004)FEMSMicrobiol.Rev.(欧洲微生物学会联合会微生物学评论)28:405-440；Varma等人,(2010)J.Food Sci.(食品科学杂志)75:M546-M551)。因此，减弱毒力的一种策略是基于益生菌株产生的某些代谢产物的产生。例如，已发现可溶性分子积聚在副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)副干酪亚种CMGB 18的上清液中，它们对耐多药铜绿假单胞菌和群体感应(QS)基因表达具有抑制性质(Cotar等人,(2010)RoumArch.Microbiol.Immunol.(罗马尼亚微生物学与免疫学档案)69:213-223；Cotar等人,(2013)Curr.Organic Chem.(当代有机化学)17:155-161)。这类化合物已被称为群体感应抑制剂(QSI)。
金黄色葡萄球菌产生外毒素，这导致月经相关的中毒性休克综合症。在培养中，人类阴道分离株罗特氏乳酸杆菌(L.reuterii)RC-14产生环状二肽环(L-Phe-L-Pro)和环(L-Tyr-L-Pro)，其已被认为干扰葡萄球菌的群体感应系统agr(一种毒力基因的关键调节剂)，并且抑制毒素在金黄色葡萄球菌MN8中的表达(Li等人,(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)108:3360-3365)。
益生元促进益生菌乳酸杆菌和双歧杆菌的生长。考虑到本发明的组合物具有益生元的性质，它可用于增加有益细菌和天然益生菌株的生长。这些有益微生物的生长增加到数万亿的水平，导致产生可以作为QSI的代谢产物，从而防止毒性致病细菌的生长并减少感染和炎症。这些有益微生物的生长增加也将导致有毒代谢产物的产生减少。因而，肠道菌群紊乱得以纠正，并且均衡的肠道微生物组可恢复人类受试者的健康。
实施例7：具有和不具有凝结芽孢杆菌的多纤维制剂的体外功效
在一项长期给药研究中，使用被称为人体肠道微生物生态系统模拟器的人体胃肠道连续模型，进行了一项实验以比较两种纤维混合物(Molly等人,(1994)Microbial Ecol.Health Dis.(健康和疾病微生物生态学)7:191-200；Ranganathan等人,(2006)ASAIO J.52:70-79)。该模型允许在不同肠区域的代表性条件下在更长的时期内培养复杂的肠道微生物群。因此，SHIME模型允许收集有关益生菌和/或益生元配方的发酵概况的详细信息，以及收集有关受处理影响的肠道发酵活性的定位的信息。进行实验以并排比较在添加凝结芽孢杆菌和不添加凝结芽孢杆菌的情况下的本发明的多纤维益生元制剂(KIBOW)的活性。
所使用的的每个单元由升结肠、横结肠和降结肠区域组成。简言之，在两周对照期内，建立微生物活性(例如，SCFA、乳酸盐、铵)和微生物组成的基线值。在对照期之后，开始三周处理期，在此期间，将每种产品补充到对照饮食中。的每个区段由连续的4个反应器组成，所述反应器模拟胃肠道的不同部分(即胃和小肠；升结肠；横结肠；降结肠)。结肠反应器室是具有恒定体积和pH控制的连续搅拌反应器。使用两个容器模拟胃和小肠，并且使用五个结肠容器评估两种多纤维组合物的效果。在结肠血管中，每个单元由升结肠室(pH 5.6-5.9；体积500ml)、横结肠室(pH 6.15-6.4；体积800ml)和降结肠室(pH6.6-6.9；体积600ml)组成。实验由以下三个阶段组成：1)稳定期；2)对照期；和3)处理期。在稳定期内，用新鲜的粪便样本接种结肠反应器后，两周的稳定期使微生物群落根据局部环境条件在不同的反应器中分化。在此期间，提供了基本营养基质以支持最初存在于粪便接种物中的肠道微生物群的最大多样性。在对照期(2周参考期)内，将标准SHIME营养素基质进一步添加到模型中持续14天的时期。在此期间对样本进行分析可以确定不同反应器中的基线微生物群落组成和活性，这将用作与多纤维处理结果进行比较的参考。在处理期(3周)内，反应器在正常条件下运行，但饮食中除了正常组成外还补充了多纤维益生元产品。
稳定期内的影响。在稳定期内，所监测的活性包括pH降低和总产气量(指示发酵活性)。在实验的对照和处理部分中，所监测的终点包括酸/碱消耗以及微生物群落活动(每周两次)、微生物群落组成(每周一次)和肠屏障活动。
对于酸/碱消耗，已知结肠反应器中微生物代谢产物的产生会改变pH。如果不进行连续的pH控制(通过添加酸或碱)，则pH值将超过固定间隔。因此，在实验期间连续监测酸/碱的消耗。关于微生物群落活动，测量了短链脂肪酸(SCFA)浓度、乳酸盐水平，以及铵离子和支链SCFA的水平。所监测的SCFA包括醋酸、丙酸和丁酸的浓度。关于乳酸盐，人类肠道既有乳酸产生菌，又有乳酸利用菌。乳酸盐由乳酸菌产生并降低环境的pH值，同时也起到抗微生物剂的作用。它也可以被其它微生物迅速转化为醋酸盐、丁酸盐和丙酸盐。铵和支链SCFA(异丁酸、异戊酸和异己酸)是蛋白水解发酵的标志物，并且可能会对宿主健康产生不利影响。关于在暴露于本发明的多纤维组合物之前、期间和之后存在的微生物群落的组成，经由qPCR在内腔中对以下组进行定量：1)人类肠道微生物组的两个主要细菌门，即厚壁菌门和拟杆菌门；2)两种有益的益生菌，即双歧杆菌和乳酸杆菌；以及3)嗜粘蛋白艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)、球形布劳特氏菌(Blautia coccoides)和直肠真杆菌(Eubacterium rectale)以及普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)。关于肠壁功能的调节，在肠屏障活动(TEER和LY渗透)以及促炎和抗炎细胞因子(即NF-kB、TNF-α、IL8、IL6和IL10)的产生方面，评估本发明的组合物对宿主的影响。
相对于对照，两种多纤维产品的气压都显著增加，表明两种组合物都被结肠微生物群发酵。两种益生元混合物在温育期(48小时)结束时得到相似的产气量(即，对于具有凝结芽孢杆菌的组合物为89.7kPa；对于不具有凝结芽孢杆菌的组合物为90.4kPa)。两种产品在温育四小时后都显示出明显的气体产生，并且测量结果表明，在温育六小时和24小时之间的产气量相似。温育24小时后，没有明显的气体产生，这可能是由于产品耗尽所致。
在结肠温育期间对pH的监测提供了SCFA和铵离子(NH4+)产生的第一个指示。通常，在温育的最初24小时内观察到pH下降，这是由于SCFA和乳酸盐的形成。在温育的最后24小时内，由于蛋白水解发酵，这种pH下降后通常接着是pH升高，这导致尤其产生NH4+。相对于对照，两种产品的发酵都伴随着较大的pH下降(降低至少0.5个pH单位)，表明这两种多纤维组合物都被结肠微生物群发酵。两种产品的pH下降相似，并且在温育的最初24小时内最明显，这证实了通过产气量测量获得的结果。然而，在温育的第二个24小时内，pH略有增加，这可能是由于纤维耗尽以及随后的细菌代谢转变为蛋白水解发酵所致。这些数据表明产气量显著增加以及pH值大幅降低，表明这两种产品都容易被人体肠道微生物组发酵，导致形成几种潜在与健康相关的代谢产物，例如SCFA和乳酸盐。
对照期内的影响。在对照期内，SCFA水平非常稳定(对照期内连续时间点之间的平均相似度为94.0％)，并且在两个SHIME单元的每一个之间可再现(平均相似度为91.5％)。这表明微生物群落在活性和组成方面是稳定的。就数据解释而言，这种高稳定性是重要的，因为它表明处理期间观察到的任何效果都由所施用的多纤维组合物引起，而两个单元之间的高再现性允许组合物之间的直接比较。
酸和碱的消耗反映了整个实验的总体微生物活性。为了确保维持最佳的环境条件，系统中的pH值由pH控制器在升结肠中控制在5.6-5.9之间，在横结肠中控制在6.15-6.4之间，在降结肠中控制在6.6-6.9之间。在不同反应器中微生物群落稳定后(从接种后第2周开始)，碱-酸消耗通常较低。但是，在处理期间，细菌可能会产生增加量的SCFA。结果，反应器中的环境将酸化，需要将碱施用于各个反应器以将它们保持在预设的pH范围内。结果，酸/碱消耗将增加。通过测量整个实验中的酸/碱消耗量，可估算出多纤维产品的潜在发酵。
两种多纤维产品都充分发酵，因为它们与施用处理后立即增加的碱消耗有关。两种组合物在所有三个结肠室中都导致相似的酸化水平(并因此增加了碱消耗)，其中在升结肠中不具有凝结芽孢杆菌的产品最初增加较高。观察到的酸化(通过添加碱来补偿)归因于血管中SCFA和/或乳酸盐水平的升高。与升结肠和横结肠相比，降结肠中两种产品的碱消耗量都相对较低。降结肠中的较低发酵被认为与先前的升结肠和横结肠血管中纤维的完全降解有关。
使用多纤维组合物处理期间的影响。接下来，研究了具有和不具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物对中SCFA产生的影响。SCFA的产生导致结肠中碳水化合物的代谢，并与各种健康影响相关。最丰富的SCFA是醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐。众所周知，SCFA在肠道健康中起着至关重要的作用。醋酸盐可用作宿主的能量来源，并用作体内脂质合成的潜在底物。此外，它是丁酸盐合成中的重要副产物。然而，SCFA对健康的促进作用主要归因于丙酸盐和丁酸盐，它们充当肠上皮的主要能源(Cummings和Englyst(1987)Am.J.Clin.Nutr.(美国临床营养学杂志)45:1243-1255)并显示针对炎症和结肠癌的保护作用。已知丙酸盐被转运到肝脏，它在此具有降低血浆中胆固醇的作用(Wright等人,(1990)Exp.Biol.Med.(实验生物学与医学)195:26-29；Demigne等人,(1995)Br.J.Nutr.(英国营养学杂志)74:209-219)并积极地影响血糖控制(Wong等人,(2006)J.Clin.Gastroenerology(临床消化病杂志)40:235-243)。用具有凝结芽孢杆菌作为组分的多纤维组合物处理结肠的实验结果示于图3A、图3B和图3C以及图4-6中。用含有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物进行的处理与以下相关：1)SCFA总产量立即增加，这主要是由于在所测试的所有三个结肠区域中丙酸盐的产生增加；2)在升结肠血管中醋酸盐和丁酸盐水平没有增加，而在横结肠和降结肠血管中醋酸盐和丁酸盐水平略有增加；3)SCFA水平从醋酸盐占优势转变为丙酸盐占优势概况；4)在升结肠的整个处理期内，SCFA的绝对水平和比例水平都保持恒定；以及5)在第一周的最后一个采样点，横结肠和降结肠血管的SCFA的绝对水平和比例SCFA水平稳定。考虑到在升结肠中对产品补充剂的立即反应，大部分多纤维组合物可能在升结肠中转化，导致产生丙酸盐。因此，在每个饲喂周期中，只有小剂量的多纤维组合物可能到达横结肠和降结肠。在这些远端区域，相对于升结肠，丙酸盐(以及因此总SCFA)水平的逐渐增加是归因于这些SCFA从升结肠中被冲走，同时又产生了少量的额外醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐。
用不具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物进行处理的实验结果示于图7A、图7B和图7C以及图4-6中。用不添加凝结芽孢杆菌的多纤维组合物进行的处理与以下相关：1)SCFA总产量立即增加，这主要是由于在所测试的所有三个结肠区中醋酸盐和丁酸盐的产生增加，以及丙酸盐的较小程度增加；2)以醋酸盐为代价生产丁酸盐(按比例生产水平)；以及3)在整个处理期内，升结肠中的绝对和比例SCFA水平保持恒定，在横结肠和降结肠血管中在第一周的最后一个采样点变得稳定。与用具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物进行SHIME处理所观察到的结果相似，在横结肠和降结肠中观察到SCFA水平相对于升结肠更为逐渐增加，这很可能是由于升结肠的冲洗作用。考虑到在升结肠中对产品补充剂的立即反应，在升结肠中大部分的多纤维组合物可能被转化，再次导致较低剂量到达横结肠。
人类肠道中既有生产乳酸的细菌，又有利用乳酸的细菌。乳酸盐是由乳酸菌产生的，并且可降低环境的pH。尤其是在低pH值下，乳酸盐可以对病原体发挥强大的抗微生物作用。乳酸盐的另一个有益作用是通过特定的利用乳酸盐的产丁酸微生物将其转化为丁酸盐，所述微生物例如粪厌氧棒状菌(Anaerostipes caccae)、哈氏厌氧棒状菌(Anaerostipes hadrus)或霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)。随着不同微生物物种产生并转化乳酸盐，可以由产量增加以及转化率降低引起乳酸盐浓度的增加。
在对照期(如上所述)内，与在处理期内达到的水平相比，两种产品在所有结肠室中的乳酸盐水平都较高。但是，仅当将所有血管的不具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物的处理结果与对照期进行比较时，差异才是统计上显著的。考虑到乳酸盐可以通过交叉进料转化为丁酸盐，并且由于在用这种不具有凝结芽孢杆菌的组合物处理后，丁酸盐水平增加，因此乳酸盐浓度的降低可能归因于在向混合物中添加凝结芽孢杆菌的情况下更有效地转化为丁酸盐。
铵(NH4+)和支链SCFA(异丁酸盐、异戊酸盐和异己酸盐的总和)的产生通常由肠道中的蛋白质降解引起，并且反映肠道微生物群的蛋白水解活性。这种增加的活性与直接和间接的有害健康影响(即结肠癌变)有关，而铵离子和SCFA产量的降低被认为是有益的。结果描绘于图8中。在当前的实验中，已证实：1)在所有肠区域中，用具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物处理期间，SCFA和铵产量显著降低，并且在整个处理期间得以维持；2)用不具有凝结芽孢杆菌的多纤维处理导致铵离子水平仅在横结肠和降结肠区域降低，而SCFA水平仅在降结肠区域降低。具有凝结芽孢杆菌的产品可降低所有肠道区域的铵离子和支链SCFA浓度，这表明该组合物对蛋白水解发酵有积极作用。类似地，不具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物显著降低了横结肠血管和降结肠血管中的铵离子浓度，而降结肠血管中支链SCFA的产生显著降低。综合考虑，这些结果表明两种益生元组合物在结肠中产生的蛋白水解发酵都减少，表明所测试的产品能够产生健康促进作用，与其他人报道的对纤维的作用一致。
对微生物组有机体种群的影响分析。定量PCR(qPCR)是一种基于通过扩增对特定细菌序列(16S rRNA基因)进行定量的分子技术。通过仔细选择选择性引物，qPCR允许对微生物生态系统中感兴趣的生物分类基团进行直接靶向定量。本发明的多纤维组合物对升结肠、横结肠和降结肠血管中的七个微生物种群的影响。通过比较对照期与处理期的DNA拷贝数来评估效果。关于监测乳酸杆菌的水平，这些细菌被认为是有益的糖酵解细菌，其能够产生高浓度的乳酸盐。乳酸盐是人类结肠环境中的一种重要的代谢产物，因为它具有抗微生物特性，还因为它是与其它细菌进行一系列营养相互作用的驱动力，从而导致下游代谢产物的产生。结果表明，用两种测试的多纤维组合物处理结肠区域都刺激了乳酸杆菌属在三个结肠区域的每个区域中的生长。像乳酸杆菌一样，双歧杆菌产生乳酸盐，但它们也是主要的醋酸盐生产者之一；对这种细菌种群的影响通常反映在醋酸盐生产水平上。尽管双歧杆菌无法自行产生丁酸盐，但它们通常可以通过交叉进料相互作用刺激丁酸盐的产生。这些实验的结果示于图9A、图9B和图9C中。结果表明，用不具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物处理在所有肠道区域中都具有强烈的双歧作用，而用具有凝结芽孢杆菌的组合物进行处理仅刺激升结肠中的生长。这些结果与醋酸盐和丁酸盐的生产数据(如上所述)一致，其中发现不具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物刺激了所有肠道区域中的醋酸盐和丁酸盐的产生，而具有凝结芽孢杆菌的组合物仅具有较小效果。拟杆菌门包含最丰富的丙酸盐生产者。因此，在一些情况下，可以发现丙酸盐浓度与这些有机体的丰度之间的关系。结果表明，具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物具有强烈的促生作用。然而，尽管包括凝结芽孢杆菌组分的组合物的效果更大，但是两种组合物都较弱地刺激了拟杆菌种群的生长。厚壁菌门包含梭菌IV和XIVa簇，已知它们包含重要的丁酸盐生产有机体。尽管普氏粪杆菌属于IV簇，但拟球梭菌(Clostridium coccoides)(最近重新分类为球形布劳特氏菌)和直肠真杆菌都是梭菌XIVa簇的成员。两种多纤维益生元产品都刺激了厚壁菌门的生长，这可能与观察到的丁酸盐产生的增加有关(如上所述)。两种组合物都在相似水平上刺激普氏粪杆菌的生长，这可能与丁酸盐产生的增加有关。此外，普氏粪杆菌是肠道健康的指标(Miquel等人,(2013)Curr.Opin.Microbiol.(微生物学当前观点)16:255-61)，其展现抗炎作用。普氏粪杆菌的丰度下降也与菌群紊乱有关。所测试的组合物均未改变球形布劳特氏菌和直肠真杆菌的丰度。两种组合物都刺激了升结肠中的嗜粘蛋白艾克曼菌的生长，但是导致横结肠和远端结肠血管中拷贝数的轻微降低。
对肠壁功能的影响。进行的最后一系列体外研究旨在检查两种多纤维组合物对肠道功能的影响。因为细菌与肠壁紧密地相互作用，所以多纤维益生元对微生物活性和丰度的调节可能会影响肠壁功能。通过在体外评估肠上皮通透性和特异性免疫标志物来评定。从SHIME实验中收集的样本用于体外评估发酵产物对肠上皮屏障功能和免疫标志物的影响。这些包括来自升结肠、横结肠和降结肠血管的样本，这些样本是在对照期和两种测试组合物(具有和不具有凝结芽孢杆菌的多纤维混合物)的处理期结束时收集的。
如先前所述进行Caco-2共培养实验(Daguet等人,(2016)J.Functional Foods(功能食品杂志)20:369-379)。简言之，将Caco-2细胞(HTB-37；美国典型培养物保藏中心)以1×105/插入物的密度接种在24孔半透性插入物(孔径为0.4μm)中。将Caco-2细胞单层培养14天，每周更换三次培养基，直到获得跨上皮电阻(TEER)超过300′Ω/cm2的功能性细胞单层。将细胞保存在含有25mM葡萄糖和4mM谷氨酰胺并补充有10mM HEPES和20％(v/v)热灭活(HI)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)中。将THP1-Blue(InvivoGen)细胞保存在含有11mM葡萄糖和2mM谷氨酰胺并补充有10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和10％(v/v)HI-FBS的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中。THP1-Blue是用报告基因构建体稳定转染的THP1人类单核细胞，所述构建体在由转录因子NF-κB诱导的启动子的控制下表达分泌的碱性磷酸酶(SEAP)基因。通过诸如LPS(从革兰氏阴性细菌中分离)的分子激活TLR后，NF-κB被激活并诱导SEAP的表达和分泌。然后通过使用QUANTI-Blue试剂(InvivoGen)在上清液中进行测量。将THP1-Blue细胞以5×105个细胞/孔的密度接种在24孔板中，并用100ng/mL的PMA处理48小时。PMA诱导细胞分化为巨噬细胞样细胞，该细胞能够粘附并引发TLR信号传导。
共培养之前，通过使用上皮伏欧表测量Caco-2单层的TEER。从所有读数中减去空插入物的TEER，以计算插入物的残余电阻。然后，如前所述(Possemiers等人,(2013)J.Agric.Food Chem.(农业与食品化学杂志)61:9380-9390)；Daguet,同上)，将带有Caco-2的插入物置于PMA分化的THP1-Blue细胞顶部进行进一步实验。顶端区室(含有Caco-2细胞)填充有无菌过滤(0.22μm)的结肠SHIME悬浮液(在Caco-2完全培养基中以1:5(v/v)稀释)。还用丁酸钠(NaB；12mM)作为阳性对照经顶端处理细胞。基底外侧区室(含有THP1-Blue细胞)填充有Caco-2完全培养基。还将细胞在两个腔室中暴露于Caco-2完全培养基作为对照。将细胞处理24小时，然后测量TEER。减去空插入物的TEER之后，将所有24小时值归一化为其特有值(以说明不同插入物的TEER差异)，并以初始值的百分比表示。然后，弃去基底外侧上清液，并用含有500ng/mL超纯LPS(大肠杆菌K12，InvivoGen)的Caco-2完全培养基经基底外侧刺激细胞。还使用LPS和氢化可的松(HC；1μM)和不含LPS的培养基(LPS-)作为对照经基底外侧刺激细胞。LPS刺激6小时后，通过Luminex multiplex(Affymetrix-eBioscience)收集基底外侧上清液以测量细胞因子(人类IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、CXCL10和MCP-1)并根据制造商的说明评估NF-κB活性。所有处理都一式三份进行。将细胞在37℃下在空气/CO2(95:5，v/v)的潮湿气氛中温育。
荧光黄(LY；MW 457)的细胞旁(细胞间)转运是在与上文关于细胞因子测量所述相同的条件下进行；两次实验之间的差异发生在预处理24小时之后；然后，代替LPS，在顶端侧对细胞给予LY。简言之，用悬浮液和NaB(12mM)预处理24小时后，将顶端和基底外侧上清液都弃去，并且在37℃下将细胞洗涤并在转运培养基(补充有10mM HEPES的汉克斯平衡盐溶液(HBSS))中平衡30分钟。然后，在顶端腔室中填充在转运培养基中稀释的100μMLY/插入物。基底外侧腔室仅填充有转运培养基。24小时后在基底外侧测量LY跨Caco-2细胞单层的转运(在485nm激发/528nm发射下测量荧光)。
对照(CM和NaB)关于通透性标志物(TEER和LY细胞旁转运)获得的结果表明，共培养温育24小时后，完全培养基(CM)对照显示TEER降低近50％，这是由于PMA激活的THP1细胞对Caco-2细胞诱导的损伤。如所预期，丁酸钠(NaB；阳性对照)能够保护Caco-2细胞免受这种损伤。然而，在LY转运实验中未发现处理之间的这种差异，这可能是因为，尽管在CM对照中观察到TEER下降，但小分子的转运仍未受到很大影响。
在对照中关于不同免疫标志物获得的结果表明，如所预期，LPS能够增加所有免疫标志物的分泌。相反，氢化可的松(HC)通过抑制LPS诱导的细胞因子和趋化因子水平以及通过抑制LPS诱导的NF-κB转录活性，充当广泛的免疫抑制剂。与之相比，NaB具有标志物依赖性作用。尽管NaB增加了NF-κB的转录活性，但它对一些免疫介体如IL-1β和TNF-α具有明显的选择性转录后抑制活性。因此，显示出对照NaB可选择性增加LPS诱导的IL-10和IL-6(参与免疫稳态)，并选择性抑制LPS诱导的IL-1β和TNF-α(促炎细胞因子)以及CXCL10、MCP-1和IL-8(参与免疫细胞募集的趋化因子)。综合考虑这些对照结果，验证了用于研究本发明的多纤维混合物的作用的测试系统。
在对照和处理的最后几周从所有结肠血管中收集的样本在过滤后在Caco-2完全培养基中稀释，并经顶端给予共培养物持续24小时。与完全培养基(CM)对照结果相比，包括SHIME对照在内的所有样本都能够维持TEER。然而，多纤维处理样本显示更有效，将TEER维持在接近或高于100％的水平(图10)。对于两种多纤维组合物，对于所有结肠血管，该结果在统计学上是显著的。当比较两种组合物时，仅升结肠样本在具有和不具有凝结芽孢杆菌的组合物之间有显著差异，其中在含有凝结芽孢杆菌的组合物处理时，显示TEER更高。关于LY的转运，结果表明小分子的被动转运受任一种处理的影响都不大(图10)。然而，与相应对照相比，处理期间收集的升结肠和降结肠样本似乎都略微降低了LY的转运，但变化在统计学上并不显著。
用样本对Caco-2/THP1-Blue共培养物进行24小时预处理后，弃去基底外侧上清液，并用LPS刺激细胞。刺激6小时后，收集基底外侧上清液以测量细胞因子和趋化因子，并确定NF-κB活性水平。与LPS+对照相比，包括对照在内的所有样本都增加或增强了LPS诱导的NF-κB转录活性。然而，与对照样本相比，在经处理的样本中对于所有血管以及对于两种组合物都可见到这种增加显著更高(图11)。在所测试的两种多纤维组合物之间没有显著差异。
观察到的NF-κB活性结果反映在关于IL-6和IL-10水平获得的结果中(图12)。与获得的NF-κB活性结果相似，所有收集样本(对照和处理)都增加或增强了LPS诱导的IL-6和IL-10水平。但是，这种增加在暴露于用多纤维组合物处理的细胞中更为显著。与相应对照相比，从收集的经多纤维处理的样本显著提高了IL-6和IL-10的水平，这是在所有三个结肠血管中都观察到的作用。但是，两种多纤维组合物之间的效果大小存在差异；在所有结肠血管中，用含有凝结芽孢杆菌作为组分的多纤维混合物处理的结肠血管中观察到的细胞因子水平更高。所有样本(包括对照)似乎都增加或增强了LPS诱导的IL-1β，而LPS诱导的TNF-α水平却受到抑制。当与相应的SHIME对照相比时，经多纤维组合物处理的样本似乎诱导IL-1β水平的较小增加并在更大程度上抑制TNF-α水平。在用不具有凝结芽孢杆菌的多纤维组合物处理的横结肠样本中关于IL-1β，以及在用凝结芽孢杆菌组分处理的横结肠样本中关于TNF-α，活性更高。
所有的样本(包括对照)都抑制了LPS诱导的CXCL10，这种作用在用本发明的组合物处理过的样本中似乎更加明显。关于IL-8水平，作用弱。
由于在这些实验中测试的测量变量和样本的数量相对较高，因此降低复杂性的分析对于解释结果可能很有用。因此，绘制了联合PCA/相关性双标图(图13)。
当减少为两个分量时，数据可由前两个分量解释约69％，其中第一个分量占原始9个变量方差的近51％。主要影响第一分量的变量是TEER、NF-κB、IL-6、TNF-α和CXCL10，而LY、IL-1β和IL-8主要影响第二分量。
综合考虑，实验数据表明，两种多纤维产品都易于在人类结肠环境中发酵，导致形成预期对人类肠道环境产生积极影响的最终产品。此外，具有和不具有凝结芽孢杆菌作为组分的两种多纤维产品都展现与对人类健康的有益作用相一致的活性。

Claims (6)

1.一种组合物，其包含低聚木糖、阿拉伯半乳聚糖、菊粉、灵芝β-葡聚糖、不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖、燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖、不溶性干式酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)发酵产物和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述酵母包括酿酒酵母。
3.根据权利要求1所述的组合物，其还包含至少一种赋形剂。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含食品、膳食补充剂、可食用的医疗食品、药物产品或营养产品。
5.一种组合物，其基本上由低聚木糖、阿拉伯半乳聚糖、菊粉、灵芝β-葡聚糖、不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖、燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖、不溶性干式酿酒酵母发酵产物和凝结芽孢杆菌组成。
6.一种用于改善或维持消化系统健康、免疫力、体重和葡萄糖平衡的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的组合物，从而改善或维持所述受试者的消化系统健康、免疫力、体重和葡萄糖平衡，所述组合物包含低聚木糖、阿拉伯半乳聚糖、菊粉、灵芝β-葡聚糖、不溶性酵母β(1,3/1,6)-葡聚糖、燕麦β(1,3/1,4)-葡聚糖、不溶性干式酿酒酵母发酵产物和凝结芽孢杆菌。
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